專利名稱：增強(qiáng)對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的組合物和方法
增強(qiáng)對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的組合物和方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)要求于2007年10月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/983，803的 優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)專利的全部?jī)?nèi)容在此通過弓I用并入本文。
關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明
本發(fā)明部分是在美國(guó)政府授予的USDA/NRI計(jì)劃#2007-01953的資助下完成。美 國(guó)政府可對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。
引言
沙門氏菌(Salmonella)仍舊是全世界的人類食物傳播感染的最常被報(bào)道的細(xì)菌 性誘因之一，并且流行病學(xué)證據(jù)表明家禽和家禽產(chǎn)品是人類感染的重要來源。在美國(guó)，每年 報(bào)道估計(jì)一百四十萬(wàn)例的人類沙門氏菌感染。這些案例中，血清型腸炎沙門氏菌(SE)和鼠 傷寒沙門氏菌(ST)是最常被分離的，雖然一些其它的血清型也被顯示引起人類中的腸炎。
沙門氏菌不常導(dǎo)致家禽群體中的明顯的臨床疾病。但是，在具有一些沙門氏菌分 離體(isolate)的幼雞中的感染導(dǎo)致孵化后頭48小時(shí)內(nèi)的2%發(fā)病率，和頭5天內(nèi)的達(dá)到 20%發(fā)病率。因此，增強(qiáng)家禽種群對(duì)沙門氏菌的抵抗力不僅將降低低水平疾病對(duì)性能的影 響，而且也還將降低對(duì)人類種群的重要的健康風(fēng)險(xiǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了包含編碼第一多肽的fliC多核苷酸序列和編碼⑶IM多肽的第二 多核苷酸序列的疫苗。CD154多肽能夠與CD40結(jié)合，其具有50個(gè)以下的氨基酸，并包括SEQ ID NO 8的140-149位氨基酸或其同源物。
在另一方面，本發(fā)明公開了包含腸炎沙門氏菌(SalmonellaenteritidisUSA的 變異體的疫苗。沙門氏菌包含編碼flic多肽的第一多核苷酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供通過施用細(xì)菌來增強(qiáng)受試者對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng) 的方法。細(xì)菌包括編碼flic多肽的第一多核苷酸序列和編碼CD154多肽的第二多核苷酸 序列。⑶154多肽能夠與⑶40結(jié)合，其具有50個(gè)以下的氨基酸，并包括SEQ ID NO :8的 140-149位氨基酸或其同源物。細(xì)菌以增強(qiáng)受試者對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的有效量進(jìn) 行施用。
在另一方面，本發(fā)明提供通過施用腸炎沙門氏菌13A的變異體增強(qiáng)受試者對(duì)有鞭 毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的方法。沙門氏菌包括編碼flic多肽的第一多核苷酸序列。沙門氏 菌以增強(qiáng)受試者對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的有效量進(jìn)行施用。
在另一方面，本發(fā)明提供通過施用細(xì)菌降低受試者中與有鞭毛的細(xì)菌感染相關(guān)的 發(fā)病率的方法。細(xì)菌包括編碼fliC多肽的第一多核苷酸序列和編碼CD154多肽的第二多 核苷酸序列。⑶巧4多肽能夠與⑶40結(jié)合，其具有50個(gè)以下的氨基酸，并包括SEQ ID NO 8的140-149位氨基酸或其同源物。細(xì)菌以降低受試者的感染有鞭毛的細(xì)菌后的發(fā)病率的 有效量進(jìn)行施用。
在另一方面，本發(fā)明提供通過施用腸炎沙門氏菌13A的變異體降低受試者中有鞭毛的細(xì)菌感染的發(fā)病率的方法。沙門氏菌包括編碼fliC多肽的第一多核苷酸序列。沙門 氏菌以降低受試者的感染有鞭毛的細(xì)菌后的發(fā)病率的有效量進(jìn)行施用。


圖1描述在腸炎沙門氏菌中進(jìn)行定點(diǎn)突變的方案。
圖2描述重疊延伸PCR方法的設(shè)計(jì)方案，其用于產(chǎn)生插入至IamB多核苷酸的環(huán)區(qū) 9中的fliC和fliC-CD154插入物。
圖3為柱形圖，顯示使用標(biāo)明的細(xì)菌接種后3天，與最初肝/脾和盲腸扁桃體中的 接種物相比較，腸炎沙門氏菌的回收百分率。
圖4為柱形圖，顯示使用標(biāo)明的細(xì)菌接種后21天，與最初肝/脾和盲腸扁桃體中 的接種物相比較，腸炎沙門氏菌的回收百分率。
具體實(shí)施方式
針對(duì)沙門氏菌的疫苗接種是困難的，因?yàn)橐呀?jīng)描述了 2000種以上的血清型并且 針對(duì)一種血清型的免疫一般不能賦予對(duì)不同血清型的免疫力。需要開發(fā)針對(duì)沙門氏菌的疫 苗以保護(hù)人類、家禽和其它家養(yǎng)動(dòng)物。能夠保護(hù)針對(duì)多種血清型的疫苗是最佳的。本發(fā)明 提供包含fliC的高度保守區(qū)的疫苗，flic為有鞭毛的沙門氏菌上發(fā)現(xiàn)的鞭毛絲蛋白。
重組DNA技術(shù)能使對(duì)許多細(xì)菌及病毒物種的操作相對(duì)容易。一些細(xì)菌及病毒有輕 微的致病性或無致病性，卻能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。這些細(xì)菌及病毒是激發(fā)對(duì)抗原的免 疫反應(yīng)的理想疫苗載體。細(xì)菌或病毒疫苗載體能夠模擬自然感染并產(chǎn)生強(qiáng)烈的和持久的免 疫性。生產(chǎn)和施用疫苗載體通常相對(duì)廉價(jià)。此外，這樣的載體經(jīng)常能攜帶不止一個(gè)抗原，而 且可以提供針對(duì)多種感染性試劑的保護(hù)。
