專利名稱：：核酸的制作方法核酸本發(fā)明涉及核酸和它們作為疫苗的用途，所述核酸編碼T細(xì)胞表位，針對(duì)所述表位將會(huì)引發(fā)一種免疫應(yīng)答。這種疫苗可被用于治療腫瘤。在癌癥疫苗和慢性病毒感染的領(lǐng)域，現(xiàn)在變得清楚的是，除了頻率之外的因素，例如腫瘤特異性T細(xì)胞的功能性親和力和啟動(dòng)途徑，是將疫苗效力最大化的主要決定因素。若干小組已經(jīng)證明，高親和力的CD8+T細(xì)胞展示優(yōu)秀的抗月中瘤活性(Alexander-Miller,/附柳朋o/ogzc2005;31:13-24,Hodge等，J/附附w朋/2005;174:5994-6004,Valmori等，J/w附w朋/2002;168:4231-40,Zeh等，J/附mw朋/1999;162:989-94)。據(jù)建議，高親和力的T細(xì)胞在患者肺瘤退化中扮演重要角色。這被一項(xiàng)研究例證，其中在所述研究中，高親和力的抗原特異性的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)在帶有顯著腫瘤退化的患者中被檢測(cè)到(Khong&Rosenberg,J7附w柳o/2002;W8:951-6)。還有證據(jù)正在出現(xiàn)以證明在體外被激發(fā)的自體腫瘤特異性T細(xì)胞的過(guò)繼性轉(zhuǎn)移是成功的，可能是因?yàn)樵隗w外的刺激使得選擇高親和力的T細(xì)胞成為可能(Vignard等，J/附附朋o/2005;175:4797-805,Dudley等，//附附柳W/er2001;24:363-73，Morgan等，J/附m朋o/2003;171:3287-95,Rosenberg&Dudley,尸racee(i/wg^o/Ae7V加'owa/Jc<af<ie，o/5We"ce51o/。/為e".ra2004;101S卿l2:14639-45)。到目前為止，若干小組已經(jīng)嘗試使用一種抗體作為該表位的運(yùn)載體(carrier)來(lái)針對(duì)預(yù)定的表位引發(fā)一種細(xì)胞免疫應(yīng)答。例如，WO96/19584(Bona等)公開了在其中T細(xì)胞表位被插入抗體的互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)的嵌合抗體，并提出這種嵌合抗體適合于引發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。然而，此文件教導(dǎo)的是DNA必須編碼功能蛋白。因此在摘要中陳述，"所述表位和母體免疫球蛋白的功能能力被保留"。并且，在第21頁(yè)上陳述，"所期望的表位的插入應(yīng)該是在編碼所述母體免疫球蛋白分子的核酸的區(qū)域，5其中所述區(qū)域?qū)λ瞿阁w免疫球蛋白分子的表達(dá)或功能不是必要的"。此外，WO96/19584中所有實(shí)施例顯示，完整的免疫球蛋白是在T細(xì)胞表位的插入之后^皮產(chǎn)生的。編號(hào)為7,067,110的美國(guó)專利公開了使用抗體的融合蛋白來(lái)引起針對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的方法，其中所述融合蛋白缺少通過(guò)多狀鍵融合到抗原的免疫球蛋白可變區(qū)域結(jié)構(gòu)域。所述融合蛋白保留結(jié)合到Fc的能力。EP0759944公開了將T細(xì)胞表位并入抗體分子內(nèi)的方法，其中所述抗體分子作為完整的免疫球蛋白被分泌，并能將CTL表位靶向至腫瘤以使它們成為CTL更好的靶。WO00/64488公開了CTL應(yīng)答可由編碼嵌合抗體的核酸引發(fā)，其中所述嵌合抗體具有被插入CDR而非其可變區(qū)域的異源性T細(xì)胞表位，只要所述核酸被導(dǎo)向在B細(xì)胞中表達(dá)。由于B細(xì)胞不能激發(fā)原初T細(xì)胞應(yīng)答，WO00/64488中所述疫苗將只在提高預(yù)先存在的T細(xì)胞應(yīng)答時(shí)有用。WO02/092126公開了CTL應(yīng)答可由包括異源性T細(xì)胞表位和部分人Fc的多肽引發(fā)，其中所述多肽結(jié)合到高親和性CD64受體。然而，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)證明，通過(guò)在例如不適當(dāng)?shù)腃DR或甚至抗體的可變區(qū)域內(nèi)插入T細(xì)胞表位而破壞抗體序列預(yù)防了重鏈和輕鏈的締合，并且沒(méi)有分泌功能抗體。編碼這些4晉折疊的抗體的DNA意外地產(chǎn)生強(qiáng)烈的T細(xì)胞應(yīng)答。此外，這不是通過(guò)CD64介導(dǎo)的，因?yàn)椴慌c小鼠或人CD64結(jié)合的人IgG2同人IgGl—樣有效地工作。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種核酸，其包括非特異性啟動(dòng)子和編碼多肽的至少一種序列，其中所述多肽中具有至少一種異源性T細(xì)胞表位但沒(méi)有任何調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位。此多肽優(yōu)選地是同源的運(yùn)載體，例如當(dāng)被用來(lái)提高人體中的T細(xì)胞應(yīng)答時(shí)它可以是人蛋白或外來(lái)蛋白或?qū)⑺蠺調(diào)節(jié)性表位鑒定并去除的人/外來(lái)嵌合蛋白。所述多肽優(yōu)選地是異二聚體的一條鏈，所述異源性T細(xì)胞表位導(dǎo)致所述異二聚體鏈的破壞以致于它不能結(jié)合或締合所述異二聚體的另一條鏈。很多分子是異二聚的，其一條鏈依賴于另一條而折疊并然后分泌。如果所述二級(jí)結(jié)構(gòu)由于異源性T細(xì)胞表位的插入而破裂，那么折疊和分泌就被抑制。在某些實(shí)施方案中，一條鏈被分泌并包含異源性CTL表位，而另一條鏈包含異源性輔助表位，但由于二級(jí)折疊的破壞而不被分泌。因此，所述核酸可編碼所述異二聚體的兩條鏈，其中一條鏈包含異源性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位并在表達(dá)時(shí)被分泌，而另一條鏈包含異源性輔助表位并在表達(dá)時(shí)不被分泌。可選擇地，各自的異二聚體鏈可在分開的核酸分子上被編碼。所述異二聚體可以是免疫球蛋白分子。所述免疫球蛋白分子的重鏈可包含異源性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位并在表達(dá)時(shí)被分泌，而所述免疫球蛋白分子的輕鏈可包含異源性輔助表位并在表達(dá)時(shí)不被分泌。本發(fā)明第一個(gè)方面中所述的核酸編碼不含有任何調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)表位的多肽。這些多肽作為T細(xì)胞表位的惰性運(yùn)載體而起作用，并可以是被免疫系統(tǒng)用來(lái)激發(fā)免疫應(yīng)答的分子或分子的一部分，因?yàn)楦鶕?jù)定義這些分子不表達(dá)竟?fàn)幮訲reg表位。適合的分子包括HLA分子、T細(xì)胞受體、TOL受體、TOL配體、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、趨化因子、趨化因子受體。優(yōu)選地，所述分子是抗體或其一部分。不希望被理論約束，本發(fā)明至少部分地基于如下的概念T細(xì)胞應(yīng)答可針對(duì)特異性的T細(xì)胞表位(例如CTL表位)通過(guò)施用編碼包括所迷T細(xì)胞表位而非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位的多肽的核酸而被產(chǎn)生。人們相信，核酸或者被抗原呈遞細(xì)胞(APC)吸收，遷移到淋巴結(jié)并被直接呈遞，或者被表達(dá)以產(chǎn)生被分泌然后被其他APC吸收的多肽。前一個(gè)核酸適合于激發(fā)輔助T細(xì)胞表位，而后一個(gè)適合于激發(fā)CTL應(yīng)答。由所述核酸編碼的多肽理想地不具有任何天然T細(xì)胞表位。在這點(diǎn)上，適合的多肽是免疫分子，例如抗體。不能締合以使得輕鏈留在APC中而重鏈被分泌的抗體重和輕鏈適合于本發(fā)明的實(shí)施，雖然本發(fā)明不限于使用抗體作為所述T細(xì)胞表位的運(yùn)載體。約40年前鑒定了抑制性T細(xì)胞的群體，但其發(fā)展卻因鑒定細(xì)胞的特殊技術(shù)的缺乏和關(guān)于阻遏之存在的科學(xué)懷疑而;f皮阻礙。然而，Sakaguchi等在1995年復(fù)蘇了對(duì)抑制性細(xì)胞的興趣，他們證明，將耗盡了CD4+CD25+T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)無(wú)胸腺小鼠導(dǎo)致了受體小鼠身上各種自身免疫疾病的發(fā)生，以及CD4+CD25+T細(xì)胞的重建避免了這些小鼠中的自身免疫反應(yīng)(Sakaguchi等J./附m/"o/1995;155:1151-1164)。接著，在小鼠和人身上的許多研究表明，具有調(diào)節(jié)活性的各種T細(xì)胞群體在對(duì)自身(控制自身耐受性XSakaguchi等丄//wm/"o/1995;155:1151-1164)以及外來(lái)抗原(Shevach:/附附朋辦2006;25:195-201,Coleman等，《/.Ce〃Mo/.2007;11:1291-1325)的免疫應(yīng)答(既是先天的又是適應(yīng)的)的阻遏上扮演重要角色。小鼠癌癥模型中Treg細(xì)胞的耗盡顯示促進(jìn)內(nèi)源的免疫介導(dǎo)的腫瘤排斥(Shimizu,等，</./附膽wo/.1999;163:5211-5218,Onizuka等，C朋cerie化wr/21999;59:3128-3133)和抗原特異性的抗腫瘤免疫性(Tanaka,等，/mww朋溈e/:2002;25:207-217)。此外，Treg細(xì)胞的耗盡加強(qiáng)腫瘤的免疫療法包括疫苗接種(Tanaka，等，丄/附ww"oAw2002;25:207-217,Dannull等，丄/騰就2005;115:3623-3633)和CTLA隱4阻斷(Sutmuller等，丄Mo/.2001;194:823-832)。此外，Treg細(xì)胞的數(shù)量在外周血液中增加(Woo等，C離er尺e廳rc/z2001;61:4766-4772,Curiel等，淑,Me血/we2004;10:942-949,Wolf等，C//w.C朋ceri^^^/z2003;9:606-612,Sasada等,C朋cer2003;98:1089-1099)，并在患有不同癌癥的患者的腫瘤微環(huán)境和？1流淋巴結(jié)中增殖(Curiel等，Me&d"e2004;10:942-949,Sasada等,O"cer2003;98:1089-1099,Liyanage等，J./w/w柳o/ogy2002;169:2756-2761,Matsuura等，2006;106:1227-1236,Yang等，S/o^/2006;107:3639-3646,Alvaro等，C//w.C朋ceri^^wr//2005;11:1467-1473)。在患有胃癌(Sasada等，C朋cw2003;98:1089-1099,Ichihara等，C/,'"/ca/C朋cwie^"rc/22003;9:4404-4408)和卵巢癌(Curiel等，A^weMWzc'/we2004;10:942-949)的患者中，差的預(yù)后和減少的存活率與更高的Treg細(xì)胞頻率有關(guān)。Treg細(xì)胞還顯示阻遏/抑制腫瘤特異性CD8+(Liyanage等，/附w朋o/ogy2002;169:2756-2761,Piccirillo等，丄/附w朋o/ogv2001;167:1137-1140,Mempel等,/附www/(y206;25:129-141,Annacker等,J./附mw"o/ogy2001;166:3008-3018,Woo等，丄Jmmw"o/ogy2002;168:4272-4276)和CD4+(Liyanage等,J.7w臓wo/ogy2002;169:2756-2761,Ichihara等,C7z力/ca/Ca"ceri^earc//2003;9:4404-4408,Nishikawa等，2005;106:1008-1011)T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生(IFNy，IL-2)和細(xì)胞溶解活性。此外，Treg細(xì)胞能阻遏樹突細(xì)胞(Romagnani等，五w:,/ww柳o/.2005;35:2452-2458)、NK細(xì)胞(Ralainirina等,J.丄ewybc.飾/.2007;81:144-153)和B細(xì)胞(Lim等,J./附www/ogy2005;175:4180-4183)的功能。合起來(lái)看，這些研究表明Treg細(xì)胞在腫瘤免疫病理學(xué)上的重要作用，并指出Treg細(xì)胞頻率和肺瘤生長(zhǎng)之間的緊密關(guān)聯(lián)。Treg細(xì)胞^皮分為天然的CD4+CD25+T細(xì)胞和多種群體的誘導(dǎo)的/適應(yīng)性的Treg細(xì)胞(Shevach,/函謹(jǐn)(y2006;25:195-201,Bluestone等，淑/附附朋o/.2005;6:345-352)(表1)。小鼠和人的約5%-10%的CD4+T細(xì)胞是天然的Treg細(xì)胞(Sakaguchi等，/附w朋o/ogy2005;6:345-352)。天然的Treg細(xì)胞在胸腺中通過(guò)與自體肽的強(qiáng)的TCR相互作用產(chǎn)生(Picca等,CWre加(9//m》wz力/m,wo/ogy2005;17:131-136,Jordan等,/wm朋o/ogy2001;2(4):301-306,Picca等，/附腿wo/o沐"/Kev/e鄉(xiāng)2006;212:74-85),而誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞從外周的非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生。此胸腺外轉(zhuǎn)換需要特殊的免疫條件例如連續(xù)暴露于低劑量的抗原，暴露于全身外周抗原或暴露于TGFP(Shevach，/附mw"砂2006;25:195-201,Akbar等，7V抓J附附朋o/.2007;7:231-237)。Treg細(xì)胞可通過(guò)下面的機(jī)制中的一種或其組合來(lái)介導(dǎo)它們的阻遏i)細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴的機(jī)制，ii)通過(guò)免疫抑制的細(xì)胞因子如IL-10或TGFP的分泌，或iii)直接殺死靶細(xì)胞的穿孔素-粒酶途徑(vonBoehmer,Atowre/附鵬wo/ogy2005;6(4):338-344)。迄今，人Treg細(xì)胞的抗原特異性被知道的很少。Wang等報(bào)道了癌癥患者中LAGE-1特異性的CD4+CD25+GITR+功能性Treg細(xì)胞克隆的鑒定(Wang等，Zwww"/砂2004;20:107-118)。Vence等證明了胂瘤抗原特異性的CD4+Treg細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者外周血液中的存在(Vence等，2007;104(52):20884-20889)。這些Treg細(xì)胞識(shí)別一大批的肺瘤抗原，其包括TRP1、NY-ESO-l、gp100和存活蛋白。此外，Vence等最先證明了NY-ESO-l特異性的Treg細(xì)胞表位在NY-ESO-l分子內(nèi)的存在。此外，據(jù)顯示，用載有合成肽或腫瘤裂解液的樹突細(xì)胞對(duì)黑素瘤患者的疫苗接種誘導(dǎo)了Treg細(xì)胞頻率的增加，這與腫瘤特異性的CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)張伴隨(Chakraborty等，//ww./mww朋/ogy2004;65:794-802)。這暗示所述疫苗含有未一皮鑒定的Treg細(xì)胞表位以及CD8+T細(xì)胞表位的可能性，這些表位由通過(guò)Treg細(xì)胞T細(xì)胞受體(TCR)的配體特異性激活而導(dǎo)致Treg細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)張。被廣泛接受的是，Treg細(xì)胞需要通過(guò)TCR識(shí)另'J/結(jié)合的抗原特異性激活，但介導(dǎo)抗原非特異性的旁觀者阻遏(Thorton&Shevach,J./附w朋o/ogv2000;164:183190)。此外，Li等提出了顯性的Treg表位在丙型肝炎病毒核心蛋白中的存在，其中所述核心蛋白刺激被感染的患者中HCV特異性的Treg細(xì)胞(Li等，/附w朋o/.Ce〃說(shuō)o/.2007;85(3):197-204)?？偟膩?lái)說(shuō)，除了近期關(guān)于使用抗內(nèi)皮DNA構(gòu)建體C200Fc對(duì)HHD轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫的發(fā)現(xiàn)，這些研究未能激發(fā)顯著的Tie-2w96特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，而且在C200FcDNA免疫之前(Middleton,博士論文。諾丁漢大學(xué)，2007年11月)耗盡CD4+CD25+Treg細(xì)胞(通過(guò)施用400嗎的PC61單克隆抗體)之后來(lái)自HHD小鼠脾細(xì)胞的分泌Tie-2w96特異性的IFNy的細(xì)胞的提高的頻率表明，DNA疫苗中的Tie-2w96含有未被鑒定的Treg細(xì)胞表位以及CD8+表位。這將解釋所迷疫苗在打破對(duì)自體抗原Tie-2的耐受性以及在HHD小鼠中引出抗肺瘤免疫力的失敗原因，這是由于充足的抗原特異性的擴(kuò)張的Treg細(xì)胞，其阻遏細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，使用惰性免疫運(yùn)載體表達(dá)T效應(yīng)表位是有優(yōu)勢(shì)的，其中所述惰性免疫運(yùn)載體不能表達(dá)Treg表位以將免疫應(yīng)答導(dǎo)向效應(yīng)表位并防止占優(yōu)勢(shì)的Treg應(yīng)答的激發(fā)。有利地，本發(fā)明中的核酸包括編碼一段序列例如前導(dǎo)序列的序列，其中所述前導(dǎo)序列允許被表達(dá)的多核苷酸被分泌。這允許所述多核苷酸被轉(zhuǎn)移到抗原呈遞細(xì)胞(APC)。所述序列可以是與所述多核普酸一起天然表達(dá)的前導(dǎo)序列，或可以是異源的前導(dǎo)序列，例如被加入的免疫球蛋白前導(dǎo)序列。在所述多核苷酸編碼膜結(jié)合分子的情況下，所述后者是特別適合的。才艮據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種核酸，其包括非特異性啟動(dòng)子和編碼免疫球蛋白分子的重組重鏈的至少一種序列，其中所述重鏈中具有至少一種異源性T細(xì)胞表位以致于所述重鏈在所述核酸被表達(dá)時(shí)不能采取10它的天然構(gòu)象。本發(fā)明這個(gè)方面的核酸編碼免疫球蛋白分子的重組重鏈。這種重鏈的結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并通常包括可變的和恒定的區(qū)域。所述重鏈可以來(lái)自抗體。所述抗體可以是單克隆的或多克隆的，并可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM,雖然IgG是優(yōu)選的。所述IgG抗體可以是任何IgG亞類，例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，或小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b或IgG3。所述IgG抗體可以是含有IgG2Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的人IgGl抗體，或含有IgGlFc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的人IgG2抗體。所述重鏈可能含有人抗體的恒定區(qū)域，以及小鼠單克隆抗體的可變的或超可變的(CDR)區(qū)域，其中所述小鼠單克隆抗體被異源性T細(xì)胞表位插入。所述可變區(qū)域而非所述超可變區(qū)域還可衍生自人抗體的可變區(qū)域。當(dāng)應(yīng)用于抗體(即包括一條重鏈和一條輕鏈)時(shí)，據(jù)說(shuō)所述抗體是人源化的。制造人源化抗體的方法是本領(lǐng)域中已知的。方法在例如Winter的編號(hào)為5,225,539的美國(guó)專利中被描述。在'J、鼠超可變區(qū)域外面的重鏈的可變區(qū)域還可衍生自小鼠單克隆抗體。在這種情況下，整個(gè)可變區(qū)域衍生自鼠單克隆抗體并且當(dāng)應(yīng)用于抗體時(shí)，所述抗體據(jù)說(shuō)是被嵌合的。制造嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。這種方法包括例如在Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)的美國(guó)專利中所描述的那些。還分別參見編號(hào)為4,816,397和4,816,567的美國(guó)專利。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸還包括編碼免疫球蛋白分子的輕鏈的至少一種序列?？蛇x地，可以提供編碼免疫球蛋白分子的輕鏈的分離的核酸。所述輕鏈中可具有至少一種異源性T細(xì)胞表位。所述T細(xì)胞表位可以使得當(dāng)所迷核酸被表達(dá)時(shí)所述輕鏈不能采取它的天然構(gòu)象。所述輕鏈可具有本文關(guān)于重鏈所述的任何特性。因此，本發(fā)明還提供編碼免疫球蛋白分子的重組輕鏈的核酸，其中所述輕鏈中具有至少一種異源性T細(xì)胞表位以致于當(dāng)核酸被表達(dá)時(shí)所述輕鏈不能采取它的天然構(gòu)象。所述核酸可包括一個(gè)非特異性啟動(dòng)子。這種核酸編碼免疫球蛋白分子，例如抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)方面，提供了一種核酸，其包括非特異性啟動(dòng)子和編碼重組免疫球蛋白分子的至少一種序列，其中所迷免疫球蛋白分子中具有至少一種異源性T細(xì)胞表位以致于當(dāng)核酸被表達(dá)時(shí)所述免疫球蛋白分子不能采取它的天然構(gòu)象。優(yōu)選地，所述重組的免疫球蛋白分子以及上述的重鏈和輕鏈不具有任何調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位。本發(fā)明還提供一種疫苗，其包括本發(fā)明的核酸和佐劑；一種藥物組合物，其包括本發(fā)明的核酸和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、賦形劑或稀釋劑；本發(fā)明的核酸在醫(yī)學(xué)上的用途；本發(fā)明的這種核酸在制造藥物方面的用途，其中所述藥物激發(fā)針對(duì)至少一種T細(xì)"包表位的免疫應(yīng)答；本發(fā)明的核酸，其激發(fā)針對(duì)至少一種T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答；以及一種激發(fā)針對(duì)T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答的方法，其包括向需要這種免疫應(yīng)答的受治療者施用治療有效量的本發(fā)明的核酸。驚人地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抗體例如單克隆抗體激發(fā)強(qiáng)的輔助和抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答，其中所述抗體可以是人或非人的，且具有被克隆在它們的可變區(qū)域內(nèi)的預(yù)定的T細(xì)胞表位，以破壞抗體的一級(jí)結(jié)構(gòu)，抑制折疊和/或限制重鏈或非常少量的完整抗體的分泌。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，可以使用編碼這種抗體的重鏈的核酸實(shí)現(xiàn)這種作用。人們相信，所述T細(xì)胞表位被加工但未被免疫蛋白體破壞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種呈現(xiàn)變性的免疫^(guò)求蛋白中預(yù)先定義的T細(xì)胞表位的DNA疫苗，其中所述變性的免疫球蛋白提高T細(xì)胞應(yīng)答的頻率和親和力。由本發(fā)明的核酸編碼的多肽在本文中可被稱作"免疫體"。據(jù)發(fā)現(xiàn)，針對(duì)T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答可以被編碼免疫球蛋白分子的至少重鏈的核酸激發(fā)，其中所述免疫球蛋白分子被T細(xì)胞表位插入以致于免疫球蛋白分子不能釆取它的天然構(gòu)象，此發(fā)現(xiàn)與本領(lǐng)域的期望背道而馳，其中被教導(dǎo)的是，抗體必須以功能型被表達(dá)。例如，如上所討論，WO96/19584教導(dǎo)的是，當(dāng)核酸編碼在其中T細(xì)胞表位被插入其CDR的抗體時(shí)，所述核酸必須編碼功能性抗體。相似地，EP0759944描述將T細(xì)胞表位并入抗體分子內(nèi)的方法，其中所述抗體分子作為完整的免疫球蛋白被分泌。雖然編號(hào)為7,067,110的美國(guó)專利公開說(shuō)可以通過(guò)抗體和抗原的融合蛋白引發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，但是據(jù)公開所述抗體缺少免疫球蛋白可變區(qū)域。