專利名稱：：一種綠僵菌的固體培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是指綠僵菌(AfetoA&'Mmflm'《op//ae)的一種固體培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：綠僵菌是廣譜性寄生真菌，可感染200余種昆蟲，對蝗蟲及地下害蟲等有特效，無殘毒，無公害，使用安全，對害蟲天敵亦有保護(hù)作用。是一種可持續(xù)、低消耗的害蟲防治制劑，可代替大量化學(xué)農(nóng)藥的使用，減輕環(huán)境污染，在生物防治中具有重要應(yīng)用價值。綠僵菌的大量培養(yǎng)是滿足田間應(yīng)用需求的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外綠僵菌固體培養(yǎng)一般采用框架式或塑料袋法培養(yǎng)，其培養(yǎng)過程中不僅設(shè)備復(fù)雜，污染率高和對濕度要求條件高，而且發(fā)酵周期長，相對生產(chǎn)效率低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種綠僵菌固體培養(yǎng)方法，將框架式與塑料袋法培養(yǎng)結(jié)合起來，可有效減少培養(yǎng)過程中的污染機(jī)率和后期對濕度的要求，并可明顯改善培養(yǎng)基的通氣性能，其發(fā)酵工藝簡單，不需要復(fù)雜設(shè)備，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)成本低，有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。本發(fā)明的主要技術(shù)方案是一種綠僵菌的固體培養(yǎng)方法，包括液體菌種的制備及固體培養(yǎng)，其特征在于固體培養(yǎng)前期采用框架式培養(yǎng)，后期采用塑料袋法培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基中具有營養(yǎng)原料麥麩和作為原料載體的玉米秸稈粉。所述的固體培養(yǎng)基中具有以下組份及重量配比的固體基質(zhì)為佳，麥麩玉米秸稈粉=60-90份5-40份。所述的固體培養(yǎng)基中添加無機(jī)鹽的較佳組份及重量配比為，按其固體基質(zhì)成分總量為100g，添加葡萄糖0.8-1.5g、硫酸銨1.5-2.5g、磷酸二氫鉀0.6-1.8g;將這些成分溶于70-200ml水后再與固體基質(zhì)攪拌均勻，蒸汽滅菌。所述的固體培養(yǎng)前期框架式培養(yǎng)接種時液體菌種量為固體培養(yǎng)基總重量的5-20%為佳。所述的框架式培養(yǎng)2-3天長滿白色菌絲時，將菌種輕輕搗碎，再裝入滅菌的聚丙烯塑料袋中進(jìn)行塑料袋法培養(yǎng)3-4天。所述的液體菌種制備的方法用的斜面培養(yǎng)基具有如下組份及重量配比較佳馬鈴薯80120g、蔗糖1624g、酵母膏46g、KH2P04l4g、MgS041.21.8g、瓊脂15g、水1L。所述的液體菌種制備的方法用的液體培養(yǎng)基具有如下組分及重量配比為佳葡萄糖3248g、酵母膏46g、蛋白胨812g、KH2P0438g、MgS040.40.6g、水1L。本發(fā)明的積極效果是將框架式與塑料袋法培養(yǎng)結(jié)合起來，可有效減少培養(yǎng)過程中的污染機(jī)率和后期對濕度的要求，并可明顯改善培養(yǎng)基的通氣性能，其發(fā)酵工藝簡單，不需要復(fù)雜設(shè)備，.發(fā)酵周期短，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)成本低，有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用液體培養(yǎng)快速生長的大量菌絲體，轉(zhuǎn)接到固體營養(yǎng)基質(zhì)上產(chǎn)生氣生分生孢子，從而縮短菌絲生長周期，提高產(chǎn)率，避免前期污染；其次，本發(fā)明前期釆用框架式培養(yǎng)，后期塑料袋法培養(yǎng)，生產(chǎn)工藝簡單，顯著減少了培養(yǎng)過程中的污染機(jī)率，縮短了發(fā)酵時間，而且不需要復(fù)雜設(shè)備，對濕度的要求降低；第三，原料主要為農(nóng)副產(chǎn)品麥麩、玉米秸稈粉，來源廣泛、充足，成本低廉，易調(diào)控，成功率高；第四，在培養(yǎng)原料中添加部分玉米秸稈粉，不僅可以使農(nóng)業(yè)廢棄物得到有效利用，而且明顯改善了培養(yǎng)基的粘度、空隙率和疏松度，培養(yǎng)過程中不用額外通氣。因此，本發(fā)明的實現(xiàn)，不僅對農(nóng)業(yè)廢棄物的利用、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面意義重大，而且有著切實的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。以下結(jié)合實例作詳述，但不作為對本發(fā)明的限定。具體實施方式生產(chǎn)工藝(1)液體菌種的制備，包括如下步驟菌種金龜子綠僵菌M105-32(或用其他的綠僵菌亦可)，河北省生物研究所保存，為公知公用菌種。斜面菌種預(yù)先將綠僵菌菌種用試管斜面在25。