在一方面，本發(fā)明提供包含編碼fliC多肽的第一多核苷酸序列和編碼⑶IM多肽 (其能夠與CD40結(jié)合)的第二多核苷酸序列的疫苗。在另一方面，本發(fā)明公開了疫苗載體 (例如細(xì)菌載體)的用途，用于疫苗接種和產(chǎn)生針對(duì)沙門氏菌和其它有鞭毛的致病性細(xì)菌 的免疫反應(yīng)。沙門氏菌菌株是適當(dāng)?shù)囊呙巛d體，因?yàn)榭梢允辜?xì)菌基因發(fā)生突變或使其毒性 減弱，以產(chǎn)生對(duì)被感染或免疫接種的受試者有低致病性或沒有致病性但同時(shí)保持免疫原性 的細(xì)菌。
多數(shù)沙門氏菌分離體含有兩個(gè)基因，其編碼鞭毛(H)抗原，fliC和fljB，它們通過 相變異機(jī)制交替地表達(dá)。相1抗原由fliC編碼而fljB編碼相2抗原。已經(jīng)鑒定fliC內(nèi)的 保守區(qū)域在多種沙門氏菌血清型之間和在fliC與fljB之間具有幾乎100%同源性。fliC 的保守區(qū)域在SEQID NO :1中描述并用于產(chǎn)生實(shí)施例中所描述的幾個(gè)疫苗載體。用于疫苗 載體的其它可能的多肽在SEQ ID NO :2(來自大腸桿菌的fliC的相似區(qū)域)、SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 12中公開。f IiC多肽的免疫原性片段也可用于產(chǎn)生疫苗。 另外，在這個(gè)fliC的保守區(qū)域和其它細(xì)菌(例如志賀桿菌(Shigella)和大腸桿菌)的鞭 毛序列之間具有廣泛的同源性，以至于表達(dá)fliC的疫苗載體也普遍地增強(qiáng)對(duì)有鞭毛的細(xì) 菌的免疫反應(yīng)。因此，沙門氏菌疫苗載體表面上的這些保護(hù)性表位的表達(dá)可誘導(dǎo)對(duì)生物的 多種血清型的保護(hù)性免疫力，并可允許對(duì)所有有鞭毛的細(xì)菌的免疫接種。
樹突狀細(xì)胞(DC)的參與對(duì)于有力的免疫反應(yīng)的啟動(dòng)是必需的，因?yàn)槠渚哂歇?dú)特的能力激活原態(tài)T細(xì)胞，引起T細(xì)胞擴(kuò)增并分化為效應(yīng)細(xì)胞。DC的作用(DC是機(jī)體的幾乎 所有組織中發(fā)現(xiàn)的抗原遞呈細(xì)胞(APC))是捕獲抗原，將抗原運(yùn)送到相關(guān)的淋巴組織，然后 把抗原遞呈給原態(tài)T細(xì)胞。被DC激活后，T細(xì)胞擴(kuò)增、分化為效應(yīng)細(xì)胞、離開次級(jí)免疫器官 并進(jìn)入外周組織。激活的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)能破壞病毒感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或者甚 至被胞內(nèi)寄生蟲(例如，沙門氏菌)感染的APC，并被證明在抗病毒感染的保護(hù)中至關(guān)重要。
⑶40是TNF受體家族分子的成員并表達(dá)于多種細(xì)胞類型上，包括專職的抗原遞呈 細(xì)胞(APC)，例如DC和B細(xì)胞。⑶40與其配體⑶154的相互作用是極其重要的，對(duì)于體液 和細(xì)胞免疫都有刺激作用?？梢酝ㄟ^抗CD40抗體模擬在DC表面表達(dá)的CD40對(duì)DC的刺激。 然而在體內(nèi)這是通過在激活的T細(xì)胞表面表達(dá)的CD40的天然配體(即CD154)相互作用發(fā) 生的。有趣的是，已經(jīng)鑒定了⑶154的⑶40結(jié)合區(qū)。⑶154的⑶40結(jié)合區(qū)可在疫苗載體 (如沙門氏菌疫苗載體)的表面表達(dá)，并可導(dǎo)致對(duì)共遞呈的肽序列增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
沙門氏菌能夠在宿主的胃腸道存活并能引起粘膜免疫反應(yīng)。使用沙門氏菌載體的 口服疫苗產(chǎn)生強(qiáng)烈的粘膜免疫反應(yīng)，而且對(duì)動(dòng)物和人類施用都相對(duì)容易。然而，與其毒性更 強(qiáng)的對(duì)應(yīng)體(counterpart)比較，許多目前的減毒的沙門氏菌疫苗菌株在產(chǎn)生強(qiáng)烈的保護(hù) 性免疫反應(yīng)方面不那么有效。強(qiáng)毒性菌株提供強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)但也可引起接種的受試者的 顯著的發(fā)病率?？梢杂米饔行У恼衬?例如口服)接種的沙門氏菌菌株可提供易于對(duì)受試 者進(jìn)行抵抗一種或多種病原性試劑(例如有鞭毛的細(xì)菌)的疫苗接種的載體?；蛘?，限制 沙門氏菌疫苗載體引起的感染的方法也是有用的。本文提供了限制沙門氏菌疫苗載體引起 的感染的方法，該方法是通過向受試者施用沙門氏菌疫苗載體和施用包含編碼fliC多肽 的第一多核苷酸序列的第二疫苗載體。第二疫苗載體的施用增強(qiáng)了對(duì)沙門氏菌的免疫反應(yīng) 并限制了沙門氏菌疫苗載體引起的感染。第二疫苗載體可以在沙門氏菌疫苗載體之前、同 時(shí)或之后施用。
本發(fā)明描述了可用作疫苗載體的腸炎沙門氏菌菌株，以及使用這個(gè)菌株制成 的各種重組疫苗載體。特別地，本發(fā)明提供了能表達(dá)外源flic多肽的腸炎沙門氏菌 13A(SE13A)。此外，本發(fā)明公開了疫苗載體和通過施用疫苗載體增強(qiáng)受試者的免疫反應(yīng)的 方法，所述疫苗載體包含編碼fliC多肽的第一多核苷酸序列和包含編碼能夠與CD40結(jié)合 的CDlM多肽或其同源物的第二多核苷酸序列。疫苗載體可以用于增強(qiáng)對(duì)沙門氏菌或另一 個(gè)有鞭毛的細(xì)菌(例如，大腸桿菌或志賀桿菌)的免疫反應(yīng)或用于降低與有鞭毛的細(xì)菌感 染相關(guān)的發(fā)病率。
基于在雞體內(nèi)引起粘膜定殖(colonization)和粘膜下易位的不尋常的能力(使 相關(guān)抗原或表位在商業(yè)化雞體內(nèi)強(qiáng)烈地呈遞)選擇了沙門氏菌的野生型分離體，腸炎沙門 氏菌13A(SE13A)(于2006年9月13日保藏于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)，保藏號(hào)為 PTA-7871)。重要地是，該野生型沙門氏菌分離體在商業(yè)化雞體內(nèi)不引起臨床可檢測(cè)的疾病 或性能的喪失，這提示該野生型沙門氏菌對(duì)脊椎動(dòng)物的致病潛在可能性低。
