專(zhuān)利名稱(chēng)：純化病毒懸浮液的方法
純化病毒懸浮液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒純化領(lǐng)域，特別地涉及用于從液體病毒懸浮液獲得 病毒的方法。
用于純化病毒懸浮液的方法在制藥領(lǐng)域特別是在疫苗領(lǐng)域中是已 知的。
因此，特別是專(zhuān)利FR2201079描述了 一種用于從病毒懸浮液純化病 毒的方法，其中在區(qū)域離心機(jī)停止時(shí)，將所述病毒懸浮液加入到分帶離 心機(jī)的轉(zhuǎn)子中；在轉(zhuǎn)子開(kāi)始緩慢(2000 5000rpm)旋轉(zhuǎn)后，在轉(zhuǎn)子的外周 加入至少兩個(gè)不同密度的液體緩沖層(coussinsdeliquide);接著， 一旦轉(zhuǎn) 子被填充了待處理的液體，則將所述轉(zhuǎn)子加速至足以從雜質(zhì)分離病毒的 速度；以及最后，在轉(zhuǎn)子速度返回到2000 5000rpm之間的速度后，在 周邊加入密度等于或大于轉(zhuǎn)子內(nèi)含物的液體，以通過(guò)其中央通道(conduit central)清空轉(zhuǎn)子；隨后收集除去雜質(zhì)的含有病毒的級(jí)分。
在旋轉(zhuǎn)過(guò)程中，不同密度的緩沖層(cousins)通過(guò)擴(kuò)散被轉(zhuǎn)化成非線 性梯度。
在所述專(zhuān)利中描述的方法是不連續(xù)的方法，但是其具有僅可能處理 恒定和有限體積的病毒懸浮液的缺陷，因此必須對(duì)待純化的病毒懸浮液 進(jìn)行預(yù)先濃縮和/或重復(fù)該相同操作多次以便處理大體積的液體。
使用這類(lèi)方法還使具有一種完全在無(wú)菌條件下進(jìn)行的方法嘗試變 得復(fù)雜。
本發(fā)明的目的是一種用于從液體病毒懸浮液獲得病毒的方法，根據(jù) 該方法，將所述病毒懸浮液進(jìn)行基于密度梯度超速離心 (ultracentrifugation sur gradient), 特征在于,
-所述超速離心是連續(xù)進(jìn)行的，
-所述密度梯度是包含至少兩個(gè)平臺(tái)(palier)的不連續(xù)梯度。
因此，可以將該純化步驟整合到在線制造工藝中，其能夠降低污染
的風(fēng)險(xiǎn)，并且能夠?qū)崿F(xiàn)從工業(yè)的觀點(diǎn)來(lái)看是有利的自動(dòng)化。
才艮據(jù)本發(fā)明方法的特定特征，在超速離心才幾的入口施加給病毒懸浮
液的離心力為36 000 60 000 g,而在外周的出口處離心力以90 000
120 OOOg存在。200880021787.2
因此，最佳的是病毒能夠滲入密度梯度層中，而病毒懸浮液中不期 望的成分則直接穿過(guò)超速離心機(jī)并被除去，而不滲入該梯度中或者即使 滲入梯度中但遷移非常小。
根據(jù)本發(fā)明方法另一特定特征，所述密度梯度是平臺(tái)形式的蔗糖梯 度，這是通過(guò)疊置至少兩個(gè)不同密度的蔗糖層以及緩沖液溶液層而獲 得的。
由此獲得至少兩個(gè)很好區(qū)別的對(duì)應(yīng)密度的"跳躍"的平臺(tái)，這能夠 4艮好地分離病毒懸浮液的成分。
通過(guò)參考附圖閱讀后面詳細(xì)描述的說(shuō)明書(shū)之后，本發(fā)明的許多優(yōu)點(diǎn) 將顯現(xiàn)，其中所迷附圖示意表示可以實(shí)施本發(fā)明的裝置。


圖1用示意圖描述了用于實(shí)施本發(fā)明的在停止?fàn)顟B(tài)時(shí)的裝置。
