專利名稱：：包含編碼metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域(RDD)的序列的質(zhì)粒的制作方法包含編碼metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域(RDD)的序列的質(zhì)粒本發(fā)明涉及包含編碼在強巨細(xì)胞病毒啟動子控制下的完整或部分metargidin的解聯(lián)蛋白(disintegrin)結(jié)構(gòu)域(RDD)或其衍生物的序列的pORT質(zhì)粒，特別地具有SEQIDNO2中顯示的序列的質(zhì)粒。所述質(zhì)粒具有體內(nèi)抗腫瘤活性，從而提供用于治療癌癥的有前景的治療劑。血管發(fā)生，新毛細(xì)血管從先前存在的血管的發(fā)生，是原發(fā)性實體瘤的生長和發(fā)展所必需的。因此已提出了目的在于抑制此類腫瘤內(nèi)新生血管形成(neovascularization)的策略(Folkman，NatMedl995；1:27_31)。抗血管生成治療對于限制癌癥顯示至少兩個明顯的有利方面(a)應(yīng)用于眾多種癌癥，因為血管發(fā)生對于所有惡性腫瘤來說是共同的現(xiàn)象；和(b)腫瘤新生血管形成的限制和消退應(yīng)當(dāng)阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)，從而降低轉(zhuǎn)移的危險。adamalysin蛋白(也稱為解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶蛋白(ADAMs))的家族包含位于金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域上的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域。解聯(lián)蛋白區(qū)域包含與整聯(lián)蛋白相互作用并且可介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的整聯(lián)蛋白結(jié)合序列(Wolfsberg，JCellBiol1995;131:275-8)。Metargidin(金屬蛋白酶-RGD-解聯(lián)蛋白蛋白)，也稱為人ADAM-15，是由平滑肌細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞以及由被激活的生成血管的內(nèi)皮細(xì)胞(angiogenicendothelialcell)(以更高的水平)表達(dá)的跨膜adamalysin(KratZSChmar等人，JBiolChem1996；271:4593_6；Ham等人，ExpCellRes2002；279:239_47；Herren等人，F(xiàn)ASEBJ1997；11173-80；Martin等人，JBiolChem2002；277:33683_9)。AMEP(抗血管生成Metargidin肽)是metargidin的重組解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域(RDD)。AMEP肽通過RGDC整聯(lián)蛋白結(jié)合序列結(jié)合整聯(lián)蛋白，例如α5β1和ανβ3(Zhang等人，JBiolChem1998;273:7345_50;Nath等人，JCellSci1999;112:579_87)，這表明此類整聯(lián)蛋白和metargidin的功能可能是相互依賴的。表達(dá)為可溶性重組蛋白的AMEP可能阻止該相互作用的假說導(dǎo)致探索RDD對血管發(fā)生和腫瘤生長的作用。之前證明RDD在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞在毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)中的增殖、遷移、侵入和組織化。在四環(huán)素誘導(dǎo)型系統(tǒng)中將被插入質(zhì)粒的RDDcDNA電轉(zhuǎn)移入小鼠骨骼肌。RDD產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因電轉(zhuǎn)移入肌肉并且用多西環(huán)素(doxycycline)誘導(dǎo)后第14天，在體內(nèi)抑制皮下(s.c.)人乳腺MDA-MB-231腫瘤生長達(dá)78%。該抗腫瘤效應(yīng)與顯著減少的腫瘤血管形成相關(guān)。此夕卜，在RDD存在的情況下，在1周的治療后，在小鼠肺中，B16F10黑素瘤轉(zhuǎn)移被抑制了74%(Trochon-Joseph等人，CancerRes2004；64:2062_2069)。然而，該四環(huán)素誘導(dǎo)型系統(tǒng)需要三種質(zhì)粒(pBi-RDD質(zhì)粒以及Tet-On和Tet_tTS載體)的共轉(zhuǎn)染和多西環(huán)素的聯(lián)合施用。因此，考慮進(jìn)一步發(fā)展更簡單且有效的體內(nèi)表達(dá)RDDcDNA的方法。