可通過將細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)條件之外持續(xù)復(fù)制所必需的至少一個(gè)基因滅活而 使SE13A分離體進(jìn)一步減毒。能用作疫苗載體的減毒或變異的沙門氏菌菌株如下所述。將 SE13A用于產(chǎn)生減毒的沙門氏菌菌株以開發(fā)疫苗并產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。SE13A對(duì)家禽具 有侵入性、無致病性，而且不造成可檢測(cè)的發(fā)病率。與非侵入性細(xì)菌載體相比，這些特性導(dǎo) 致增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。通過使限制細(xì)菌傳播能力的基因突變而使SE13A減毒可以提高疫苗的安全性。例如，具有aroA和/或htrA突變的SE13A菌株保留產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力，但在宿 主中的復(fù)制受到限制。因此，減毒作用提高了疫苗載體的安全性而未使其免疫原性下降。
可以在多種其它沙門氏菌基因中進(jìn)行突變，這些基因包括但不限于Cya、Crp、aSd、 cdt、phoP、phoQ、ompR、外膜蛋白、dam、htrA或其它應(yīng)激相關(guān)基因、aro、pur和gua。如實(shí)施 例中所示，發(fā)現(xiàn)aroA和htrA突變可使SE13A減毒。aro基因是涉及莽草酸酯(shikimate) 生物合成途徑或芳香酶途徑的酶，而aro突變體是芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨 酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。htrA是編碼降解異常蛋白的細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶的應(yīng)激反應(yīng)基因。htrA突 變體也是減毒的并表現(xiàn)出對(duì)過氧化氫敏感性增加。
實(shí)施例中描述的aroA和htrA突變是缺失突變，但能以各種方式產(chǎn)生突變。適合 地，突變?yōu)椴荒芤詥我徊襟E修復(fù)的非反向突變(non-reverting mutation) 0適合的突變包 括缺失、反轉(zhuǎn)、插入及置換。疫苗載體可以包括一種以上突變，例如疫苗載體可以同時(shí)包含 aroA及htrA突變。產(chǎn)生這種突變的方法在本領(lǐng)域中廣為人知。
SE13A或減毒的SE13A變異體可用作疫苗載體?？蓪⒕幋afIiC多肽抗原和來自任 何數(shù)目的致病有機(jī)體的其它抗原的多核苷酸插入細(xì)菌中，并由該細(xì)菌表達(dá)以產(chǎn)生抗原性多 肽?？蓪⒍嗪塑账岵迦爰?xì)菌的染色體或在質(zhì)粒上或其它染色體外DNA上編碼。適合地，可 將編碼fliC抗原的多核苷酸插入被表達(dá)的細(xì)菌的多核苷酸中。適合地，細(xì)菌的多核苷酸編 碼跨膜蛋白，將編碼fliC抗原的多核苷酸插入至細(xì)菌多核苷酸序列中，以允許fliC抗原在 細(xì)菌表面表達(dá)。例如，以閱讀框(frame)的形式將編碼fIiC的多核苷酸插入至細(xì)菌的編碼 跨膜蛋白外環(huán)區(qū)的多核苷酸區(qū)中，以使細(xì)菌多核苷酸序列保留在閱讀框中。參看實(shí)施例1。
此外，可將編碼fliC抗原的第一多核苷酸插入編碼分泌多肽的多核苷酸中。本領(lǐng) 域的技術(shù)人員將理解，編碼flic抗原的多核苷酸可以插入細(xì)菌的眾多的多核苷酸中，以使 flic抗原表達(dá)并呈遞至經(jīng)過細(xì)菌疫苗載體治療的受試者的免疫細(xì)胞。在實(shí)施例中，將編碼 fliC抗原的多核苷酸插入SE13A的IamB基因的環(huán)區(qū)9中?？梢园▎我豢截惢蛞粋€(gè)以上 拷貝的編碼fliC抗原的多核苷酸。在實(shí)施例中，描述了包含插入至IamB的環(huán)區(qū)9中的單 個(gè)拷貝的fliC抗原的細(xì)菌疫苗載體。此外，可以將表位的拷貝插入細(xì)菌疫苗載體中的一個(gè) 以上的位置。多核苷酸的拷貝可以連接在一起或通過連接子分開。適合的連接子是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的，包括但不限于重復(fù)的氨基酸，例如1-10絲氨酸殘基。
如以下更詳細(xì)描述的那樣，疫苗載體可以包括CD154多肽，CDlM多肽能夠在受試 者內(nèi)與CD40結(jié)合并刺激受試者對(duì)疫苗載體及其相關(guān)抗原產(chǎn)生反應(yīng)。如上所述，可將這些多 核苷酸插入疫苗載體的染色體中或保持在染色體外。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，這些多核 苷酸可以插入到多種內(nèi)源多核苷酸中并在疫苗載體的不同部分(例如細(xì)胞壁)表達(dá)或被分 泌。編碼能夠增強(qiáng)對(duì)外源抗原的免疫反應(yīng)的CD154多肽的多核苷酸也可以編碼外源抗原。 可將編碼CDlM多肽的多核苷酸與編碼fliC抗原的多核苷酸連接起來，從而在疫苗載體 中CDlM多肽和fIiC抗原存在于同一多核苷酸上。在實(shí)施例中，編碼能夠與CD40結(jié)合的 ⑶154多肽的多核苷酸也編碼fliC抗原。參見所附序列表中SEQ ID NO 1，2，9，10和11。 在實(shí)施例中，將fliC抗原的多核苷酸和編碼CDlM多肽的多核苷酸都插入IamB基因的環(huán) 區(qū)9中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，也可以使用編碼其它跨膜蛋白的和IamB基因的其它環(huán)區(qū) 的細(xì)菌多核苷酸。
SE13A細(xì)菌包括編碼fliC多肽(該多肽是與沙門氏菌天然相關(guān)的全長(zhǎng)fliC多肽的一部分)的外源多核苷酸。適合地，可將編碼部分flic多肽或整個(gè)flic多肽的多核苷 酸插入疫苗載體。在實(shí)施例中，將7個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO 1)導(dǎo)入SE13A。適合地， 插入至疫苗載體的fliC多肽部分是免疫原性片段。免疫原性片段是能夠激發(fā)細(xì)胞或體液 免疫反應(yīng)的肽或多肽。適合地，fliC的免疫原性片段可以是全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列的6個(gè)或更多 個(gè)氨基酸、10個(gè)或更多個(gè)氨基酸、15個(gè)或更多個(gè)氨基酸，或者20個(gè)或更多個(gè)氨基酸。
其它適合包含在fliC疫苗載體中的表位包括但不限于，編碼其它細(xì)菌多肽的多 核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，多種序列可以與任何其它抗原結(jié)合使用，而且也可以與 編碼免疫刺激肽(如CD154多肽)的多肽聯(lián)合使用。
