專利名稱：：與玉米葉片保綠性主效qtl緊密連鎖的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及玉米育種領(lǐng)域，尤其涉及一種玉米保綠性分子標(biāo)記，更具體的是涉及一種與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其在玉米育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：玉米(Z^wa;^L.)是世界上重要的糧食和詞料作物，栽培面積僅次于小麥(7>/"cmwaeW/vwmL.)禾口水稻(0_yzasa"vaL.)。近年來(lái)由于禾中質(zhì)資源匱乏，玉米生產(chǎn)出現(xiàn)徘徊，在產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性育種上進(jìn)展緩慢，育種家一直致力于優(yōu)異基因資源的發(fā)掘和利用，以求在玉米種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育上取得突破。衰老是植物生長(zhǎng)發(fā)育的最后階段，其典型特征是葉綠素降解和光合能力降低，作物成熟前衰老將直接導(dǎo)致產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降。保綠性指保綠植物生長(zhǎng)后期葉片衰老或黃化延緩而保持綠色的特性，被認(rèn)為是作物的理想農(nóng)藝性狀(TheorApplGenet，1987，73，551—555;AnnApplBiol，1993，123，193—129;JExpBot.,2000，51，329—337;TheorApplGenet,2000，101，733-741;Haussmannetal，2002，106，133—142)。研究認(rèn)為，保綠型玉米品種是當(dāng)今最有價(jià)值的玉米品種，代表了玉米品種演進(jìn)白勺方向(InGeneticcontributiontoyieldgainsoffivemajorcropplants(CSSAspecialpublication7).EDWRFehr.Madison:CropScieceScietyofAmerica.，1984，15—47;CerealResearchCommunications,1998，26，161—167;CropScience,1991，31，47—248)。因此，玉米葉片保綠性是與產(chǎn)量、飼用品質(zhì)、抗性具有最為永久和直接聯(lián)系的重要性狀，高產(chǎn)、多抗、適應(yīng)性廣是玉米育種的主攻方向，保綠性狀是當(dāng)前玉米超級(jí)育種的重要指標(biāo)。然而，保綠性狀是一個(gè)比較復(fù)雜的性狀，受多個(gè)基因控制，并與環(huán)境存在互作，使得用傳統(tǒng)方法選育具保綠性狀的品種進(jìn)展緩慢。近幾年發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，有效地解決了著這一問(wèn)題，通過(guò)構(gòu)建重要抗源的遺傳圖譜和數(shù)量性狀位點(diǎn)(QuantitativeTratitLoci，QTL)分析，可以找到與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖(或共分離)的分子標(biāo)記。使用與葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以對(duì)種質(zhì)材料在苗期進(jìn)行早代篩選，克服環(huán)境影響，淘汰保綠差的植株，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高育種和選擇效率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種與玉米葉片保綠性主效.QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記。通過(guò)QTL分析發(fā)現(xiàn)，在連鎖群2上分別在標(biāo)記umcl845和umcl026之間，以及umcl026和umcl541之間各存在一個(gè)保綠性QTL位點(diǎn)。進(jìn)一步分析表明umcl026與玉米主效葉片保綠性QTL相連鎖，能夠用于種質(zhì)材料葉片保綠性預(yù)測(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種分子標(biāo)記，應(yīng)用于玉米保綠性鑒定。該分子標(biāo)記與玉米葉片保綠性緊密連鎖，即該分子標(biāo)記的有無(wú)直接關(guān)系到該植株保綠性的強(qiáng)弱。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種分子標(biāo)記，應(yīng)用于在玉米的育種和資源鑒定。該分子標(biāo)記與玉米葉片保綠性緊密連鎖，即該分子標(biāo)記的有無(wú)直接關(guān)系到該植株保綠性的強(qiáng)弱。在對(duì)玉米葉片的保綠性的早期預(yù)測(cè)和篩選當(dāng)中，該分子標(biāo)記能克服環(huán)境影響，對(duì)種質(zhì)材料的苗期實(shí)現(xiàn)早代篩選，淘汰保綠差的植株，提高育種和選擇效率。一種與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，以5，-TCGTCGTCTCCAATCATACGTG-3'(SEQIDNo:l)和5'-GCTACACGATACCATGGCGTTT-3'(SEQIDNo:2)為引物對(duì)，提取的玉米總DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)擴(kuò)增后得到的長(zhǎng)度為230bp的DNA片段。其步驟如下1.玉米總DNA的提取在玉米67葉時(shí)剪取2片幼嫩葉片(去除中脈)剪碎后混合用于總DNA的提取。