用包含驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的組成型表達(dá)的人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和卡那霉素抗性基因的PVAX質(zhì)粒(Invitrogen，V260-20)進(jìn)行了初步嘗試。然而，該載體在轉(zhuǎn)基因表達(dá)和體外抗增殖活性方面未獲得十分令人滿意的結(jié)果。將RDDcDNA進(jìn)一步克隆入由CobraBiomanufacturing提供的用于人的臨床應(yīng)用的缺乏任何抗生素抗性基因的質(zhì)粒pORT-RDD質(zhì)粒。該新型質(zhì)粒的特征還在于強組成型啟動子(CMV-內(nèi)含子A)、人分泌信號(人尿激酶uPA信號)、數(shù)目減少的免疫刺激性CpG序列(在pORT-RDD中150個)、較小的大小和高拷貝數(shù)。意外地發(fā)現(xiàn)pORT-RDD載體在體外獲得與強抗增殖活性相關(guān)的高水平的RDD轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。已在體內(nèi)進(jìn)行了在黑素瘤的動物模型中證明抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性的進(jìn)一步實驗。因此，pORT-RDD載體提供了用于癌癥和轉(zhuǎn)移的抗血管生成治療的有前景的治療劑。因為其缺乏任何抗生素抗性基因，因此根據(jù)涉及基因轉(zhuǎn)移藥品的臨床方面的另外的指導(dǎo)方針(GuidelineEMEACPMP/BWP/3088/99；Directive2001/18/CE)，該載體也是特別適當(dāng)?shù)?。定義“Metargidin”是指也稱為MDC-15或ADAM-15的人金屬蛋白酶-RGD-解聯(lián)蛋白蛋白。Kratzschmar等人(JBiolChem1996；271:4593-6)描述了metargidin的克隆。“RDD”是指人metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域。RDD的cDNA序列作為SEQIDNO1示于所附序列表中?！癆MEP”或“抗血管生成Metargidin肽”是指重組RDD肽。術(shù)語“衍生物”是指其中從上述序列置換、添加或缺失1個或多個核苷酸的RDD的cDNA序列的變體，只要其保持野生型RDD的生物活性，例如在體外和/或體內(nèi)對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制和/或?qū)ρ馨l(fā)生的抑制。優(yōu)選，這樣的變體具有序列，所述序列與上述cDNA序列SEQIDN01具有至少80%，優(yōu)選至少85%，至少90%，更優(yōu)選至少95%，或至少98%的同一性?？梢岳缤ㄟ^在不斷增加的量的RDD的衍生物的片段存在的情況下或在其不存在的情況下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，進(jìn)行例如96小時，以及通過進(jìn)行細(xì)胞增殖測定以定量細(xì)胞增殖的抑制來估量內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制。可通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ɡ缤ㄟ^MTT測定法(例如細(xì)胞增殖試劑盒I，RocheDiagnostics,Germany)來估量細(xì)胞增殖。血管發(fā)生的抑制可以例如通過測定小管樣結(jié)構(gòu)(由培養(yǎng)在支持基質(zhì)例如基質(zhì)膠(Matrigel)上的內(nèi)皮細(xì)胞形成)的形成來估量.術(shù)語“肽”無差別地指二肽、寡肽或多肽，即其中無論其長度，單體是通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物?！百|(zhì)粒”是通常能夠在它們的宿主例如細(xì)菌中自主復(fù)制的染色體外雙鏈DNA(dsDNA)分子。如本文中所使用的，術(shù)語“載體”和“質(zhì)?！睙o差別地指借助于其可將RDDcDNA序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞以轉(zhuǎn)化宿主并且促進(jìn)RDD序列表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)的媒介物。"pORT質(zhì)?！笔侵赴子诒环词奖磉_(dá)的阻抑物結(jié)合的操縱子的質(zhì)粒。所述操縱子可以是例如lac操縱子、A操縱子、trp操縱子、gal操縱子、ara操縱子、Arg操縱子和Tet操縱子。pORT質(zhì)粒已描述于Williams等人，NucleicAcidsRes.1998May1；26(9)2120-4；Cranenburgh^A,NucleicAcidsRes.2001Mar1；29(5):E26；Cranenburgh^人，JMolMicrobiolBiotechnol.2004；7(4):197_203中和國際專利申請W09709435中。