圖2用示意圖描述了用于實(shí)施本發(fā)明的在運(yùn)行狀態(tài)時(shí)的裝置。
特別適合實(shí)施本發(fā)明的超速離心裝置的例子是例如描述于專(zhuān)利申 請(qǐng)US 2005/0215410中的裝置。
正如在附圖中所描繪的，這類(lèi)裝置主要由轉(zhuǎn)子構(gòu)成，所述轉(zhuǎn)子包含 構(gòu)成了具有中央核心2的罐的圓柱外殼1。該罐在其下部具有待處理液 體的入口 3，在其上部具有出口4。為了簡(jiǎn)化，沒(méi)有描繪該裝置不同部 分的的驅(qū)動(dòng)手段和固定手段。
在外殼1和核心2之間可以利用的容積被密度梯度所占據(jù)，其中根 據(jù)本發(fā)明，所述密度梯度由至少兩個(gè)不同密度的層5和6,以及緩沖溶 液層7構(gòu)成。如圖l所示，在停止時(shí)，這些密度梯度的層水平疊置，密 度最高的層處于下面，緩沖液層則位于上面。如圖2所示，當(dāng)該裝置被 使用時(shí)，不同密度的層圍繞核心同心地配置，其中密度最高的層在距離 核心最遠(yuǎn)的位置，而從入口 3進(jìn)入的待處理病毒懸浮液則在通過(guò)出口 4 被排出之前在接近核心的區(qū)域內(nèi)流通。
根據(jù)本發(fā)明，所處理的病毒懸浮液是液體懸浮液，其含有可以是活 著或非活著的病毒。它們可以是在制備疫苗中所使用的病毒，特別是流 感、麻滲、腮、腺炎、皰瘆、黃熱病、狂犬病或脊髓灰質(zhì)炎病毒或所有具 有使其可以用于預(yù)防疾病的特征的其他病毒。這些病毒可以通過(guò)在細(xì) 胞、或器官或者(對(duì)于流感病毒的情況)在雞蛋上進(jìn)行培養(yǎng)而制備。對(duì)于 在細(xì)胞上制備病毒的情況，待除去的主要成分是蛋白質(zhì)和細(xì)胞DNA。對(duì) 于在雞蛋上制備病毒的情況，適合除去的成分之一是卵清蛋白。事實(shí)上，
4歐洲衛(wèi)生局(autoriti6s de sant6 en Europe)建立的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定了每劑量的給 藥疫苗l昭卵清蛋白的限制闕值。當(dāng)然，工業(yè)公司盡力充分降低到所批 準(zhǔn)的闕值之下；因此重要的是能夠提供簡(jiǎn)單并且有效的方法，其能夠最 大地減少產(chǎn)生自病毒生產(chǎn)的雜質(zhì)。
本發(fā)明的方法是非常有利的，并且顯示出，在待處理的病毒懸浮液 是由包含流感病毒的尿嚢液構(gòu)成時(shí)，高度有效性，其中其適合分離產(chǎn)生 自用于病毒傳代的雞蛋的卵清蛋白。
本發(fā)明的方法是在單一的區(qū)域超速離心步驟中進(jìn)行的。為此目的， 所使用的超速離心機(jī)的罐是圓柱罐，其壁優(yōu)選是由鈦制成的；在其中心， 其具有圓柱核心，該圓柱核心具有允許流體流動(dòng)的凹槽；該核心有利地 由NorylTM制成。根據(jù)本發(fā)明，在核心和外壁之間可以利用的容積足以 引入能夠產(chǎn)生具有至少二個(gè)平臺(tái)的密度梯度的產(chǎn)品。因此，已經(jīng)注意到， 通過(guò)使用具有K10核心的KII型超速離心系統(tǒng)，獲得完全適合本發(fā)明的 8升的容積。 、
為了確保通過(guò)密度梯度的純化，將至少3個(gè)不同密度的層在停止時(shí) 裝載到超速離心機(jī)的罐中?？梢酝ㄟ^(guò)使用各種產(chǎn)品獲得該密度梯度，例 如蔗糖、氯化銫、酒石酸鉀或溴化鉀；利用蔗糖已經(jīng)獲得了特別好的結(jié) 果。因此，可以獲得3個(gè)層，其中2層由不同濃度蔗糖構(gòu)成，所述層之 一由緩沖溶液構(gòu)成。根據(jù)待純化的病毒懸浮液的性質(zhì)，可以考慮更多的 層，這將能夠獲得更多不同密度的平臺(tái)。