此外，此融合蛋白將具有所述抗原中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位。因此，雖然所述蛋白可以激發(fā)抗體應(yīng)答，但是它將不激發(fā)高親和力的T細(xì)胞應(yīng)答，這是由于所述抗原中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位。如上所討論，WO00/64488公開編碼具有被插入CDR而非其可變區(qū)域的異源性T細(xì)胞表位的嵌合抗體的核酸，其中所述核酸被導(dǎo)向在B細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明所述核酸未被導(dǎo)向在B細(xì)胞中的表達(dá)，并因此將不會(huì)在體外或體內(nèi)特異性地耙向B細(xì)胞。本發(fā)明所述核酸可被任何抗原呈遞細(xì)胞包括樹突細(xì)J包吸收，并能因此啟動(dòng)原初CTL和輔助T細(xì)胞應(yīng)答，然而WO00/64488中所述疫苗將只對(duì)增強(qiáng)預(yù)先存在的T細(xì)胞應(yīng)答有用。根據(jù)本發(fā)明的核酸所誘導(dǎo)的應(yīng)答的功能性親和力分析證明，當(dāng)與合成肽的免疫比較時(shí)可產(chǎn)生高親和力應(yīng)答。這還與提高的在體外和體內(nèi)識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞的能力相關(guān)。此觀察與其他研究中所記載的具有可比性，在所述其他研究中高親和力的TRP2特異性CTL顯示了更好的抗腫瘤活性(Zeh等，J/附ww朋/1999;162:989-94,Harada等，/柳ww"o/ogy2001;104:67-74)。本發(fā)明所述核酸具有一個(gè)非特異性啟動(dòng)子，即提高核酸表達(dá)但對(duì)在其中表達(dá)被提高的細(xì)胞沒(méi)有特異性的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子優(yōu)選地導(dǎo)致樹突細(xì)胞和/或角質(zhì)化細(xì)胞中核酸的表達(dá)。適合的啟動(dòng)子的例子包括CMV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他非特異性啟動(dòng)子。可選地，本發(fā)明所述核酸可具有一種或多種啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子在樹突細(xì)胞(例如Cdllb啟動(dòng)子)和角質(zhì)化細(xì)胞(例如MHCII啟動(dòng)子，Chin等，2001,//m附朋o/.167,5549-5557)中導(dǎo)致特異性表達(dá)。本發(fā)明某些方面中所述核酸編碼免疫球蛋白分子，優(yōu)選地為包括抗體所有主要特性的抗體，也就是說(shuō)包含可變和恒定區(qū)域的重和輕鏈。所述抗體可以是單克隆或多克隆的，并可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，雖然IgG是優(yōu)選的。所述IgG抗體可以是任何IgG亞類，例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，或小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b或IgG3。所述IgG抗體可以是具有IgG2Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的人IgGl抗體。所述抗體可具有人抗體的恒定區(qū)域，以及小鼠單克隆抗體的可變或超可變區(qū)域，在其中異源性T細(xì)胞表這種抗體據(jù)說(shuō)是人源化的。制造人源化抗體的方法是本領(lǐng)域中已知的。方法在例如Winter的編號(hào)為5,225,539的美國(guó)專利中^皮描述。在小鼠超可變區(qū)域外面的抗體的可變區(qū)域還可衍生自小鼠單克隆抗體。在這種情況下，整個(gè)可變區(qū)域衍生自鼠單克隆抗體并且所述抗體據(jù)說(shuō)是被嵌合的。制造嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。這種方法包括例如在Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)的美國(guó)專利中所描述的那些。還分別參見編號(hào)為4,816,397和4,816,567的美國(guó)專利。本發(fā)明某些方面中所述核酸是這樣的從其表達(dá)的重鏈、輕鏈或免疫球蛋白分子中具有至少一種異源性T細(xì)胞表位，以致于所述重鏈、輕鏈或免疫球蛋白分子不能采取它的天然構(gòu)象。所述T細(xì)胞表位可破壞被表達(dá)的蛋白以致于所述重鏈或免疫球蛋白分子不能再結(jié)合到它的抗原，以致于所述重和輕鏈(當(dāng)存在時(shí))不能再締合，或者以致于所述重鏈或免疫球蛋白分子不能被適當(dāng)?shù)胤置?，例如。所述破壞可以是在免疫球蛋白分子的三?jí)結(jié)構(gòu)，其可避免雙好d建的形成。如下面更詳細(xì)的討論，其中所述免疫球蛋白分子是抗體，T細(xì)胞表位可插入或取代所述抗體的CDR1和CDR2區(qū)域。CDR1和CDR2形成所述抗體P片層構(gòu)象的一部分，并且被部分地淹沒(méi)在被折疊的分子中。它們的長(zhǎng)度的任何變化、氨基酸組成或變化將破壞此結(jié)構(gòu)并防止重和輕鏈的折疊與締合。CDRH3被暴露于免疫球蛋白分子的表面并因此更允許改變。在本發(fā)明中，優(yōu)選的是CDR1和/或CDR2被T細(xì)胞表位所取代。的確，在某些實(shí)施方案中，在CDRH接合處骨架區(qū)域的喪失完全地破壞抗體折疊但在這些區(qū)域中表位的插入導(dǎo)致良好的T細(xì)胞應(yīng)答。在CDRH1(5個(gè)氨基酸長(zhǎng)度)或CDRH2(17個(gè)氨基酸長(zhǎng)度)中引入任何表位導(dǎo)致充分的破壞以允許重鏈的分泌，但是只有非常少量的完整抗體被分泌，即使輕鏈具有它的天然序列。這表明，二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于重和輕鏈的配對(duì)是重要的。在輕鏈的CDRL1中引入任何表位導(dǎo)致輕鏈的低水平分泌，即使只將單個(gè)表位引入重鏈的CDRH3。"異源性T細(xì)胞表位"旨在表示對(duì)抗體是異源性的T細(xì)胞表位。例如，異源性T細(xì)胞表位可以是之前不存在于抗體中的表位。異源性T細(xì)胞表位可作為整體被插入，雖然它可以從被插入的氨基酸序列與第二部分的側(cè)翼氨基酸一起被制作。這是為了保證被插入的表位在異源的核酸中具有與原始抗原相似的加工情況。一種或多種CTL/輔助表位可被插入相同的可變區(qū)域中。所述T細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)表位可被插入重鏈或輕鏈中的任何地方。優(yōu)選地，表位或每個(gè)表位被插入重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)域，雖然編碼具有T細(xì)胞表位的重鏈或抗體的核酸被包括進(jìn)本發(fā)明，其中所述T細(xì)胞表位被插入重鏈和/或輕鏈的僅僅恒定區(qū)域或者恒定區(qū)域和可變區(qū)域。在本發(fā)明的核酸中，編碼T細(xì)胞表位的一條或多條序列可^L插入(即添加至)編碼重鏈和/或輕鏈的序列，或可纟皮取代進(jìn)編碼重鏈和/或輕鏈的序列。在可變區(qū)域內(nèi)，所述T細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)表位可插入或:f又代重鏈和/或輕鏈的CDR中任一種或多種，即L1、L2、L3、Hl、H2或H3。在這些中，Ll、H1和H2目前是優(yōu)選的。在某些實(shí)施方案中，T細(xì)胞表位插入或取代CDRL1和/或Hl和/或H2。優(yōu)選地，被引入的T細(xì)胞表位與抗體的原始CDR的氨基酸的大小和電荷不相似，以致于所述抗體不釆取它的天然構(gòu)象，例如不正確地折疊和分泌?？蛇x地或另外地，它們可插入或取代環(huán)繞CDR的骨架區(qū)域。被插入的T細(xì)胞表位優(yōu)選地是細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL或CD8)表位?？蛇x地或另外地，輔助T細(xì)胞(CD4)表位可被插入。T細(xì)胞表位可使用已知的T細(xì)胞算法來(lái)預(yù)測(cè)或作為肽被合成，并使用標(biāo)準(zhǔn)的T細(xì)胞測(cè)定來(lái)篩選。T細(xì)胞表位可具有范圍從5至50、7至40、8至30或9至20個(gè)氨基酸的氨基酸長(zhǎng)度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)氨基酸。所述表位可使用編碼抗原表位的互補(bǔ)寡核苷酸插入，其中所述抗原表位被退火并克隆進(jìn)抗體骨架的特定位點(diǎn)，在所述骨架中的CDR(或其他區(qū)域)被獨(dú)特的限制性酶位點(diǎn)所替換。重組抗體激發(fā)輔助和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的能力可如15本文所例證的那樣進(jìn)行篩選。各種組合在本發(fā)明中是可能的。在某些實(shí)施方案中，一種或多種CD8表位插入和/或取代CDRHl和/或H2，或在重鏈或抗體的非CDR可變區(qū)域中。另外地或可選地，一種或多種CD4表位可插入和/或取代CDRL1，或在輕鏈或抗體的非CDR可變區(qū)域中。當(dāng)有多個(gè)T細(xì)胞表位時(shí)，所述T細(xì)胞表位可以是相同的或不同的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，許多組合是可能的，其包括CDRHl中的一種CD8表位，和CDRLl中的一種CD4表位；CDRH2中的一種CD8表位，和CDRLl中的一種CD4表位；CDRHl和CDRH2中的一種CD8表位，和CDRLl中的一種CD4表位；CDRHl中的2種CD8表位，和CDRLl中的一種CD4表位；CDRH2中的2種CD8表位，和CDRLl中的一種CD4表位；等。本發(fā)明的核酸可包括來(lái)自單個(gè)靶抗原的多個(gè)T細(xì)胞表位，其中所述靶抗原可結(jié)合I類和II類MHC分子二者的大多數(shù)。這可產(chǎn)生一種能用于廣布的人口接種的疫苗?？蛇x地，本發(fā)明中有用的核酸可包括來(lái)自多個(gè)靶抗原的多個(gè)T細(xì)胞表位，其中所述耙抗原可結(jié)合最常見的I類和II類表型。這可產(chǎn)生一種可以預(yù)防抗原損失變異體的選擇的疫苗。靶抗原可來(lái)自單個(gè)的病原體或腫瘤類型，或可被選擇以針對(duì)各種病原體或癌癥引發(fā)免疫應(yīng)答。靶向特定的常見HLA表型的本發(fā)明中有用的核酸可包括來(lái)自多種多樣的癌癥和/或病原體的許多T細(xì)胞表位，其提供單個(gè)疫苗以預(yù)防疾病。可以插入任何T細(xì)胞表位，假如它激發(fā)輔助和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答?？梢允褂脕?lái)自病原體例如HIV、丙型肝炎和需要CTL以清除潛在感染的其他感染的T細(xì)胞表位，雖然優(yōu)選地所述表位是"自體表位"，即相關(guān)于與細(xì)胞增殖例如癌癥相關(guān)的狀況/病癥。優(yōu)選地，該T細(xì)胞表位使得重鏈或抗體不能正確折疊并分泌。因此，優(yōu)選地，被插入的表位具有與原始的可變區(qū)域不相似的大小和氨基酸組成。所述核酸可具有多個(gè)不同T細(xì)胞表位以^(更產(chǎn)生各種各樣的T細(xì)胞應(yīng)答。所述核酸可包括來(lái)自單個(gè)抗原的多個(gè)表位，從而保證不同HLA類型的個(gè)體的大多數(shù)對(duì)單個(gè)疫苗進(jìn)行應(yīng)答。可選地，可以使用來(lái)自靶向受限的一系列HLA種類的多個(gè)抗原的多個(gè)'i'細(xì)胞原，或者它們可包括靶向各種各樣實(shí)體瘤或病原體的完全不同的抗原。本發(fā)明所述核酸分子甚至可凈皮設(shè)計(jì)成靶向肺瘤中不同細(xì)胞群體，例如腫瘤上皮和內(nèi)皮抗原。意外地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)T細(xì)胞表位被插入重鏈的結(jié)構(gòu)限制的CDR或非CDR區(qū)域時(shí)，它們引發(fā)優(yōu)良的CTL應(yīng)答。這看上去是由于大量重鏈的分泌，其中所述重鏈只能與輕鏈弱締合，由于體積大的表位向它們的可變區(qū)域的插入。這與定理矛盾，所述定理描迷道"只有由抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)源性合成的蛋白被呈遞在I類MHC分子上并被CTL識(shí)別"一WO過(guò)程，并通常需要通過(guò)特定的受體進(jìn)行吸收。這可以是人Fcyl抗體的CD64受體。然而，據(jù)預(yù)測(cè)，大量的完整抗體或抗原-抗體復(fù)合物將更善于靶向此受體。相比之下，本文所呈遞的結(jié)果清楚地顯示，不應(yīng)該結(jié)合CD64的很低水平的完整抗體和大量的游離重鏈引出優(yōu)良的CTL應(yīng)答。的確，據(jù)本文所顯示，CTL應(yīng)答當(dāng)CTL表位被插入不能結(jié)合CD64的抗體時(shí)可被激發(fā)，其中所述抗體例如IgG2抗體或IgGl分子，其中所述IgGl分子的CD64結(jié)合區(qū)域被來(lái)自IgG2的非CD64結(jié)合區(qū)域替換。編碼重鏈的核酸優(yōu)選地包括前導(dǎo)序列以允許它被分泌。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果重鏈的前導(dǎo)序列被除去以防止分泌并允許更多內(nèi)源性蛋白被產(chǎn)生，那么這降低CTL應(yīng)答。這與預(yù)期完全相反。雖然不希望受到理論約束，本發(fā)明人相信，這意味著核酸在非抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)，其中所述非抗原呈遞細(xì)胞分泌高水平的重鏈和然后可被抗原呈遞細(xì)胞吸收的少量天然蛋白?？蛇x地，核酸可直接轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞，其中所述抗原呈遞細(xì)胞遷移到引流淋巴結(jié)并在其中向原始CTL分泌少量天然蛋白和大量重鏈，其中所對(duì)于激發(fā)有效的CTL應(yīng)答的核酸疫苗，其必須優(yōu)選地在一種蛋白內(nèi)編碼CTL表位，其中所述蛋白以很低水平被分泌和/或同時(shí)分泌大量變性蛋白。然而，在沒(méi)有輔助應(yīng)答存在下，CTL應(yīng)答不能成熟為高親和性記憶應(yīng)答。因此，優(yōu)選的是，T輔助表位被插入重鏈或免疫球蛋白分子，優(yōu)選地插入抗體輕鏈的可變區(qū)域。再一次，意外地并且與定理相反，輕鏈只以很低量分泌，其中所述定理描述道"只有被耙細(xì)胞外源性吸收的蛋白被II類MHC分子呈遞并^皮輔助T細(xì)胞識(shí)別"。為了防止輕鏈分泌而將前導(dǎo)序列移除，對(duì)于輔助應(yīng)答沒(méi)有作用。因此，本發(fā)明所述核酸可以或不可以具有抗體輕鏈的前導(dǎo)序列。這些結(jié)果暗示，核酸被抗原呈遞細(xì)胞吸收，其中所述抗原呈遞細(xì)胞可能通過(guò)自體吞噬而在來(lái)自內(nèi)源合成的蛋白的II類MHC的情況下呈遞T輔助表位。對(duì)于協(xié)助CTL應(yīng)答的輔助T細(xì)胞，它們識(shí)別的T細(xì)胞上。這暗示，由所述核酸編碼的、合成輕鏈的抗原呈遞細(xì)胞必須還合成、分泌和交叉呈遞CTL表位本身，或從相鄰的APC吸收重鏈。本發(fā)明還提供分離的樹突細(xì)胞，其呈遞來(lái)自內(nèi)源產(chǎn)生的輕鏈的II類MHC上的異源輔助T細(xì)胞表位，以及來(lái)自交叉呈遞的重鏈的異源CTL表位。這種樹突細(xì)胞可被用在本文所述療法中。本發(fā)明所述核酸能通過(guò)編碼一種變性抗體而使存在的T細(xì)胞表位更具有免疫原性，其中所述變性抗體導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答頻率和親和力二者的增力口。本發(fā)明所述核酸可以是DNA、cDNA或RNA例如mRNA,其通過(guò)克隆獲得，或者完全或部分地通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生。為了治療用途，所述核酸優(yōu)選地是以能夠在待治療的受治療者體內(nèi)被表達(dá)的形式存在。本發(fā)明所述核酸可以是重組的或作為分離物以分離的和/或純化的形式被提供。它可以不含或大致不含在人類基因組的基因兩側(cè)的核酸，除了可能地一種或多種表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明所述的核酸包含RNA時(shí)，本文所示的序列參考應(yīng)該被認(rèn)為是RNA相等物的參考，其中U取代T。本發(fā)明所述核酸可由技術(shù)人員容易地制備，例如使用本文所含信息和參考文獻(xiàn)以及本領(lǐng)域已知技術(shù)(例如，參見Sambrook、Fritscli和Maniatis,"MolecularCloning",ALaboratoryManual(《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989和Ausubel等，ShortProtocolsin18MolecularBiology(《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)，JohnWiley和Sons,1992)，假如核酸序列和克隆是可得的。這些技術(shù)包括(i)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增這種核酸例如來(lái)自基因組來(lái)源的樣品，(ii)化學(xué)合成，或(iii)制備cDNA序列。編碼所述多肽的DNA可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適合途徑被生成和使用，其包括取出編碼DNA,鑒定待表達(dá)的部分任一側(cè)的適合的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以及從DNA切除所述部分。所述部分然后可在標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)可得的表達(dá)系統(tǒng)中被可操作地連接到適合的啟動(dòng)子。另一種重組手段是使用適合的PCR引物來(lái)擴(kuò)增所述DNA的相關(guān)部分?？梢詫?duì)所述序列進(jìn)行修飾，例如使用位點(diǎn)定向誘變，以導(dǎo)致修飾肽的表達(dá)或考慮用來(lái)表達(dá)所述核酸的宿主細(xì)胞中的密碼子優(yōu)選。為了獲得核酸序列的表達(dá)，所述序列可被導(dǎo)入載體，其中所述載體具有可操作地連接到所述核酸以控制其表達(dá)的一種或多種控制序列。所述載體可包含驅(qū)使被插入的核酸的表達(dá)的其他序列例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、致使所述多肽作為融合蛋白被產(chǎn)生的核酸序列和/或編碼分泌信號(hào)以使宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽從細(xì)胞分泌的核酸。如果希望，然后可以通過(guò)如下獲得多肽將所述栽體轉(zhuǎn)化進(jìn)在其中所述載體是功能性的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以使多肽被產(chǎn)生，以及從宿主細(xì)胞或周圍培養(yǎng)基中回收所述多肽。原核和真核細(xì)胞被用于本領(lǐng)域此目的，包括大腸桿菌菌林、酵母和真核細(xì)胞例如昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞(例如，COS、CHO細(xì)胞、Bowes黑素瘤和其他適合的人細(xì)胞)。當(dāng)本發(fā)明涉及編碼抗體的重鏈和輕鏈的核酸時(shí)，相應(yīng)的核酸可存在于被相同或不同的啟動(dòng)子驅(qū)使的相同表達(dá)載體中，或在分開的表達(dá)載體中。本發(fā)明所述核酸可被用來(lái)激發(fā)針對(duì)患者中至少一種T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答，其中所述患者例如包括人的哺乳動(dòng)物。輔助和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答可被激發(fā)。針對(duì)本發(fā)明中獲得的特定表位的T細(xì)胞應(yīng)答可具有比較高的親和力，這是與由作為簡(jiǎn)單肽的相同表位的免疫接種或由在抗原內(nèi)作為肽或核酸被編碼的相同表位的免疫接種獲得的相比。本發(fā)明所述核酸可作為組合療法被施用，即編碼輕鏈的核酸與編碼重鏈的核酸。所述核酸可通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服或其他途徑被施用。皮內(nèi)或肌肉內(nèi)施用是優(yōu)選的，因?yàn)檫@些組織含有樹突細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"治療"包括任何能夠使人或非人動(dòng)物獲益的療法。所述治療可以是針對(duì)遺傳的或后天的疾病。優(yōu)選地，所述治療是針對(duì)與細(xì)胞增殖例如癌癥或傳染性疾病相關(guān)的狀況/病癥。能夠使用核酸治療的癌癥類型的例子包括任何實(shí)體瘤、結(jié)腸直腸癌、肺、乳腺、胃、卵巢、子宮、肝、腎、胰腺、黑素瘤、膀胱、頭頸、腦、食道、胰腺和骨腫瘤，以及軟組織癌癥，以及白血病。能夠使用核酸治療的傳染性疾病的例子包括HIV感染、丙型肝炎或需要T細(xì)胞免疫力來(lái)清除的任何慢性感染。核酸可以與藥學(xué)上可接受的一種或多種運(yùn)載體聯(lián)合使用。這種運(yùn)載體可包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、脂質(zhì)體、水、甘油、乙醇及其組合。佐劑可被用于促使宿主免疫應(yīng)答的激發(fā)，并可包括氫氧化鋁、溶血卵磷脂、普流羅尼(pluronic)、多元醇、多聚陰離子、肽、蛋白和油乳膠。本發(fā)明中有用的核酸可在藥物組合物中配制。除了上述物質(zhì)中的一種，這些組合物可包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、運(yùn)載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其他物質(zhì)。這種物質(zhì)應(yīng)該是無(wú)毒的并不應(yīng)該干擾活性成分的效力。所述運(yùn)載體或其他物質(zhì)的確切性質(zhì)可取決于施用途徑，例如皮內(nèi)、口服、靜脈內(nèi)、皮膚上或皮下、經(jīng)鼻、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)途徑。所述制劑優(yōu)選地是作為沉淀至極小的金顆粒表面上的穩(wěn)定干燥粉末的核酸，并適合于通過(guò)基因槍注射。所迷制劑可以適合于使用電穿孔進(jìn)行皮內(nèi)或月幾肉內(nèi)施用。包括核酸的或用于核酸的遞送的組合物優(yōu)選地以"治療有效量"施用于個(gè)體，這足以顯示對(duì)所述個(gè)體的益處。所施用的實(shí)際量以及施用的速率和時(shí)間過(guò)程，將取決于^f皮治療的狀況的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療的處方，例如劑量的決定等，是在全科醫(yī)生和其他醫(yī)學(xué)博士的責(zé)任范圍內(nèi)，并通?？紤]到待治療的病癥、患者個(gè)體的狀況、遞送位點(diǎn)、施用方法和醫(yī)師已知的其他因素。本發(fā)明所述核酸特別地與存在的癌癥的治療以及對(duì)初始治療或手術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)防相關(guān)。上面提到的技術(shù)和方案的例子可在Remington'sPharmaceuticalSciences(《雷明頓藥物科學(xué)》)，笫16版，Oslo,A.(編輯)，1980中找到。優(yōu)選地，本發(fā)明所述核酸激發(fā)輔助和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其中所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞當(dāng)以有效量施用于人時(shí)能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。最佳劑量可由醫(yī)生基于若干參數(shù)來(lái)確定，其中所述參數(shù)包括，例如，年齡、性別、體重、受治療狀況的嚴(yán)重程度、被施用的活性成分和施用途徑。例如，1-1000嗎的DNA的劑量足以激發(fā)輔助和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答二者。本發(fā)明所述核酸可與另外的藥學(xué)上可接受的成分一起施用。這種成分包4舌，例如，免疫系統(tǒng)刺激劑。組合物可^f皮單獨(dú)施用，或與其他治療聯(lián)合施用，或者同時(shí)或者連續(xù)地，這取決于受治療的狀況。其他癌癥治療包括本領(lǐng)域已知的其他單克隆抗體、其他化療劑、其他放射療法技術(shù)或其他免疫療法。本發(fā)明所述組合物的一個(gè)特殊應(yīng)用是作為外科手術(shù)的助劑，即在肺瘤^:除去之后幫助減少癌癥復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。