如以上所討論，疫苗載體中可以包括編碼能夠增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的CD154多 肽的多核苷酸。適合地，CDlM多肽長(zhǎng)度為50個(gè)氨基酸以下，更適合地是40個(gè)以下、是30 個(gè)以下或是20個(gè)以下氨基酸的長(zhǎng)度。多肽可介于10至15個(gè)氨基酸之間、10至20個(gè)氨基 酸之間或10至25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度之間。CDlM序列和CD40結(jié)合區(qū)在各種物種間不是高度保 守的。雞和人的CDM4氨基酸序列分別見于SEQ ID NO :9及SEQ ID NO :8。
已經(jīng)確定了一些物種的⑶巧4的⑶40結(jié)合區(qū)，包括人、雞、鴨、小鼠和牛，分別見于 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5,SEQID NO 6 禾口 SEQ ID NO -J0 雖然不同物種之 間的CD40結(jié)合區(qū)的序列有可變性，但人CDlM多肽能夠增強(qiáng)雞的免疫反應(yīng)。因此，人們可 以使用物種特異性CDlM多肽或異源CD154多肽來實(shí)施本發(fā)明。
在實(shí)施例中制備了幾種SE13A重組細(xì)菌。在每種含有同時(shí)編碼fliC和⑶巧4肽 的多核苷酸的SE13A菌株中，f IiC多肽和⑶巧4多肽被編碼在同一多核苷酸上，而且它們彼 此處于閱讀框內(nèi)并與其所插入至的沙門氏菌IamB多核苷酸處于閱讀框內(nèi)。在替代性具體 實(shí)施方式中，CDM4多肽和fliC多肽可被不同的多核苷酸編碼。SE13A的aroA htrAfliC 包含aroA和htrA的缺失并同時(shí)編碼fliC表位(SEQ ID NO 1)和可選地插入至IamB的環(huán) 區(qū) 9 的 CD154 多肽(SEQ ID NO 3)。
本發(fā)明還提供包括減毒沙門氏菌菌株和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。藥學(xué)上可 接受的載體是任何適合體內(nèi)施用的載體。藥學(xué)上可接受的適合用于組合物中載體的例子包 括但不限于，水、緩沖溶液、葡萄糖溶液或細(xì)菌培養(yǎng)液。組合物的附加成份可以適合地包括， 例如，賦形劑，如穩(wěn)定劑、防腐劑、稀釋劑、乳化劑和滑潤(rùn)劑。藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑 的例子包括穩(wěn)定劑，如碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、右旋糖苷)、 蛋白(如白蛋白或酪蛋白)、含蛋白試劑(如牛血清或脫脂乳)和緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖 液)。特別是在組合物中添加這樣的穩(wěn)定劑時(shí)，該組合物適合冷凍干燥或噴霧干燥。
本發(fā)明還提供通過施用包含fliC多肽和能夠與⑶40結(jié)合并激活⑶40的⑶154 多肽的疫苗載體而增強(qiáng)受試者免疫反應(yīng)的方法。向受試者施用有效量的包括編碼能夠與 CD40結(jié)合的CDlM多肽的多核苷酸的疫苗載體以增強(qiáng)受試者對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)。適合地， 疫苗載體包含編碼包括人類CDlM多肽(SEQ ID NO 8)的140-149位氨基酸的多肽或其同 源物的多核苷酸。如上所述和如實(shí)施例中所證明，CD154的CD40結(jié)合區(qū)在物種間不是保守 的，然而異源CDlM能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)(即在雞中使用人類序列)。因此，源自一個(gè)物種的 140-149位氨基酸的同源物可用于刺激不同物種中的免疫反應(yīng)。
在本文中鑒定出幾種適合的多肽。適合地，多核苷酸編碼來自于與受試者同一物 種的⑶IM多肽。適合地，將編碼SEQ ID NO :3的多肽的多核苷酸用于人類受試者，將編碼SEQ ID NO :4的多肽的多核苷酸用于雞，將編碼SEQ ID NO :5的多肽的多核苷酸用于鴨，將 編碼SEQID NO :6的多肽的多核苷酸用于小鼠，和將編碼SEQ ID NO :7的多肽的多核苷酸用 于牛。在實(shí)施例中，在雞疫苗載體中使用人類CDlM多肽(SEQ ID NO :3)，而且證明可增強(qiáng) 對(duì)外源抗原的免疫反應(yīng)。因此，CDlM多肽和受試者的其它異源組合可用于本發(fā)明的方法。 CD154多肽可用于增強(qiáng)受試者對(duì)任何外源抗原或存在于疫苗載體中的除fliC多肽之外的 抗原性多肽的免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，CD154多肽可用于增強(qiáng)對(duì)存在于疫苗 載體中的一種以上抗原性多肽的免疫反應(yīng)。
來自⑶154的多肽至少部分通過與其受體⑶40的結(jié)合而刺激免疫反應(yīng)。在實(shí)施 例中使用了與CDlM多肽同源的多肽，其在受試者免疫細(xì)胞上表達(dá)并且能夠與巨噬細(xì)胞和 其它抗原遞呈細(xì)胞上的CD40受體結(jié)合。這個(gè)配基-受體復(fù)合物的結(jié)合刺激巨噬細(xì)胞(和 巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞，例如樹突狀細(xì)胞)以增強(qiáng)吞噬作用和抗原呈遞，并同時(shí)增加已知能夠 激活其它局部免疫細(xì)胞(如B淋巴細(xì)胞)的細(xì)胞因子的分泌。因此，CDlM肽相關(guān)分子是 免疫反應(yīng)及擴(kuò)大的抗體產(chǎn)生的優(yōu)選靶標(biāo)。
本方法可用的潛在疫苗載體包括但不限于沙門氏菌屬(腸炎沙門氏菌)、志賀 菌屬Shigella)、埃希桿菌屬(Escherichia)(大腸桿菌)、耶爾森菌屬Yersinia)、博 德特氏菌屬(Bordetella)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳酸菌屬(Lactobacillus) > ff ^ 屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、弧菌屬(Vibrio)(霍亂弧菌)、李斯特菌屬 (Listeria)、腺病毒(adenovirus)、痘病毒(poxvirus)、皰疫病毒(herpesvirus)、甲病毒 (alphavirus)及腺相關(guān)病毒。