pORT-RDD質(zhì)粒和其產(chǎn)生0RT技術(shù)使用質(zhì)粒介導(dǎo)的阻抑物滴定法Oppressortitration)來激活宿主選擇標(biāo)記，從而消除對質(zhì)粒攜帶的標(biāo)記基因的要求。例如，可對包含在Iac操縱子/啟動子(lacO/P)的轉(zhuǎn)錄控制下的必需基因例如dapD基因的細(xì)菌株系進(jìn)行基因工程改造。在誘導(dǎo)劑例如乳糖不存在的情況下，該株系由于dapD表達(dá)的抑制(因LacI阻遏蛋白結(jié)合IacO/P)而不能生長。通過滴定來自操縱子的LacI，使用高拷貝數(shù)目的包含Iac操縱子(IacO)的質(zhì)粒進(jìn)行的轉(zhuǎn)化有效地誘導(dǎo)dapD表達(dá)。必需基因的調(diào)控確保細(xì)菌的生長以及包含IacO和復(fù)制起始區(qū)的重組質(zhì)粒的維持(Williams等人，NucleicAcidsRes.1998Mayl；26(9)2120-4；Cranenburgh^A,NucleicAcidsRes.2001Marl；29(5):E26；Cranenburghφ人，JMolMicrobiolBiotechnol.2004；7(4)197-203)。已設(shè)計了編碼RDD基因的表達(dá)質(zhì)粒pORT-RDD。更特別地，將包含由人尿激酶分泌信號驅(qū)動的RDD基因的表達(dá)盒插入pORTlaCMV，即包含強真核組成型啟動子(CMV-內(nèi)含子A)的0RT質(zhì)粒。因而RDD表達(dá)盒在強巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的控制之下并且被置于牛生長激素(bGH)多聚苷酸化信號的上游。pORT-RDD質(zhì)粒的序列示于SEQIDNO:2。因此，本發(fā)明涉及包含編碼完整或部分metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域或其衍生物的序列的PORT質(zhì)粒，其中插入所述序列，使之在強巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的控制之下。特別地，pORT質(zhì)粒可包含編碼序列SEQIDNO1的metargidin的解聯(lián)蛋白或其變體的序列，在所述變體中，從SEQIDNO:1置換、添加、缺失一個或多個核苷酸，并且所述變體與SEQIDNO1具有至少80%的序列同一性，并且保持在體外和/或體內(nèi)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或抑制血管發(fā)生的能力。本發(fā)明的質(zhì)粒可包含metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域的“部分”。在這樣的情況下，優(yōu)選，metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域的部分(其還可稱為“片段”)保持野生型RDD的生物活性，例如在體外和/或體內(nèi)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或抑制血管發(fā)生的生物活性。特別地，包含編碼metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域(RDD)的序列的質(zhì)粒具有SEQIDNO2中所示的序列。所述質(zhì)粒，也稱為pORT-RDD質(zhì)粒，可按照任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ貏e地重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，可在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，例如細(xì)菌宿主細(xì)胞特別地大腸桿菌(Escherichiacoli)細(xì)菌，更特別地經(jīng)基因工程改造而包含在lac操縱子/啟動子(lacO/P)的轉(zhuǎn)錄控制下的必需染色體基因例如dapD的大腸桿菌中擴(kuò)增pORT-RDD質(zhì)粒。此外，pORT-RDD質(zhì)粒是使得可能在被轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，例如哺乳動物宿主細(xì)胞，特別地腫瘤細(xì)胞時表達(dá)RDD肽的表達(dá)質(zhì)粒。因此，本發(fā)明還提供了用pORT-RDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指以任何方式選擇、修飾、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)或使用或操作以用于通過細(xì)胞產(chǎn)生物質(zhì)，例如通過細(xì)胞擴(kuò)增pORT-RDD質(zhì)?；蛴糜谕ㄟ^細(xì)胞表達(dá)RDD肽的任何生物的任何細(xì)胞。