注射(皮內(nèi))可能是本發(fā)明所述核酸的治療性施用的首要途徑。核酸可以局部地方式被施用于腫瘤部位或其他期望的部位，或可以以耙向腫瘤或其他細(xì)胞的方式纟皮遞送。核酸的劑量將取決于所使用的試劑的性質(zhì)，例如它的結(jié)合活性和體內(nèi)血漿半衰期、制劑中多肽的濃度、施用途徑、給藥部位和速率、所涉及的患者的臨床耐受性、折磨患者的病理學(xué)狀況以及諸如此類，這恰恰是在醫(yī)生的技術(shù)范圍內(nèi)。例如，每位患者每次施用100貼的核酸的劑量是優(yōu)選的，雖然每劑的劑量可在約10貼至1mg范圍內(nèi)變動(dòng)。在一系列的連續(xù)接種中使用不同劑量；醫(yī)師可施用最初的接種，然后追加相對(duì)較小劑量的核酸。在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及將T細(xì)胞表位從靶抗原人工引入抗體的可變區(qū)域的方法，以及將這種人工的抗體用作疫苗以激發(fā)輔助和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答二者。本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)方面提供一種宿主細(xì)胞，其含有本文所公開的核酸。本發(fā)明所述核酸可被整合入宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)?？梢酝ㄟ^(guò)包含根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)促進(jìn)與所述基因組重組的序列來(lái)促進(jìn)整合。核酸可21以是在細(xì)胞內(nèi)的外染色體載體上，或否則對(duì)所述細(xì)胞是可鑒定地異源性的或外源性的。再一個(gè)進(jìn)一步的方面提供一種方法，其包括將本發(fā)明所述核酸引入宿主細(xì)胞。所述引入可使用任何可得的技術(shù)，其通?？梢?特別地對(duì)于體外引入)沒(méi)有限制地被稱作"轉(zhuǎn)化"。對(duì)于真核細(xì)胞，適合的技術(shù)可包括磷酸4丐轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒例如牛痘或?qū)τ诶ハx細(xì)胞的桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，適合的技術(shù)可包括氯化鉤轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用細(xì)菌噬菌體的轉(zhuǎn)染。作為備選方案，可以使用核酸的直接注射。標(biāo)志物基因例如抗生素抵抗或敏感性基因可被用來(lái)鑒定含有感興趣的核酸的克隆，這是本領(lǐng)域眾所周知的。所述引入之后可以是導(dǎo)致或允許所述核酸的表達(dá)，例如通過(guò)在表達(dá)所述基因所需條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞(其可包括實(shí)際上被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，雖然所述細(xì)胞將更可能是被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代)，以致于產(chǎn)生被編碼的多肽(或肽)。如果所述多肽偶合在適合的信號(hào)前導(dǎo)肽上被表達(dá)，它可從細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中。在表達(dá)的產(chǎn)生之后，多肽或肽可看情況從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離和/或純化，并且接下來(lái)如所期望的被使用，例如在組合物制劑中，其中所述組合物可包含一種或多種另外的成分，例如包含一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、纟某介物或運(yùn)載體(例如，見下文)的藥物組合物。本發(fā)明還提供在候選抗原中鑒定T細(xì)胞表位的方法，其包括在非人動(dòng)物中將T調(diào)節(jié)性細(xì)胞耗盡；用候選抗原免疫所迷非人動(dòng)物；以及篩選以觀察T細(xì)胞應(yīng)答的引發(fā)是否針對(duì)候選抗原上被預(yù)測(cè)的表位的肽或者候選抗原中所有可能重疊的肽?？梢栽诜侨藙?dòng)物例如小鼠或大鼠上實(shí)施所述方法?？梢允褂每笴D25抗體或通過(guò)化學(xué)療法例如環(huán)磷酰胺將T調(diào)節(jié)性細(xì)胞在非人動(dòng)物中耗盡，其中所述抗CD25抗體可選地可以與毒素例如Ontak偶合，其中所述環(huán)磷酰胺優(yōu)先地殺死T調(diào)節(jié)性細(xì)胞。一旦T調(diào)節(jié)性細(xì)胞祐^耗盡，可以使用編碼候選抗原的DNA或通過(guò)候選抗原本身對(duì)非人動(dòng)物進(jìn)行免疫。優(yōu)選地，所述候選抗原作為抗原-Fc融合蛋白被提供。在篩選步驟中，鑒定了在非人動(dòng)物中激發(fā)的任何T細(xì)胞應(yīng)答所針對(duì)的肽。這能使用例如ELISPOT的技術(shù)在體外完成。如果T細(xì)胞應(yīng)答被引發(fā)至候選表位，此表位可被用來(lái)免疫非人動(dòng)物。如果此肽引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答，可通過(guò)在根據(jù)本發(fā)明所述的核酸中編碼所述表位來(lái)提高親和力和頻率。此方法可允許由免疫蛋白體加工的T細(xì)胞表位的鑒定。本發(fā)明每個(gè)方面的優(yōu)選的特征與已作必要的修正的每個(gè)其他方面是一樣的。本文提到的現(xiàn)有技術(shù)資料以法律所允許的最完全范圍被并入。現(xiàn)在本發(fā)明將在下面非限制性實(shí)施例中被進(jìn)一步描述。引用如下附圖圖1:描繪重鏈載體pOrigHIB的特征的圖使用與人IgGlFc恒定區(qū)域符合讀框的HindlII/Afel來(lái)克隆抗體SC100的野生型非免疫性重可變區(qū)域。Fc區(qū)域包括CH1、CH2、CH3結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)域。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高水平表達(dá)由人類細(xì)胞巨化病毒的立即早期啟動(dòng)子驅(qū)使。BGH聚腺苷酸化向OrigHIB人IgGl鏈的下游發(fā)信號(hào)以保證mRNA的穩(wěn)定性和有效終止。EM7是細(xì)菌啟動(dòng)子，其控制博萊霉素抗性基因的表達(dá)并允許大腸桿菌中的抗生素選擇，而抗性基因上游的SV40早期啟動(dòng)子允許在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的選擇。SV40聚腺苷酸化向抗性基因的下游發(fā)信號(hào)以指導(dǎo)zeofmRNA的3，端的適當(dāng)加工。所述載體還在其主鏈中包含細(xì)菌中繁殖的復(fù)制的ColEl起點(diǎn)?；パa(bǔ)決定的DNA序列被有效地去除并單獨(dú)地或共同地交換限制性位點(diǎn)RE1、RE2和RE3(分別地ftpl、M^cl和)。圖2:描繪重鏈載體pOrigLIB的特征的圖使用與人k恒定區(qū)域符合讀框的BamHI/BsiWI來(lái)克隆抗體SC100的野生型非免疫性輕可變區(qū)域。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高水平表達(dá)由人類細(xì)胞巨化病毒的立即早期啟動(dòng)子驅(qū)使。BGH聚腺苷酸化向OrigLIB鏈的下游發(fā)信號(hào)以保證mRNA的穩(wěn)定性和有效終止。所述載體還包括復(fù)制的ColEl起點(diǎn)和氨節(jié)西林的抗生素抗性基因，其中所述氨芐西林允許細(xì)菌的繁殖和選擇?；パa(bǔ)決定區(qū)域被有效地去除并單獨(dú)地或共同地交換限制性位點(diǎn)RE4、RE5和RE6(分另'J地五coRV、和爭(zhēng)I)。圖3:野生型免疫體嵌合重鏈的序列展示了全長(zhǎng)嵌合igGl重鏈的核苷酸和翻譯中的氨基酸序列。CDR的位置是在由卡巴特(kabat)編號(hào)方案所定義的方框中。終止密碼子由紅色星號(hào)所示。州m/m/4/^I限制性位點(diǎn)被突出顯示，其被用在可變重區(qū)域的轉(zhuǎn)移中。圖4:野生型免疫體嵌合k鏈的序列展示了全長(zhǎng)嵌合k鏈的核苷酸和翻譯中的氨基酸序列。CDR的位置是在由卡巴特編號(hào)方案所定義的方框中。終止密碼子由星號(hào)所示。被用在可變輕鏈區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的Sfl/wHT/^/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖5:重疊延伸PCR通過(guò)重疊PCR，CDR被移除并被獨(dú)特的限制性位點(diǎn)替換。正向引物Hl、H2、H3、Ll、L2和L3(表2)被設(shè)計(jì)成分別替換重和輕鏈的可變區(qū)域中的CDR1、2和3。含有引物的、位于中間的、所選的每個(gè)獨(dú)特的酶識(shí)別序列缺少待除去的(綠色部分)CDR序列，其中所述CDR序列被夾在10-20bp的野生型序列之間。所述正向引物與普通的反向引物即huHeClonR或huLiClonR(表2)—起被用在第一輪PCR中，其中所述huHeClonR或huLiClonR退火至分別在野生型構(gòu)建體pOrigHIB和pOrigLIB中的人類重和輕恒定結(jié)構(gòu)域。生成的片段不含野生型CDR序列(紅色部分)，但有效地交換限制性位點(diǎn)。為了擴(kuò)增整個(gè)可變重和輕區(qū)域，需要第二輪PCR,其使用第一輪所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物作為反向引物，以及在單個(gè)質(zhì)粒中退火至CMV啟動(dòng)子的普通CMV正向引物。第二輪PCR產(chǎn)物被亞克隆進(jìn)pCR2.1(Invitrogen)，而且在序列確認(rèn)之后，含有Hl、H2、H3、Ll、L2和L3版本的重/輕(VH和VL)可變區(qū)域單獨(dú)地、組合地和一起^^皮插回單個(gè)構(gòu)建體pOrigHIB和pOrigLIB中，其分別使用HindlII/Afel和BamHI/BsiWI交換野生型區(qū)域。24圖6:免疫體重鏈可變區(qū)域的序列重可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列，其中CDR已經(jīng)^f皮其相應(yīng)的酶位點(diǎn)Hl、H2和H3單獨(dú)地、組合地和一起替換。獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)被突出顯示。CDR1、2和3分別被i^/I、Ms'cl和替換。圖7:免疫體K鏈可變區(qū)域的序列重可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列，其中CDR已經(jīng)被其相應(yīng)的酶位點(diǎn)L1、L2和L3單獨(dú)地、組合地和一起替換。獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)被突出顯示。CDR1、2和3分別被五coRV、和T/;wI替換。圖8:描繪雙表達(dá)載體pDCOrig的特征的圖一旦所有表位已經(jīng)被并入單個(gè)載體中的可變重和可變輕位點(diǎn)，它們被轉(zhuǎn)移到雙表達(dá)載體中，其使用如突出顯示的與其相應(yīng)的人恒定區(qū)域符合讀框的HindlII/Afel和BamHI/BsiWI。重鏈的Fc區(qū)域包括CH1、CH2、CH3結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)域。重和輕鏈二者在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高水平表達(dá)由人類細(xì)胞巨化病毒的立即早期啟動(dòng)子驅(qū)使。BGH聚腺普酸化向兩條鏈的下游發(fā)信號(hào)以保證mRNA的穩(wěn)定性和有效終止。EM7是細(xì)菌啟動(dòng)子，其控制博萊霉素抗性基因的表達(dá)并允許大腸桿菌中的抗生素選擇，而抗性基因上游的SV40早期啟動(dòng)子允許在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的選擇。SV40聚腺苷酸化向抗性基因的下游發(fā)信號(hào)以指導(dǎo)zeormRNA的3'端的適當(dāng)加工。所述載體還在其主鏈中包含細(xì)菌中繁殖的復(fù)制的ColEl起點(diǎn)。圖9:含有避免Fc區(qū)域合成的終止密碼子的免疫體IB15重鏈的序列嵌合重鏈pDCOrigIB15CH1終止的核香酸和氨基酸序列。使用位點(diǎn)定向誘變?cè)谌薸gGlFc恒定區(qū)域的CH1結(jié)構(gòu)域之后插入終止密碼子，如星號(hào)所示。粗體的核苷酸和氨基酸代表CH1結(jié)構(gòu)域。在方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)和H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。歷^tlI/4/feI限制性位點(diǎn)被突出顯示，其被用在將可變重區(qū)域從單個(gè)構(gòu)建體中轉(zhuǎn)移。圖10:不含前導(dǎo)序列的DCIB15重可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列使用正向引物pOrig重的不含前導(dǎo)序列和反向引物huHeClonR(表2)通過(guò)PCR除去前導(dǎo)序列，其中所述反向引物huHeClonR有效地結(jié)合至人IgGlCH]結(jié)構(gòu)域并再擴(kuò)增重可變(Vh)區(qū)域。在序列確認(rèn)后，減去前導(dǎo)序列的VH區(qū)域被克隆回雙表達(dá)構(gòu)建體DCIB15，其使用與人IgGl恒定區(qū)域符合讀框的//^^IIM/eI。方框內(nèi)的氨基酸代表HI中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)和H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。被用在可變重區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的歷m/in/y4/eI限制性位點(diǎn)-故突出顯示。圖11:不含前導(dǎo)序列的DCIB15K可變區(qū)域的核普酸和氨基酸序列使用正向引物pOrig輕的不含前導(dǎo)序列和反向引物huLiClonR(表2)通過(guò)PCR除去前導(dǎo)序列，其中所迷反向引物huLiClonR再擴(kuò)增輕可變(VL)區(qū)域。在序列確認(rèn)后，減去前導(dǎo)序列的VL區(qū)域-波克隆回雙表達(dá)構(gòu)建體DCIB15，其使用與人k恒定區(qū)域符合讀框的io附HI/fo/WI。方框內(nèi)的#^酸代表Ll中的H印BCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在可變輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的^wwHI/fe/WI限制性位點(diǎn)^皮突出顯示。圖12:人lgG2恒定區(qū)域的序列被擴(kuò)增的重的人IgG2恒定區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。和限制性位點(diǎn)被突出顯示，其被用在雙表達(dá)載體DCIB15中的huigGl恒定區(qū)域的轉(zhuǎn)移和替換中。圖13:人igG3恒定區(qū)域的序列被擴(kuò)增的重的人igG2恒定區(qū)域的核苷酸和氣基酸序列。和限制性位點(diǎn)被突出顯示，其被用在雙表達(dá)載體DCIB15中的huigGl恒定區(qū)域的轉(zhuǎn)移和替換中。圖14:免疫體雙表達(dá)載體的人同種型A雙表達(dá)載體pDCOriglB15huigG2的圖。B雙表達(dá)載體pDCOriglB15huigG3的圖。#皮用在可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///mffllM/eI和萬(wàn)"wHI/fe/WI限制性位點(diǎn)被、突出顯示。圖15:含有G2基序的DCIB66重鏈的序列嵌合重鏈的核苷酸和氨基酸序列。在與高親和性FqRl(CD64)相互作用的關(guān)鍵的結(jié)合基序中的氨基酸E233L234L235被來(lái)自人igG2的P233V234A235取代，其在方框中被加粗以突出顯示。方框中的其他氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)和H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。被突出顯示的^伊IA4/^1位點(diǎn)被用于將含有所述取代的部分轉(zhuǎn)移至pDCOrigIB15huigGl。被用在可變重區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的幼力JIIIM/eI限制性位點(diǎn)一皮顯示為^L體。圖16:含有Gl結(jié)合基序的DCIB67重鏈的序列嵌合重鏈的核普酸和氨基酸序列。在人IgG2恒定區(qū)域中的氨基酸P233V234A235被關(guān)鍵的結(jié)合基序取代以與來(lái)自人IgGl的高親和性FqRl(CD64)E233L234L235G236相互作用，其在方框中被加粗以突出顯示。方框中的其他氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)和H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。被突出顯示的J取I"/^1位點(diǎn)被用于將含有所迷取代的部分轉(zhuǎn)移至pDC0riglB15huigG2。被用在可變重區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///m/in/4/feI限制性^立點(diǎn)纟皮顯示為4旦體。圖17:鼠IgG2a免疫體表達(dá)栽體(A)單鏈pMoOrigHIB載體，(B)含有Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和Ll中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)的雙表達(dá)載體DCIB53,以及(C)含有H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和H3中的HLA-DR4限制的gp100CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)的雙表達(dá)載體DCIB63的圖。顯示了所使用的限制性位點(diǎn)。圖18:描繪調(diào)節(jié)性順應(yīng)式質(zhì)粒pVAXDCIB54的構(gòu)建的示意圖使用NruI將重的單鏈載體pVaxIB54HIB(A)直鏈化。使用Nrul和HpaI將輕鏈表達(dá)盒從pOrigLIB(B)切除并克隆進(jìn)被直鏈化的質(zhì)粒以生成雙表達(dá)載體pVaxDCIB54(C)。#1用在可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的州wdlIM/eI和SamHIAfts/WI限制性位點(diǎn)#1突出顯示。圖19:DCIB15的序列與表達(dá)栽體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和Ll中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的歷w^niM/eI和萬(wàn)amffl/fe/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖20:免疫體構(gòu)建體產(chǎn)生低水平的完整蛋白。A，通過(guò)夾心Elisa對(duì)來(lái)自CHO-S細(xì)胞上清液的免疫體重鏈水平的定量，其中所述CHO-S細(xì)胞被含有g(shù)plOO/Hl、TRP2/H2和HepBCD4/L1的免疫體(DCIB15)轉(zhuǎn)染。上清液被不摻雜地使用，用培養(yǎng)基按1比3、1比10和1比30稀釋，并與人IgG陽(yáng)性對(duì)照比較。B，通過(guò)夾心Elisa對(duì)含有g(shù)plOO/Hl、TRP2/H2和H印Bhelp/Ll的純化的免疫體(DCIB15)的分析與陽(yáng)性對(duì)照的比較。C和D,通過(guò)夾心Elisa對(duì)來(lái)自CHO-S轉(zhuǎn)染子上清液的重鏈和完整免疫體的表達(dá)的確定。將抗人Fc特異性抗體涂布在板上。為了檢測(cè)重鏈，使用抗人IgGFc特異性HRP抗體，而且為了檢測(cè)完整的免疫體，使用抗人k鏈特異性HRP抗體。E，通過(guò)夾心Elisa對(duì)來(lái)自CHO-S轉(zhuǎn)染子(DCIB15、DCIB31、DCIB32、DCIB36、DCIB48、DCIB49、DCIB52、DCIB54)上清液的重鏈、輕鏈和完整免疫體的確定。將抗人Fc特異性抗體或抗人k鏈抗體涂布在板上。為了檢測(cè)重鏈，抗人IgGFc特異性HRP抗體與抗人Fc特異性涂布抗體共同使用。為了檢測(cè)完整免疫體，抗人k鏈特異性HRP抗體與抗人Fc特異性涂布抗體共同使用。為了檢測(cè)輕鏈，抗人k鏈特異性HRP抗體與抗人k鏈特異性抗體共同使用。圖21:DCIB24的序列28與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氛基酸序列。方框中的氨基酸代表H2中的卵白蛋白表位(SIINFEKL)和Ll中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///mfflIA4/eI和5awHI/^/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖22:DCIB25的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的^f皮克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和L3中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的所^ffll"/eI和y^7附HI/^/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖23:DCIB31的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H3中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的7/,"^fflA4>I和限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖24:DCIB32的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H3中的被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///"dllM/eI和SawHI/feAVI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖25:DCIB36的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表L3中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的I和5amffl/fe/WI限制性位點(diǎn)一皮突出顯示。圖26:DCIB48的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和H3中的HLA-DR4限制的即100CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///"dllM/eI和SamHI/fe/WI限制性位點(diǎn)^皮突出顯示。圖27:DCIB49的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H3中的H印BCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的州wdlIM/eI和5awHI/萬(wàn)wWI限制性位點(diǎn)-故突出顯示。圖28:DCIB52的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H2中的被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的州mffllM/eI和SamHI/BWWI限制性位點(diǎn)#皮突出顯示。圖29:DCIB54的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的HLA-DR7限制的gp100CD4表位(GTGRAMLGTHTMEVTVYH)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和H3中的HLA-DR4限制的gp100CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///"dllM/eI和^W7ffl/^/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖30:DCIB18的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和LI中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。