采用CTAB法提取總DNA，步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)NucleicAcidsRes,1980，8，4321禾卩Genetics,1994，138，1251—1274。42.PCR擴(kuò)增，3.變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，4.銀染程序。一種獲得與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記的方法如下(1)玉米保綠性F2分離群體和F2:3性狀鑒定群體的構(gòu)建及保綠性鑒定選用葉片保綠性強(qiáng)的玉米自交系齊319為親本1(P,)與保綠性較差的玉米自交系Mol7為親本2(P2)進(jìn)行雜交，得到雜交一代雜種(F,)。由雜種一代F,自交獲得雜交二代(F2)分離群體，F(xiàn)2分離群體單株自交授粉獲得雜種三代家系(F2:3)的性狀鑒定家系。當(dāng)年夏季在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米園(36°16'N，H7。9'E，海拔128m)種植P"P2、Fi和F2，其中F2群體種植500株，隨機(jī)選取350株。當(dāng)植株生長(zhǎng)至67葉時(shí)剪取P,、P2、Ft和350個(gè)F2單株的2片幼嫩葉片提取總DNA。提取總DNA的350個(gè)F2單株開(kāi)花期套袋單株自交，配制F2:3家系。提取總DNA的具體方法為CTAB法，步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)NucleicAcidsRes,1980，8，4321禾nGenetics,1994,138，1251—1274。次年夏季在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米園(36°16'N，117°9'E，海拔128m)種植P,、P2和166個(gè)有足夠量種子的Fw家系。種植采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，具體為單行區(qū)，行距0.70米，行長(zhǎng)4米，每行15株，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)。田間管理常規(guī)操作保證各處理栽培條件的一致性。在開(kāi)花期和成熟期鑒定葉片保綠性。保綠性大小用保綠度表示，即相對(duì)綠葉面積，相對(duì)綠葉面積=(成熟期植株綠葉面積/開(kāi)花期最大葉面積)x100%(CerealResearchCommunications,1998，26，161—167;TheorApplGenet"2002，106，133—142)。在Fw家系每個(gè)鑒定小區(qū)中間隨機(jī)選取5個(gè)單株掛牌標(biāo)記，成熟期調(diào)査不同家系每個(gè)掛牌單株的綠葉面積，即成熟期葉面積-長(zhǎng)x寬x0.75，以每個(gè)小區(qū)平均值計(jì)算每個(gè)家系的葉片保綠度，即成熟期綠葉面積與開(kāi)花期綠葉面積的比值(TheorApplGenet.，2002，106，133—142)。(2)分子標(biāo)記分析，遺傳圖譜構(gòu)建及QTL分析選取在兩個(gè)親本間具有擴(kuò)增多態(tài)性的引物組合，對(duì)166個(gè)F2:3家系保綠性狀進(jìn)行分析。分離F2群體的每個(gè)單株玉米葉片的總DNA，采用微衛(wèi)星(Simplesequencer印eat，SSR)分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6g/100ml聚丙烯酰胺凝膠上離后，獲得分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)，將獲得的多態(tài)性數(shù)據(jù)采用軟件MAPMAKER/EXP3.0(Lincolnetal，WhiteheadInstituteTechnicalReport,WhiteheadInstitute,Cambridge,Massachusetts,USA,1992)，設(shè)定LOD^3.0，選擇Kosambi函數(shù)構(gòu)建S06的遺傳連鎖圖譜。綜合遺傳圖譜數(shù)據(jù)和保綠性鑒定資料(參見(jiàn)步驟(1))，先采用WinCartQTL2.5進(jìn)行(Wangetal，DepartmentofStatistics,NorthCarolinaStateUniversity,Raleigh,NC.2007,http:〃www.statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)，分析QTL，再利用復(fù)合區(qū)間作圖(CompositeIntervalMapping,CIM)方式進(jìn)行判斷(LOD閥值設(shè)定為2.5)。當(dāng)LOD大于2,5時(shí)，說(shuō)明該區(qū)間存在一個(gè)QTL連鎖位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)復(fù)合區(qū)間作圖(CompositeIntervalMapping,CIM)分析發(fā)現(xiàn)在連鎖群2的umcl026標(biāo)記，艮卩5，-TCGTCGTCTCCAATCATACGTG-3，和5,-GCTACACGATACCATGGCGTTT-3,弓l物對(duì)與齊319的主效葉片保綠性QTL相連鎖，并可用于種質(zhì)材料葉片保綠性預(yù)測(cè)。本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果本發(fā)明通過(guò)SSR分子標(biāo)記和QTL分析，在連鎖群2上分別在標(biāo)記umcl845和umcl026之間，以及umcl026和umcl541之間各存在一個(gè)保綠性QTL位點(diǎn)。