專利名稱：：一種結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫的構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：RobertKoch首次成功分離培養(yǎng)了結(jié)核分枝桿菌，從而為戰(zhàn)勝世界上一個主要的瘟疫帶來了巨大的希望。然而125年過去了，結(jié)核分枝桿菌仍然是一個分布廣泛的病原菌，感染了近三分之一的人類并且每年殺死約兩百萬人(RaviglioneMC.TheTB印idemicfrom1992to2002.7iiZ;e2rw7o57's(^/j'"Z人2003,83:4-14.)。結(jié)核分枝桿菌具有一些難以治愈的特征。它能夠適應(yīng)種種不利的生存環(huán)境并且能夠阻止正常巨噬細胞的成熟。結(jié)核分枝桿菌還能夠進入休眠狀態(tài)，使得感染并不表現(xiàn)出癥狀，在體內(nèi)一直潛伏數(shù)十年。當(dāng)宿主的免疫系統(tǒng)由于營養(yǎng)不良，患病或者年老的而變得衰弱，潛伏的結(jié)核桿菌就有可能復(fù)活(SmithI.餘co》a"eri咖to力ercw7osispathogenesisandmoleculardeterminantsofvirulence.yer，2003，16:463-496.)。作為一個古老的致病菌，針對它的預(yù)防措施和診斷方法卻是兒十年沒有更新。大量數(shù)據(jù)表明卡介苗(BCG)接種對兒童的保護效果較明顯，但對成人的免疫效果極不穩(wěn)定(BroschRetal.GenomeplasticityofBCGandimpactonvaccineefficacy.尸潔爿ca"cj'〃"，2007，104:5596-5601.)。艮P使對于兒童，BCG的免疫保護效果在不同地區(qū)不同種族中也存在顯著差異(080%)。BCG的局限性推動了抗結(jié)核病新疫苗的開發(fā)。找到更好的保護性抗原，發(fā)展安全、高效的新型結(jié)核病疫苗勢在必行。在診斷方面，目前存在敏感性較低，特異性較差，操作復(fù)雜，檢測周期長等問題，因此找到更多的特異性抗原，開發(fā)研制快速特異診斷結(jié)核病的方法，成為控制結(jié)核病蔓延的首要任務(wù)。由于臨床耐藥菌株的出現(xiàn)，研究細菌耐藥機制，并針對耐藥菌尋找新藥靶，開發(fā)新型抗結(jié)核藥物也已迫在眉睫。同時抗原一般都是細胞壁的重要組成部分或者是分泌蛋白，有些還承擔(dān)著重要的細胞代謝過程。因此抗原也是非常合適的候選藥物靶標(biāo)。本發(fā)明通過外源表達結(jié)核分枝桿菌的蛋白質(zhì)，利用血清學(xué)技術(shù)鑒定出新的保護性抗原，在建立新的免疫預(yù)防方法、診斷檢測方法以及新藥的開發(fā)等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價值。Bisen等利用鳥槍法打斷結(jié)核分枝桿菌基因組DNA進行外源表達，利用ELISA和westernblot檢測表達蛋白質(zhì)的免疫原性，獲得了一些能與結(jié)核病人血清特異反應(yīng)的抗原(BisenPSetal.AnalysisoftheshotgunexpressionlibraryoftheMycobacteriumtuberculosisgenomeforimmunodominantpolypeptides:potentialuseinserodiagnosis.Ci/"ZVag"Ls力/腳"/30厶2003,10:1051-1058.)。其缺陷是將結(jié)核分枝桿菌基因組隨機打斷，這樣并不能夠準(zhǔn)確得到其每個基因的表達產(chǎn)物，因此這種方法做鑒定到的抗原是不全面的。Malen等將雙向電泳與血清學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，最終利用串聯(lián)質(zhì)譜在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)物濾液中鑒定到4個能與結(jié)核病病人血清發(fā)生強烈反應(yīng)的蛋白質(zhì)(MalenH，SoftelandT，WikerHG.AntigenanalysisofMycobacteriumtuberculosisH37Rvculturefiltrateproteins.5<朋《////^ww厶2008,67:245^52.)。其缺陷在T結(jié)核分枝桿菌的有些抗原物質(zhì)只有在感染宿主細胞時才特意表達或者分泌，所以只檢測其在體外培養(yǎng)時的濾液不能夠準(zhǔn)確反映其在宿主細胞內(nèi)的真實情況，有必要準(zhǔn)確克隆表達其全基因組所有編碼基因，對其表達產(chǎn)物的抗原性進行研究。Kashino等利用高效液相色譜和質(zhì)譜的方法在結(jié)核病病人的尿液中檢測到4個特異分泌的蛋白能夠特異的與病人血清發(fā)生反應(yīng)(KashinoSSetal-IdentificationandcharacterizationofMycobacteriumtuberculosisantigensinurineofpatientswithactivepulmonarytuberculosis:aninnovativeandalternativeapproachofantigendiscoveryofusefulmicrobialmolecules,"i"http://hm//2</，2008.)。其缺陷是只能檢測少量在尿液中才能存在的抗原，并不能反映結(jié)核分枝桿菌在人體內(nèi)存在時所分泌的所有抗原。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，構(gòu)建一種結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫及其應(yīng)用。