C傳代培養(yǎng)、活4化，當(dāng)斜面長滿綠色孢子時即可；液體培養(yǎng)基每個250ml三角瓶中放入60ml培養(yǎng)基，115。C蒸汽滅菌30分鐘；接種從固體斜面中挑出一小塊菌苔接入液體搖瓶；培養(yǎng)25士rC搖床振蕩培養(yǎng)36-42小時，長成白色粘稠菌絲體即可向固體培養(yǎng)基中接種。(2)固體培養(yǎng)a.固體培養(yǎng)基麥麩60-90%、玉米秸稈粉5-40%(上兩種為100);以下為占上兩種的百分?jǐn)?shù)葡萄糖O.8-1.5g、硫酸銨1.5-2.5g、磷酸二氫鉀0.6-1.8g;將這些成分溶于70-200ml水后再與固體基質(zhì)攪拌均勻，pH自然，115"C蒸汽滅菌50分鐘；b.接種按5-20%接種量，將液體種倒入固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，放入下鋪滅菌報紙的淺盤中培養(yǎng)(厚度3-4cm)，淺盤底為尼龍網(wǎng)，通氣性好，注意各環(huán)節(jié)均需無菌操作；c.培養(yǎng)方法培養(yǎng)室溫度為25士rC，濕度30-70%,培養(yǎng)2-3天，長滿白色菌絲時，輕輕搗碎，裝入可蒸汽滅菌的聚丙烯塑料袋中，袋子兩端塞入滅菌棉花，再用細(xì)繩捆住繼續(xù)培養(yǎng)3-4天(裝入袋后室內(nèi)無濕度要求)，內(nèi)外均長出綠色孢子即可，從袋中倒出，在陰涼通風(fēng)處晾干即為粗品(或在35'C烘24h，含水率《12%)。實施例1:(1)液體菌種的制備a.斜面菌種預(yù)先將金龜子綠僵菌M105-32菌種用試管斜面培養(yǎng)基在25"C傳代培養(yǎng)、活化，當(dāng)斜面長滿綠色孢子時即可；b.液體培養(yǎng)基配制0.5L液體培養(yǎng)基，每個250ml三角瓶中放入60ml培養(yǎng)基，115。C蒸汽滅菌30分鐘；c.接種從固體斜面中挑出一小塊菌苔接入液體搖瓶，一只斜面可接6-8個瓶子；d.培養(yǎng)25土rC搖床振蕩培養(yǎng)36-42小時，長成白色粘稠菌絲體即可向固體培養(yǎng)基中接種。(2)固體培養(yǎng)a.固體培養(yǎng)基麥麩4.2kg玉米秸稈粉0.8kg、葡萄糖60g、硫酸銨90g、磷酸二氫鉀55g、自來水為6L，先用水將葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀溶解，再倒入固體培養(yǎng)基中攪拌均勻，pH自然，分裝成幾個小布袋，放入髙壓滅菌鍋內(nèi)115"蒸汽滅菌50分鐘；b.接種將液體種倒入固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，放入下鋪滅菌報紙的淺盤中培養(yǎng)(厚度3-4cm)，淺盤底為尼龍網(wǎng)，通氣性好，幾個盤子可以疊放，最上層再蓋層塑料布(保濕)，注意各環(huán)節(jié)均需無菌操作；c.培養(yǎng)方法培養(yǎng)室預(yù)先消毒，溫度25士rC，濕度30-70%，培養(yǎng)2-3天，長滿白色菌絲時，輕輕搗碎，裝入可蒸汽滅菌的聚丙烯塑料袋中，袋寬15cm，袋長35-40cm，袋子兩端塞入滅菌棉花，再用細(xì)繩捆住繼續(xù)培養(yǎng)3-4天(裝入袋后室內(nèi)無濕度要求)，內(nèi)外均長出綠色孢子，從袋中倒出，放在陰涼通風(fēng)處晾干即為粗品(或在35。C烘24h，含水率《12%)。血球計數(shù)板計數(shù)L31Xl(T孢子/克粗品，平板計數(shù)1.15X10l包子/克粗品。固體斜面培養(yǎng)基具有如下組份及重量配比較佳馬鈴薯80120g、蔗糖1624g、酵母膏46g、KH2P04l4g、MgS041.21.8g、瓊脂15g、水1L。(例2同)液體菌種制備的方法用的液體培養(yǎng)基具有如下組份及配比為佳葡萄糖3248g、酵母膏46g、蛋白胨812g、KH2P0438g、MgSOd0.40.6g、水1L。(例2同)實施例2:(1)液體菌種的制備a.斜面菌種預(yù)先將金龜子綠僵菌M105-32菌種用試管斜面培養(yǎng)基在25'C傳代培養(yǎng)、活化，當(dāng)斜面長滿綠色孢子時即可；b.液體培養(yǎng)基配制1.7L液體培養(yǎng)基，每個250ml三角瓶中放入60ml培養(yǎng)基，115。C蒸汽滅菌30分鐘；c.接種從固體斜面中挑出一小塊菌苔接入液體搖瓶，一只斜面可接6-8個瓶子；d.培養(yǎng)25土rC搖床振蕩培養(yǎng)36-42小時，長成白色粘稠菌絲體即可向固體培養(yǎng)基中接種。(2)固體培養(yǎng)a.固體培養(yǎng)基..麥麩12.Okg、玉米秸稈粉3.Okg、葡萄糖120g、硫酸銨280g、磷酸二氫鉀140g、自來水為13L，先用水將葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀溶解，再倒入固體培養(yǎng)基中攪拌均勻，pH自然，分裝成幾個小布袋，放入高壓滅菌鍋內(nèi)115"蒸汽滅菌50分鐘；b.接種將培養(yǎng)好的液體種倒入滅菌固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，放入下鋪滅菌報紙的淺盤中(厚度3-4cm)，淺盤底為尼龍網(wǎng)，通氣性好，幾個盤子可以疊放，最上層再蓋層塑料布(保濕)，注意各環(huán)節(jié)均需無菌操作；c.