pORT-RDD質(zhì)粒至宿主細(xì)胞的離體或體內(nèi)導(dǎo)入可通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、基因槍的使用或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染來進(jìn)行。本發(fā)明還提供了a)產(chǎn)生pORT-RDD質(zhì)粒的方法，該方法包括由培養(yǎng)用所述pORT-RDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞組成的步驟，和b)從培養(yǎng)的宿主細(xì)胞回收pORT-RDD質(zhì)粒的方法。為了產(chǎn)生和擴(kuò)增pORT-RDD質(zhì)粒，可特別地使用由Cranenburgh等人(Nuc1eicAcidsRes.2001Mar1；29(5):E26)描述的大腸桿菌DH1株系，即包含在lac操縱子/啟動子控制下的dapD染色體基因的株系。這些株系可通過CobraBio-manufacturing獲得?？扇菀椎胤蛛x和繁殖轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，因為，除非在補充有IPTG(其誘導(dǎo)dapD的表達(dá))或DAP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，否則通過阻抑物滴定選擇，只有轉(zhuǎn)化體可在任何培養(yǎng)基中生長。pORT-RDD質(zhì)?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員，例如通過用轉(zhuǎn)化的0RT-株系接種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，例如LB培養(yǎng)基(即蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl5g/l)，然后進(jìn)行培養(yǎng)來容易地產(chǎn)生。在實驗室規(guī)模上，這可通過在常規(guī)的實驗室培養(yǎng)瓶中在37°C下，優(yōu)選在振蕩(例如200rpm)的條件下溫育來進(jìn)行。pORT-RDD質(zhì)粒還可在發(fā)酵罐中以更大的規(guī)模產(chǎn)生。有利地，可按照由Varley等人(Bios印aration.1999;8(1-5):209_17)描述的方案，或按照其改進(jìn)方案進(jìn)行發(fā)酵。用于進(jìn)行發(fā)酵的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基包含KH2P043g/l、Na2HP046g/l、NaCl0.5g/l、聚丙二醇麗2025g0.2%、微量元素溶液、CaCl2、2H200.03g/l、FeS04.7H200.04g/l、檸檬酸0.02g/l和MgS040.5g/l、維生素溶液、四環(huán)素12mg/l。培養(yǎng)基還可包含蛋白胨2g/l、酵母提取物20g/1、(NH4)2S0410g/l、甘油2.8%。備選地，可連續(xù)地將蛋白胨、酵母提取物、(NH4)2S04和甘油加入發(fā)酵容器。優(yōu)選在37°C、pH6.8和50%的空氣飽和度的溶解氧設(shè)定點下進(jìn)行發(fā)酵。通常將培養(yǎng)收獲物進(jìn)行離心以沉淀細(xì)胞。然后可冷凍細(xì)胞沉淀并且在純化之前于-70°C下貯存。純化pORT-RDD質(zhì)粒的適當(dāng)方法的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。優(yōu)選，可通過下列步驟來進(jìn)行純化(a)堿性裂解培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，然后進(jìn)行中和；(b)網(wǎng)袋過濾；(c)陰離子交換層析；(d)濃縮；(e)離子對反相和尺寸排阻層析，和(f)過濾o因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生pORT-RDD質(zhì)粒的方法，該方法包括步驟a)培養(yǎng)用pORT-RDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；b)從培養(yǎng)的宿主細(xì)胞回收pORT-RDD質(zhì)粒；和c)通過⑴堿性裂解培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，然后中和；(ii)網(wǎng)袋過濾；(iii)陰離子交換層析；(iv)濃縮/滲濾；(V)離子對反相和尺寸排阻層析，和(Vi)過濾來純化所述pORT-RDD質(zhì)粒。本發(fā)明還涉及從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞純化pORT-RDD質(zhì)粒的方法，該方法包括步驟(a)堿性裂解宿主細(xì)胞，然后進(jìn)行中和；(b)網(wǎng)袋過濾；(c)陰離子交換層析；(d)濃縮；(e)離子對反相和尺寸排阻層析，和(f)過濾。