本發(fā)明通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))獲得結(jié)核分枝桿菌基因組所有編碼基因，利用傳統(tǒng)分子克隆方法精確克隆結(jié)核分枝桿菌的基因片段混合物至大腸桿菌表達載體，得到了結(jié)核分枝桿菌的基因表達文庫。通過對該文庫的基因進行外源表達和變性純化，得到了高覆蓋率的結(jié)核分枝桿菌的基因表達產(chǎn)物，最終綜合利用血清學(xué)方法與分子生物學(xué)實驗方法鑒定出新的保護性抗原，以便為結(jié)核病的檢測和防治提供新的侯選抗原或為結(jié)核病的治療提供新的藥物靶標(biāo)。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的為了實現(xiàn)本發(fā)明，申請人制備獲得了兩個適用于構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫的表達載體，利用PCR反應(yīng)獲得結(jié)核分枝桿菌的全部編碼基因，進而通過將結(jié)核分枝桿菌的全部編碼基因精確克隆到構(gòu)建的表達載體中，通過轉(zhuǎn)化大腸桿齒表達菌株BL21(DE3),最后得到結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫，對該文庫進行了初步應(yīng)用，證明該文庫可以有效地篩選到新型保護性抗原，從而完成了本發(fā)明。具體地本發(fā)明的技術(shù)方案如下一、構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫的組氨酸標(biāo)簽融合表達載體pETEXba步驟如下(1)將商購的載體pET28a上的T&I酶切位點消除，獲得一個中間載體pET28a-AX;(2)將步驟(l)獲得的中間載體pET28a-AX用限制性內(nèi)切酶yWel和i7;oI進行消化；(3)利用極端嗜熱古菌Sso7/atei^c"s的c^《2基因作為第一個媒介基因，通過PCR的方法從極端嗜熱古菌5!卵7/aten'^w基因組中擴增獲得末端含有A&I和i2wl酶切位點的Wc&媒介基因；(4)將步驟(3)獲得的媒介基因^fc必用限制性內(nèi)切酶/V&I和J力ol進行消化；(5)將步驟(2)的載體和步驟(4)的媒介基因在16'C連接過夜，得到第二個中間載體pET28a-62;(6)將步驟(5)獲得的第二個中間載體pET28a-62用限制性內(nèi)切酶和Aol進行消化；(7)利用極端嗜熱古菌SsW/ateric^的微型染色體維持基因MCM作為第二個媒介基因，通過PCR方法獲得末端含有^coRI和酶切位點的MCM媒介基因；(8)將步驟(7)獲得的MCM媒介基因用限制性內(nèi)切酶化oRI和勒ol進行消化；(9)將步驟(6)的載體和步驟(8)的媒介基因在16。C連接過夜，得到表達載體pETEXba,其大小為6526bp，該載體pETEXba的核苷酸序列如序列表SEQIDNO;1所示。它還包括一個適用于克隆結(jié)核分枝桿菌所用編碼基因的多克隆位點。在上述制備步驟中，步驟(3)中cofc^基因的擴增所用的弓l物對的序列如下正向引物14bEcoR-f:GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG,反向引物14bEcoR-r:ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAAACCT;步驟(7)中MCM基因擴增所用的引物對的序列如下正向引物TrgXcm-f:GAGCGAATTCGTTGGAMTTCCTAGTMAC,反向引物Xcm-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTMCAT。二、構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫的谷胱甘肽還原酶標(biāo)簽融合表達載體PGEXMCM步驟如下(1)利用極端嗜熱古菌S幼J/ataric"s的微型染色體維持基因MCM,作為改造載體的原始媒介基因，通過PCR的方法從極端嗜熱古菌Sw7/aten'c"s基因組中擴增獲得MCM媒介基因'將該媒介基因用充分酶切形成缺失844個堿基的片段，獲得末端含有&》RI和酶切位點的MCM媒介基因；(2)將商購的pTRG載體用限制性內(nèi)切酶和iMI進行消化；(3)將步驟(l)獲得的媒介基因和步驟(2)的載體在16。C連接過夜，得到中間載體pTRGMCM;(4)將商購的pGEX-4T-l載體用限制性內(nèi)切酶fe/ffl和I力o[進行消化；(5)將通過步驟(3)獲得的中間載體pTRGMCM用限制性內(nèi)切酶fe/dH和ZAoI進行消化；(6)將步驟(4)的載體和步驟(5)的1.2kb片段在16'C連接過夜，得到表達載體pGEXMCM，其大小為6190bp,該載體pGEXMCM的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。它還包括一個適用于克隆結(jié)核分枝桿菌所用編碼基因的多克隆位點。在上述制備步驟中步驟(1)中MCM基因擴增所用的引物對的序列如下正向引物Trgada-f:GAGCGMTTCGTTGGAAATTCCTAGTAMC,反向引物Ad即tor-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTMCAT。三、結(jié)核分枝桿菌表達文庫的構(gòu)建(1)根據(jù)GenBank提供的結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組核酸序列(登錄號NC000962),設(shè)計出了結(jié)核分枝桿菌基因組所有編碼基因的引物(見實施例l)，。