進(jìn)一步分析表明umcl026，即5'-TCGTCGTCTCCAATCATACGTG-3,禾tl5,-GCTACACGATACCATGGCGTTT-3,引物對(duì)，與玉米主效葉片保綠性QTL相連鎖，即該分子標(biāo)記的有無(wú)直接關(guān)系到該植株保綠性的強(qiáng)弱，能夠用于種質(zhì)材料葉片保綠性預(yù)測(cè)或鑒定。以此引物對(duì)對(duì)玉米總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用凝膠電泳分離得到長(zhǎng)度為230bp的條帶。該分子標(biāo)記與玉米葉片保綠性緊密連鎖，即該分子標(biāo)記的有無(wú)直接關(guān)系到該植株保綠性的強(qiáng)弱。在玉米的育種和資源鑒定或?qū)τ衩兹~片的保綠性的早期預(yù)測(cè)和篩選當(dāng)中，該分子標(biāo)記能克服環(huán)境影6響，對(duì)種質(zhì)材料的苗期實(shí)現(xiàn)早代篩選，淘汰保綠差的植株，提高育種和選擇效率。將其應(yīng)用于玉米保綠性鑒定當(dāng)中，能對(duì)不同種質(zhì)材料葉片的保綠性進(jìn)行預(yù)測(cè)。本發(fā)明所述植物的自交系來(lái)源如下所述的"齊319"是從美國(guó)先鋒公司玉米雜交種78599中多代自交選育而成，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院20世紀(jì)90年代選育的保綠性強(qiáng)、配合力高、抗倒性強(qiáng)和綜合性狀優(yōu)良的玉米自交系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所。所述的"Mol7"是20世紀(jì)70年代從美國(guó)引進(jìn)后曾被我國(guó)廣泛應(yīng)用、保綠性較差的玉米自交系，是從187-2xl03雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所。所述的"8112"是從美國(guó)商品玉米中分離選育而成。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于山東省萊州市農(nóng)科所。所述的"黃早4"是"塘四平頭"自交系繁殖田中選擇。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所與北京市農(nóng)林科學(xué)院作物研究所。所述的"掖502"是從340x黃早4雜交材料中選育而成。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于山東省萊州市西由種子公司。所述的"埃原311"是從埃及205x原武02雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于北京農(nóng)學(xué)院。所述的"吉853"是從(黃早4x自330)x黃早4雜交材料中選育而成。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所。所述的"掖488"是從8112x5003雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于山東省萊州市玉米研究所。所述的"沈137"是從美國(guó)種質(zhì)6JK1118中選育而成。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。所述的"掖478"是從8112x5003雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于山東省萊州巿玉米研究所。所述的"3195"是從丹340x旅九寬雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種業(yè)有限公司。所述的"昌7-2"是昌單7號(hào)(V59x黃早4)中選育成的二環(huán)系，再導(dǎo)入亞熱帶玉米種質(zhì)S901(SWANI選系)。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于河南省高科種業(yè)有限公司。所述的"178"是從美國(guó)先鋒公司玉米雜交種78599中多代自交選育而成。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)。所述的"BM"是從230BxMol7雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。所述的"齊205"是從S3xPo70雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所。所述的"E28"是以A619Ht為抗源與旅9寬雜交，用旅9寬回交三代，連續(xù)自交二代選育而成。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于丹東市農(nóng)科院。所述的"武314"是從黃早4x(武302Dx黃爆裂)雜交材料中選育而成。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于陜西高效農(nóng)業(yè)研究所。所述的"B73"是美國(guó)種質(zhì)，從BSSS中選育而成。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)。所述的"H21"是從黃早4xH84雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院。所述的"吉846"是從吉63xMol7雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所。所述的"文黃31413"是從黃早4x文青1331雜交后代中選出的二環(huán)系。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。