30表位的免疫體構(gòu)建體(DCIB18)對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽、HepB輔助肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B,通過(guò)測(cè)量對(duì)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的應(yīng)答而測(cè)定了來(lái)自被免疫小鼠的脾細(xì)胞對(duì)TRP2表位的親和力。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力^^皮指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。C,來(lái)自被免疫小鼠的脾細(xì)胞被耗盡了CD8T細(xì)胞，并且針對(duì)TRP2肽、HepB輔助肽和培養(yǎng)基對(duì)照被分析以確定IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中表位特異性應(yīng)答的存在。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。D，在6天的體外TRP2肽激發(fā)之后，來(lái)自被免疫小鼠的脾細(xì)胞在4小時(shí)的51Cr釋^:測(cè)定中針對(duì)B16F10、B16F10IFNa和B16F10siKb黑素瘤細(xì)胞系的細(xì)萬(wàn)包毒性。E，在第0、7和14天用免疫體DNA(DCIB15、DCIB31、DCIB32、DCIB36、DCIB48、DCIB52和DCIB54)對(duì)C57BI/6或HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。F,通過(guò)測(cè)量對(duì)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的應(yīng)答而測(cè)定了來(lái)自被免疫小鼠的脾細(xì)胞對(duì)TRP2表位的親和力。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力纟皮指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。G,在第0、7和14天用免疫體DNA(DCIB15、DCIB48、DCIB49、DCIB52和DCIB54)對(duì)C57BI/6或HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)H鄰B輔助肽(DCIB15、DCIB49和DCIB52)或gpl00DR4輔助肽(DCIB48和DCIB54)和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。圖32:免疫體DNA的免疫接種優(yōu)于肽的免疫接種或全抗原的免疫接種。A,將免疫體DNA的免疫接種(DCIB18)與不完全弗氏佐劑中的肽表位的皮下免疫接種或表達(dá)TRP2抗原的DNA的免疫接種進(jìn)行比較。在第0、7和14天對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫并在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽(■)、HepB輔助肽(聽)和培養(yǎng)基對(duì)照(□)來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B，通過(guò)測(cè)量對(duì)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的應(yīng)答而測(cè)定了來(lái)自被免疫體DNA()和肽()免疫的小鼠的脾細(xì)胞對(duì)TRP2表位的親和力。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。C，在6天的體外TRP2肽激發(fā)之后，來(lái)自纟皮免疫小鼠的脾細(xì)胞在4小時(shí)的51&釋放測(cè)定中針對(duì)B16F10")、B16F10IFNa(識(shí))和B16F10siKb(□)黑素瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。D,將免疫體DNA的免疫接種(DCIB18)與TRP2肽脈沖的DC的免疫接種進(jìn)行比較。在第0、7和14天對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫并在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽的滴定量來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。E，將免疫體DNA的免疫接種(DCIB18)與TRP2肽脈沖的DC的免疫接種進(jìn)行比較。在第0、7和14天對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫并在第19天用TRP2肽脈沖的LPS胚細(xì)胞在體外刺激脾細(xì)胞。刺激之后六天，用鉻釋;^丈測(cè)定來(lái)評(píng)估CTL系溶解B16F10或B16F10siKb黑素瘤系的能力。用%細(xì)胞毒性來(lái)測(cè)量應(yīng)答。F，將免疫體DNA的免疫接種(DCIB24)與SIINFEKL肽的免疫接種進(jìn)行比較。在第0、7和14天對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫并在第19天通過(guò)IFNy酶耳關(guān)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)SIINFEKL肽和對(duì)照肽來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。G，將免疫體DNA的免疫接種(DCIB15)與即100210M肽的免疫接種進(jìn)行比較。在第0、7和14天對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫并在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)gp100210M肽和對(duì)照的滴定量來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。H，將免疫體DNA的免疫接種(DCIB24)與SIINFEKL肽的免疫接種進(jìn)行比較。在第0、7和14天對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫并在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)SIINFEKL肽的滴定量來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。I，將免疫體DNA的免疫接種(DCIB15)與gpl00210M肽的免疫接種進(jìn)行比較。在第0、7和14天對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫并在第19天通過(guò)IFNy酶耳關(guān)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)gp100210M肽的滴定量來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力^C指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。圖33:DCIB21的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H2中的H印BSAg表位(IPQSLDSWWTSL)和Ll中的I-Ad限制的FluHACD4表位(FERFEIFPKE)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的歷m/IIIA4/eI和6amHI/^/WI限制性位點(diǎn)-陂突出顯示。圖34:可從CDRH2位點(diǎn)加工多個(gè)表位。A，在第0、7和14天用含有CDRH2中的SIINFEKL表位和CDRLl中的HepBCD4表位的免疫體構(gòu)建體(DCIB24)對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)SIINFEKL肽、不相關(guān)肽、HepBCD4肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B,在第0、7和14天用含有CDRH2中的H叩BCD8表位和CDRLl中的FluHACD4表位的免疫體構(gòu)建體(DCIB21)對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)HepBCD8肽、不相關(guān)肽、FluHACD4肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。圖35:DCIB17的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)和Ll中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///mfllIM/eI和^w2ffl/Bw'WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖36:DCIB26的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核香酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H1中的Tie-2Z84表位(FLPATLTMV)和Ll中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的歷wffllM/eI和5a/wHI/fe/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖37:可從可變區(qū)域加工多個(gè)CTL表位。A，在第0、7和14天用含有去掉部分骨架的CDRHl中的gp100IMDQVPFSV表位和CDRLl中的HepBCD4表位的免疫體構(gòu)建體(DCIB17)對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)gplOOIMDQVPFSV肽、HepBCD4肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B，在第0、7和14天用含有去掉部分骨架的CDRH1中的Tie2表位和CDRLl中的HepBCD4表位的免疫體構(gòu)建體(DCIB26)對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNY酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)Tie2肽、HepBCD4肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。圖38:可從相同免疫體構(gòu)建體中不同表位生成多種CTL應(yīng)答。HLA-A2限制的gplOO表位IMDQVPFSV被人工引入CDRHI位點(diǎn)并與CDRH2中的TRP2表位SVYDFFVWL并排，而且H印BCD4表位存在于CDRLl位點(diǎn)(DCIB15)。A，在第0、7和14天用免疫體DNA對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶3關(guān)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)gp100肽、TRP2肽、HepB輔助肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B，通過(guò)測(cè)量對(duì)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的應(yīng)答而測(cè)定了來(lái)自被免疫的小鼠的脾細(xì)胞對(duì)gp100修飾的IMDQVPFSV()表位、gp100野生型ITDQVPFSV表位(▲)和TRP2表位(■)的親和力。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。C，來(lái)自被免疫小鼠的脾細(xì)胞在4小時(shí)的sCr釋放測(cè)定中針對(duì)被gp100IMDQVPFSV肽、TRP2肽或?qū)φ账}沖的T2細(xì)胞和B16F10和B16F10HHD黑素瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。D，在第0、7和14天用含有i)CDRHl中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位(DCIB15)或ii)CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位(DCIB18)的免疫體DNA對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)gp100肽(■)、TRP2肽(難)、HepB輔助肽(謹(jǐn))和培養(yǎng)基對(duì)照(□)來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。E，使用IO貼DNA的溶液結(jié)合電穿孔通過(guò)肌肉內(nèi)對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在脛骨肌中隔周地進(jìn)行三次免疫接種。單獨(dú)使用DCIB24或DCIB18,二者結(jié)合地在相同位點(diǎn)或二者同時(shí)地但在分開的位點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。在第19天分析脾細(xì)胞以確定TRP2、SIINFEKL肽特異性免疫應(yīng)答的存在。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。圖39:DCIB37的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H1中的GP100F7L表位(TITDQVPLSV)和Ll中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的/f/wdllM/eI和SawHI/Bw'WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖40:DCIB40的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表HI中的GP100F7I表位(TITDQVPISV)和LI中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的//^flllM/eI和5^wHI/^/WI限制性位點(diǎn)-故突出顯示。圖41:DCIB41的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表HI中的GP100野生型表位(TITDQVPFSV)和LI中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的//z'wflnM/eI和6a/wHI/^^WI限制性位點(diǎn)^皮突出顯示。圖42:DCIB42的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的#1克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表HI中的GP100F7Y表位(TITDQVPYSV)和LI中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的歷w^III/y4/eI和^7wHI/fe/WI限制性位點(diǎn)-故突出顯示。圖43:DCIB43的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的^f皮克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表HI中的GP100V5L表位(TITDQLPFSV)和LI中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///mflll/v4/eI和BawHI/^/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖44:非錨定殘基的修飾能提高表位的免疫原性。在第0、7和14天用含有CDRH1區(qū)域中被修飾的gplOO表位的免疫體構(gòu)建體(DCIB37、DCIB40、DCIB41、DCIB42和DCIB43)對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶:f關(guān)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)gpl00野生型36表位肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。圖45:DCIB35的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表HI中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和Ll中HLA-DR4限制的gP100CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///"^inM/ei和5amHI/^z'WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖46:多個(gè)CD4輔助應(yīng)答可被處理和呈遞以引發(fā)體內(nèi)的免疫應(yīng)答。A，在第0、7和14天用含有CDRLl區(qū)域中I-Ab限制的H印BCD4表位的免疫體構(gòu)建體(DCIB15)對(duì)HHDII或C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。B，在第0、7和14天用含有CDRL1區(qū)域中I-Ad限制的HuHACD4表位(DCIB21)對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫。C，在第0、7和14天用含有CDRL1中HLA-DR4限制的gp100CD4表位的免疫體構(gòu)建體(DCIB35)對(duì)HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶^I關(guān)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)相應(yīng)的肽、不相關(guān)肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。D，在第0、7和14天用含有CDRL1(DCIB35)中、CDRH3(DCIB54)中和CDRL3(DCIB50)中HLA-DR4限制的gp100CD4表位的免疫體構(gòu)建體對(duì)HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)相應(yīng)的肽、不相關(guān)肽和培養(yǎng)基對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。圖47:DCIB50的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核脊酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和L3中HLA-DR4限制的gP100CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的州mfllI/4TeI和SamHI/^s/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖48:CD8T細(xì)胞應(yīng)答部分地依賴于分泌的重鏈但輔助應(yīng)答不需要分泌的輕鏈。A，在第0、7和14天用含有i)CDRHl中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位(DCIB15),ii)在重鏈上不含前導(dǎo)序列的CDRHl中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位，iii)在輕鏈上不含前導(dǎo)序列的CDRHl中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位的免疫體DNA構(gòu)建體對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)gp100(■)和HepBCD4(顯)肽和培養(yǎng)基對(duì)照(□)來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B，通過(guò)夾心Elisa對(duì)來(lái)自CHO-S轉(zhuǎn)染子上清液的重鏈、輕鏈和完整免疫體的確定。將抗人Fc特異性抗體或抗人k鏈抗體涂布在板上。為了檢測(cè)重鏈，抗人IgGFc特異性HRP抗體與抗人Fc特異性涂布抗體共同使用。為了檢測(cè)完整免疫體，抗人k鏈特異性HRP抗體與抗人Fc特異性涂布抗體共同使用。為了檢測(cè)輕鏈，抗人k鏈特異性HRP抗體與抗人k鏈特異性抗體共同使用。C,在第0、7和14天用含有i)CDRHl中的gpl00表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位(DCIB15),ii)在重鏈上不含前導(dǎo)序列的CDRHl中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位的免疫體DNA構(gòu)建體對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。D,在第0、7和14天用含有i)CDRHl中的gpl00表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位(DCIB15)，ii)在重鏈上不含前導(dǎo)序列的CDRHl中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位的免疫體DNA構(gòu)建體對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)HepB輔助肽來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。圖49:免疫體Fc區(qū)域有利于建立有效的免疫應(yīng)答。A，在第0、7和14天用含有i)CDRHI中的即100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位(DCIB15),ii)缺少Fc區(qū)域的CDRHl中的即100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的H印BCD4表位的免疫體DNA構(gòu)建體對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2(驟)肽、培養(yǎng)基對(duì)照(□)、B16F10黑素瘤系(■)和B16F10siKb陰性對(duì)照細(xì)胞系(■)來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B，在第0、7和14天用含有i)CDRHl中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位(DCIB15)，ii)缺少Fc區(qū)域的CDRHl中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位的免疫體DNA構(gòu)建體對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFlSTy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。C，為了HepB輔助肽的特異性應(yīng)答，分析了相同的小鼠。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。D,通過(guò)測(cè)量對(duì)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的應(yīng)答而測(cè)定了來(lái)自被DCIB15或缺少Fc區(qū)域的DCIB15(DCIB15FcStop)免疫的小鼠的脾細(xì)胞對(duì)TRP2表位的親和力。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。E，在第0、7和14天用含有i)CDRHl中的即IOO表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl人IgGl中的HepBCD4表位(DCIB15)，ii)帶有人IgG2恒定區(qū)域的相同構(gòu)建體(DCIB33)，iii)帶有人IgG3恒定區(qū)域的相同構(gòu)建體(DCIB65),iv)帶有被人IgG2結(jié)合基序替換的人IgGl結(jié)合基序的相同構(gòu)建體(DCIB66)以及v)帶有被人IgGl基序替換的結(jié)合基序的DCIB33(DCIB67)的免疫體DNA構(gòu)建體對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽(■)、培養(yǎng)基對(duì)照(□)和HepB輔助肽(ffl)來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。