通過PCR獲得結(jié)核分枝桿菌的所有編碼基因。設(shè)計引物時，根據(jù)基因內(nèi)部的酶切位點種類將結(jié)核分枝桿菌所有基因分為六類，前五類基因在上下游引物中分別引入fcoRI和J&I、AcoRI和Z力oI、AfetI和Z力aI、和J力ol、fezzffl和7力oI的酶切位點組合，并校正讀碼框，最后一類采用連接頭的方法在上游引入^:oRI酶切位點，在下游引入酶切位點。部分編碼基因的PCK結(jié)果見圖1。(2)將PCR得到的產(chǎn)物分別按照大小、酶切位點或功能進行分類混合，經(jīng)酶切消化后，與用相同方法酶切的表達載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，制備質(zhì)粒，即得到結(jié)核分枝桿菌的基因表達文庫混合質(zhì)粒。獲得的混合質(zhì)粒的電泳結(jié)果見圖6。四、結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的外源表達以及蛋白質(zhì)的純化將得到的表達文庫的混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株，'從轉(zhuǎn)化的平板上挑取單菌落分別進行誘導(dǎo)表達。按照《具體實施方式》中描述的方法進行變性條件下的蛋白質(zhì)純化。部分蛋白質(zhì)的表達及純化結(jié)果分別見圖7及圖8。五、抗原的初步大規(guī)模篩選按照《具體實施方式》中描述的方法對純化的蛋白質(zhì)進行大規(guī)模的抗原篩選?？乖暮Y選結(jié)果見表2。本發(fā)明的優(yōu)點是，操作成本低、高通量、覆蓋率高，并能夠全面鑒定到結(jié)核分枝桿菌基因組內(nèi)的所有抗原。本發(fā)明更詳細的技術(shù)方案參見《具體實施方式》。序列表SEQIDNO:l是本發(fā)明中表達載體pETEXba的核苷酸序列。序列表SEQIDNO:2是本發(fā)明中表達載體pGEXMCM的核苷酸序列。圖l:本發(fā)明技術(shù)路線圖；'圖2:是本發(fā)明實施例1列舉的部分結(jié)核分枝桿菌基因的PCR擴增結(jié)果的電泳圖譜。從左到右依次是yiV7鄉(xiāng)c、yWJi7c、WW息/r/JJ。、射孤、AW息7"鵬、射J鄰、yWJJ7、iWW《、iPW3激、^iV/3^、AV7J4/、《r/W么yK345'7v"必、AV7J47、iK"必、h"必、jPW35。。它們的大小依次是2.16kb、2.04kb、2.52kb、1.32kb、0.24kb、0.60kb、0.96kb、0.36kb、0.24kb、0.90kb、0.66kb、0.78kb、0.78kb、0.72kb、0,54kb、0.30kb、0.30kb、0.24kb、1.50kb、1.08kb、0.60kb、2.52kb、1.68kb、0.72kb;達載體pETEXba的構(gòu)建過程示意圖；圖4:本發(fā)明構(gòu)建的表達載體pETEXba的載體圖譜；圖5:是本發(fā)明構(gòu)建的表達載體pGEMCM的構(gòu)建過程示意圖；圖6:是本發(fā)明構(gòu)建的表達載體pGEXMCM的載體圖譜；圖7:結(jié)核分枝桿齒基因PCR產(chǎn)物混合庫克隆至pETEXba表達載體的電泳結(jié)果圖。從左到右樣品依次是DNAMarker、pETEXba-A、pETEXba-B、pETEXba-C、pETEXba-D、pETEXba-E、pETEXba-F、pETEXba-G。AG是指結(jié)核分枝桿菌編碼基因的PCR產(chǎn)物按照大小分成7組混合后的編號；圖8:舉例說明結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫部分蛋白質(zhì)的表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖。從左到右樣品編號依次是D284、D286、D288、D2恥、D291、D292、D293、D333、D363、D385;圖9:舉例說明結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫部分蛋白質(zhì)的純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖。從左到右樣品編號依次是D291、D293、D367、D334、D336、D363、D37Q、D379、D380、D390。具體實施例方式實施例l:結(jié)核分枝桿菌基因的PCR擴增以結(jié)核分枝桿菌H37Rv總基因組(登錄號NC000962)DNA為模板，用根據(jù)GenBank提供的結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組核酸序列設(shè)計的引物擴增結(jié)核分枝桿菌的基因組編碼基因。結(jié)核分枝桿菌編碼基因的引物設(shè)計方法根據(jù)編碼基因內(nèi)部的酶切位點，選擇基因內(nèi)部沒有的酶切位點組合(&oRI和Z&I、&<^1和/1%01、他rt和JSal、船fl和乃ol、及Mfll和i7o1),從編碼基因的前后各取20bp設(shè)計引物，并通過末端保護堿基的改變調(diào)整上下游引物的GC含量達到一致，具體引物舉例如下(以24對引物對為例)R1325cf:ATATGCGGCCGCAATGTCGTTTGTAATCGCCG，R1325cr:GCGCATCTAGAATCTACGACMCCCGGGTGAT;R1326cf:TAGAGCGGCCGCTATGAGTCGATCCGAGAMCT，R1326cr:TATATCTCGAGTACTAGGCGGGCGTCAGCCACA;R1327cf:AGTCGGATCCGTGAGTGGCCGGGCAATCGG，R1327cr:AGTCCTCGAGTCACCTCCTGCGCAGCAGCG;R1328f:AGTCGMTTCTAGTGAAAGCCCTTCGCCGGTT，R1328r:TATATATCTAGATCAGGCCAGGGTGACCAGGC;R1330cf:TATAGGATCCGTGGGGCCACCCCCAGCCGC，R1330cr:CGTCCTCGAGTCAGGCCGGGATCGTGCGTG;R1331f:AGTCGAATTCTAATGGCTGTTGTGTCAGCGCC，K1331r:TCTATATCTAGATCACCGGTCCTGCTGCATCG;R1332f:ATATGAATTCATATGCCGCCGGTTTGTGGGCG，R1332r:GCGTATTCTAGATCATCGAGACCCCATCAGCA;R1333f:CGTCGAATTCTAATGAACTCCATCACCGACGT，R1333r:TATATATCTAGATCAGGACCCGAATGCTCCGG;.R1334f:AGTCGAATTCTAGTGTTGCTTAGGAMGGMC，R1334r:TCTATATCTAGATCAGTACTGCTCGACGACAT;R1335f:GCGCGAATTCGCATGMCGTCACCGTATCCAT，R1335r:TATATATCTAGATCACCCACCGGCCACGGCGG;R1336f:AGTCGAATTCTAATGACACGATACGACTCGCT，7R1336r:TAGCTATCTAGATCATGCCCATAGTTGCCCTT;R1337f:TATAGAATTCTAATGGGCATGACCCCGCGCCG,R1337r:GCTAGCTCTAGATCATAACTTCGGATGCCCGG;R1338f:TATAGCGGCCGCTATGAATTCGCCGTTGGCGCC,R1338r:GCGCGTCTAGAGCCTAATGMTGCGCGATGGGT,R1339f:AGTCGAATTCGCATGCGTCGATGTATTCCGCA,R1339r:TATATATCTAGACTAGCCGGCTCGCCGGACTT:R1340f:TATAGCGGCCGCTGTGTCCMGCGAGAAGACGG,R1340r:GCTGCTCTAGAGCTCAGGTGCC嵐CGCCTTCG;R1341f:AGTCGMTTCTAGTGGCGCTTGTGACCAAGCT,R1341r:TCTATATCTAGATTAGCCTGTCGCCAGGGAGC;R1342cf:AGTCGAATTCTAATGACCGCACCCGAAACGCC，R1342cr:TAGCTATCTAGACTAAAGCCCGMGCGGGCCT;R1343cf:TATAGMTTCTAGTGTCCACTACCCGCCGTCG,R1343cr:TGCTGATCTAGATCATGCGGTGGTCCTGTTCT;R1344f:ATATGAATTCAGATGTGGCGATATCCACTMG,R1344r:ATATATTCTAGATCACTCATCGCGGTATTTGG;R1345f:ATATGAATTCATATGAGTGAGCTCGCGGCCGT,R1345r:ATATATTCTAGATCAGTCCGCCATCTCCAGGG;R1346f:ATATGMTTCATATGACGGCCGGCTCCGACCT,R1346r:AGCGATTCTAGACTACGCTTTGGAAGCTCCGA:R1347cf:AGTCGMTTCTAATGACCMACCCACATCCGC,R1347cr:TATATATCTAGATTACGCAGCCGTGGTCGGAG;R1348f:AGTCGMTTCTAATGGCACGCGGGTTGCAGGG,K1348r:TAGCTATCTAGATCATCGGGTGCCGTCCTGCG;R1349f:AGTCGAATTCTAATGATCCGCACCTGGATAGC，R1349r:TCTATATCTAGATTACTCGGCGAGGATCTGCC;R1350f:GAATGMTTCTTATGGCGTCATTGCTGAACGC，R1350r:ATATATTCTAGATCATATGAACCGGCCGCCAG。對應(yīng)基因的PCR結(jié)果參見圖2。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表1和表2:表lPCR反應(yīng)體系反應(yīng)組分體積(Hi)H37Rv基因組DNA2引物22XGCBuffer252.5mM譜Ps8d孤O13'Taq酶0.3總體積508表2PCR反應(yīng)條件反應(yīng)步驟時間循環(huán)次數(shù)96。C5min1鄰。Clmin6crclmin3072。C3min72°C8min1實施例2:表達載體pETEXba的改造(1)通過末端補齊修飾的方法(具體方法參見Takara公司T4DMPolymerase使用方法)將商購的pET28a(購自Novagen公司)載體上的ZfeI酶切位點消除，獲得一個中間載體，命名為pET28a-AX;(2)將步驟(1)獲得的中間載體pET28a-AX用限制性內(nèi)切酶Atfel和.ftoI進行消化；(3)利用極端嗜熱古菌Ssolfafar/c"s的cc/c必基因(GenebankID:1455035)作為改造載體的第一個媒介基因。通過PCR的方法極端嗜熱古菌Xso2/^an'CT^基因組中擴增(正向引物14bEcoR-f:GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG，反向引物14bEcoR-r:ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAMCCT,下劃線為酶切位點)從獲得末端含有Atfel和Wol酶切位點的cA股基因片段；(4)將步驟(3)獲得的媒介基因片段cofc&用限制性內(nèi)切酶M/el和進行消化；(5)將通過步驟(2)和步驟(4)獲得的載體和媒介基因在16'C進行連接過夜，得到中間載體，命名為pET28a-62;(6)將步驟(5)獲得的中間載體pET28a-62用限制性內(nèi)切酶fcoRI和Z力ot進行消化；(7)利用極端嗜熱古菌5!so7/ater/c"s的微型染色體維持基因(mini-chromosomemaintenance-likegene,MCM，GenebankID:1455038)作為改造載體的第二個媒介基因。