所述的"鄭32"是從美國(guó)單交種3382中經(jīng)單株選優(yōu)，連續(xù)自交育成。本發(fā)明當(dāng)中所用的該自交系來(lái)自于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。圖1為齊319玉米自交系連鎖群2及其QTL位置圖，其中，圖左側(cè)為標(biāo)記距離(單位厘摩)；右側(cè)為標(biāo)記名稱。8具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說(shuō)明，均購(gòu)自西格瑪一奧德里奇(Sigma—Aldrich)公司。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒(méi)有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科學(xué)出版社，1994)。該書及其后續(xù)出版版本是本領(lǐng)域技術(shù)人員在進(jìn)行與分子生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作時(shí)最常用的具有指導(dǎo)性的參考書籍。實(shí)施例1分子標(biāo)記的確定(1)玉米保綠性F2分離群體和F2:3性狀鑒定群體的構(gòu)建及保綠性鑒定選用葉片保綠性強(qiáng)的玉米自交系齊319為親本1(P》與保綠性較差的玉米自交系Mol7為親本2(P2)進(jìn)行雜交，得到雜交一代雜種(F》。由雜種一代Ft自交獲得雜交二代(F2)分離群體，F(xiàn)2分離群體單株自交授粉獲得雜種三代家系(F2:3)的性狀鑒定家系。當(dāng)年夏季在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米園(36°16'N，117°9'E，海拔128m)種植Pi、P2、F,和F2，其中F2群體種植500株，隨機(jī)選取350株。當(dāng)植株生長(zhǎng)至67葉時(shí)，剪取P,、P2、F,和350個(gè)F2單株的2片幼嫩葉片提取總DNA。提取總DNA的350個(gè)F2單株開(kāi)花期套袋單株自交，配制F2:3家系。提取總DNA的具體方法為CTAB法，步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)NucleicAcidsRes，1980，8，4321禾卩Genetics,1994,138，1251—1274。次年夏季在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米園(36°16'N，117°9'E，海拔128m)種植P,、P2和166個(gè)有足夠量種子的Fw家系。種植采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，具體為單行區(qū)，行距0.70米，行長(zhǎng)4米，每行15株，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)。田間管理常規(guī)操作保證各處理栽培條件的一致性。在開(kāi)花期和成9熟期鑒定葉片保綠性。保綠性大小用保綠度表示，即相對(duì)綠葉面積，相對(duì)綠葉面積=(成熟期植株綠葉面積/開(kāi)花期最大葉面積)x100%(CerealResearchCommunications,1998，26，161—167;TheorApplGenet"2002，106，133—142)。在F2:3家系每個(gè)鑒定小區(qū)中間隨機(jī)選取5個(gè)單株掛牌標(biāo)記，成熟期調(diào)查不同家系每個(gè)掛牌單株的綠葉面積，即成熟期葉面積H^x寬x0.75，以每個(gè)小區(qū)平均值計(jì)算每個(gè)家系的葉片保綠度，即成熟期綠葉面積與開(kāi)花期綠葉面積的比值(TheorApplGenet.,2002，106，133—142)。(2)分子標(biāo)記分析，遺傳圖譜構(gòu)建及QTL分析選取在兩個(gè)親本間具有擴(kuò)增多態(tài)性的引物組合，對(duì)166個(gè)Fw家系保綠性狀進(jìn)行分析。分離F2群體的每個(gè)單株玉米葉片的總DNA，采用微衛(wèi)星(Simples叫uencer印eat，SSR)分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6g/100ml聚丙烯酰胺凝膠上離后，獲得分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)，將獲得的多態(tài)性數(shù)據(jù)采用軟件MAPMAKER/EXP3.0(Lincolnetal，WhiteheadInstituteTechnicalReport,WhiteheadInstitute,Cambridge,Massachusetts,USA，1992)，設(shè)定LOD^3.0，選擇Kosambi函數(shù)構(gòu)建S06的遺傳連鎖圖譜。綜合遺傳圖譜數(shù)據(jù)和保綠性鑒定資料(參見(jiàn)步驟(1))，先采用WinCartQTL2.5進(jìn)行(Wangetal，DepartmentofStatistics,NorthCarolinaStateUniversity,Raleigh,NC.2007,http:〃www.statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)，分析QTL，再利用復(fù)合區(qū)間作圖(CompositeIntervalMapping,CIM)方式進(jìn)行判斷(LOD閥值設(shè)定為2.5)。