產(chǎn)生和/或純化pORT-RDD質(zhì)粒的方法進(jìn)一步描述于下列實施例1中。當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞時，本發(fā)明還提供了體外或體內(nèi)在細(xì)胞中表達(dá)RDD肽的方法，該方法包括用pORT-RDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞，由此在細(xì)胞中表達(dá)RDD肽(或AMEP，因為其是重組RDD肽)。哺乳動物細(xì)胞特別地是腫瘤細(xì)胞。RDD肽的表達(dá)可用于其中將要抑制血管生成活性的情況，例如癌癥中。此外，本發(fā)明者已意外地證明RDD肽在體外展示直接的抗腫瘤活性。特別地，已證明pORT-RDD質(zhì)粒在用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的黑素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物中抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。下面進(jìn)一步詳細(xì)描述治療性應(yīng)用。用于p0RT-RDD質(zhì)粒批次的表征的體外功效測定為了能夠比較或標(biāo)準(zhǔn)化pORT-RDD質(zhì)粒的不同批次的功效(potency)，本發(fā)明者開發(fā)了體外測定pORT-RDD質(zhì)粒的功效的方法。因而本發(fā)明提供了測定pORT-RDD質(zhì)粒對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制功效的體外方法，該方法包括步驟a)提供腫瘤細(xì)胞系的亞匯合(sub-confluent)培養(yǎng)物；b)分別用不斷增加的量的根據(jù)本發(fā)明的pORT-RDD質(zhì)粒或用對照轉(zhuǎn)染步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物；c)在適合于獲得用對照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的增殖的條件下培養(yǎng)步驟b)的被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；d)對于每一個特定量的被轉(zhuǎn)染的pORT-RDD質(zhì)粒，測定與步驟a)中提供的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞的數(shù)目相比，存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，所述細(xì)胞培養(yǎng)物被提供用于用所述特定量的pORT-RDD質(zhì)粒進(jìn)行的轉(zhuǎn)染；e)對于用對照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，測定與步驟a)中提供的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞的數(shù)目相比，存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，所述細(xì)胞培養(yǎng)物被提供用于用所述對照進(jìn)行的轉(zhuǎn)染；由此如果步驟d)中計算的存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)低于步驟e)中計算的存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，則pORT-RDD質(zhì)粒被確定為具有抑制功效?？砂凑毡景l(fā)明的方法使用的腫瘤細(xì)胞系可以特別地是黑素瘤細(xì)胞系，例如B16F10細(xì)胞、C9細(xì)胞或451Lu細(xì)胞。優(yōu)選，以50-80%的匯合、更優(yōu)選以50%的匯合提供腫瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)物。可以例如通過在24孔多孔板中每孔接種15000個B16F10細(xì)胞或30000個C9細(xì)胞或30000個451Lu細(xì)胞來制備腫瘤細(xì)胞系的亞匯合培養(yǎng)物?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定可用于轉(zhuǎn)染的pORT-RDD質(zhì)粒的不斷增加的量。例如，可使用0.1至2.0μgpORT-RDD質(zhì)粒的量轉(zhuǎn)染15000個B16F10細(xì)胞或30000個C9細(xì)胞或30000個451Lu細(xì)胞?？赏ㄟ^脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，例如使用Lipofectamine和Plus試劑(例如由Invitrogen銷售的)來提高體外轉(zhuǎn)染率。