通過PCR的方法(正向引物TrgXcm-f:GAGCGMTTCGTTGGMATTCCTAGTAMC，反向引物Xcm-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTMCAT，下劃線為酶切位點)以在實施例3步驟(1)中獲得的MCM媒介基因為模板擴增獲得末端含有fcoRI和酶切位點的MCM媒介基因；(8)將步驟(7)獲得的MCM媒介基因用限制性內(nèi)切酶&oRI和通o[進行消化；(9)將通過步驟(8)和步驟(6)獲得的媒介基因和載體在16'C進行連接過夜，得到改造成功的表達載體，命名為pETEXba(載體圖譜見圖3)，其大小為6526bp。實施例3:pGEX-4T-l表達載體的改造(1)利用極端嗜熱古菌Sso/atar化os的微型染色體維持基因(mini-chromosomemaintenance-likegene,MCM，GenebankID:1455038)作為改造載體的原始媒介基因。通過PCR(正向引物Trgada-f:GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAMC，反向弓l物Adaptor-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTMCAT,下劃線為酶切位點)的方法從極端嗜熱古菌sW/aterio/5基因組中擴增獲得2.0kb的MCM基因。由于在MCM內(nèi)部存在兩個限制性內(nèi)切酶識別位點，將該片段經(jīng)充分酶切形成缺失844個堿基的片段。隨后將該片段經(jīng)末端補齊修飾方法(具體方法參見Takara公司T4DNAPolymerase使用方法)處理形成末端含有￡coRI和Z/wI酶切位點，大小為1.2kb的MCM媒介基因；(2)將商購的pTRG載體(購自Stratagene公司)用限制性內(nèi)切酶&oRI和v仿ol進行消化；(3)將通過步驟(1)獲得的片段與步驟'(2)獲得的載體在16'C進行連接過夜'得到中間載體，命名為pTRGMCM;9(4)將商購的pGEX-4T-l載體(購自上海捷瑞生物工程有限公司)用限制性內(nèi)切酶Aa/zfll和J力ol進行消化；(5)將通過步驟(3)獲得的中間載體用限制性內(nèi)切酶feMII和J力ol進行消化；(6)將通過步驟(4)和步驟(5)獲得的載體和片段在16'C進行連接過夜，得到改造成功的表達載體，命名為pGEXMCM(載體圖譜見圖5)，其大小為6190bp。實施例4:將結(jié)核分枝桿菌'編碼基因的PCR產(chǎn)物克隆至改造的表達載體(1)結(jié)核分枝桿菌編碼基因PCR產(chǎn)物的混合根據(jù)結(jié)核分枝桿菌編碼基因的大小以及酶切位點的組合方式進行分類，獲得AG7組(每組又包含按照不同酶切位點進行組合的小組)基因大小不同的PCR混合物；(2)將通過步驟(1)獲得的PCR混合物分別經(jīng)對應(yīng)限制性內(nèi)切酶消化；(3)將通過實施例2和實施例3獲得的表達載體分別用于PCR混合物對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切消化；(4)將通過步驟(2)獲得的PCR混合物酶切產(chǎn)物和步驟(3)獲得的載體在16。C進行連接過夜；連接反應(yīng)的體系見表3:表3連接反應(yīng)的體系反應(yīng)組分體積(nl)載體2PCR混合物2連接酶緩沖液0.5連接酶0.5(5)將通過步驟(4)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a(購自上海超研生物科技有限公司)；(6)分別將得到的轉(zhuǎn)化子接種至LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，制備質(zhì)粒，即得到結(jié)核分枝桿菌的基因表達文庫混合質(zhì)粒?；旌腺|(zhì)粒的電泳圖譜詳見圖4。實施例5:蛋白質(zhì)的小量誘導(dǎo)表達本實施例中使用的通用LB培養(yǎng)基和附加的抗生素卡那霉素(見具體步驟所示)配方參見J.薩姆布魯克，ER弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002年。(1)將通過實施例3獲得的表達文庫的混合質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL2纟(DE3)菌株(購自上海超研生物科技有限公司〉，使其轉(zhuǎn)化子數(shù)目達到所含基因數(shù)目的3倍左右；(2)從步驟(1)轉(zhuǎn)化得到的平板上挑取單菌落接入lml含有卡那霉素(30ng/ml)的LB培養(yǎng)基中。于37'C搖床培養(yǎng)過夜；'(3)向步驟(2)獲得的過夜培養(yǎng)物中加入lml含有卡那霉素(30ug/ml)以及IPTG(異丙基-e-D-硫代半乳糖苷，終濃度1.OmM)的LB培養(yǎng)基。于37'C搖床繼續(xù)培養(yǎng)12個小時；(4)將通過步驟(3)獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，12000轉(zhuǎn)每分鐘離心1分鐘收集菌體'倒去上清，將菌體于一20。C保存。剩余培養(yǎng)物作為菌種保存于一20'C;(5)部分結(jié)核分枝桿菌編碼基因的誘導(dǎo)表達結(jié)果詳見圖5。