F,通過(guò)夾心Elisa對(duì)來(lái)自CHO-S轉(zhuǎn)染子(DCIB15、DCIB33、DCIB65、DCIB66和DCIB67)上清液的重鏈、輕鏈和完整免疫體的確定。將抗人Fc特異性抗體或抗人k鏈抗體涂布在板上。為了檢測(cè)重鏈，抗人IgGFc特異性HRP抗體與抗人Fc特異性涂布抗體共同使用。為了檢測(cè)完整免疫體，抗人k鏈特異性HRP抗體與抗人Fc特異性涂布抗體共同使用。為了檢測(cè)輕鏈，抗人k鏈特異性HRP抗體與抗人k鏈特異性抗體共同使用。G,通過(guò)夾心Elisa對(duì)來(lái)自被DCIB53轉(zhuǎn)染的CHO-S的上清液中的重鏈免疫體的確定。將抗小鼠Fc特異性抗體涂布在板上。為了檢測(cè)重鏈，抗小鼠IgG2a特異性HRP抗體被使用。圖50:免疫體免疫接種提高免疫應(yīng)答并克服在全抗原中觀察到的調(diào)節(jié)。A，在第0、7和14天用免疫體DNA構(gòu)建體DCIB15或pcDNA3載體中的全gp100抗原對(duì)HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠(HHDII)進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)gp100肽或?qū)φ諄?lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B，通過(guò)在腹膜內(nèi)注射400|ig抗CD25抗體(PC61)使C57BI/6小鼠耗盡CD25陽(yáng)性細(xì)胞。接下來(lái)在第4、11和18天用免疫體DNA構(gòu)建體DCIB15或pOrig載體中的全TRP2抗原對(duì)耗盡CD25的小鼠和未耗盡的動(dòng)物二者進(jìn)行免疫。在第23天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽或?qū)φ諄?lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。C和D，HHDII小鼠未被處理(c)或被腹膜內(nèi)400嗎的PC61mAb處理(d)。4天后，使用Tie2C200HFcDNA構(gòu)建體對(duì)所有小鼠進(jìn)行免疫。間隔7天重復(fù)進(jìn)行DNA免疫接種一共3次。最后一次免疫接種之后6天，收集脾細(xì)胞并通過(guò)先體外后體內(nèi)的IFNy酶:f關(guān)免疫斑點(diǎn)測(cè)定使用1pg/ml的來(lái)自Tie-2的每一個(gè)預(yù)測(cè)的CTL表位重新刺激。柱表示每只單個(gè)小鼠的被歸一化至背景對(duì)照的三個(gè)值的平均，而誤差棒代表與平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。E和F，HHDII小鼠未被處理(e)(=3)或被腹膜內(nèi)400昭的PCW抗體處理(f)(w-2)。4天后，在IFA(皮下)中使用按l:l混合的IOO貼Z12肽和100貼Z48肽對(duì)所有小鼠進(jìn)行免疫。第一次肽免疫接種之后7天重復(fù)施用肽免疫接種。最后一次免疫接種之后14天，收集脾細(xì)胞并通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定使用1嗎/ml的Z12肽(黑柱)或單獨(dú)的培養(yǎng)基(空柱)重新刺激。柱表示三個(gè)值的平均，而誤差棒代表與平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。G，在IFA(皮下)中使用按1:1混合的100貼Z12肽對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫。第一次肽免疫接種之后第7和14天重復(fù)施用肽免疫接種。最后一次免疫"^妻種之后7天，收集脾細(xì)胞并分析以證實(shí)對(duì)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的表位特異性應(yīng)答的存在。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量來(lái)自單個(gè)小鼠的應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。H，在第0、7和14天通過(guò)基因槍使用免疫體DNA構(gòu)建體DCIB71對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫。最后一次免疫接種之后7天，收集脾細(xì)胞并分析以證實(shí)對(duì)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的表位特異性應(yīng)答的存在。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量來(lái)自單個(gè)小鼠的應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。圖51:DCIB71的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的Tie-2Z12表位(ILINSLPLV)和Ll中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的/f/mffllM/eI和5awHI/fe/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖52:DCIB72的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表H2中的Tie-2Z12表位(ILINSLPLV)和Ll中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的///wdllM/eI和BawHI/^AVI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖53:異種Fc在提供T細(xì)胞輔助方面的角色以及抗原特異性T細(xì)胞41輔助的要求。A，在第0、7和14天用含有CDRHI中的gpl00表位或CDRH2中的TRP2表位(相應(yīng)地，IB17和IB18)的重鏈免疫體DNA構(gòu)建體對(duì)C57BI/6或HHDII小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNY酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)gp100肽或TRP2肽和對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B，通過(guò)測(cè)量對(duì)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的應(yīng)答而測(cè)定了來(lái)自被含有CDRH2中TRP2表位的免疫體重鏈免疫的小鼠的脾細(xì)胞對(duì)TRP2表位的親和力。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。C，在第0、7和14天用含有CDRH1中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRLl人IgGl中的HepBCD4表位(DCIB15)或者CDRHl中的gp100表位、CDRH2中的TRP2表位和帶有鼠IgG2a恒定區(qū)域的CDRLl中的HepBCD4表位(DCIB53)的免疫體DNA構(gòu)建體對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽、HepB輔助肽和對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。D,通過(guò)測(cè)量對(duì)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的應(yīng)答而測(cè)定了來(lái)自被DCIB15和DCIB53免疫的小鼠的脾細(xì)胞對(duì)TRP2表位的親和力。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。E，在第0、7和14天用含有CDRH1中的gpl00DR4表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRH3人IgGl中的gpl00DR7表位(DCIB54)或者CDRHl中的gpl00DR4表位、CDRH2中的TRP2表位和帶有鼠IgGh恒定區(qū)域的CDRH3中的即100DR7表位(DCIB64)的免疫體DNA構(gòu)建體對(duì)HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽、gpl00DR4輔助肽和對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。F，通過(guò)測(cè)量對(duì)IFNy酶l關(guān)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的應(yīng)答而測(cè)定了來(lái)自被DCIB54和DCIB64免疫的小鼠的脾細(xì)胞對(duì)TRP2表位的親和力。42用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。圖54:DCIB53的序列表達(dá)載體pDCOrigmoigG2a中鼠的重和輕全長(zhǎng)鏈的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和Ll中的HepBCD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的////wffllM/eI和BawHL7^al限制性位點(diǎn)^皮突出顯示。圖55:DCIB64的序列表達(dá)載體pDCOrigmoigG2a中鼠的重和輕全長(zhǎng)鏈的核苷酸和氨基酸序列。終止密碼子由星號(hào)標(biāo)明。方框中的氨基酸代表H1中HLA-DR7限制的gp100CD4表位(GTGRAMLGTHTMEVTVYH)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和H3中HLA-DR4限制的部100CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的歷wJU!A4/eI和SawHI////^1限制性位點(diǎn)一皮突出顯示。圖56:免疫蛋白酶體的加工對(duì)于免疫體構(gòu)建體中表位的應(yīng)答的產(chǎn)生是重要的。在第0、7和14天用含有CDRH1中的即1002°9-217表位(DCIB41)或CDRHl中修飾版的gpl00210M(DCIB")對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)即1002()9-217肽或gpl00210M肽和對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。A，在第0、7和14天用免疫體DNA(DCIB15)通過(guò)基因槍進(jìn)行肌肉內(nèi)+a電穿孔或皮內(nèi)+a電穿孔而對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。B，通過(guò)測(cè)量對(duì)IFNy酶耳關(guān)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中增加的肽濃度的應(yīng)答而測(cè)定了來(lái)自被不同途徑免疫的小鼠的脾細(xì)胞對(duì)TRP2表位的親和力。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答，而親和力被指定為導(dǎo)致50%最大效應(yīng)功能的濃度。圖58:免疫體免疫接種誘發(fā)類白癜風(fēng)脫色素作用并保護(hù)免受腫瘤的攻擊。A，被含有CDRH2中的TRP2表位和CDRLl中的HepBCD4表位的免疫體DNA(DCIB18)免疫的C57BI/6小鼠證明在免疫接種位點(diǎn)的毛發(fā)生長(zhǎng)中的脫色素作用。B，在第3次和第4次免疫接種之間通過(guò)靜脈內(nèi)注射用2xl(^個(gè)B16F10IFNa細(xì)胞攻擊被免疫的C57BI/6小鼠。在腫瘤攻擊之后49天評(píng)估肺中的腫瘤負(fù)荷。腫瘤負(fù)荷^皮表示為平均腫瘤面積所占總的肺面積的百分比。在最后一次免疫接種之后7天經(jīng)過(guò)皮下用2><104個(gè)B16F10IFNa細(xì)胞攻擊被免疫的小鼠。以3-4天的間隔測(cè)量腫瘤尺寸，而且一旦腫瘤生長(zhǎng)超出限制，就將小鼠安樂(lè)死。C，腫瘤注射后第46天評(píng)估的腫瘤尺寸。D，存活率。圖59:免疫體免疫"l矣種顯著地推遲胂瘤生長(zhǎng)。A，使用2xl(^個(gè)B16F10細(xì)胞對(duì)C57BI6小鼠進(jìn)行皮下注射。腫瘤注射4天后，使用DCIB52免疫體DNA對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。在腫瘤注射后第11和18天重復(fù)進(jìn)行免疫接種。以3-4天的間隔分析腫瘤負(fù)荷，而且一旦紳瘤生長(zhǎng)超出最大的允許限制，就將小鼠安樂(lè)死。繪制腫瘤體積對(duì)時(shí)間的圖表。B,使用2><104個(gè)B16F10IFNa細(xì)胞對(duì)C57BI6小鼠進(jìn)行皮下注射。肺瘤注射14天后，使用DCIB52免疫體DNA對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。在紳瘤注射后第21和28天重復(fù)進(jìn)行免疫接種。以3-4天的間隔分析胂瘤負(fù)荷，而且一旦腫瘤生長(zhǎng)超出最大的允許限制，就將小鼠安樂(lè)死。顯示在胂瘤植入后第47天的肺瘤體積。C,使用2xl0"個(gè)B6F10細(xì)胞在皮下而且在適當(dāng)情況下使用抗CD25抗體在腹膜內(nèi)對(duì)C57BI6小鼠進(jìn)行注射。腫瘤注射4天后，使用DCIB52免疫體DNA或?qū)φ彰庖唧wDNA對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。在腫瘤注射后第11和18天重復(fù)進(jìn)行免疫接種。在適當(dāng)情況下，在第11天將免疫接種與抗CTLA-4抗體的腹膜內(nèi)注射相結(jié)合。以3-4天的間隔分析腫瘤負(fù)荷，而且一旦腫瘤生長(zhǎng)超出最大的允許限制，就將小鼠安樂(lè)死。繪制腫瘤體積對(duì)時(shí)間的圖表。圖60:DCIB68的序列與表達(dá)載體pDCOrig中人IgGlFc和k恒定區(qū)域符合讀框的被克隆到重和輕可變區(qū)域的核香酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl和L3中的HLA-DR7限制的gp100CD4表位(GTGRAMLGTHTMEVTVYH)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和H3和Ll中的HLA-DR4限制的gp100CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在來(lái)自單個(gè)構(gòu)建體可變重和輕區(qū)域的轉(zhuǎn)移中的歷"dlI/4/eI和^mHI/^/WI限制性位點(diǎn)被突出顯示。圖61:免疫應(yīng)答可由不同載體骨架表達(dá)的免疫體構(gòu)建體生成。在第0、7和14天用含有CDRHl中的gpl00DR4表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRH3人IgGl中的gpl00DR7表位的免疫體DNA構(gòu)建體(DCIB54,Bl-3)和pVax載體中的等價(jià)構(gòu)建體(VaxDCIB54，Cl-3)對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。在第19天通過(guò)1FNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定針對(duì)TRP2肽和對(duì)照來(lái)分析脾細(xì)胞。用斑點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞來(lái)測(cè)量應(yīng)答。實(shí)施例方法DNA載體的生成使用PCR來(lái)擴(kuò)增pSVgptHuigGl和pSVhygHuCk載體(BiovationLtd)中的SC100克隆VHdVKb(WO01/88138)的去免疫鼠重和輕可變區(qū)域。使用州"^111/4^1和^7附111/&/\￥1位點(diǎn)將Vh和VL區(qū)域PCR產(chǎn)物與人IgGl和k恒定區(qū)域符合讀框地克隆以生成單鏈構(gòu)建體pOrigHIB和pOrigLIB(參見圖1和2)。通過(guò)雙脫氧鏈終止法來(lái)確認(rèn)全長(zhǎng)嵌合重和k鏈的序列(Sanger等,PraceWwg^Ae齒"6)船/爿oKifem少o/Sc/ewcesf/ze7wte/Stotesq/]mm'ca1977;74:5463-7)。嵌合重和輕鏈的DNA和被翻譯的蛋白序列分別被顯示在圖3和4?；パa(bǔ)決定區(qū)域(CDR)的位置被指明。除了保持六個(gè)氨基酸的重CDR2區(qū)域以外，重和輕鏈的CDR被完全除去并交換為獨(dú)特的限制酶位點(diǎn)。這通過(guò)仔細(xì)檢查序列任一側(cè)的區(qū)域以便進(jìn)行允許限制酶位點(diǎn)生成的切除來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些獨(dú)特的限制性位點(diǎn)被用來(lái)打開DNA以使編碼抗原表位的寡核苷酸可被插入。通過(guò)引入表位引物而將在限制性位點(diǎn)生成中失去的多數(shù)骨架序列替換，從而保證氨基酸在翻譯時(shí)被保持并且所述序列符合讀框地保留。表1列出所有CDR的被選酶位點(diǎn)和表位寡核苷酸序列。CDR區(qū)域^皮除去并用獨(dú)特的限制性位點(diǎn)通過(guò)重疊延伸PCR替換，如圖5所示。對(duì)于重可變區(qū)域，寡核苷酸H1、H2和H3(參見表2)被設(shè)計(jì)為替換三個(gè)CDR中的每一個(gè)。每個(gè)特定的引物含有10-20bp的序列，其被并入酶位點(diǎn)的任一側(cè)。與結(jié)合至人IgGl恒定區(qū)域的普通反向引物huHeClonR(參見表2)結(jié)合使用，第一輪PCR被設(shè)置成由1pl的模板質(zhì)粒pOrigHIB、2pl的dNTPS(2.5mM)、5ji的10x的Taq聚合酶》爰沖液、1pl的正向和反向引物(25pmol)、用無(wú)菌蒸餾水配成的終體積為50pl的5個(gè)單位的Taq聚合酶(NewEnglandBiolabs)組成。反應(yīng)經(jīng)歷了在95°C下5分鐘的最初變性，接著是在95。C下30s的35個(gè)循環(huán)，在55°C(退火)下1分鐘，和在72°C(延伸)下1分鐘。最后一個(gè)循環(huán)包含使用TechnePHC-1可編程循環(huán)反應(yīng)器的10分鐘的延伸。相似地，對(duì)于輕可變區(qū)域，寡核苷酸Ll、L2和L3^皮設(shè)計(jì)為替換三個(gè)CDR中的每一個(gè)(參見表2)。第一輪PCR按照上述被設(shè)置，但含有結(jié)合至人k鏈的恒定區(qū)域以及模板pOrigLIB的反向引物huLiClonR(參見表2)。表1.CDR替換酶和表位寡核苷酸序列的列表表位寡核苷酸5'NN柳鄉(xiāng)TGGGTTCG3'3'N柳NNNACCCAAGC5'5TNN柳,CGATTGA3'3'A,、柳MGCTAAGT5'5'GAMMMM,TG3'3'CTN,MMMAC5'5'CTCTTGCM,NNNTGGT3'3'GAGAACGNN剛,ACCA5'CDRRE位點(diǎn)Hl~/H2她c/H3LIT2yTO,5'CTACNM柳NMAG3'"，3'GATG剛NN剛TC5'lP'ATAATGACG,NN柳AAGCCACCTCC5'N代表表位DNA序列余下的字母代表需要被并入的骨架核苷酸之后的PCR,如上述所設(shè)置。450bp的擴(kuò)增的DNA片段被直接克隆進(jìn)TATOPO載體pCR2.1(Invitrogen)，而且被測(cè)序以確認(rèn)VH和VL區(qū)域擴(kuò)增的克隆缺乏CDR和限制性位點(diǎn)的替換。在可變重和輕區(qū)域中的CDR被它們相應(yīng)的酶位點(diǎn)Hl、H2、H3、Ll、L2和L3單獨(dú)地、組合地和一起替換(圖6和7)。然后使用HindlII/Afel和Bamffl/BsiWI直接替換親本的野生型去免疫的SC100Vh和Vl區(qū)域而將不同版本插入pOrigHIB和pOrigLIB。這允許含有單個(gè)或多個(gè)表位的分子的生成(來(lái)自相同或不同抗原)。表2——引物<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>SVYDFFVWL5'-磷酸化的-TAGTGTTTATGATTTTTTTGTGTGGCTCCGATTCA-3'3'-ATCACAAATACTAAAAAAACACACCGAGGCTAAGT陽(yáng)磷酸化的-5'互補(bǔ)的寡核苷酸在無(wú)菌的雙蒸餾水中被再懸浮至終濃度1mg/ml，并用TE緩沖液將10^的每種引物配制成終體積50^而設(shè)置反應(yīng)以共同退火。反應(yīng)^皮循環(huán)在95。C下5分鐘(O.rC/秒)，在72。C下20分鐘0.1。C/秒，在55°C下20分鐘，然后^^皮保持在4°C。為了插入H2位點(diǎn)，通過(guò)設(shè)置Mscl限制性消化(取決于將被用于表位插入的CDR)將載體pOrigHIBH2和/或pOrigHIBH1H2直線化，并在37°C孵育過(guò)夜。所述消化物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，而且被切的載體用凝膠提取來(lái)純化。為了避免直線化的載體的自體連接，來(lái)自載體5'端的磷酸基團(tuán)通過(guò)處理和在37。C孵育過(guò)夜而被除去，所述孵育是將小牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)5個(gè)單位，10的10xNEB緩沖液3，用無(wú)菌蒸鎦水配制成終體積100pl。去磷酸化的載體被純化，而且用不摻雜的、1/100和1/200稀釋的退火的寡核苷酸建立的連接作用使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其直接克隆進(jìn)H2位點(diǎn)。使用通用的CMV正向引物通過(guò)在單個(gè)栽體中測(cè)序而確認(rèn)表位的插入。表3CTL和輔助表位蛋白質(zhì)坐標(biāo)序列HLA限制TRP2180-188SVYDFFVWLagtgtttatga,ttgtgtggctcA2,KbGP100209-217ITDQWFSVaccattactgaccaggtgcctttctccgtgA2GP100(210M)209-217(M)IMDQVPFSVaccattatggaccaggtgcctttctccgtgA2GP100(F7L)209-217ITDQVPLSVaccattactgaccaggtgcctttgtccgtgA2GP10044-59■RQLYPEWTEAQRLDtggaacaggcagctgtatccagagtggacagaagcccagagacttgacDR0401HEPBSAG28-39IPQSLDSWWTSLataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcKd(CTL)HepB核蛋白128-140TPPAYRPPNAPILactcctccagcttatagacc3ccaa3tgcccctatcctaI-Ab(輔助)MAGE3271-279FLWGPRALVttcctgtggggtccaagggccctcgttA2Tie2(Z83)124-132FLPATLTMTttcctaccagctactttaactatgactA2<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>向雙表達(dá)載體pDCOrig中的轉(zhuǎn)移一旦所有表位已經(jīng)被并入單個(gè)載體中的Vh和Vl位點(diǎn)，使用與其相應(yīng)的人恒定區(qū)域符合讀框的歷m/III/Afel和SothHI/RwWI將它們轉(zhuǎn)移到雙表達(dá)載體pDCOrig中。為了生成免疫體TM雙表達(dá)載體pDCOrig，使用挨著CMV啟動(dòng)子的平端限制性內(nèi)切酶Nml將pOrigHIB直線化。用平端Nrul和Hpal內(nèi)切酶將pOrigLIB消化以切除整個(gè)輕鏈表達(dá)盒，其中所述輕鏈表達(dá)盒由CMV啟動(dòng)子、去免疫的人k鏈和BGH多聚腺苷酸信號(hào)組成。在直線化的載體pOrigHIB和輕鏈表達(dá)盒的凝膠電泳、分離以及凝膠提取之后，所述載體被去磷酸化而且輕鏈表達(dá)盒被連接以形成構(gòu)建體pDCOrig(圖8)。pDCOrig中輕鏈盒的方向通過(guò)限制性分析被確認(rèn)。pDCOrig含有在相同構(gòu)建體中被合并的重和輕鏈基因編碼序列二者，其消除內(nèi)含子序列和兩種載體系統(tǒng)。表達(dá)由高水平的CMV立即早期啟動(dòng)子和其他DNA控制元件例如牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化信號(hào)驅(qū)使。還包括選擇標(biāo)志物博萊霉素以將表達(dá)和生產(chǎn)效率最大化。