此外，本發(fā)明公開了增強(qiáng)對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的方法和降低與隨后 感染有鞭毛的細(xì)菌相關(guān)的發(fā)病率的方法。簡(jiǎn)言之，該方法包含向受試者施用有效量 的包含編碼fliC多肽的多核苷酸序列的疫苗載體。fliC多肽包括SEQ ID NO 1-2 和10-12?？梢砸员绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的多種方式將fliC多肽插入疫苗載體，包 括但不限于在BMCBiotechnol. 2007 Sept, 17:7(1) :59中描述的無痕定點(diǎn)突變系統(tǒng) (scarlesssite-directed mutation system)，(Scarless and Site-directed Mutagenesis)，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。也可以工 程化疫苗載體使其表達(dá)fliC多肽和以上討論的能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)的多核苷酸(如SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9)。特別的，疫苗載體可以表達(dá)能夠結(jié)合⑶40的OTlM的多肽，以增強(qiáng) 受試者對(duì)fliC多肽的免疫反應(yīng)。可選地，疫苗載體是細(xì)菌，例如腸炎沙門氏菌。
將施用的疫苗載體的有用劑量將根據(jù)受試者的年齡、體重和物種、施用的模式及 途徑、以及尋找對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)的病原體類型而變化?？梢匀魏巫阋约ぐl(fā)免疫反應(yīng)的劑 量施用組合物。對(duì)于細(xì)菌疫苗而言，預(yù)計(jì)IO3至101°個(gè)細(xì)菌、IO4至IO9個(gè)細(xì)菌、或IO5至IO7 個(gè)細(xì)菌的劑量范圍是適合的。組合物可以只施用一次，或可以施用兩次或更多次以增強(qiáng)免 疫反應(yīng)。例如，組合物可以施用兩次或更多次，每次隔一周、隔兩周或隔三周或隔更多周。在 施用之前使細(xì)菌適合地存活，但在一些具體實(shí)施方式
中，在施用之前將細(xì)菌殺死。在一些具 體實(shí)施方式中，細(xì)菌能夠在受試者體內(nèi)復(fù)制，而在其它具體實(shí)施方式
中，細(xì)菌不能在受試者 體內(nèi)復(fù)制。
對(duì)于向動(dòng)物或人類的施用而言，可以以多種手段施用組合物，這些手段包括但不 限于鼻內(nèi)、粘膜、通過噴霧、皮內(nèi)、非腸道、皮下、口服、通過氣霧或肌內(nèi)。點(diǎn)眼施用或添加到飲水或食物中也是適合的。對(duì)于雞而言，可以將組合物施用到卵中。
本發(fā)明的一些實(shí)施例提供增強(qiáng)受試者免疫反應(yīng)的方法。適合的受試者包括但不限 于脊椎動(dòng)物，適合的哺乳動(dòng)物、適合的人類和鳥類，適合的家禽如雞。也可以使用其它感染 的動(dòng)物模型。增強(qiáng)免疫反應(yīng)包括但不限于，誘導(dǎo)受試者的免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的治療性或預(yù)防性 效應(yīng)。特別地，增強(qiáng)免疫反應(yīng)可包括抗體的產(chǎn)生增加、抗體重鏈的類別轉(zhuǎn)換增強(qiáng)、抗原呈遞 細(xì)胞的成熟、輔助性T細(xì)胞的刺激、溶細(xì)胞性T細(xì)胞的刺激或T及B細(xì)胞記憶的誘導(dǎo)。
可預(yù)計(jì)將來自相同或不同病原體的幾個(gè)表位或抗原在單一疫苗載體中組合施用， 以產(chǎn)生針對(duì)多個(gè)抗原的增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。重組疫苗載體可以編碼來自多種病原體微生物、 病毒或腫瘤相關(guān)抗原的抗原。施用能夠表達(dá)多種抗原的疫苗載體具有同時(shí)誘導(dǎo)抵抗兩種或 更多種疾病的免疫力的優(yōu)點(diǎn)。例如，活的減毒細(xì)菌(如腸炎沙門氏菌13A)為激發(fā)抵抗多種 抗原的免疫反應(yīng)提供適合的疫苗載體。
可以使用編碼抗原的外源多核苷酸構(gòu)建細(xì)菌疫苗，所述多核苷酸可被插入細(xì)菌基 因組中的任何非必需位點(diǎn)，或可選地使用本領(lǐng)域中廣為人知的方法質(zhì)粒上攜帶所述多核苷 酸。一個(gè)適合的插入多核苷酸的位點(diǎn)是在跨膜蛋白的外部部分內(nèi)或?qū)⒃摱嗪塑账崤c靶向用 于分泌途徑的外源多核苷酸的序列偶聯(lián)。一個(gè)用于插入多核苷酸的適合的跨膜蛋白的例子 是IamB基因。在實(shí)施例中，fliC和⑶IM多核苷酸插入IamB序列的環(huán)區(qū)9中。
外源多核苷酸包括但不限于，編碼選自病原體微生物或病毒的抗原的多核苷酸， 并包括疫苗載體的多核苷酸，該多核苷酸以產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)的方式表達(dá)。這樣的多核苷 酸可以來自病原性病毒，如流感病毒(例如M2e、紅細(xì)胞凝集素、或神經(jīng)氨酸酶)、皰疹病毒 (例如編碼皰疹病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的基因)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如gpl60包膜蛋白)、腺病毒、副 粘液病毒、冠狀病毒等等。外源多核苷酸也可以獲自病原性細(xì)菌，例如編碼細(xì)菌蛋白(如毒 素)和外膜蛋白的基因。此外，來自寄生蟲的外源多核苷酸是用于載體疫苗的理想候選物。
疫苗載體中也可以包括編碼參與激發(fā)免疫系統(tǒng)的多肽的多核苷酸，如活的減毒的 沙門氏菌屬疫苗。多核苷酸可以編碼已知具有刺激效應(yīng)的免疫系統(tǒng)分子，如白細(xì)胞介素、腫 瘤壞死因子或干擾素，或是另一種參與免疫調(diào)節(jié)的多核苷酸。疫苗載體也可包括編碼已知 刺激免疫反應(yīng)的肽(例如本文描述的CDlM多肽)的多核苷酸。
以下實(shí)施例只是示例性的，而不是限制本發(fā)明或所附權(quán)利要求的范圍。
實(shí)施例
實(shí)施例1. fliC和fliC/CDIM插入物的構(gòu)建
菌株和培養(yǎng)條件
除非另有說明，否則首先將所有質(zhì)粒保持在T0P10大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen， Carlsbad, CA, USA)中。使用腸炎沙門氏菌13A來引入突變。腸炎沙門氏菌菌株13A是從 USDA/APHIS/NVSL獲得的田野分離體，并以保藏號(hào)PTA-7871保藏于ATCC。攜帶質(zhì)粒pKD46 的細(xì)菌在30°C生長(zhǎng)。其它細(xì)菌在37°C生長(zhǎng)。質(zhì)粒消除在37°C實(shí)施。
將Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基用于細(xì)胞的常規(guī)生長(zhǎng)，SOC培養(yǎng)基(Invitrogen， Carlsbad,CA,USA)用于電穿孔之后的表型表達(dá)。在適當(dāng)時(shí)，將以下抗生素添加到培養(yǎng)基中 氨比西林(Amp) 100 μ g/ml、卡那霉素(Km) 50 μ g/ml 和氯霉素(Cm) 25 μ g/ml。
質(zhì)粒
以前描述過質(zhì)粒 pKD46、pKD13 和 pBCUcel (Datsenko 和 Wanner，PNAS 2000，97 :6640-6645 和 Kang 等人，J Bacteriol 2004，186 :4921-4930, 二者通過引用全文并入 本文)。質(zhì)粒PKD46編碼Red重組酶酶類，其介導(dǎo)引入的線性DNA與染色體DNA之間的同 源重組。這個(gè)質(zhì)粒還包含氨比西林抗性基因而且對(duì)溫度敏感，所以其需要30°C的溫度以在 細(xì)胞中維持生長(zhǎng)。質(zhì)粒PKD13用作重疊PCR反應(yīng)中Km抗性(Knf)基因的擴(kuò)增模板。質(zhì)粒 pBC-I-Scel (在37°C維持在細(xì)胞中)產(chǎn)生HceI酶，I-SceI酶剪切以下18個(gè)堿基對(duì)的稀 有識(shí)別序列5' -TAGGGATAACAGGGTAAT-3‘ (SEQ ID NO 13)。質(zhì)粒 pBCHcel 還包含氯 霉素抗性(Cnf)基因。
PCR
在表1中列出了用于PCR的所有引物。通常，PCR的反應(yīng)條件如下在總體積 50 μ L中含有大約0. Iyg純化的基因組、質(zhì)?；騊CR產(chǎn)生的DNA Oliagen，Valencia, CA, USA), 1 X 克隆的 Pfu 聚合酶緩沖液、5U Pfu 聚合酶(Stratagene La Jolla, CA, USA)、ImM dNTP(GEHealthcare Bio-Sciences Corp. ,Piscataway,NJ)和每個(gè)引物 1·2μΜ。使用 DNA 引擎熱循環(huán)儀(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)在以下擴(kuò)增條件下進(jìn)行擴(kuò)增94°C，2分鐘； 94°C持續(xù)30秒、58°C持續(xù)60秒、72°C持續(xù)90秒(每11Λ)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；和72°C持續(xù) 10分鐘以進(jìn)行最后的延伸。每個(gè)PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠純化Oliagen，Valencia, CA, USA)，并 以25 μ L的EB緩沖液洗脫以制備用于重疊延伸PCR的模板，或者以50 μ L的EB緩沖液洗 脫，經(jīng)乙醇沉淀，并重懸于5μ L的ddH20中，以使其通過電穿孔進(jìn)入腸炎沙門氏菌中。
表1引物序列
權(quán)利要求
1.一種包含編碼fliC多肽的第一多核苷酸序列和編碼能與⑶40結(jié)合的⑶154多肽 的第二多核苷酸序列的疫苗，其中⑶巧4多肽具有50個(gè)以下的氨基酸并包含SEQ ID NO 8 的140-149位氨基酸或其同源物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其中fliC多肽包括SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12、SEQID NO 1 的免疫原性片段、SEQ ID NO 2 的免 疫原性片段、SEQ IDNO 10的免疫原性片段、SEQ ID NO 11的免疫原性片段或SEQ IDNO 12的免疫原性片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其中⑶154多肽包括SEQIDNO :3、SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO5,SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的疫苗，其中疫苗是細(xì)菌疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，細(xì)菌在其表面上包含fIiC多肽和CDlM多肽中的至少一個(gè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的疫苗，其中細(xì)菌選自沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、桿菌屬或 乳酸菌屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其中細(xì)菌是腸炎沙門氏菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其中細(xì)菌是選自ATCC保藏號(hào)為PTA-7871、ATCC保藏 號(hào)為PTA-7872或ATCC保藏號(hào)為PTA-7873的腸炎沙門氏菌13A。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸中至少 一個(gè)插入到編碼跨膜蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中跨膜蛋白是lamB。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中疫苗包含一個(gè)以上拷貝的第一多核 苷酸序列。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中疫苗包含一個(gè)以上拷貝的第二多核 苷酸序列。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中第一多核苷酸序列與第二多核苷酸 序列按照處于閱讀框內(nèi)的方式連接。