實施例6:蛋白質(zhì)的變性純化本實施例中使用的緩沖液B、C和E配方參見下表l_表4實施例5中使用的緩沖液B、C和E的組分及其配比_緩沖液_^_磷酸二氫鈉.Tris-Cl_PHBufferB柳.0.1M0.01M__§^_BufferC8M0.1M0.01M6.3BufferE__2J^J_0,01M_￡^_(1)向在實施例4中收集的菌體中加入lmlBufferB,于37'C搖床孵育過夜，使菌體裂解；(2)將步驟(1)裂解后的菌體于4'C，16000轉(zhuǎn)/分鐘離心1小時，將上清取出到1.5ml離心管；(3)取20u1鎳親和層析膠珠(購自GE公司)到一個1.5ml離心管，加入lml磷酸緩沖液(PBS，配方參見上述《分子克隆技術(shù)實驗指南》，2002年，科學(xué)出版社，pH7.4),輕柔混勻，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，小心吸出上清，重復(fù)二次；(4)向步驟(3)的膠珠里加入O.5ml50mMNiSO"輕柔混勻，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，小心吸出上清；(5)向步驟(4)的膠珠里加入lmlPBS，輕柔混勻，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，小心吸出上清，重復(fù)三次；(6)向步驟(5)的膠珠里加入lralBufferB，輕柔混勻，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，小心吸出上清；(7)將步驟(2)獲得的上清與步驟(6)獲得的膠珠在一個1.5ml離心管中室溫混勻1小時，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，小心吸出上清；(8)向步驟(7)的膠珠里加入lmlBufferC，輕柔混勻，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，小心吸出上清；(9)向步驟(8)的膠珠里加入50ulBufferE,輕柔混勻，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，小心吸出上清；(10)通過步驟9獲得的上清中即包含結(jié)核分枝桿菌編碼基因的表達產(chǎn)物，經(jīng)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測純化的結(jié)果。部分結(jié)核分枝桿菌編碼基因表達產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見圖6。實施例7:間接ELISA檢測結(jié)核分枝桿菌編碼基因表達產(chǎn)物的免疫原性本實施例中使用的緩沖液配方如下包被液0.05M、p朋.6的碳酸鹽緩沖液(Na2C03:1.59g;NaHC03:2.93g;用蒸餾水定容到1L);洗滌液含0.05%吐溫-20的PBS溶液(PBS配方參見《分子克隆技術(shù)操作指南》)；封閉液含5%脫脂牛奶的洗滌液；終止液2MH2S04;具體實施步驟(l)包被用包被液將通過實施例5純化得到的蛋白質(zhì)溶液稀釋50倍，用微量移液器吸取稀釋好的樣品加入ELISA板內(nèi)'，每孔100ul，4'C過夜;根據(jù)己有文獻報道(RosenkrandsIetal.IdentificationofjPK您i^froinRD4asanovelserodiagnostictargetfortuberculosis.7i;6e_ra//as/s，2008,88,335-343)包被結(jié)核分枝桿菌編碼基因iV^2W的表達產(chǎn)物作為間接法ELISA的正對照。包被樣品順序如表5所示'表5包被樣品順序設(shè)計<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(2)洗滌次日從4。C取出步驟(1)的ELISA板，甩干內(nèi)容物，向孔內(nèi)加入洗滌液'每孔200ul，靜置3分鐘，甩干，再加洗滌液，如此泡洗三次，最后一次甩干后'將ELISA板朝下放在濾紙上反復(fù)拍打干凈；(3)封閉向步驟(2)的ELISA板中加入封閉液，每孔200yl，37。C溫育30min。(4)洗滌同步驟(2)的方法；(5)加入一抗反應(yīng)向步驟(4)的ELISA板中加入結(jié)核病人血清(湖北省武漢市結(jié)核病防治所惠贈)稀釋液，每孔100ul，37。C溫育30rain;(6)洗滌同步驟(2)的方法；(7)加入二抗反應(yīng)向步驟(6)的ELISA板中加入二抗(購自武漢意德生物技術(shù)有限公司)稀釋液，每孑LlOOul，37。C溫育30min;(8)洗滌同步驟(2)的方法；(9)顯色向步驟(8)的ELISA板中加入TMB底物顯色(購自武漢意德生物技術(shù)有限公司)，每孔100ul，避光30min;.(10)終止反應(yīng)向步驟(9)的ELISA板中加入終止液終止顯色反應(yīng)；(11)結(jié)果讀取利用酶標(biāo)儀讀取0045。的值。ELISA結(jié)果(0D45。)如表6所示表6ELISA檢測結(jié)果(OD柳)123456789101112A0.700.820.630.670.680.390.570.610.660.380.540.62B0.550.830.490.900.850.610.520.530.650.310.690.32C0.730.420.410.460.300.330.360.360.370.320.120.94根據(jù)上表的結(jié)果，挑選出OD咖〉0.65的蛋白質(zhì)的對應(yīng)菌體進行測序(由INVITROGEN公司完成)，根據(jù)測序結(jié)果對結(jié)核分枝桿菌基因組序列進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)這些基因分別屬于表7所述的基因表7ELISA檢測結(jié)果0D45。