該載體的精心設(shè)計(jì)在可變和恒定區(qū)域接合處保持了獨(dú)特的限制性酶位點(diǎn)，并提供快速和簡(jiǎn)單的方法以產(chǎn)生可變區(qū)域的不同組合(表位插入，參見圖8)。表4列出所生成的一些pDcOrigIB構(gòu)建體。表4.pDCOrig構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>DDcOriglB15CH1終止的生成使用Quik變化位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Stratagene)和互補(bǔ)的寡核苷酸origstophuHeCHl正向和OrigstophuHeCHl反向引物(參見表2)按照制造商的指示將終止密碼子并入構(gòu)建體pDCOriglB15中的人IgGl恒定區(qū)域的CH1結(jié)構(gòu)域之后。通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)終止密碼子的并入(圖9)。前導(dǎo)序列從pDCOriglB15中的去除為了從載體pDCOrigIB15的重和輕鏈除去前導(dǎo)序列，設(shè)置了PCR,其使用pDCOrigIB15模板以及無(wú)前導(dǎo)序列的pOrig輕鏈和無(wú)前導(dǎo)序列的pOrig重鏈正向引物分別與反向引物huHeClonR和hiLiClonR的結(jié)合(表2)。擴(kuò)增的片段是被連接至載體pCR2.1(Invitrogen)的TATOPO，而且通過(guò)測(cè)序來(lái)確認(rèn)克隆。缺乏前導(dǎo)序列的IB15Vh和Vl區(qū)域二者分別通過(guò)使用HindlII/Afel和BamHI/BsiWI位點(diǎn)被克隆回pDCOrigIB15。Vh和Vl區(qū)域的DNA序列和翻譯分別被顯示在圖10和11中。免疫體雙表達(dá)載體pDCOrig的人IgG2和IgG3同種型的構(gòu)建人IgG3恒定區(qū)域通過(guò)PCR被擴(kuò)增，其使用分別含有Afel和EcoRV并帶有模板pOTB7huigG3的huigg3正向和反向引物(表2)(圖像克隆4566267MGC45809)。相似地，人IgG2恒定區(qū)域被擴(kuò)增，其使用帶有pTOB7huigG2模板的igG2正向和igG2反向引物(表2X圖像克隆6281452MGC71314)。兩種片段都是被連接到pCR2.1的TOPO而且被確認(rèn)序列(圖12和13)。構(gòu)建體pDCOriglB15中的hmgGl恒定區(qū)域被有效地替換成huigG2和huigG3二者以產(chǎn)生pDCOriglB15huigG2和pDCOnglB15huigG3(圖14)，其中huigG2和huigG3使用Afel和Sapl位點(diǎn)與重可變區(qū)域符合讀框地克隆。兩種載體都在可變/恒定區(qū)域接合處保持相同的獨(dú)特限制性位點(diǎn)。這允許在所有的人同種型單和雙鏈免疫體載體之間容易地交換可變區(qū)域。人IgGlFcy和人IgG2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變?yōu)榱擞胔uigG2的P233V234A235取代CH2結(jié)構(gòu)域中huigGl結(jié)合基序的氨基酸E233L234L235,使用PCR重新擴(kuò)增含有所述突變的短片段。含有所述取代和組成的限制性位點(diǎn)Ahdl的反向引物huigGlPVA反向與正向引物HIBF(表2)和模板pDCOrigIB]5—起使用。所得片段被連接至載體pCR2.1(Invitrogen)。在序列確認(rèn)后，含有所述突變的部分通過(guò)向質(zhì)粒pDCOrigIB15huigGl的單切割A(yù)gel/Mdl位點(diǎn)插入而有效地替換野生型序列(圖15)。構(gòu)建體pDCOrigIB15huigG2的huigG2恒定結(jié)構(gòu)域中的氨基酸P233V234A235也被huigGl結(jié)合基序ELLG取代。如前所述，含有所述取代和組成的限制性位點(diǎn)Ahdl的反向引物huigG2ELLG反向(表2)與正向引物HIBF和模板pDCOrigIB15人igG2—起使用。所述片段是被連接到載體pCR2.1的TATOPO。在序列確認(rèn)后，含有huigGl結(jié)合基序的部分使用質(zhì)粒pDCOrigIB15huigG2的Agel/Ahdl位點(diǎn)再次替換野生型序列(圖16)。pDCOrig鼠IgG2a質(zhì)粒DCIB53和DCIB63的生成為了構(gòu)建鼠igG2a版本的雙表達(dá)栽體pDCOrig,從分離自雜交瘤細(xì)胞系337的總RNA合成cDNA。為了擴(kuò)增鼠lgG2a恒定區(qū)域，含有限制性位點(diǎn)Afe1的正向引物migG2aC1AfeF2與在終止密碼子之后包含Xbal位點(diǎn)的反向引物migG2aXbaRA共同使用。PCR片段是被連接到載體pCR2.1的TOPO。在序列確認(rèn)后，鼠igG2a恒定區(qū)域被切除并與鼠重可變區(qū)域符合讀框地被克隆進(jìn)載體pOrigHIB的Afel/Xbal位點(diǎn)以有效地替換人igGl。通過(guò)使用Quik變化位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Stratagene)以及分別地互補(bǔ)引物MoigG2BamHI正向和反向、MoigG2Xho1正向和反向的^f立點(diǎn)定向i秀變，BamHI和Xhol位點(diǎn)被依次除去而在翻譯時(shí)不改變來(lái)自鼠igG2a恒定區(qū)域的氨基酸序列。這生成單鏈免疫體載體pMoOrigHIB(圖17A)。用位于SV40啟動(dòng)子的Afel和單切割A(yù)vrll將含有MoigG2a恒定區(qū)域的pMoOrigHIB的一部分從單個(gè)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到與鼠重可變區(qū)域符合讀框的雙表達(dá)載體pDCOrigIB15中以生成仍然含有人k區(qū)域的中間載體pDCOriglB15MoigG2ahuk。為了擴(kuò)增鼠k區(qū)域，cDNA與在終止密碼子之后含有BsiWI位點(diǎn)的引物MoLClBsiFl與包含Xhol位點(diǎn)的引物MoLCXhol—起用作模板。如前所述，被擴(kuò)增的片段是被克隆到載體pCR2.1的TOPO。使用BsiWI/Xho1說(shuō)明書第50/71頁(yè)鼠k區(qū)域凈皮切除并連4妻到免疫體載體pOrigLIBLl和pOrigLIBhepB輔助/Ll以替換人k恒定區(qū)域生成中間載體pMoLIBLlBsi和pMoLIBHepB輔助/LlBsi。免疫體系統(tǒng)包括使用在可變和恒定區(qū)域接合處的獨(dú)特限制性位點(diǎn)的可變區(qū)域的轉(zhuǎn)移，同時(shí)鼠重可變和moigG2a恒定區(qū)域之間的接合處可容納Afel位點(diǎn)(存在于所有的人免疫體載體中)而不改變翻譯時(shí)的氨基酸序列，在鼠可變和k之間的區(qū)域是有問(wèn)題的。在分析此接合處的序列時(shí)，不可包括不改變氨基酸序列的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)。在接合處的BsiWI位點(diǎn)被移除以恢復(fù)野生型序列。這使用重疊PCR通過(guò)擴(kuò)增完整的鼠全長(zhǎng)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)。使用在接合處和兩側(cè)區(qū)域含有野生型序列并有效地移除BsiWI的正向引物MokSDM正向來(lái)設(shè)置第一個(gè)PCR，而BGH反向引物和中間輕鏈載體pMoLIBLlBsi和pMoLIBhepB輔助/LlBsi被分別作為模板。來(lái)自第一引物ImmunoLikozFor—起使用。擴(kuò)增的全長(zhǎng)鼠k鏈?zhǔn)潜贿B接到pCR2.1的TOPO而且序列被確認(rèn)。在pCR2.1中的Ll位點(diǎn)含有hepB輔助的全長(zhǎng)鼠k鏈被切除并克隆進(jìn)中間雙表達(dá)載體pDCOrigIB15MoigG2ahuk的BamHI/Xho1位點(diǎn)以替換人k鏈而生成鼠雙表達(dá)載體pDCOrigIBGP100210m/HlTRP2/H2H印B輔助/LlmoIgG2a(DCIB53,圖17B和54)。相似地，含有Ll位點(diǎn)的全長(zhǎng)鼠k鏈被切除并克隆進(jìn)中間雙表達(dá)載體pDCOriglB15MoigG2ahuk的BamHI/Xho1位點(diǎn)以替換人k鏈而生成帶有空的Ll位點(diǎn)的中間鼠雙表達(dá)載體pDCOriglB15moIgG2a。為了生成帶有野生型輕可變區(qū)域的構(gòu)建體，互補(bǔ)的5'磷酸化引物wtKvarLl正向和反向(表2)如上所述被退火并在用EcoRV直線化后插入Ll位點(diǎn)。最后，使用HindlII/Afel將來(lái)自含有GP100DR7/H1TRP2/H2和GP100DR4/H3的DCIB54的重可變區(qū)域轉(zhuǎn)移以生成pDCOrigGP100DR7/H1TRP2/H2GP100DR4/H3moigG2a野生型k(DCIB68，圖17C和60)。SV40啟動(dòng)子移除使用包含Nhel位點(diǎn)的正向引物SV40PremFOR和帶有模板pOrigHIB的SV40PremREV反向引物(表2)將EM7細(xì)菌啟動(dòng)子和博萊霉素基因擴(kuò)54增。所得的511bp的PCR片段是連接的pCR2.1TOPO并通過(guò)測(cè)序而確認(rèn)。使用來(lái)自pCR2.1的Nhel和Fsel將EM7啟動(dòng)子和一部分博萊霉素基因切除并直接克隆進(jìn)pOrigfflBHl而有效地移除SV40啟動(dòng)子。Nhel位點(diǎn)殘基位于SV40啟動(dòng)子之前，而Fsel識(shí)別序列是載體的博萊霉素基因中的單切割。在序列確認(rèn)后，從單個(gè)載體將更大的部分轉(zhuǎn)移到編碼huigGl尾端、BGH多聚腺苷酸、EM7和部分博萊霉素基因的pDCOrigIB68載體以用Sapl和Fsel消化而有效地將SV40啟動(dòng)子從雙表達(dá)載體移除。對(duì)FDA法規(guī)遵從的一種pVaxl(Invitrogen)的pDCOrig骨架的改變使用HindIII和Xbal從構(gòu)建體DCIB54將免疫體全長(zhǎng)人igGl重鏈切除并插入載體pVaxl的MCS中的這些位點(diǎn)(圖18A)。為了生成雙鏈表達(dá)載體的pVax版本，使用臨近于CMV啟動(dòng)子的平端限制性內(nèi)切酶Nml將pVaxIB54HIB直線化。使用平端Nml和Hpal內(nèi)切酶將pOrigLIB(圖18B)消化以切除整個(gè)輕鏈表達(dá)盒，其中所述輕鏈表達(dá)盒由CMV啟動(dòng)子、免疫體人k鏈和BGH多聚腺苷酸信號(hào)組成。在直線化的載體pVaxIB54HIB和輕鏈表達(dá)盒的凝膠電泳、分離以及凝膠提取之后，所述載體被去磷酸化而且輕鏈表達(dá)盒被連接以形成構(gòu)建體pVaxDCIB54(圖18C)。pVaxDCIB54中輕鏈盒的方向通過(guò)限制性分析被確認(rèn)。pVaxDCIB54在可變/恒定區(qū)域接合處保持相同的獨(dú)特限制性位點(diǎn)，以允許在所有的人同種型單和雙鏈免疫體載體之間容易地交換可變區(qū)域。例如，為了生成pVaxDCIB68(圖60),使用BamHI/BsiWI將含有GplOODR4/Ll和Gpl00DR7/L3的鼠輕可變區(qū)域從DCIB68切除并克隆進(jìn)pVaxDCIB54以有效地替換輕野生型可變區(qū)域。r)Orig鼠TRP2和pCDNA3GP100的生成為了構(gòu)建pOrig鼠TRP2,由從細(xì)胞系B16F10分離的5pg總RNA而合成的cDNA被用作模板以使用分別包含HindIII或EcoRV位點(diǎn)的鼠TRP2正向和反向引物(表2)來(lái)擴(kuò)增全長(zhǎng)的鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP2)。全長(zhǎng)TRP2被連接至載體pOrigHIB的HindlII/EcoRV多個(gè)克隆位點(diǎn)。還使用被設(shè)計(jì)為分別含有EcoRV和Xhol位點(diǎn)的鼠GP100正向和反向引物從cDNA擴(kuò)增全長(zhǎng)鼠GP100(表1)。PCR產(chǎn)物被克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體pCDNA3(Invitrogen)的EcoRV/Xho1位點(diǎn)。通過(guò)限制性分析鑒定二種質(zhì)粒并用DNA測(cè)序確認(rèn)。夾心Elisa使用50pl溶于PBS的10叫/ml的抗人IgG、Fc特異性抗體(Sigma12136)或抗人k輕鏈抗體(DakoA0191)涂布Falcon96孔柔性板并在4°C過(guò)夜。使用SkanWasher400(MolecularDevices)和200pl/孔PBS-吐溫20(0.05%)將板沖洗三次，并用PBS中的1%魚皮明膠(Sigma)(1%FSG/PBS)封閉孔。在室溫將板孵育1小時(shí)并用1%的FSG/PBS沖洗。將含有被表達(dá)的免疫體或純化的免疫體蛋白的組織培養(yǎng)上清液(50pi)加入孔中，一式三份，并在室溫將板孵育1小時(shí)。用1%的FSG/PBS將板沖洗，并檢測(cè)結(jié)合的免疫體，其中所述檢測(cè)是通過(guò)加入50iul/孔過(guò)氧化物酶軛合的抗人IgG、Fc特異性抗體(SigmaA0170)或抗人k輕鏈抗體(SigmaA7164),在1%的FSG/PBS中稀釋1/2000，并在室溫孵育1小時(shí)。用1%的FSG/PBS將板沖洗，并通過(guò)加入50pl/孔的TMB底物(R&DSystems)而顯影。在VERSAmax孩吏孔板讀數(shù)儀(MolecularDevices)上測(cè)量650nm的吸光度。小鼠和免疫接種在持有內(nèi)政部許可的項(xiàng)目許可證下進(jìn)行動(dòng)物研究。6至12周大的雄性和雌性C57BI/6(Harlan)或HLA-A2轉(zhuǎn)基因(HHDII)小鼠(巴斯德研究所，巴黎)被使用。使用不完全弗氏佐劑將合成肽(由英國(guó)諾丁漢大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)系的JohnKeyte制造)乳化并通過(guò)皮下途徑注射。每只小鼠接受10嗎肽/免疫接種。使用制造商的指示將DNA涂布于1.0pm金顆粒(BioRad，HemelHempstead,英國(guó))并通過(guò)Helios基因槍(BioRad)施用于皮內(nèi)。每只小鼠接受1昭DNA/免疫接種?？寐兜腄NA溶液也通過(guò)皮內(nèi)或月幾肉內(nèi)施用(10(xg/免疫接種)，并與注射之后立即進(jìn)行的短的電脈沖結(jié)合。在第0、1和2周將小鼠免疫，并在第3周移除脾臟。通過(guò)在免疫接種之前四天經(jīng)腹膜內(nèi)注射400嗎抗CD25抗體(PC61)或在第二次免疫接種的同時(shí)經(jīng)腹哮內(nèi)注射200昭抗CTLA-4抗體來(lái)使體內(nèi)T細(xì)胞亞群耗盡。體外的再刺激最后一次免疫接種之后五天，在37。C將脾細(xì)胞(5xl06/ml)與同基因的被輻射的(20Gy)、被肽脈沖的脂多糖(LPS)胚細(xì)胞(0.5至lxl(^個(gè)細(xì)胞/ml)共同培養(yǎng)在24孔板中的含有10%FBS、2mM谷氨酰胺、20mMHEPES緩沖液、100單位/ml青霉素、100昭/mr1鏈霉素和1(T5M2-巰基乙醇的2mlRPMI-1644中。通過(guò)在37。C用25pg/mlLPS(Sigma)和7pg/ml石克酸葡聚糖(Pharmacia,MiltonKeynes，英國(guó))將脾細(xì)胞(1.5乂106個(gè)細(xì)胞/ml)活化3天而獲得LPS胚細(xì)胞。使用之前，使用100貼/ml合成肽培養(yǎng)2xl(f個(gè)LPS胚細(xì)胞1個(gè)小時(shí)。在第6天用51Cr釋放測(cè)定來(lái)測(cè)定培養(yǎng)物的細(xì)胞毒素活性。"Cr釋放測(cè)定在含有或不含有100將/ml肽的情況下使用1.85MBq鉻酸(51Cr)鈉(Amersham,Essex,英國(guó))將耙細(xì)胞標(biāo)記1小時(shí)。孵育后在RPMI中將它們沖洗3次并用100pg/ml肽再孵育1小時(shí)。在V形底的96孔板安放5x103個(gè)耙/孔，并在200pi的終體積中與不同密度的效應(yīng)細(xì)胞共同孵育。在37。C下4小時(shí)后，從每孔取出50卩il上清液并轉(zhuǎn)移到固態(tài)閃爍定量盤(Lumaplate)(Packard,Rigaweg，荷蘭)。在Topcount微孔板閃爍計(jì)數(shù)器(Packard)上對(duì)板讀數(shù)。使用下面的式計(jì)算百分比特異性溶解特異性溶解=lOOx[(實(shí)驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放y(最大釋放-自發(fā)釋放)]先體外后體內(nèi)的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定才艮據(jù)制造商的指示(Mabtech,瑞典)使用鼠IFNy捕捉和檢測(cè)試劑進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定。簡(jiǎn)言之，將抗IFNy抗體涂布于96孔Immobilin-P板的孔中，并將5><105個(gè)脾細(xì)胞種在重復(fù)的孔中。合成肽(以若干種濃度)或5xl(^個(gè)靶黑素瘤細(xì)胞被添加到這些孔中并在37。C下孵育40小時(shí)。孵育后，使用生物素?；目笽FNY抗體來(lái)檢測(cè)被捕捉的IFNy，并用鏈霉抗生素蛋白堿性磷酸酶和顯色底物使之顯影。使用自動(dòng)化的板讀數(shù)器(CTL)分析斑點(diǎn)并計(jì)數(shù)。使用效應(yīng)功能對(duì)肽濃度的圖表，將功能性親和力按照介導(dǎo)50%最大效應(yīng)功能的濃度而計(jì)算。根據(jù)制造商的指示使用CD8Dynabead(Dynal)把來(lái)自脾細(xì)胞群體的CD8T細(xì)胞耗盡，然后將其加入先體外后體內(nèi)的酶耳關(guān)免疫斑點(diǎn)測(cè)定。腫瘤研究隨機(jī)選4奪C57BI/6小鼠組成治療組并在五周中隔周進(jìn)行免疫。在第三和第四次免疫接種之間，通過(guò)靜脈內(nèi)注射向尾靜脈注射^104個(gè)B16F10IFNa黑素瘤細(xì)胞來(lái)攻擊它們。當(dāng)^皮靜脈內(nèi)注射時(shí)，B16F10細(xì)胞遷移到肺以形成轉(zhuǎn)移瘤。對(duì)小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和痛苦表征進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在腫瘤攻擊之后第49天，將小鼠安樂(lè)死并分析肺以確定轉(zhuǎn)移瘤的存在。在先體外后體內(nèi)的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中分析脾臟以確定表位和腫瘤特異性免疫應(yīng)答的存在。在三周中隔周對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行免疫，并在最后一次免疫之后7天在右側(cè)用2><104個(gè)B16F10HHD黑素瘤細(xì)胞通過(guò)皮下進(jìn)行攻擊。以3-4天的間隔監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)，并使用卡鉗測(cè)量腫瘤尺寸。實(shí)施例1-免疫體構(gòu)建體產(chǎn)生低水平的完整抗體使用含有分別在CDRHl和CDRH2中的gp100表位IMDQVPFSV和TRP2表位SVYDFFVWL以及在CDRLl中的HepBCD4表位TPPAYRPPNAPIL的免疫體構(gòu)建體(DCIB15;圖19)制作穩(wěn)定的CHO-S細(xì)胞轉(zhuǎn)染子。使用夾心elisa分析來(lái)自這些轉(zhuǎn)染子的上清液中免疫體蛋白的表達(dá)。將抗人IgGFc特異性抗體涂布于板上，并加入上清液。使用抗人Fc特異性HRP抗體來(lái)識(shí)別重鏈而檢測(cè)結(jié)合的免疫體。與對(duì)照相比，在上清液中^r測(cè)到的重鏈濃度為約1昭/ml(圖20a)。使用蛋白A親和柱將免疫體從上清液中提純并分析免疫體的存在。與對(duì)照相比，免疫體的純化產(chǎn)生遠(yuǎn)低于之前預(yù)期的量的蛋白(圖20b)。鑒于可能要純化如此低產(chǎn)量的完整蛋白，使用夾心ELISA分析在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中的免疫體構(gòu)建體中重鏈和完整抗體二者的表達(dá)。還測(cè)試了含有在CDRLl中的H印BCD4表位和CDRH2中的SIINFEKL表位(DCIB24;圖21)，或者分別在CDRHl和CDRH2中的gp100表位IMDQVPFSV和TRP2表位SVYDFFVWL以及CDRL3中的HepBCD4表位TPPAYRPPNAPIL(DCIB25;圖22)的構(gòu)建體。將抗人IgGFc特異性抗體涂布于板上，并加入上清液。使用抗人Fc特異性HRP抗體來(lái)識(shí)別重鏈或使用抗人k鏈特異性HRP抗體來(lái)識(shí)別完整免疫體而檢測(cè)結(jié)合的免疫體。免疫體轉(zhuǎn)染子顯示高水平的重鏈分泌但是很低水平的完整免疫體(圖20c和d)。該數(shù)據(jù)表明，將CD8和CD4T細(xì)胞表位并入重和輕鏈可變區(qū)域破壞了免疫體的總體結(jié)構(gòu)從而妨礙了完整抗體的形成。來(lái)自^L轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞的上清液的另外的分析數(shù)據(jù)證明，只有含有被并入CDRH3或CDRL3的CTL表位的構(gòu)建體作為完整抗體被分泌(圖20e)。與此相反，對(duì)CDRH1或CDRH2中4壬何表位的并入允許重的完整抗體少量分泌，即使不向輕鏈中并入任何東西它也分泌。將CDRL1中任何表位并入任一輕鏈導(dǎo)致輕鏈低水平的分泌，即使只有一種表位-故并入重鏈的CDRH3。實(shí)施例2-被并入免疫體骨架的CTL表位被加工并呈遞以引起體內(nèi)的免疫應(yīng)答將之前發(fā)表的來(lái)自TRP2的CTL表位氨基酸280-288(Bloom等，T7eJm^"a/q,五j^era^wto/Me^dm1997;185:453-9)人工引入與CDRLl中的乙型肝炎通用的CD4表位并排的免疫體構(gòu)建體的CDRH2區(qū)域(DCIB18;圖30)。通過(guò)基因槍用免疫體DNA經(jīng)皮內(nèi)對(duì)C57BI/6小鼠隔周地免疫三次。接下來(lái)通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定分析脾細(xì)胞的TRP2特異性應(yīng)答。與對(duì)照相比，用免疫體DNA免疫的小鼠證明了大量的TRP2肽特異性應(yīng)答，但是對(duì)HepBCD4肽具有特異性的應(yīng)答的水平較低(圖31a)。還通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中的肽滴定研究了TRP2特異性應(yīng)答的親和力。在五個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的超過(guò)十五只小鼠中，應(yīng)答的親和力在10力M至10-HM肽的范圍內(nèi)。一個(gè)代表性的例子顯示在圖31b中。為了確認(rèn)該TRP2特異性應(yīng)答是通過(guò)CD8T細(xì)胞介導(dǎo)的，使用免疫體DNA對(duì)C57BI/6小鼠隔周地免疫三次。最后一次免疫接種之后六天，分離脾細(xì)胞并通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定在體外分析特異性應(yīng)答。為了確定TRP-2特異性應(yīng)答是否由CD8T細(xì)胞介導(dǎo)，在用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定進(jìn)行分析前將CD8T細(xì)胞耗盡。CD8T細(xì)胞的耗盡導(dǎo)致TRP2特異性應(yīng)答的消失；然而，CD8耗盡沒(méi)有影響HepBCD4肽應(yīng)答，這表明它非?？赡苁怯蒀D4T細(xì)胞介導(dǎo)的(圖31c)。為了確定由免疫體DNA免疫接種產(chǎn)生的應(yīng)答是否能夠殺死體外的靶細(xì)胞，使用TRP2肽脈沖的LPS胚細(xì)胞在體外刺激脾細(xì)胞6天，并在針對(duì)B16F10黑素瘤細(xì)胞的鉻釋放測(cè)定中分析。來(lái)自免疫體DNA免疫的小鼠的脾細(xì)胞證明了B16F10細(xì)胞和B16F10IFNa細(xì)胞二者優(yōu)良的裂解作用，其中所述B16F10細(xì)胞具有低水平的表面I類MHC,而B16F10IFNa細(xì)胞與不表達(dá)H-2Kb分子(B16F10siKb)的B16F10系相比具有高表達(dá)的表面I類MHC。針對(duì)B16F10siKb細(xì)胞系的殺死的消除證明殺死是依賴于CD8的而且是通過(guò)H-2Kb被限制的(圖31d)。這些結(jié)果顯示，被并入免疫體骨架CDRH2區(qū)域的TRP2(SVYDFFVWL)CD8表位被加工和呈遞以引起由I類MHC介導(dǎo)的高頻率應(yīng)答。H印BCD4表位也在II類MHC的背景下被加工和呈遞以由DNA免疫接種引起良好的CD4介導(dǎo)的應(yīng)答。使用相同的方法學(xué)，還從其他含有TRP2表位的構(gòu)建體分析TRP2表位特異性應(yīng)答。將TRP2表位并入重鏈中的CDR導(dǎo)致高頻率肽特異性應(yīng)答(圖31e)。與此相反，將CTL表位并入輕鏈導(dǎo)致CTL頻率的顯著降低(DCIB36)。TRP2表位特異性應(yīng)答的親和力分析揭示，當(dāng)從重鏈中的表位生成時(shí)它們具有高親和力，但在從輕鏈表達(dá)表位時(shí)這大大降低(圖31f)。