當(dāng)LOD大于2.5時(shí)，說(shuō)明該區(qū)間存在一個(gè)QTL連鎖位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)復(fù)合區(qū)間作圖(CompositeIntervalMapping,CIM)分析發(fā)現(xiàn)在連鎖群2上，分別在標(biāo)記umcl845禾卩umcl026之間，以及umcl026禾口umcl541之間各存在一個(gè)保綠性QTL位點(diǎn)，其對(duì)應(yīng)的LOD值分別為4.21和3.02，分別解釋遺傳變異為10.67%和11.11%(見(jiàn)表1和圖1)，其臨近標(biāo)記皆為umcl026，艮卩5,-TCGTCGTCTCCAATCATACGTG-3，禾口5'-GCTACACGATACCATGGCGTTT-3，引物對(duì)，結(jié)果表明umcl026與齊319的主效葉片保綠性QTL相連鎖，并可用于種質(zhì)材料葉片保綠性預(yù)測(cè)。與保綠自交系齊319葉片保綠性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記umcl026標(biāo)記是用玉米齊319/Mol7雜交二代(F2)葉片分離DNA，采用5,-TCGTCGTCTCCAATCATACGTG-3，禾卩5'畫GCTACACGATACCATGGCGTTT-3';進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠(SCAR、STS)和6g/100ml聚丙烯酰胺凝膠(SRAP、SSR)上電泳分離后獲得，大小為230bp。表1齊319/Mo17玉米保綠性主效QTL分析QTL連鎖群LOD值標(biāo)記區(qū)間臨近標(biāo)記貢獻(xiàn)率(％)24.21umc1845umc1026umcl02610.6723.02umc1026umc1541umcl02611.11實(shí)施例2分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增1.玉米總DNA的提取在玉米67葉時(shí)剪取2片幼嫩葉片(去除中脈)剪碎后混合用于總DNA的提取。將新鮮葉片(約5g)在液氮中速凍，于研缽中快速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入65。C預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液(83.5mmol/LTris-7.5，1.175mol/LNaCl，16.7mmol/LEDTA-8.0，1.67%CTAB，1%(3-ME)15ml，充分振蕩混勻，65。C恒溫箱中保溫1.52h(每隔10min搖蕩一次)。取出，待冷卻至室溫后加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，輕輕搖勻510min。室溫下離心10min(8,000r/min)，取上清液轉(zhuǎn)至50ml離心管，加入2/3體積的異丙醇，輕輕搖勻，室溫下靜置一段時(shí)間后，得到DNA沉淀。將DNA用70%乙醇洗滌兩次。將DNA吹干，再加入23mlTE緩沖液(pH8.0)充分溶解，加入1020)ilRNAaseA溶液(10mg/ml)，37°C下恒溫水浴12h。加入等體積的酚一氯仿(1:1)，輕輕混勻lOmin.，離心10min(4,000r/min)。取上清，加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.2)，混勻后加入2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，并輕輕搖勻，室溫下靜置一段時(shí)間后，用玻璃棒鉤出DNA沉淀。將DNA用70%乙醇洗滌兩次。將DNA吹干，加入200300(illiTE-8.0充分溶解。用紫外分光廣度儀測(cè)定DNA濃度，用TE緩沖液(pH8.0)將DNA濃度調(diào)至0.3嗎爾l。4。C保存?zhèn)溆谩?.PCR擴(kuò)增(1)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系反應(yīng)組份終濃度反應(yīng)體積ddH20_5，10x緩沖液(無(wú)Mg)lxl単MgCl2(25mmol/L)1.6mmol/L0.8|aldNTP(每種10mmol/L)#禾中0.2mmol/L0.2(^1Taq酶(5U/pl)0.5U/1(V10.1piDNA(IO一I)20ng/10|^ll都lPrimer(10pmol/pi)1Opmol/Leachl.Oul合計(jì)lOpl(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)熱程序1循環(huán)30循環(huán)1循環(huán)94°C，5min94°C，35s72°C，5min5060°C，40s72°C，lmin將各反應(yīng)組分混勻后，按以上程序在PCR儀上擴(kuò)增。(3)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳儀器北京六一儀器廠生產(chǎn)的EPC3000三恒電泳儀膠型34x32x0.4mm凝膠6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳程序清洗玻璃板用自來(lái)水沾上洗滌劑把玻璃板反復(fù)擦洗干凈，用雙蒸水擦洗2遍，再用95%酒精擦洗兩遍，干燥。在長(zhǎng)板上涂lml0.5%(w/v)的粘合硅烷，另一塊板上涂lm12。/。(w/v)分離硅烷。操作過(guò)程中防止兩塊玻璃互相污染。12待玻璃板徹底干燥后組裝電泳槽，水平儀檢測(cè)。聚丙烯酰胺凝膠的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>灌膠用100ml注射器，經(jīng)由注射孔輕輕灌進(jìn)凝膠液，防止出現(xiàn)氣泡。待膠流動(dòng)到膠版上面時(shí)，在上部輕輕插入梳子，使其凝聚至少lh以上。預(yù)電泳取1500mllxTBE緩沖液，其中800ml加入正極槽，700ml加入負(fù)極槽，拔出梳子。80W恒功率預(yù)電泳30min，使溫度達(dá)到5(TC。變性10(^1PCR樣品加入3.5^16xLoadingBuffer,混勻后，在95°C變性5min，立即放入冰上冷卻10min以上。