>0.65的樣品號及其對應(yīng)的基因號樣品號基因號樣品號基因號樣品號基肉號樣品號基因號樣品號基因號El新抗原E2E4新抗原E5附娜E9新抗原E14新抗原E16歸IE17M鄉(xiāng)E23新抗原E25M微在這些基因中/Wi"i^(RosenkrandsIetal.Identificationof/PkA2^2fromRD4asanovelserodiagnostictargetfortuberculosis.7i;力ercw7o57.s,2008,88，335-343)、j^k。做(MalenH,SoftelandT，WikerHG.Antigenanalysisof妙co》acferj'咖f"Z)arcu7os7's1H37Rvculturefiltrateproteins.6"ca/^/i"孤肌/707,2008，67:245—252.)、yWA4(MalenH，SoftelandT，WikerHG.Antigenanalysisof妙c0Z7a"eri鵬勵erctJcisis1H37Rvculturefiltrateproteins.5caW//鵬""o/,2008,67:245-252.)、/PW675c(SiddersBetal.Screeningofhighlyexpressedmycobacterialge加sidentifiesRv3615casausefuldifferentialdiagnosticantigenfortheMycobacteriumtuberculosiscomplex,i/2/ec"/鵬叫2008，76:3932-9.)以及yi^75"(Buddle，B.M.etal.DifferentiationbetweenJZ/coAscter/iw6oyisBCG—vaccinatedand力01a'5^infectedcattlebyusingrecombinantmycobacterialantigens.,ZVagT.i/z朋朋o7，1999，6:1-5.)均是已有文獻報道的結(jié)核分枝桿菌抗原。本實施例不僅成功鑒定到以上5個已經(jīng)報道的結(jié)核分枝桿菌抗原，另外還成功的鑒定和篩選到5個新型的候選抗原(即表7中標(biāo)注的"新抗原")。這5個候選抗原均能夠與結(jié)核發(fā)病人血清發(fā)生強烈反應(yīng)，有些甚至比現(xiàn)有的用于診斷結(jié)核病的抗原信號還要強烈，在結(jié)核病的血清學(xué)診斷中具有潛在的應(yīng)用價值。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>ttccaagaattctcatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgat1440ggitggctgctgcccatggtatatctccttcttsaagtt犯acaaaattatttct卿ggg1500g犯ttgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcggg3tcg卿1560tctcgatcctctacgccggEtcgcatcgtggccggcatcacCggCgCC3C3ggtgcggttg1620ctggcgcctatatcgccgac3tC8CCg3tgggg3卿tcgggctcgccacttcgggctca1680tgagcgcttgtttcggcgtgggta^tggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcg1740ccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactac1800tgggctgcttg3gtcgcaJ:33ggg卿gCgtcgagatcccggacaccatc1860gaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgstagcgcccgg卿卿g,tcaattcagg1920gtggtg犯tgtga犯ccagtaacgttetacgatfetcgcagagta_tgccggtgtctcttat1980cagaccgtttcccgcgtggtg犯ccaggccagccacgtttctgcgseia^c2040gtgg鄉(xiāng)cggcgeitggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcaca3C犯CtggCg2100ggc朋acagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcg2160caaattgtcgcggcgatt朋atctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcg2220atggtag3acg卿cggcgtcgaagcctgt犯鄉(xiāng)ggcggtgcacaatcttctcgcgc犯2280cgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtgg肌2340gctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacaxxcal:caac2400agtattattttctcccatga卿cggtacgcgactgggcgtgg3gC3tCtggtcgcattg2460ggtcaccagcaaMcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgt2520ctggctggctggcat肌atatctcactcgcaatcaaattc3gCCg3t3gCgg犯cggg犯2580ggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgc犯3tgCtg犯,tgagggcatc2640gttcccactgcgatgctggttgccaacgatC3g3tggCgCtgggcgc犯tgcgcgccatt2700accgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataxxgaa2760gacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaac8gg3"tt"ttCgcctgctgggg2820caaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtg33gggcaatcag2880ctgttgcccgtctcactggtgaaaagaa犯accaccctggcgcccaatacgcaaaccgcc2940tctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaa3000柳gggcagtgagcgc^cgc^ttaatgtaagttagctcactcattaggC3CCggg3tC3060tcgaccgatgcccttgagagccttc犯cccagtcagctccttccggtgggcgcggggcat3120gactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgcc3180ggcagcgctctgggtcattttCggCg3gg3ccgctttcgctggagcgcgacgatgstcgg3240cctgtcgcttgcggtattcgg犯tcttgcaicgccctcgctcaagccttcgtcactggtcc3300cgtttcggcgcattatcgccggCEltggCgg.ccccacgggt3360gC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TCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體pETEXba，其特征在于，它還包括一個適用于克隆結(jié)核分枝桿菌所用編碼基因的多克隆位點。3、一種用于構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫的谷胱甘肽還原酶標(biāo)簽融合表達載體pGEXMCM，其特征在于，它是通過如下步驟獲得的1)利用極端嗜熱古菌S.的微型染色體維持基因MCM，作為改造載體的原始媒介基因，通過PCR的方法從極端嗜熱古菌S基因組中擴增獲得MCM媒介基因，將該媒介基因用SflwHI充分酶切形成缺失844個堿基的片段，獲得末端含有^oRI和J^ol酶切位點的MCM媒介基因；2)將商購的pTRG載體用限制性內(nèi)切酶￡c0RI和Wol進行消化；3)將步驟l)獲得的媒介基因和步驟2)的載體在16'C連接過夜，得到中間載體pTRGMCM;4)將商購的pGEX-4T-l載體用限制性內(nèi)切酶5owHI和屈ol進行消化；5)將通過步驟3)獲得的中間載體pTRGMCM用限制性內(nèi)切酶5fl附HI和^oI進行消化；6)將步驟4)的載體和步驟5)的1.2kb片段在16'C連接過夜，得到表達載體pGEXMCM，其大小為6190bp，該載體pGEXMCM的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示；其中，步驟l)中MCM基因擴增所用的引物對的序列如下正向引物Trgada-f:GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC，反向引物Adaptor-r:GGATGGCTCGAGTCTAGACTAGACTTTTTTGTAACAT。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達載體pGEXMCM，其特征在于，它還包括一個適用于克隆結(jié)核分枝桿菌所用編碼基因的多克隆位點。5、一種構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫的方法，其特征在于如下步驟1)利用PCR反應(yīng)獲得結(jié)核分枝桿菌的全部編碼基因；2)將步驟1)所述的結(jié)核分枝桿菌的全部編碼基因精確克隆到權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，得到結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫。全文摘要本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫的構(gòu)建方法及應(yīng)用。發(fā)明的特征是，制備獲得了兩個適用于構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫的表達載體pETEXba和pGEXMCM，利用PCR反應(yīng)獲得結(jié)核分枝桿菌的全部編碼基因，進而通過將結(jié)核分枝桿菌的全部編碼基因精確克隆到構(gòu)建的表達載體中，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，最后得到結(jié)核分枝桿菌基因表達文庫。對該文庫進行了初步應(yīng)用，證明該文庫可以有效地篩選到新型保護性抗原。所構(gòu)建的表達載體pETEXba和pGEXMCM的核苷酸序列如SEQIDNO1和SEQIDNO2所述。本發(fā)明的方法成本低、高通量、覆蓋率高?？捎糜谛滦捅Ｗo性抗原及藥物靶標(biāo)的篩選。文檔編號C12N15/70GK101487018SQ20091006095公開日2009年7月22日申請日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日發(fā)明者何正國,李雨慶申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)