14.一種疫苗，其包含腸炎沙門氏菌13A的變異體，其中沙門氏菌包含編碼f IiC多肽的 外源的第一多核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的疫苗，其中fliC多肽包括SEQID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 1 的免疫原性片段、SEQ ID NO 2 的 免疫原性片段、SEQ IDNO 10的免疫原性片段、SEQ ID NO 11的免疫原性片段或SEQ IDNO 12的免疫原性片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的疫苗，其中疫苗包含一個(gè)以上拷貝的第一多核苷酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)所述的疫苗，其中第一多核苷酸序列插入到編碼跨膜 蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的疫苗，其中跨膜蛋白是lamB。
19.根據(jù)權(quán)利要求14-18任一項(xiàng)所述的疫苗，還包含編碼能與⑶40結(jié)合的⑶巧4多肽 的第二多核苷酸序列，其中⑶巧4多肽具有50以下氨基酸并包含SEQ ID NO 8的140-149氨基酸或其同源物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的疫苗，其中CDlM多肽包括SEQIDNO :3、SEQ ID NO :4、SEQ IDNO :5, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7。
21.根據(jù)權(quán)利要求19-20任一項(xiàng)所述的疫苗，其中第一多核苷酸序列與第二多核苷酸 序列按照處于閱讀框內(nèi)的方式連接。
22.根據(jù)權(quán)利要求中19-21任一項(xiàng)所述的疫苗，其中第二多核苷酸序列插入到編碼跨 膜蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其中跨膜蛋白是lamB。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-23任一項(xiàng)所述的疫苗，其中疫苗包含一個(gè)以上拷貝的第二多核 苷酸序列。
25.一種增強(qiáng)受試者中對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的方法，包括向受試者施用疫苗載 體，所述疫苗載體包含編碼fliC多肽的第一多核苷酸序列和編碼能f與CD40結(jié)合的CDlM 多肽的第二多核苷酸序列，其中⑶1 多肽具有50個(gè)以下氨基酸并包含SEQ ID N0:8的 140-149氨基酸或其同源物，并且所述的疫苗載體以有效增強(qiáng)受試者對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免 疫反應(yīng)的量施用。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中fIiC多肽包括SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 1 的免疫原性片段、SEQ ID NO 2 的 免疫原性片段、SEQ IDN0:10的免疫原性片段、SEQ ID NO 11的免疫原性片段或SEQ IDNO 12的免疫原性片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或沈所述的方法，其中CDlM多肽包括SEQIDNO :3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO :5, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27任一項(xiàng)所述的方法，其中疫苗載體是細(xì)菌疫苗載體。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，細(xì)菌在其表面上包含fIiC多肽和⑶巧4多肽中的至 少一個(gè)。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀或四所述的方法，其中細(xì)菌選自沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、桿菌屬 或乳酸菌屬。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中細(xì)菌是腸炎沙門氏菌。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中細(xì)菌是選自ATCC保藏號(hào)為PTA-7871、ATCC保 藏號(hào)為PTA-7872或ATCC保藏號(hào)為PTA-7873的腸炎沙門氏菌13A。
33.根據(jù)權(quán)利要求25-32任一項(xiàng)所述的方法，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸中至 少一個(gè)插入到編碼跨膜蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中跨膜蛋白是lamB。
35.根據(jù)權(quán)利要求25-34任一項(xiàng)所述的方法，其中疫苗包含一個(gè)以上拷貝的第一多核 苷酸序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求25-35任一項(xiàng)所述的方法，其中疫苗包含一個(gè)以上拷貝的第二多核 苷酸序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求25-36任一項(xiàng)所述的方法，其中第一多核苷酸序列與第二多核苷酸 序列按照處于閱讀框內(nèi)的方式連接。
38.根據(jù)權(quán)利要求25-37任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)菌通過選自口服、鼻內(nèi)、非腸道或卵內(nèi)的方法施用。
39.根據(jù)權(quán)利要求25-38任一項(xiàng)所述的方法，其中增強(qiáng)的免疫反應(yīng)包括增強(qiáng)的抗體反應(yīng)。
40.根據(jù)權(quán)利要求25-39任一項(xiàng)所述的方法，其中增強(qiáng)的免疫反應(yīng)包括增強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)。
41.根據(jù)權(quán)利要求25-40任一項(xiàng)所述的方法，其中受試者是家禽類物種成員。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中家禽類物種是雞。
43.根據(jù)權(quán)利要求25-40任一項(xiàng)所述的方法，其中受試者是哺乳動(dòng)物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中受試者是人類。
45.根據(jù)權(quán)利要求25-44任一項(xiàng)所述的方法，其中向受試者施用大約IO4至約IO9個(gè)細(xì)菌。