電泳用吸球吹吸加樣槽，清除氣泡，插入樣品梳子，每一個(gè)加孔加入5pl樣品。80W恒功率電泳l.Oh左右。電泳結(jié)束后，小心分開(kāi)兩塊玻璃板，凝膠會(huì)緊貼在涂BindingSilance的玻璃板上。(4)銀染程序固定將凝膠板置于2L醋酸液(10%)中，輕輕搖蕩20min。漂洗用2L雙蒸水搖蕩漂洗5min.染色用2L新配的染色液中(2gAgN03，3ml37%(v/v)甲醛)，輕輕振蕩30min。漂洗用2L雙蒸水漂洗，時(shí)間不超過(guò)10秒。顯影在2L顯影液中(顯影液含無(wú)水Na2C0360g，Na2S203400|al，37。/。甲醛3ml，提前5h配制，置于4"C冰箱中預(yù)冷)輕輕搖蕩，直至出現(xiàn)帶紋。定影在2L10。/。(v/v)醋酸溶液中定影5min。漂洗用2L雙蒸水漂洗5min。干膠室溫下自然晾干24h以上。實(shí)施例3與齊319葉片保綠性主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記在不同種質(zhì)材料中的驗(yàn)證獲得的與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記umcl026，也在不同種質(zhì)材料植株進(jìn)行了葉片保綠性預(yù)測(cè)。先從它們的苗期葉片中分離總DNA，然后利用標(biāo)記umc1026的引物對(duì)對(duì)這些總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過(guò)評(píng)判圖譜來(lái)確定是否存在相應(yīng)的標(biāo)記。當(dāng)存在相應(yīng)的擴(kuò)增條帶時(shí)，說(shuō)明該品系保綠性較好，不存在則說(shuō)明保綠性一般或較差。然后基于這些判斷準(zhǔn)則對(duì)不同自交系植株的保綠性進(jìn)行預(yù)測(cè)。隨后生育后期測(cè)定受測(cè)樣品的葉片保綠性并與預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果見(jiàn)表2，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果非常吻合。表2用umcl026預(yù)測(cè)種質(zhì)材料葉片保綠性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>+"表示有標(biāo)記umcl026的230bp擴(kuò)增條帶"_"表示無(wú)標(biāo)記umcl026的230bp擴(kuò)增條帶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，umc1026分子標(biāo)記不僅適用于齊319自交系和雜交系5的保綠性預(yù)測(cè)，還適用于其它眾多玉米品系的保綠性預(yù)測(cè)。序列表<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120〉與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記<130>0911091<160>1<170>Patentlnversion3.3<210〉SEQIDNo1<211>22<212>DNA<213〉umcl026前引物<400>1tcgtcgtctcC33tc3tscgtg22<210>SEQIDNo2<211>22<212>DNA<213>umcl026后引物<400>1gctscacgatsccstggcgttt221權(quán)利要求1.一種與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，其由引物對(duì)5’-TCGTCGTCTCCAATCATACGTG-3’和5’-GCTACACGATACCATGGCGTTT-3’組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，以玉米總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)凝膠電泳得到長(zhǎng)度為230bp的DNA片段。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，在玉米保綠性鑒定中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，在玉米的育種和資源鑒定中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，在對(duì)玉米葉片的保綠性早期預(yù)測(cè)和篩選中的應(yīng)用。全文摘要一種與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過(guò)構(gòu)建玉米分子標(biāo)記遺傳圖譜和數(shù)量性狀位點(diǎn)分析，找到與玉米葉片保綠性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記。將其應(yīng)用于玉米的育種和資源鑒定當(dāng)中，能預(yù)測(cè)種質(zhì)材料葉片的保綠性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米葉片的保綠性的早期預(yù)測(cè)和篩選，提高育種效率。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101519692SQ200910046639公開(kāi)日2009年9月2日申請(qǐng)日期2009年2月25日優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日發(fā)明者吳愛(ài)忠,孔令杰,董樹亭,許瑞瑞,鄭成超,鄭洪建申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院