裝載是通過(guò)首先加入緩沖液體，接著以提高密度的順序引入所述緩 沖層；這種裝載是在停止時(shí)進(jìn)行的。
當(dāng)所有都已裝載時(shí)，將轉(zhuǎn)子加速到最高速度，即35 000 ~ 40 500 rpm。在加速過(guò)程中，通過(guò)入口 3加入待處理的病毒懸浮液。如 圖2所示，這時(shí)待處理液體沿著核心2流動(dòng)；在此位置，其受到36 000 ~60000g的離心力，而在靠近外壁的加速度為90 000- 120 000 g;盡 管待處理液體在其進(jìn)入超速離心機(jī)處受到了相對(duì)低的離心力，但病毒可 以滲入梯度內(nèi)部，并且沒(méi)有觀察到所擔(dān)心的病毒的過(guò)多損失。 一些不期
望的蛋白質(zhì)或顆粒也能夠滲入該梯度中；然而，不同的密度平臺(tái)將構(gòu)成 對(duì)于在開(kāi)始時(shí)病毒懸浮液中存在的某些成分無(wú)法通過(guò)的屏障。由于病毒 是重顆粒，因此他們自身能夠遷移到接近梯度端點(diǎn)的等密度點(diǎn)。根據(jù)本 發(fā)明，獲得了非常好的病毒/卵清蛋白的分離。借助于單個(gè)超速離心步驟，由此獲得99%的卵清蛋白的去除。
在全部體積的病毒懸浮液都被處理之后，通過(guò)不同密度級(jí)分回收密 度梯度的液體，并進(jìn)行處理以從密度最大的級(jí)分中分離病毒。 、
接著可以利用常規(guī)方法對(duì)病毒進(jìn)行滅活或處理。
令人吃驚地，無(wú)論高加速以及該加速的持續(xù)時(shí)間，本發(fā)明能夠保持 這些密度梯度平臺(tái)。事實(shí)上，本發(fā)明人曾經(jīng)擔(dān)心足夠大的8L容積會(huì)導(dǎo) 致梯度的不穩(wěn)定性，并且還擔(dān)心由于與現(xiàn)有技術(shù)中通常使用的裝置相比 該裝置入口的旋轉(zhuǎn)速度被降低導(dǎo)致會(huì)有顯著的病毒損失。
實(shí)施例從雞蛋尿嚢液純化流感病毒
提供KII型超速離心系統(tǒng)，在其中心具有Alfa Wasserman提供的
K10核心。
在停止時(shí)，將下列連續(xù)加入到轉(zhuǎn)子中
-稍微超過(guò)8L的125 mM檸檬酸鹽緩沖液，
-3.4 1^34%嚴(yán)糖溶液，其置換了部分檸檬酸鹽緩沖液，
-1.6 L 55%蔗糖溶液，其同樣置換了部分檸檬酸鹽緩沖液。
接著，將轉(zhuǎn)子加速最高達(dá)到35 000 rpm的速度，并將待處理的尿嚢
液即60升以10升/小時(shí)的速度加入。該尿嚢液已經(jīng);波預(yù)先澄清并濃縮，
以除去一部分污染物；其含有期望分離以將其引入疫苗中的流感病毒。 進(jìn)行超速離心6小時(shí)，接著通過(guò)用125 mM檸檬酸替換尿嚢液進(jìn)行
沖洗1小時(shí)。該沖洗階段不僅能夠除去梯度入口處的雜質(zhì)，而且并尤其
為病毒提供了更多的時(shí)間以遷移至它的等密度區(qū)。
在所有待處理液體都已經(jīng);故超離心之后，停止旋轉(zhuǎn)并分32個(gè)250ml
的級(jí)分收集梯度。
接著在折射率、光學(xué)密度和特別是清蛋白定量方面對(duì)這些級(jí)分進(jìn)行 分析。觀察到獲得了非常好的病毒/清蛋白分離。保存含有47 35%蔗糖 的級(jí)分，其為含有最大量的病毒和最小量的卵清蛋白的級(jí)分。
接著將這些級(jí)分合并，并在分級(jí)之前，通過(guò)稀釋標(biāo)準(zhǔn)化至恒定的光 學(xué)密度值(這是病毒蛋白質(zhì)含量的指標(biāo))，接著滅活和過(guò)濾以獲得分離的 滅活病毒顆粒的懸浮液。