在本發(fā)明的方法中，“對照”存在于另外用于與不同量的pORT-RDD質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染混合物中。使對照不具有任何質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染通?？赏ㄟ^在無血清培養(yǎng)基(包含例如用于脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的試劑并且不含質(zhì)粒DNA(對照)或含有不同量的質(zhì)粒DNA)中，于37°C，5%CO2下溫育細(xì)胞，進(jìn)行例如4小時來進(jìn)行。然后常規(guī)地，即在37°C、5%C02T于完全培養(yǎng)基(即支持細(xì)胞生長的培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行例如72至120小時，優(yōu)選進(jìn)行96小時。在培養(yǎng)期結(jié)束時，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒?，例如使用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)試劑或臺盼藍(lán)來估量細(xì)胞存活。為了比較批次，可以以百分?jǐn)?shù)存活細(xì)胞作為被轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA的量的函數(shù)來對測定的細(xì)胞存活的百分?jǐn)?shù)作圖，例如圖12-14中所顯示的。pORT-RDD質(zhì)粒的冷凍干燥本發(fā)明還提供了制備冷凍干燥的pORT-RDD質(zhì)粒的方法，該方法包括步驟a)將pORT-RDD質(zhì)粒的溶液冷凍至_40V至_60V；b)升華步驟，其通過在200至300iibar的壓力下將溫度增加至+5°C至+15°C的溫度，進(jìn)行10至20小時的時間來進(jìn)行；和c)第二干燥步驟，其在室溫優(yōu)選在+20°C下，在200至300iibar下進(jìn)行，直至pORT-RDD質(zhì)粒達(dá)到室溫(+20°C)，然后在30-70ubar下進(jìn)行直至20小時。冷凍步驟可通過在1至2小時內(nèi)將pORT-RDD溶液的溫度從室溫(特別地+20°C)降低至-40°C至-60°C，并且保持該溫度2小時來進(jìn)行。優(yōu)選，進(jìn)行冷凍步驟，使溫度下降至-50°C。優(yōu)選通過在250iibar壓力下，在3小時內(nèi)將溫度從_50°C升高至+10°C，然后在+10°C(工作臺溫度(tabletemperature))下進(jìn)行12小時來進(jìn)行升華步驟。優(yōu)選通過在50ubar下，在+20°C下進(jìn)行直至20小時來進(jìn)行第二干燥。有利地，在進(jìn)行冷凍干燥法的過程中可將甘露醇和葡萄糖用作冷凍保護(hù)劑。因此，可將pORT-RDD質(zhì)粒配制于包含甘露醇和葡萄糖的溶液中?？稍诶鋬鲋皩⒗?%的甘露醇(以100mg/ml)和1%的葡萄糖(以500mg/ml)(百分?jǐn)?shù)以甘露醇或葡萄糖溶液的體積對質(zhì)粒溶液的體積來表示)加入pORT-RDD質(zhì)粒溶液，特別地在10mMTrisUmMEDTApH7.5中配制的pORT-RDD質(zhì)粒的溶液。因此，用于冷凍的pORT-RDD質(zhì)粒溶液優(yōu)選包含1.9-2.0mg/ml甘露醇和4.8-4.9mg/ml葡萄糖。藥物組合物和治療性應(yīng)用本發(fā)明還提供了pORT-RDD質(zhì)粒用于制備意欲用于治療腫瘤的藥劑的用途。本發(fā)明還涉及pORT-RDD質(zhì)粒用于治療腫瘤的用途。還提供了治療腫瘤的方法，該方法包括對需要其的受試者施用治療有效量的pORT-RDD質(zhì)粒。在本發(fā)明的說明書中，術(shù)語“治療”或“醫(yī)治”是指逆轉(zhuǎn)、減輕此類術(shù)語所用于的病癥或狀況或此類疾病或狀況的一個或多個癥狀、抑制其進(jìn)展或預(yù)防其。“治療有效量”是在受體受試者中，特別地在癌癥治療方面，有效地產(chǎn)生有益結(jié)果的量。這樣的量可通過回顧已出版的文獻(xiàn)，通過進(jìn)行體外試驗或通過在健康實驗動物中進(jìn)行代謝研究來初步測定。如本文中使用的，術(shù)語“受試者”是指哺乳動物，例如嚙齒目動物、貓科動物、犬科動物和靈長類動物。優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的受試者是人。因為RDD肽具有抗血管生成活性，因此使用pORT-RDD質(zhì)粒的治療可用于眾多種癌癥并且可阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)，即阻止轉(zhuǎn)移的發(fā)生和/或發(fā)展。根據(jù)本發(fā)明，腫瘤可以是任何腫瘤，例如原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤、實體瘤或軟組織腫瘤、或血液惡性腫瘤。事實上，不斷增加的證據(jù)表明血管發(fā)生也在血液惡性腫瘤中起著重要作用(Dong等人，CritRevOncolHematol.2006Dec21)。