46.根據(jù)權(quán)利要求25-45任一項(xiàng)所述的方法，其中向受試者施用大約IO5至約IO7個(gè)細(xì)菌。
47.根據(jù)權(quán)利要求25-46任一項(xiàng)所述的方法，其中在給受試者施用前殺死細(xì)菌。
48.根據(jù)權(quán)利要求25-46任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)菌在受試者體內(nèi)不能復(fù)制。
49.一種增強(qiáng)受試者中對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的方法，包括向受試者施用腸炎沙 門氏菌13A的變異體，所述的變異體包含編碼fliC多肽的外源的第一多核苷酸序列，變異 體以有效增強(qiáng)受試者對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的量施用。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中fIiC多肽包括SEQID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12、SEQID NO 1 的免疫原性片段、SEQ ID NO 2 的免 疫原性片段、SEQ IDNO 10的免疫原性片段、SEQ ID NO 11的免疫原性片段或SEQ IDNO 12的免疫原性片段。
51.根據(jù)權(quán)利要求49或50任一項(xiàng)所述的方法，其中疫苗包含一個(gè)以上拷貝的第一多核 苷酸序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求49-51任一項(xiàng)所述的方法，其中第一多核苷酸序列插入到編碼跨膜 蛋白的外部部分的多核苷酸序列中。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中跨膜蛋白是lamB。
54.根據(jù)權(quán)利要求49-53任一項(xiàng)所述的方法，還包含編碼能與⑶40結(jié)合的OTlM多 肽的第二多核苷酸序列，其中⑶154多肽具有50個(gè)以下氨基酸并包含SEQ ID NO :8的 140-149氨基酸或其同源物。
55.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中CDlM多肽包括SEQIDN0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5, SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7。
56.根據(jù)權(quán)利要求M-55任一項(xiàng)所述的方法，其中第一多核苷酸序列與第二多核苷酸 序列按照處于閱讀框內(nèi)的方式連接。
57.根據(jù)權(quán)利要求49-56任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)菌通過選自口服、鼻內(nèi)、非腸道或 卵內(nèi)的方法施用。
58.根據(jù)權(quán)利要求49-57任一項(xiàng)所述的方法，其中增強(qiáng)的免疫反應(yīng)包括增強(qiáng)的抗體反應(yīng)。
59.根據(jù)權(quán)利要求49-58任一項(xiàng)所述的方法，其中增強(qiáng)的免疫反應(yīng)包括增強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)。
60.根據(jù)權(quán)利要求49-59任一項(xiàng)所述的方法，其中受試者是家禽類物種成員。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中家禽類物種是雞。
62.根據(jù)權(quán)利要求49-59任一項(xiàng)所述的方法，其中受試者是哺乳動(dòng)物。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中受試者是人類。
64.根據(jù)權(quán)利要求49-63任一項(xiàng)所述的方法，其中向受試者施用大約IO4至約IO9個(gè)細(xì)菌。
65.根據(jù)權(quán)利要求49-64任一項(xiàng)所述的方法，其中在給受試者施用前殺死細(xì)菌。
66.根據(jù)權(quán)利要求49-64任意項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)菌不能在受試者體內(nèi)復(fù)制。
67.一種降低受試者中與有鞭毛的細(xì)菌感染相關(guān)的發(fā)病率的方法，包括向受試者施用 疫苗載體，所述疫苗載體包含編碼fliC多肽的第一多核苷酸序列和編碼能與CD40結(jié)合的 ⑶154多肽的第二多核苷酸序列，⑶巧4多肽具有50個(gè)以下氨基酸并包含SEQ ID NO 8的 140-149氨基酸或其同源物，并且所述的細(xì)菌以有效增強(qiáng)受試者對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反 應(yīng)的量施用。
68.一種降低受試者中與有鞭毛的細(xì)菌感染相關(guān)的發(fā)病率的方法，包括向受試者施用 腸炎沙門氏菌13A的變異體，所述的變異體包含編碼f IiC多肽的外源的第一多核苷酸序 列，變異體以有效增強(qiáng)受試者對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的量施用。
69.一種限制沙門氏菌疫苗載體引起的感染的方法，包括向受試者施用沙門氏菌疫苗 載體并且施用包含編碼fliC多肽的第一多核苷酸序列的第二疫苗載體，其中第二疫苗載 體增強(qiáng)對(duì)沙門氏菌的免疫反應(yīng)并限制沙門氏菌疫苗載體引起的感染。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含fliC和CD154多肽的疫苗及包含fliC多肽的腸炎沙門氏菌疫苗載體。本發(fā)明還提供了增強(qiáng)針對(duì)有鞭毛的細(xì)菌的免疫反應(yīng)的方法以及降低與有鞭毛的細(xì)菌感染相關(guān)的發(fā)病率的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102037135SQ200880116911
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者B·哈格斯, K·喬菜, L·博格曼, M·考克斯, S·萊頓, W·博特吉, Y·M·權(quán) 申請(qǐng)人:德克薩斯A&M大學(xué)體系, 阿肯色大學(xué)評(píng)議會(huì)