當(dāng)檢查所有構(gòu)建體時(shí)，高頻率高親和力輔助應(yīng)答(圖31g)。表明，重鏈的分泌是刺激CTL應(yīng)答而非輔助應(yīng)答的優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例3-免疫體DNA免疫接種優(yōu)于肽免疫接種或全抗原免疫接種為了分析免疫體DNA免疫接種的效率，將其與不完全弗氏佐劑中的狀表位的皮下免疫接種或用表達(dá)TRP2抗原的DNA的免疫接種進(jìn)行對(duì)比。用包括連接到IFA中通用的輔助表位的TRP2表位的DNA或肽使C57BI/6小鼠接受三次每周一次的免疫接種。在免疫體免疫的小鼠中生成的TRP2和輔助肽特異性應(yīng)答在幅度上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)由肽免疫接種或全TRP2抗原免疫接種引起的特異性應(yīng)答(圖32a)。這些肽特異性應(yīng)答的進(jìn)一步親和力分析揭示，由免疫體DNA免疫的小鼠生成的應(yīng)答具有比來(lái)自肽免疫的個(gè)體生成的應(yīng)答強(qiáng)得多的親和力(圖32b)。接下來(lái)，分析在C57BI/6小鼠中產(chǎn)生的應(yīng)答以鑒定針對(duì)B16F10細(xì)胞系和作為陰性對(duì)照的B16F10siKb細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性能力。圖32c顯示，免疫體DNA免疫的小鼠能夠具有H-2Kb限制的體外抗胂瘤活性，而且肽免疫的小鼠和全抗原免疫的小鼠二者在殺死相同的黑素瘤細(xì)胞系方面是不成功的。還將免疫體免疫接種與DC+肽的免疫接種進(jìn)行比較。C57BI/6小鼠接受三次每周一次的DNA或DC+肽免疫接種。TRP2肽特異性應(yīng)答具有可比的頻率，但免疫體免疫的小鼠與DC+肽免疫的那些相比產(chǎn)生了較高的親和力應(yīng)答(圖32d)。當(dāng)這些應(yīng)答被分析以確定在體外殺死B16F10黑素瘤細(xì)胞的能力時(shí)，這也被證明(圖32e)。由免疫體免疫接種生成的應(yīng)答在較低的效應(yīng)對(duì)靶的比率下顯示了比來(lái)自DC+肽免疫的小鼠的應(yīng)答更強(qiáng)地殺死B16F10黑素瘤。它們還顯示了B16F20siKb黑素瘤系的較高特異性溶解，其中所述B16F20siKb黑素瘤系已降低H-2Kb的水平。將含有H-2Kb限制的卵白蛋白表位SIINFEKL和錨定物修飾的HLA-A2限制的gp100表位IMDQVPFSV(210M)的免疫體構(gòu)建體與C57BI/6或HHDII小鼠中相應(yīng)的表位肽免疫接種分別進(jìn)行比較。小鼠接受三次每周一次的免疫接種，其使用IFA中的DNA或肽。在最后一次免疫接種之后的應(yīng)答分析揭示，與肽免疫的小鼠相比，免疫體DNA免疫的小鼠生成較高頻率的肽特異性應(yīng)答(圖32f和g)。還通過(guò)肽滴定分析這些應(yīng)答的親和力。免疫體免疫接種引起比肽免疫接種顯著較高的親和力應(yīng)答(圖32h和i)。由免疫體DNA疫苗生成的TRP2特異性應(yīng)答的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于由合成肽或全TRP2抗原所生成的特異性應(yīng)答。然而，臨床試驗(yàn)證據(jù)表明，肺瘤特異性CD8T細(xì)胞的高頻率的存在不必然導(dǎo)致腫瘤退化，而且通常在疫苗試驗(yàn)中目標(biāo)臨床應(yīng)答率是非常低的(Rosenberg等，//wm/朋/2005;175:6169-76;Rosenberg等，AtowreA^&"加2004;10:909-15)。現(xiàn)在正在變得清楚的是，除了頻率之外的因素例如腫瘤特異性T細(xì)胞的功能性親和力以及啟動(dòng)途徑在將疫苗效力最大化時(shí)是主要的決定因素。若干研究組已經(jīng)證明，高親和力CD8T細(xì)胞顯示優(yōu)秀的抗腫瘤活性(Alexander-Miller,Immunologicresearch,2005;31:13-24;Hodge等，JImmunol2005;174:5994-6004;Valmori等，JImmunol2002;168:4231-40;Zeh等，JImmunol1999;162:989-94;Alexander-Miller等，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica1996;93:4102-7)。在我們的研究中，對(duì)免疫體誘導(dǎo)的TRP2特異性應(yīng)答的功能性親和力的分析證明，與合成肽免疫接種相比，可生成高親和力應(yīng)答。此高親和力應(yīng)答還與在體外識(shí)別和殺死胂瘤細(xì)胞的能力的提高相關(guān)。來(lái)自APC的信號(hào)或應(yīng)答的啟動(dòng)途徑對(duì)于高親和力免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)也是至關(guān)重要的(Oh等，JImmunol2003;170:2523-30)。實(shí)施例4-多個(gè)表位可從CDRH2位點(diǎn)被加工為了證明多個(gè)表位可,人CDRH2^皮加工和呈遞以引起免疫應(yīng)答，將來(lái)自卵白蛋白的H-2Kb限制的表位SIINFEKL(DCIB24;圖21)和H-2Kd限制的乙型肝炎表位IPQSLDSWWTSL(DC:舊21;圖33)人工導(dǎo)入重可變區(qū)域中的H2位點(diǎn)。這些免疫體構(gòu)建體還包含輕可變區(qū)域中CDRLl位點(diǎn)中的I-Ab限制的(TPPAYRPPNAPIL)表位、乙型肝炎CD4表位或I-Ad限制的流行性感冒血凝素(FERFEIFPKE)表位。用免疫體DNA通過(guò)基因槍對(duì)C57BI/6或Balb/c小鼠進(jìn)行三次隔周的皮內(nèi)免疫。接下來(lái)通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定來(lái)分析脾細(xì)胞中表位特異性CD8和CD4應(yīng)答的存在。被免疫的C57BI/6小鼠證明了高頻率SIINFEKL特異性應(yīng)答但對(duì)輔助表位較低的特異性應(yīng)答(圖34a)。Balb/c小鼠也產(chǎn)生了高頻率乙型肝炎表位特異性CD8應(yīng)答和對(duì)輔助表位相似水平的應(yīng)答(圖34b)。該數(shù)據(jù)表明，來(lái)自CDRH2位點(diǎn)的CD8表位的加工和呈遞不受特異性表位序列或長(zhǎng)度的限制。實(shí)施例5-多個(gè)CTL表位可從可變區(qū)域凈皮加工62為了證明表位可從可變區(qū)域而不只是CDR區(qū)域被加工和呈遞，將表位并入CDRH1位點(diǎn)并除去部分骨架區(qū)域。示例性表位是修飾的HLA-A2限制的來(lái)自gpl00的表位IMDQVPFSV(DCIB17;圖35)和來(lái)自Tie-2的表位FLPATLTMV(DCIB26;圖36)。免疫體構(gòu)建體還包含CDRLl位點(diǎn)中的乙型肝炎CD4表位。用免疫體DNA通過(guò)基因槍對(duì)HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠(HHDII)進(jìn)行三次隔周的皮內(nèi)免疫。接下來(lái)通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定來(lái)分析脾細(xì)胞中表位特異性CD8和CD4應(yīng)答的存在。HHDII小鼠引起高頻率的gp100210M表位特異性應(yīng)答和對(duì)HepBCD4表位的合理應(yīng)答(圖37a)。在用含有Tie2表位的構(gòu)建體免疫的HHDII小鼠中的應(yīng)答不具有同樣高的頻率，但產(chǎn)生了對(duì)Tie2表位和HepBCD4表位二者都具有特異性的大量應(yīng)答(圖37b)。該實(shí)施例中的數(shù)據(jù)表明，被插入可變區(qū)域中的表位可被加工和呈遞以引起體內(nèi)的免疫應(yīng)答。還很明顯的是，這不局限于一種表位序列。實(shí)施例6-多種CTL應(yīng)答可從相同免疫體構(gòu)建體中不同表位產(chǎn)生將前述HLA-A2限制的gp100表位IMDQVPFSV人工引入CDRHI位點(diǎn)，并與TRP2表位SVYDFFVWL并排，其中所述TRP2表位也被相同構(gòu)建體的CDRH2位點(diǎn)中的HLA-A2所限制。HepBCD4表位存在于CDRLl位點(diǎn)中(DCIB15;圖19)。用免疫體DNA通過(guò)基因槍對(duì)HHDTT小鼠進(jìn)行三次隔周的皮內(nèi)免疫。接下來(lái)通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定來(lái)分析脾細(xì)胞中表位特異性CD8和CD4應(yīng)答的存在。圖38a顯示，產(chǎn)生了對(duì)gpl00和TRP2表位二者都具有特異性的應(yīng)答，雖然TRP2特異性應(yīng)答的頻率較低。還產(chǎn)生了對(duì)HepBCD4表位的應(yīng)答。還通過(guò)IFNY酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定中的肽滴定研究了TRP2特異性應(yīng)答的親和力。對(duì)gplOO表位的應(yīng)答的親和力范圍是從10"。M至10-HM的肽，而且對(duì)TRP2表位是從l(TyM至10-K)M的肽。圖38b顯示了代表性的例子。為了確定所述應(yīng)答是否能夠在體外殺死靶細(xì)胞，用TRP2和gplOO肽脈沖的LPS胚細(xì)胞在體外刺激脾細(xì)胞6天并在針對(duì)肽標(biāo)記的T2細(xì)胞和B16F10HHD黑素瘤細(xì)胞的鉻釋放測(cè)定中進(jìn)行分析。將B16F10HHD黑素瘤系的特異性殺死與對(duì)照B16F10黑素瘤系進(jìn)行對(duì)比。應(yīng)答還證明了與對(duì)照相比肽標(biāo)記的T2細(xì)胞的特異性溶解(圖38c)。將兩個(gè)CD8表位合并為單個(gè)免疫體構(gòu)建體看來(lái)似乎在表位之間導(dǎo)致了某種程度的免疫顯性。所述免疫顯性的表位是對(duì)1類MHC具有最強(qiáng)親和性的表位。當(dāng)用含有g(shù)p100和TRP2CD8表位二者的構(gòu)建體免疫的小鼠與用只含有TRP2CD8表位的構(gòu)建體免疫的小鼠相比較時(shí)，TRP2應(yīng)答的頻率降低(圖38d)。該數(shù)據(jù)證明，表位特異性免疫應(yīng)答可由對(duì)兩種不同CD8表位具有特異性的相同DNA構(gòu)建體生成。這些還能夠具有體外的抗肺瘤活性。然而，存在某種程度的免疫顯性，其支配對(duì)于亞顯性表位的應(yīng)答頻率。表位(DCIB24)的分離的免疫體構(gòu)建體進(jìn)行相似的研究。使用單獨(dú)的DCIB18或DCIB24、結(jié)合在相同位點(diǎn)中的DCIB18和DCIB24或者在相同時(shí)間^旦不同位點(diǎn)中的DCIB18和DCIB24對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。進(jìn)行三次隔周的免疫接種，其通過(guò)與電穿孔結(jié)合將DNA通過(guò)肌肉內(nèi)注射進(jìn)脛骨肌。所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的分析顯示，當(dāng)用DCIB18或DCIB24單獨(dú)對(duì)小鼠免疫時(shí)可引起高頻率肽特異性應(yīng)答(圖38e)。用這些構(gòu)建體在相同位點(diǎn)對(duì)小鼠免疫導(dǎo)致TRP2肽特異性應(yīng)答的顯著喪失。這表明，SIINFEKL表位與TRP2表位相比是支配性的。如果用分離位點(diǎn)的構(gòu)建體對(duì)小鼠免疫，TRP2特異性應(yīng)答可被恢復(fù)(p=0.0026)。此數(shù)據(jù)表明，免疫顯性的確影響由IB免疫接種生成的免疫應(yīng)答，但這能通過(guò)在空間上分離的位點(diǎn)上的免疫接種來(lái)解決。實(shí)施例7-非錨定殘基修飾能增強(qiáng)T細(xì)胞識(shí)別之前的例子顯示，修飾的即100表位IMDQVPFSV是免疫顯性的，并且具有對(duì)HLA-A2的高親和性(使用SYFPEITHI算法^皮預(yù)測(cè)并在T2穩(wěn)定測(cè)定中被證明-表5)。由于野生型gpl00表位ITDQVPFSV不是免疫原性的，所以在非錨定殘基進(jìn)行修飾，其中所述非錨定殘基將具有與野生型表位相似的HLA-A2結(jié)合親和性，但也提高免疫原性。這些修飾的表位被人工引入免疫體構(gòu)建體的CDRHl位點(diǎn)，并與野生型表位一起被測(cè)試(DCIB37、DCIB40、DCIB41、DCIB42、DCIB43;圖39-43)。用單獨(dú)的免疫體重鏈DNA通過(guò)基因槍對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行三次隔周的皮內(nèi)免疫。接下來(lái)通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定來(lái)分析脾細(xì)胞中表位特異性CD8應(yīng)答的存在。維持對(duì)HLA-A2親和性(表5)的野生型即IOO表位的兩種修飾(F7L和F7I;DCIB37;圖39,DCIB40;圖40)證明了與野生型表位相比更優(yōu)良的誘導(dǎo)表位特異性免疫應(yīng)答的能力(圖44a)。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>實(shí)施例8-多種CD4輔助應(yīng)答可被加工和呈遞以引起體內(nèi)的免疫應(yīng)答為了檢驗(yàn)CD4輔助表位是否可被加工和呈遞以引起體內(nèi)的免疫應(yīng)答，將不同表位獨(dú)立地人工導(dǎo)入免疫體構(gòu)建體的CDRLl位點(diǎn)。這些包括了來(lái)自流行性感冒血凝素的I-Ad限制的表位FERFEIFPKE(DCIB21;圖33)、來(lái)自HBcAg的I-Ab限制的表位TPPAYRPPNAP1L(DCIB15;圖19)和來(lái)自gp100的HLA-DR4限制的表位WNRQLYPEWTEAQRLD(DCIB35;圖45)。用免疫體DNA通過(guò)基因槍對(duì)Balb/c、C57BI/6或HHDII和DR4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行三次隔周的皮內(nèi)免疫。接下來(lái)通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定來(lái)分析脾細(xì)胞中表位特異性CD4應(yīng)答的存在。圖46a、b和c證明，所有三個(gè)CD4輔助表位可從CDRLl位點(diǎn)被加工和呈遞以引起體內(nèi)的表位特異性免疫應(yīng)答。還測(cè)試了gp100HLA-DR4限制的表位從不同CDR的加工和呈遞。使用將所述表位并入CDRL1(DCIB35;圖45)、CDRH3(DCIB54;圖29)或CDRL3(DCIB50;圖47)的構(gòu)建體對(duì)HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行三次隔周免疫。圖46d顯示，能從不同CDR有效地加工輔助表位以引起高頻率輔助應(yīng)答。實(shí)施例9-CTL應(yīng)答部分地依賴于分泌的重鏈但輔助應(yīng)答不需要分泌的輕鏈通常地，CD4T細(xì)胞表位由外源地獲得的蛋白加工而來(lái)，而CD8T細(xì)胞表位由內(nèi)源地產(chǎn)生的蛋白而來(lái)?，F(xiàn)在有證據(jù)表明，外源地獲得的抗原的表位的交叉呈遞引起CD8T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。還提出，該啟動(dòng)途徑在CD8T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的發(fā)展中是更有效的。最近，對(duì)于CD4介導(dǎo)的應(yīng)答已經(jīng)有了相似的發(fā)現(xiàn)。逐漸增加的證據(jù)表明，衍生自細(xì)胞內(nèi)蛋白的CD4T細(xì)胞表位在II類MHC的情況下可被加工和呈遞。為了確定是否需要分泌的免疫體來(lái)誘導(dǎo)CD8和CD4T細(xì)胞應(yīng)答，制備了在重鏈或輕鏈上不含前導(dǎo)序列的含有CDRHl位點(diǎn)中的HLA-A2限制的gp100表位IMDQVPFSV和CDRLl位點(diǎn)中的I-Ab限制的HepB輔助表位TPPAYRPPNAPIL的免疫體構(gòu)建體(圖10和11)。用免疫體DNA通過(guò)基因槍對(duì)HHDII小鼠進(jìn)行三次隔周的皮內(nèi)免疫。接下來(lái)通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定來(lái)分析脾細(xì)胞中表位特異性CD8和CD4T細(xì)胞應(yīng)答的存在。當(dāng)分析所述應(yīng)答以鑒別gpl00特異性CD8應(yīng)答時(shí)，據(jù)觀察，將前導(dǎo)序列從免疫體構(gòu)建體的重鏈除去導(dǎo)致了表位特異性應(yīng)答的減少，然而CD4應(yīng)答未受影響(圖48a)。將前導(dǎo)序列從重鏈除去影響了被轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞對(duì)重鏈的分泌(圖48b)。將前導(dǎo)序列從輕鏈除去從而防止輕鏈的分泌，但看上去未影響表位特異性CD8或CD4應(yīng)答(圖48c)。當(dāng)重鏈上不存在前導(dǎo)序列時(shí)，CD8應(yīng)答顯著減少，但CD4應(yīng)答保持未受影響(圖48c和d)。該數(shù)據(jù)暗示，重鏈的分泌對(duì)于CD8T細(xì)胞應(yīng)答的有效誘導(dǎo)是重要的，這表明CD8表位正在經(jīng)歷交叉呈遞。其次，它暗示，CD4表位衍生自細(xì)胞內(nèi)免疫體以引起免疫應(yīng)答。實(shí)施例10-不包括Fc的CTL應(yīng)答的減少是由于缺乏蛋白分泌本實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)Fc區(qū)域的存在是否對(duì)建立有效免疫應(yīng)答有益。通過(guò)在Fc之前并入終止密碼子以防止轉(zhuǎn)錄和翻譯，將Fc區(qū)域從免疫體構(gòu)建體除去，其中所述免疫體構(gòu)建體含有CDRH2中的H-2Kb限制的TRP2表位SVYDFFVWL和CDRLl中的I-Ab限制的HepBCD4表位TPPAYRPPNAPIL(DCIB15)(圖9)。用免疫體DNA通過(guò)基因槍對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行三次隔周的皮內(nèi)免疫。接下來(lái)通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定來(lái)分析脾細(xì)胞中表位特異性CD8和CD4T細(xì)胞應(yīng)答的存在。用缺乏Fc區(qū)域的免疫體構(gòu)建體免疫的小鼠生成了低水平的TRP2肽特異性應(yīng)答，其中所述應(yīng)答與含有Fc區(qū)域的構(gòu)建體相比能夠非常低水平地識(shí)別腫瘤細(xì)胞系B16F10(圖49a)。來(lái)自若干實(shí)驗(yàn)的對(duì)TRP2和HepB輔助肽特異性應(yīng)答二者的分析證明，缺乏Fc區(qū)域的構(gòu)建體生成顯著較低的TRP2肽特異性應(yīng)答(圖49b)。然而，F(xiàn)c區(qū)域的去除未影響HepB輔助應(yīng)答(圖49c)。這與我們之前的結(jié)果一致，其顯示，輔助在輕鏈中作用最好，在所述輕鏈中，它不被分泌并因此通過(guò)直接呈遞而起作用。與此相反，CTL應(yīng)答是由直接和間接的呈遞二者共同激發(fā)的，而且后者可得益于Fc靶向作用。可選地，F(xiàn)c終止構(gòu)建體導(dǎo)致截短的重鏈的較少分泌，這可為應(yīng)答的減少提供解釋。因此，將編碼TRP-2的免疫體人工31入IgG2(DCIB33)和IgG3恒定區(qū)域(DCIB65)，其中前者不應(yīng)該結(jié)合至CD64但能結(jié)合至CD32,而且還可以結(jié)合至小鼠中的Fc受體IV。人IgG3能結(jié)合CD32和CD64兩者。兩種免疫體都激發(fā)強(qiáng)的CTL應(yīng)答(圖49e)。這表明，F(xiàn)c靶向作用不是間接呈遞的有力組分。為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)問(wèn)題，IgGl的Fc靶向結(jié)構(gòu)域^皮替換為對(duì)等的IgG2結(jié)構(gòu)域，反之亦然(DCIB66、67,圖15和16)。兩種構(gòu)建體都激發(fā)強(qiáng)的CTL應(yīng)答(圖49e)。這可能是由于免疫體頂疫苗只分泌重鏈，其中所述重鏈可能不締合并允許Fc結(jié)合(圖49f和g)。實(shí)施例11-免疫體免疫接種增強(qiáng)免疫應(yīng)答并克服從全抗原中觀察到的調(diào)節(jié)。它還允許鑒定新的異源性T細(xì)胞表位。這可導(dǎo)致用編碼T細(xì)胞表位的人抗體進(jìn)行免疫的第二種好處，其中所述人抗體與多數(shù)自體抗原相比是不表達(dá)調(diào)節(jié)性表位的惰性運(yùn)載體。表達(dá)gp100表位或TRP-2表位的免疫體TM激發(fā)了高頻率、高親和力的T細(xì)胞應(yīng)答(頻率1/103,親和力1(T1QM)，而用TRP-2抗原的全gpl00進(jìn)行的免疫接種激發(fā)了具有低頻率和親和力的T細(xì)胞(頻率1/105,親和力l(T7M)。CD25的耗盡部分地恢復(fù)了對(duì)抗原的應(yīng)答，但免疫體仍是超過(guò)100倍(圖50a和b)。相似地，用編碼連接到Fc的Tie-2的前200個(gè)氨基酸的DNA的免疫接種未能激發(fā)針對(duì)最主要的10個(gè)被預(yù)測(cè)的表位的免疫應(yīng)答。將Tie-2的前196個(gè)氨基酸的序列輸入Epi.Ten和NetCTL在線預(yù)測(cè)算法。這兩種方法除了預(yù)測(cè)HLA-A*0201結(jié)合親和性之外都還考慮蛋白酶體切割和TAP轉(zhuǎn)運(yùn)。還將MHCpred和Syfpe池i算法用作較老的預(yù)測(cè)算法的例子，其中所述較老的預(yù)測(cè)算法只考慮被預(yù)測(cè)的MHC結(jié)合親和性。全Tie-2分子可包含另外的CTL表位，其中所述表位可對(duì)存在于前196個(gè)氨J^酸中的那些產(chǎn)生免疫顯性作用。因此，還將Tie-2的全序列輸入相同的算法以獲得來(lái)自全分子的每種被預(yù)測(cè)的表位的排名。在小鼠和人中不具有同源性的肽未被計(jì)入。使用幾種不同的預(yù)測(cè)算法選擇了余下的肽中的六個(gè)，據(jù)預(yù)測(cè)，它們一致地呈遞優(yōu)良的CTL表位。通過(guò)不同算法獲得的針對(duì)這些肽中每種的相應(yīng)分?jǐn)?shù)，以及Z83(之前鑒定的表位)的結(jié)果，被總結(jié)在表6中。來(lái)自被轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞的上清液的另外的分析數(shù)據(jù)證明，只有含有被并入CDRH3或CDRL3的CTL表位的構(gòu)建體作為完整抗體被分泌(圖20e)。與此相反，對(duì)CDRH1或CDRH2中任何表位的并入允許重的完整抗體少量分泌，即使不向輕鏈中并入任何東西它也分泌。將CDRL1中任何表位并入任一輕鏈導(dǎo)致輕鏈低水平的分泌，即使只有一種表位被并入重鏈的CDRH3。為了確定T細(xì)胞庫(kù)是否存在于識(shí)別來(lái)自Tie-2的任何被預(yù)測(cè)的CTL表位的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠中，使用天然的Tie2C200hFcDNA構(gòu)建體對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫(Ramage等，Int.J.Cancer2004;:245-250)，并通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定來(lái)篩選脾細(xì)胞以確認(rèn)肽特異性IFNY應(yīng)答。DNA免疫接種之前4天，在用PC61mAb處理后使用C2001iFc如前所述對(duì)另一組小鼠進(jìn)行免疫。用天然的C200HFcDNA構(gòu)建體免疫的小鼠沒(méi)有產(chǎn)生識(shí)別Z83的IFNy應(yīng)答，不管在免疫接種之前動(dòng)物是否耗盡了CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。除了Z284之外，在免疫接種之前未耗盡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的動(dòng)物身上沒(méi)有檢測(cè)到針對(duì)任何新肽的顯著IFNy應(yīng)答，其中所述z284看上去在一只動(dòng)物(m3)體內(nèi)刺激應(yīng)答，其平均值為69SFC/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞(圖50c和d)。在DNA免疫接種之前耗盡了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的動(dòng)物中，2/3的動(dòng)物(Ml和M3)展示了針對(duì)Z282肽再刺激的IFNy應(yīng)答，其平均值分別為320和94SFC/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞。Ml還展示了針對(duì)Z285再剌激的部分應(yīng)答，其平均值為85SFC/百萬(wàn)個(gè)脾細(xì)胞。來(lái)自Tie-2中被預(yù)測(cè)的CD8+表位體內(nèi)篩選的明顯抵觸的結(jié)果可能是免疫顯性的結(jié)果，因?yàn)閬?lái)自用天然的C200HFc構(gòu)建體在不存在CD25+細(xì)胞時(shí)進(jìn)行免疫的小鼠的IFNy應(yīng)答看上去傾向于一種主要的肽。為了進(jìn)一步研究能夠?qū)282表位進(jìn)行應(yīng)答的T細(xì)胞庫(kù)，在不存在來(lái)自其他潛在CD8+表位的竟?fàn)帟r(shí)，用IFA中的Z282肽在CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的存在或不存在下對(duì)一組HHD小鼠進(jìn)行免疫。所有用Z282免疫的小鼠產(chǎn)生了肽特異性IFNy應(yīng)答，即使在CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的存在下被免疫時(shí)。未被耗盡的動(dòng)物中的小鼠3產(chǎn)生了最強(qiáng)的應(yīng)答，其平均值為215SFC/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。來(lái)自被耗盡的動(dòng)物的最強(qiáng)應(yīng)答在小鼠2上被觀察到，其平均值為137SFC/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞(圖50e和f)。由肽免疫接種誘導(dǎo)的應(yīng)答保持低頻率。為了檢測(cè)如果表位從全抗原產(chǎn)生的任何調(diào)節(jié)性影響中被除去，較高頻率應(yīng)答是否能被生成，將z282(也被稱作z12)表位人工引入免疫體構(gòu)建體的Hl位點(diǎn)并與Ll中的HepBCD4并排(DCIB71，圖51)。然后用z12肽或免疫體DNA(通過(guò)基因槍)對(duì)HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行三次隔周的免疫，然后分析表位特異性免疫應(yīng)答的存在。所有用z12肽免疫的小鼠展示低頻率和親和力的表位特異性應(yīng)答(圖50g)。然而，當(dāng)zl2表位一皮人工引入免疫體構(gòu)建體時(shí)，在所有小鼠中69誘導(dǎo)了更高頻率和親和力的應(yīng)答(圖50h)?？偨Y(jié)來(lái)說(shuō)，如果CD25細(xì)胞在免疫接種之前被耗盡，免疫應(yīng)答則被激發(fā)至Tie2表位的3/10。相似地，如果這些表位中的一個(gè)^皮呈遞為肽，則可產(chǎn)生微弱的免疫應(yīng)答。然而，如果該表位被呈遞在免疫體TM構(gòu)建體中，則產(chǎn)生高頻率和高親和力的T細(xì)胞應(yīng)答。這些結(jié)果表明，在Tie-2的前200個(gè)氨基酸中有T-reg表位，其抑制CTL應(yīng)答。如果將這些T-reg或它們的表位除去，則可能揭示對(duì)自體抗原的應(yīng)答，其中所述應(yīng)答可通過(guò)在免疫體中的呈遞而^皮進(jìn)一步增強(qiáng)。名稱1<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>表6.來(lái)自Tie-2的被預(yù)測(cè)的HLA-A*0201限制的CTL表位。工肽的名稱。2Tie-2分子中氨基酸殘基的開始位置。3肽序列。4使用EpiJen網(wǎng)站服務(wù)器的預(yù)測(cè)。以IC5。nM的單位給出分?jǐn)?shù)，較低的分?jǐn)?shù)代表較高親和性的肽。5使用NetCTL1.2網(wǎng)站服務(wù)器的預(yù)測(cè)。分?jǐn)?shù)代表三種獨(dú)立預(yù)測(cè)方法的加權(quán)總和，MHC結(jié)合的相對(duì)加權(quán)是1。、示明高于閾值0.75的分?jǐn)?shù)，其被鑒定為來(lái)自為已知表位獲得的數(shù)據(jù)集的CTL表位的分界點(diǎn)。6使用SYFPEITffl程序的預(yù)測(cè)。HLA-A*0201結(jié)合肽的最大分?jǐn)?shù)是36。7使用MHCPred疊加法的預(yù)測(cè)，其用來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)MHC和TAP的肽親和性。再一次以IC5。nM的單位給出分?jǐn)?shù)，較低的分?jǐn)?shù)代表較高親和性的肽。建議的IC5。值是在0.01至5000nM之間。對(duì)于所有預(yù)測(cè)方法，排名值表明從所述196個(gè)氨基酸的片段中預(yù)測(cè)表位的順序，括號(hào)中的值代表來(lái)自全Tie-2分子的排名預(yù)測(cè)。為了對(duì)比，包括了為衍生自流行性感冒A病毒基質(zhì)蛋白的已知Z18CTL表位而獲得的值。實(shí)施例12-異體Fc在提供T細(xì)胞輔助中的作用和抗原特異性T細(xì)胞輔助的要求高親和力的T細(xì)胞應(yīng)答的激發(fā)通常需要在啟動(dòng)中的T細(xì)胞輔助。根據(jù)最初設(shè)想，這將由輕鏈中編碼的HepB外源輔助表位來(lái)提供。的確，針對(duì)此表位產(chǎn)生了強(qiáng)的輔助應(yīng)答。然而，由于重鏈被分泌而輕鏈沒(méi)有，即使當(dāng)兩條鏈都將由相同APC產(chǎn)生時(shí)hepB表位可能已經(jīng)為直接呈遞提供了輔助，不太可能的是，它能為間接呈遞的重鏈提供輔助，因?yàn)檫@不太可能被相同的抗原呈遞細(xì)胞吸收。因此，使用只編碼重鏈的DNA載體對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。高頻率、高親和力CTL應(yīng)答仍被生成(圖53a和b)。這暗示著輔助不被需要或小鼠體內(nèi)異體的人Fc提供被連接的外源輔助。因此，評(píng)估了小鼠IgG2a構(gòu)建體重和輕鏈的分泌(圖49g)并篩選了免疫應(yīng)答的生成(DCIB53，圖54)。雖然它仍然顯示高頻率高親和力的T細(xì)胞應(yīng)答，但這些不如對(duì)等的人構(gòu)建體強(qiáng)，這表明異體的Fc提供被連接的輔助(圖53c和d)。然后將HLA-DR4gp100表位并入小鼠IgGh構(gòu)建體(DCIBM,圖55)以提供CTL產(chǎn)生的被連接的輔助還有抗原特異性T細(xì)胞輔助二者而刺激腫瘤環(huán)境中的炎癥。這些構(gòu)建體激發(fā)高頻率和高親和力的CTL和輔助應(yīng)答(圖53e和f)?？梢栽谌嘶颊咧惺褂帽磉_(dá)相同表位的hlgGl構(gòu)建體。實(shí)施例13-免疫蛋白酶體的加工在免疫體構(gòu)建體表位的應(yīng)答產(chǎn)生中是重要的有人建議，免疫蛋白酶體具有改變由自體抗原產(chǎn)生的表位的陣列的能力，因?yàn)樗哂幸环N不同樣式的切割。在一些情況下，當(dāng)對(duì)免疫蛋白酶體向上調(diào)節(jié)時(shí)，新表位被產(chǎn)生，而在其他情況下表位被破壞。有證據(jù)表明，免疫蛋白酶體不能產(chǎn)生衍生自黑素瘤抗原的幾種表位，即MelanA/MART-1、gpl00，-"7和酪氨酸酶369-377(Chapiro等，2006.JImmunol;176:1053-61)。Chapiro及其同事已經(jīng)建議，加工和呈遞gpl00表位的能力與免疫蛋白酶體的向上調(diào)節(jié)有關(guān)。成熟的DC被認(rèn)為是對(duì)免疫應(yīng)答的啟動(dòng)負(fù)責(zé)的，并且被認(rèn)為組成性地表達(dá)免疫蛋白酶體(Macagno等，2001.EurJImmunol;31:3271_80)。因此，將印1002(]9-2'7表位人工引入免疫體構(gòu)建體的CDRH1位點(diǎn)并測(cè)試它在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)肽特異性免疫應(yīng)答的能力。未從該構(gòu)建體觀察到肽特異性應(yīng)答(圖56)。然而，當(dāng)修飾表位以使其在位置210具有甲硫氨酸(210M)而非蘇氨酸時(shí)，這防止免疫蛋白酶體對(duì)它的切割，并觀察到表位特異性應(yīng)答(圖56)。還測(cè)試了衍生自VEGFR2的HLA-A2限制的肽(氨基酸773-781VIAMFFWLL)和兩種修飾的hTERT肽(氨基酸572-580YLFFYRKSV和氨基酸988-997YLQVNSLQTV)以確認(rèn)免疫體構(gòu)建體應(yīng)答的生成。最初通過(guò)計(jì)算機(jī)的表位預(yù)測(cè)和肽免疫接種來(lái)發(fā)現(xiàn)這些表位從而否定蛋白酶體加工的需要。然而，它們被呈遞在宿主內(nèi)皮/肺瘤細(xì)胞的表面上，這表明它們是通過(guò)組成性蛋白酶體從全抗原被加工的。當(dāng)被人工引入免疫體構(gòu)建體時(shí)，這些表位中沒(méi)有一個(gè)產(chǎn)生應(yīng)答，這表明由免疫蛋白酶體進(jìn)行的加工對(duì)于免疫應(yīng)答的有效產(chǎn)生可能是必須的。實(shí)施例14-不同免疫接種方法對(duì)于從免疫體疫苗引起免疫應(yīng)答是有效的已經(jīng)顯示，免疫體疫苗在通過(guò)基因槍施用時(shí)對(duì)引發(fā)高頻率和親和力CD8和CD4應(yīng)答是有效的。隨后使用其他免疫接種方法測(cè)試免疫體疫苗的T細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生。經(jīng)過(guò)皮內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑使用含有CDRH2中的TRP2表位的免疫體DNA對(duì)C57BI/6小鼠進(jìn)行免疫。將免疫接種與電穿孔結(jié)合或不結(jié)合，而且隔周地進(jìn)行三次。使用基因槍免疫的小鼠顯示高頻率TRP2肽特異性應(yīng)答。這些與通過(guò)和電穿孔結(jié)合的肌肉內(nèi)或皮內(nèi)途徑免疫的'j、鼠是可比的。在不使用電穿孔時(shí)通過(guò)肌肉內(nèi)或皮內(nèi)途徑的免疫接種產(chǎn)生了較低頻率的TRP2肽特異性應(yīng)答(圖57a)。根據(jù)肽滴定所測(cè)量，所有TRP2肽特異性應(yīng)答都具有高親和力(圖57b)。實(shí)施例15-免疫體免疫接種誘發(fā)類白癲風(fēng)脫色素作用并保護(hù)免受腫瘤的攻擊既然用免疫體DNA免疫的小鼠產(chǎn)生具有針對(duì)高轉(zhuǎn)移性的和弱免疫原性的肺瘤細(xì)胞系B16F10的細(xì)胞毒素活性的免疫應(yīng)答，測(cè)試了疫苗在體內(nèi)的保護(hù)效力。使用IBDNA(DCIB18;圖30)通過(guò)基因槍向腹部剃毛的皮膚內(nèi)對(duì)小鼠進(jìn)行五次隔周的免疫。在免疫接種進(jìn)行中，將1404個(gè)表達(dá)IFNa的B16F10細(xì)胞通過(guò)靜脈內(nèi)注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，其中所述細(xì)胞在肺內(nèi)形成轉(zhuǎn)移性腫瘤。當(dāng)最后一次免疫接種后允許毛發(fā)再長(zhǎng)回來(lái)時(shí)，在用免疫體DNA免疫的小鼠身上免疫接種部位處觀察到白色毛發(fā)的生長(zhǎng)(圖58a)。在腫瘤細(xì)胞注射七周后，將小鼠處死并分析內(nèi)部和外部肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量。免疫體DNA免疫的小鼠與未處理的對(duì)照小鼠相比展現(xiàn)了肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量的顯著減少(圖58b)。還使用IBDNA(DCTB18)通過(guò)基因槍對(duì)小鼠進(jìn)行三次隔周的免疫。在最后一次免疫接種七天后，用2xl(f個(gè)表達(dá)IFNa的B16F10細(xì)胞通過(guò)皮下對(duì)小鼠進(jìn)行攻擊。監(jiān)視小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和存活。一旦腫瘤達(dá)到內(nèi)政部規(guī)定的最大限度，將小鼠安樂(lè)死。免疫體DNA免疫的小鼠展現(xiàn)了顯著地較慢的皮下胂瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)的存活(圖58c和d)。TRP2特異性應(yīng)答是CD8介導(dǎo)的，因?yàn)镃D8+細(xì)胞的耗盡廢除應(yīng)答。CD8T細(xì)胞已被鑒定為抗腫瘤免疫中主要的參與者，而且我們的結(jié)果顯示，免疫體DNA免疫接種在小鼠模型中引起體內(nèi)抗腫瘤免疫。所有無(wú)疾病跡象的被免疫小鼠在免疫接種部位展現(xiàn)了類白癲風(fēng)的皮毛脫色素作用。之前白癜風(fēng)通常與小鼠體內(nèi)的腫瘤保護(hù)相關(guān)，并與患有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者體內(nèi)成功的IL-2免疫療法高度相關(guān)(Overwijk等，Prac'"(i/wg;s'o/AeMsr/fe"a/v4c(3(iemj;q/"^/mYeJS"totes1o/Jmer/ca'1999;96:2982-7;Lane等:C朋ceritoea廠c/2004;64:1509-14;Steitz等，C""，'力w羅朋//艦簡(jiǎn)C/2er2006;55:246-53;Rosenberg&White,./7i，/M尸/as7)s'7i^wor/纖,/1996;19:81-4)。實(shí)施例16-免疫體免疫接種顯著地延緩肺瘤生長(zhǎng)之前顯示，免疫體免疫接種顯著地保護(hù)免受腫瘤的攻擊。隨后測(cè)試了疫苗在治療情況中的效力。將2^104個(gè)B16F10腫瘤細(xì)胞通過(guò)皮下注射進(jìn)C57BI/6小鼠。注射四天后，用含有CDRH2中的TRP2表位的免疫體DNA或?qū)φ彰庖唧wDNA對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。在腫瘤注射后第11和18天進(jìn)行重復(fù)的免疫接種。以3-4天的間隔監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)。與對(duì)照免疫的小鼠相比，免疫體免疫的小鼠展示了攻擊性B16F10黑素瘤生長(zhǎng)的顯著延緩(圖59a)。還使用攻擊性較弱的B16F10IFNa肺瘤系進(jìn)行了相似的研究。將2x104個(gè)腫瘤細(xì)胞通過(guò)皮下注射進(jìn)C57BI/6小鼠并在第14天用免疫體DNA或?qū)φ誅NA進(jìn)行免疫。在腫瘤注射后第21和28天進(jìn)行重復(fù)的免疫接種。在腫瘤注射后第47天，免疫體免疫的小鼠與對(duì)照免疫的小鼠相比展現(xiàn)了顯著地較低的腫瘤生長(zhǎng)(圖59b)。之前的數(shù)據(jù)表明，T調(diào)節(jié)性細(xì)胞的耗盡促進(jìn)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，因此進(jìn)行了抗腫瘤研究。在此研究中，將2xl(^個(gè)B16F10腫瘤細(xì)胞通過(guò)皮下注射進(jìn)小鼠并在第4、11和18天用免疫體DNA或?qū)φ誅NA進(jìn)行免疫。在第0天通過(guò)注射抗CD25抗體(PC61)將小鼠中T調(diào)節(jié)性細(xì)胞耗盡。與第二次免疫接種同時(shí)，還將抗CTLA-4抗體注射進(jìn)小鼠，因?yàn)檫€顯示CTLA-4的阻斷在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制中是有利的。監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)，而且雖然免疫體免疫接種顯著地延緩腫瘤生長(zhǎng)(p-0.0188)，但使用抗CD25和抗CTLA-4抗體的治療使其進(jìn)一步提高(p=0.001)(圖59c)。使用抗CD25抗體的治療看上去不顯著地延緩在免疫體免疫的小鼠中觀察到的肺瘤生長(zhǎng)。實(shí)施例17-免疫應(yīng)答可由不同載體骨架表達(dá)的免疫體構(gòu)建體產(chǎn)生。當(dāng)免疫體構(gòu)建體從不同載體骨架被表達(dá)時(shí)，分析應(yīng)答。含有CDRH1中的gpl00DR7表位、CDRH2中的TRP2表位和CDRH3中的部100DR4表位的帶有野生型輕鏈的免疫體構(gòu)建體被人工引入雙表達(dá)載體DCOrig和DCVax(DCIB54，圖18和29)。通過(guò)基因槍對(duì)HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行三次隔周免疫，通過(guò)IFNy酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定先體外后體內(nèi)地分析應(yīng)答。使用含有CDRH1和CDRL3中的gpl00DR7表位、CDRH2中的TRP2表位、CDRH3和CDRL1中的gpl00DR4表位的免疫體構(gòu)建體進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)(DCIB68，圖60)。該構(gòu)建體被人工引入DCOrig、缺乏SV40啟動(dòng)子74的DCOrig和DCVax載體骨架二者。用Orig載體中的免疫體構(gòu)建體(Bl-3)免疫的小鼠與pVax載體中的免疫體構(gòu)建體(Cl-3)相比展示相似頻率的表位應(yīng)答(圖61)?？偟膩?lái)說(shuō)，免疫體技術(shù)具有從非免疫原性抗體骨架引起高頻率和親和力CD8和CD4免疫應(yīng)答的優(yōu)秀能力，其能夠在體內(nèi)有效地預(yù)防腫瘤生長(zhǎng)。它具有同時(shí)靶向多達(dá)六種不同抗原的能力，并具有避開調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的問(wèn)了一種全新的接種方法，并證明了免疫體系統(tǒng)被用作許多其他癌癥類型和微生物相關(guān)疾病的多價(jià)疫苗的潛力。權(quán)利要求1.一種核酸，其包括非特異性啟動(dòng)子和編碼多肽的至少一種序列，其中所述多肽中具有至少一種異源性T細(xì)胞表位但沒(méi)有任何調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位。2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的核酸，其中所述多肽是異二聚體的一條鏈，所迷異源性T細(xì)胞表位導(dǎo)致所述異二聚體鏈的破壞以致于它不能結(jié)合所述異二聚體的另一條鏈。3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的核酸，其編碼所述異二聚體的兩條鏈，其中一條鏈包含異源性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位并在表達(dá)時(shí)被分泌，而另一條鏈包含異源性輔助表位并在表達(dá)時(shí)不被分泌。4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的核酸，其中所述異二聚體是免疫球蛋白分子。5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的核酸，其中所述免疫球蛋白分子的重鏈包含異源性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)表位并在表達(dá)時(shí)被分泌，而所述免疫球蛋白分子的輕鏈包含異源性輔助表位并在表達(dá)時(shí)不被分泌。6.—種核酸，其包括非特異性啟動(dòng)子和編碼免疫球蛋白分子的重組重鏈的至少一種序列，其中所述重鏈中具有至少一種異源性T細(xì)胞表位以致于所迷重鏈在所述核酸纟皮表達(dá)時(shí)不能采取它的天然構(gòu)象。7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的核酸，其還包括編碼免疫球蛋白分子的輕鏈的至少一種序列。8.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的核酸，其與包括編碼免疫球蛋白分子的輕鏈的至少一種序列的核酸相組合。9.根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8中所述的核酸，其中所述輕鏈中具有至少一種異源性T細(xì)胞表位。10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的核酸，其中所述T細(xì)胞表位使得當(dāng)所述核酸被表達(dá)時(shí)所述輕鏈不能采取它的天然構(gòu)象。11.根據(jù)權(quán)利要求4至10中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述至少一種t細(xì)胞表位是在重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)域中。12.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的核酸，其中所述至少一種t細(xì)胞表位是在所述抗體的重鏈和/或輕鏈的至少一種cdr中。13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的核酸，其中所述cdr是cdrl1、cdrh1和/或cdrh2。14.根據(jù)權(quán)利要求4至13中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼所述至少一種t細(xì)胞表位的序列被插入編碼所述重鏈或輕鏈的序列中。15.根據(jù)權(quán)利要求4至13中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼所述至少一種t細(xì)胞表位的序列被取代進(jìn)編碼所迷重鏈或輕鏈的序列中。16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的核酸，其編碼抗體。17.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的核酸，其中所述抗體是單克隆抗體。18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述至少一種t細(xì)胞表位是細(xì)胞毒性t細(xì)胞表位。19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述至少一種t細(xì)胞表位是輔助t細(xì)胞表位。20.根據(jù)權(quán)利要求4至19中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述重鏈和/或輕鏈具有至少一種細(xì)胞毒性t細(xì)胞表位和至少一種輔助t細(xì)胞表位。21.—種核酸，其包括非特異性啟動(dòng)子和編碼重組免疫球蛋白分子的至少一種序列，其中所述免疫球蛋白分子中具有至少一種異源性t細(xì)胞表位以致于當(dāng)所述核酸被表達(dá)時(shí)所述免疫球蛋白分子不能采取它的天然構(gòu)象。22.根據(jù)權(quán)利要求21中所述的核酸，其通過(guò)權(quán)利要求6至20中任一項(xiàng)所述的特征來(lái)修飾。23.—種疫苗，其包括前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的核酸以及佐劑。24.—種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的核酸和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、賦形劑或稀釋劑。25.根據(jù)權(quán)利要求]至22中任一項(xiàng)所述的核酸，其用于醫(yī)學(xué)。26.根據(jù)權(quán)利要求25中所述的核酸，其用于激發(fā)針對(duì)至少一種T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答。27.根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的核酸在制備用于激發(fā)針對(duì)至少一種T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。28.—種激發(fā)針對(duì)T細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答的方法，其包括向需要這種免疫應(yīng)答的受治療者施用治療有效量的如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的核酸。全文摘要本發(fā)明提供一種核酸，其包括非特異性啟動(dòng)子和編碼多肽的至少一種序列，其中所述多肽中具有至少一種異源性T細(xì)胞表位但沒(méi)有任何調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位。所述多肽可以是異二聚體的一條鏈，所述異源性T細(xì)胞表位導(dǎo)致所述異二聚體鏈的破壞以致于它不能結(jié)合所述異二聚體的另一條鏈。所述核酸能被用于引發(fā)針對(duì)至少一種異源性T細(xì)胞表位的T細(xì)胞應(yīng)答。文檔編號(hào)C12N15/13GK101678092SQ200880017669公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年3月28日優(yōu)先權(quán)日2007年3月28日發(fā)明者林達(dá)·吉利恩·達(dá)蘭特,瑞切爾·路易斯·麥瑟瑞漢姆,維多利亞·安妮·普德尼申請(qǐng)人:斯堪賽爾有限公司