實體瘤或軟性腫瘤(softtumor)的實例包括膀胱癌、乳腺癌、骨癌、腦癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、肝癌、肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌和皮膚癌，特別地黑素瘤。血液惡性腫瘤包括例如急性或慢性白血病，例如急性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病(acutelymphoblasticleukaemia)、慢性髓性白血病或慢性淋巴細(xì)胞性白血??；淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤；和骨髓增生異常綜合征。根據(jù)實施方案，根據(jù)本發(fā)明的藥劑、質(zhì)?；蛑委煼椒ㄒ庥糜陬A(yù)防和/或治療轉(zhuǎn)移瘤。雖然pORT-RDD質(zhì)粒可以被單獨施用，但優(yōu)選以藥物組合物的形式提供pORT-RDD。因而，本發(fā)明還提供了包含pORT-RDD質(zhì)粒和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。如本文中所使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”和其語法變型，當(dāng)它們指組合物、媒介物、載體、稀釋劑和試劑時，它們可互換使用并且表示能夠?qū)蛟谑茉囌呱鲜┯盟霾牧隙划a(chǎn)生不期望的生理效應(yīng)例如惡心、眩暈、心嘈(gastricupset)等。本領(lǐng)域內(nèi)已知的適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體包括但不限于無菌水、生理鹽溶液、葡萄糖、右旋糖(dextrose)或緩沖溶液。載體可包括助劑(auxiliaryagent)，包括但不限于稀釋劑、穩(wěn)定劑(S卩，糖和氨基酸)、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、PH緩沖劑、增稠添加劑(viscosityenhancingadditive),著色劑等?？赏ㄟ^靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、損傷內(nèi)(intralesionally)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、經(jīng)直腸、局部、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、囊內(nèi)(intravesicularly)、經(jīng)粘膜、心包內(nèi)、口服、局部、局部性途徑和/或使用氣霧劑(aerosol)、注射、輸注、連續(xù)輸注、直接地或通過導(dǎo)管局部灌注水浴靶細(xì)胞(bathingtargetcell)和/或灌洗來施用包含pORT-RDD質(zhì)粒的藥物組合物。例如，可配制用于胃腸外施用的，例如配制用于通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑注射的本發(fā)明的pORT-RDD組合物(然而可使用其他途徑例如氣霧劑來施用)。根據(jù)本公開內(nèi)容，包含本發(fā)明的pORT-RDD質(zhì)粒和/或另外的試劑作為活性成分的水性組合物的制備對于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員來說將是已知的，如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,MackPublishingCompany,1980中舉例說明的。一般地，此類組合物被制備為可注射的液體溶液或懸浮液；還可制備適合用于在注射前通過加入液體而制備溶液或懸浮液的固體形式。還可乳化制劑。特別地，可將藥物組合物配制為固體劑型，例如膠囊、片劑、丸劑、粉劑、錠劑或顆粒劑。無菌注射液可通過將質(zhì)粒以需要的量與其他上面例舉的組分(如果需要的話)一起整合入適當(dāng)?shù)娜軇┲?，然后進(jìn)行過濾滅菌來制備。如果需要，應(yīng)當(dāng)對液體介質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)木彌_，并且在注射前首先用充足的生理鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。還涉及用于直接注射的高度濃縮的組合物的制備，其中預(yù)期DMSO用作溶劑可導(dǎo)致極其快速的滲透，從而將高濃度的活性劑遞送至小區(qū)域。組合物將是無菌的，其流動性達(dá)到可被容易地注射的程度，其在制造和貯存的條件下是穩(wěn)定的，并且進(jìn)行了防腐處理以抗微生物的污染作用?？捎糜谥苽淇勺⑸浣M合物的適當(dāng)?shù)娜軇┑膶嵗ㄓ蒊OmMTrisImMEDTA、150mMNaCl，pH7.5或生理血清(NaCl0.9%)組成的TENaCl溶液?？