培養(yǎng)方法培養(yǎng)室預(yù)先消毒，溫度25土rC，濕度30-70%,培養(yǎng)2-3天，長滿白色菌絲時，輕輕搗碎，裝入可蒸汽滅菌的聚丙烯塑料袋中，袋寬15cm，袋長35-40cm，袋子兩端塞入滅菌棉花，再用細(xì)繩捆住繼續(xù)培養(yǎng)3-4天(裝入袋后室內(nèi)無濕度要求)，內(nèi)外均長出綠色孢子，從袋中倒出，放在陰涼通風(fēng)處晾干即為粗品(或在35t:烘24h，含水率《12%)。血球計數(shù)板計數(shù)1.16X10"孢子/克粗品，平板計數(shù)1.05Xl(T孢子/克粗品。其他實施例，方法同上，配比如下表l。其他實施例配比<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>效果發(fā)酵周期由同類技術(shù)的12-14天縮短到6-7天，發(fā)酵水平》U)0億/克粗品。不僅明顯縮短了發(fā)酵周期，而且不需要復(fù)雜設(shè)備，對濕度的要求降低。權(quán)利要求1、一種綠僵菌的固體培養(yǎng)方法，包括液體菌種的制備及固體培養(yǎng)，其特征在于固體培養(yǎng)前期采用框架式培養(yǎng)，固體培養(yǎng)的后期采用塑料袋法培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基中具有營養(yǎng)原料麥麩和作為原料載體的玉米秸稈粉。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠僵菌的固體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的固體培養(yǎng)基中具有以下組分及重量配比的固體基質(zhì)，麥麩玉米秸稈粉二60-90份:5-40份。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的綠僵菌的固體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的固體培養(yǎng)基中添加無機(jī)鹽的組分及重量配比為，按其固體基質(zhì)成分總量為100g，添加葡萄糖0.8-1.5g、硫酸銨1.5-2.5g、磷酸二氫鉀0.6-1.8g;將這些成分溶于70-200ml水后再與固體基質(zhì)攪拌均勻，蒸汽滅菌。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠僵菌的固體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的固體培養(yǎng)前期框架式培養(yǎng)接種時液體菌種量為固體培養(yǎng)基總重量的5-20%。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的綠僵菌的固體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的框架式培養(yǎng)2-3天長滿白色菌絲時，將菌種輕輕搗碎，再裝入滅菌的聚丙烯塑料袋中進(jìn)行塑料袋法培養(yǎng)3-4天。6、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4或5所述的綠僵菌的固體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的液體菌種制備的方法用的固體斜面培養(yǎng)基具有如下組分及重量配比馬鈴薯80120g、蔗糖1624g、酵母膏46g、KH2P04l4g、MgS041.21.8g、瓊脂15g、水1L。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的綠僵菌的固體培養(yǎng)方法，其特征在于所述的液體菌種制備的方法用的所述的液體菌種制備的方法用的液體培養(yǎng)基具有如下組分及重量配比葡萄糖3248g、酵母膏46g、蛋白胨812g、KH2P0438g、MgS040.40.6g、水1L。全文摘要本發(fā)明涉及一種綠僵菌的固體培養(yǎng)方法，涉及生物發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
。包括液體菌種的制備及固體培養(yǎng)，其特征在于固體培養(yǎng)前期采用框架式培養(yǎng)，后期采用塑料袋法培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基中具有營養(yǎng)原料麥麩和作為原料載體的玉米秸稈粉。本發(fā)明的積極效果是將框架式與塑料袋法培養(yǎng)結(jié)合起來，可有效減少培養(yǎng)過程中的污染機(jī)率和后期對濕度的要求，并可明顯改善培養(yǎng)基的通氣性能，其發(fā)酵工藝簡單，不需要復(fù)雜設(shè)備，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)成本低，有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。文檔編號C12R1/645GK101525577SQ200910073840公開日2009年9月9日申請日期2009年3月2日優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日發(fā)明者史延茂,尹淑麗,崔冠慧,張麗萍,張根偉,李書生,段普凡,程輝彩,超董,黃亞麗申請人:河北省生物研究所