觀察到，根據(jù)本發(fā)明方法純化的病毒在片段化之前是完整的病毒， 在所收獲的級(jí)分中卵清蛋白的濃度對(duì)于這些病毒后面用于疫苗制劑而言是足夠低的，符合歐洲藥典(Pharmacop6e Europ6ene)關(guān)于要求卵清蛋白低于1 ng/劑量的量的規(guī)定。
權(quán)利要求
1.用于從液體病毒懸浮液獲得病毒的方法，根據(jù)該方法，使病毒懸浮液經(jīng)受基于密度梯度的超速離心，其特征在于-所述超速離心是連續(xù)進(jìn)行的，-所述密度梯度是包含至少兩個(gè)平臺(tái)的不連續(xù)梯度。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在超速離心機(jī)的入口施加給 液體病毒懸浮液的離心力為36 000~60 000 g的值。
3. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在密度梯度的末 端施加給病毒懸浮液的離心力為90 000 120 000 g的值。
4. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述密度梯度是 通過(guò)疊置至少兩個(gè)不同密度的蔗糖層和緩沖溶液層而獲得的蔗糖梯度。
5. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在超速離心機(jī)內(nèi) 可用于所述液體流通和密度梯度的容積是大約8升。
6. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在所述超速離心 機(jī)中病毒懸浮液的流速是大約10升/小時(shí)。
7. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于待處理的液體病 毒懸浮液包含懸浮在濃縮尿嚢液中的流感病毒和卵清蛋白。
8. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，根據(jù)該方法 -在全部病毒懸浮液都已被處理之后，通過(guò)增大或降低的梯度的級(jí)分回收超速離心機(jī)中存在的蔗糖，-保存含有所述病毒的密度最高的級(jí)分。
9. 用于實(shí)施前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述方法的裝置，其至少包含 -能夠達(dá)到至少35 000rpm的旋轉(zhuǎn)速度的轉(zhuǎn)子，其包含具有鈦壁的圓柱形罐以及由NoryFM制成的帶橫肋的內(nèi)部核心， -待處理病毒懸浮液的入,口 ， -經(jīng)過(guò)處理的液體的出口， 其特征在于-所述密度梯度由至少兩個(gè)不同密度的蔗糖層和由緩沖溶液構(gòu)成的 層構(gòu)成，-還在于可以用于密度梯度和待處理流體流通的容積是大約8升。
全文摘要
本發(fā)明目的為從液體病毒懸浮液獲得病毒的方法，根據(jù)該方法使病毒懸浮液經(jīng)受基于密度梯度的超速離心，超速離心是以連續(xù)方式進(jìn)行的，以及密度梯度是包含至少兩個(gè)平臺(tái)的不連續(xù)梯度。
文檔編號(hào)C12N7/02GK101688188SQ200880021787
公開(kāi)日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日
發(fā)明者A·弗蘭康, J·-M·康特詹, M·塔爾迪, O·布拉斯 申請(qǐng)人:賽諾菲巴斯德有限公司