赏ㄟ^藥學(xué)領(lǐng)域內(nèi)熟知的任何方法以單位劑型的形式制備制劑。此類方法包括使PORT-RDD質(zhì)粒與組成一種或多種配合劑的載體結(jié)合的步驟。一般地，通過使pORT-RDD質(zhì)粒與液體載體或精細(xì)的固體載體或兩者均勻且密切地結(jié)合，然后如果需要，給產(chǎn)物塑形來制備制劑。用于給受試者施用的本發(fā)明的pORT-RDD質(zhì)粒組合物(和/或另外的試劑)的實際劑量可根據(jù)物理和生理因素例如受試者的體重、腫瘤體積、狀況的嚴(yán)重度、特發(fā)病和基于施用的途徑來確定。通過考慮這些因素，可容易地確定用于特定受試者和/或療程的脂質(zhì)組合物的劑量。取決于被治療的受試者和特定的施用模式，治療可發(fā)生變化。例如，在本發(fā)明中，pORT-RDD質(zhì)粒的劑量范圍可以是大約0.05mg/kg體重至大約500mg/kg體重。當(dāng)對動物進(jìn)行治療時，術(shù)語“體重”是可應(yīng)用的。當(dāng)治療分離的細(xì)胞時，本文中使用的“體重”應(yīng)當(dāng)理解為表示“總細(xì)胞重量”。術(shù)語“體重”可以應(yīng)用于分離的細(xì)胞和動物的治療。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)多種劑量范圍，例如0.05mg/kg體重至300mg/kg體重、0.lmg/kg體重至lOOmg/kg體重、0.2mg/kg體重至50mg/kg體重或0.5mg/kg體重至10mg/kg體重的功用。優(yōu)選劑量方案可以在0.1至lmg/kg體重之間。當(dāng)然，所有這些劑量是示例性的，處于這些點之間的任何劑量也預(yù)期用于本發(fā)明。對于任何特定受試者的特定劑量水平將取決于多種因素，包括體重、總體健康狀況、性別、飲食、施用的時間和途徑、吸收和排泄的速度、與其他藥物的組合以及被治療的特定癌癥的嚴(yán)重度?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員使用pORT-RDD質(zhì)粒的任何適當(dāng)?shù)氖┯媚Ｊ健４祟惙椒òǖ幌抻谕ㄟ^注射、顯微注射、電穿孔、電轉(zhuǎn)移、快速注射(jet-injection)進(jìn)行的質(zhì)粒的直接遞送、磷酸鈣沉淀、使用DEAE-葡聚糖然后使用聚乙二醇、直接的聲波裝載(directsonicloading)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒轟擊、使用碳化硅纖維進(jìn)行的攪拌、PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化、干燥/抑制_介導(dǎo)的DNA吸收或此類方法的任何組合。優(yōu)選通過電轉(zhuǎn)移施用pORT-RDD質(zhì)粒，如下面進(jìn)一步描述的。電轉(zhuǎn)移方案通過對患有皮下腫瘤的小鼠進(jìn)行瘤內(nèi)或肌內(nèi)電轉(zhuǎn)移來成功地施用pORT-RDD質(zhì)粒。因此，本發(fā)明涉及pORT-RDD質(zhì)粒用于通過電轉(zhuǎn)移，特別地通過瘤內(nèi)和/或肌內(nèi)電轉(zhuǎn)移進(jìn)行的腫瘤的治療的用途。本發(fā)明還提供了pORT-RDD質(zhì)粒用于制備意欲被體內(nèi)電轉(zhuǎn)移入腫瘤細(xì)胞的藥劑的用途。本發(fā)明還涉及pORT-RDD質(zhì)粒用于體內(nèi)電轉(zhuǎn)移入腫瘤細(xì)胞的用途?？砂凑毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒娹D(zhuǎn)移待施用的質(zhì)粒。有利地，可按照國際專利申請PCT/IB2006/002401中描述的方案進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。根據(jù)該方案，將質(zhì)?；蛩巹┡c腫瘤或肌肉細(xì)胞接觸，然后如下電刺激腫瘤或肌肉-首先，使用至少一個200至2000伏/cm的高電壓(HV)場強的脈沖-其次，使用具有50至200伏/cm的低電壓(LV)場強和300至2000ms的持續(xù)時間的單脈沖?？蓪①|(zhì)粒與腫瘤或肌肉細(xì)胞接觸數(shù)秒至10分鐘，例如30秒至5分鐘，在應(yīng)用HV脈沖之前。優(yōu)選在易于與電轉(zhuǎn)移電極接觸的肌肉即身體表面上的肌肉中進(jìn)行肌內(nèi)電轉(zhuǎn)移?？赏ㄟ^直接的瘤內(nèi)注射、通過全身性施用(例如，靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)途徑)或通過局部或皮下施用來接觸質(zhì)粒。質(zhì)粒的肌內(nèi)注射可用于將質(zhì)粒與腫瘤或肌肉細(xì)胞接觸。特別地，可首先用至少一個400至2000伏/cm，優(yōu)選600至2000，優(yōu)選800至1600伏/cm，更優(yōu)選900至1200，通常大約1000伏/cm的HV場強的脈沖電刺激腫瘤或肌肉組織。HV脈沖可具有10至1000us，優(yōu)選50至200us，通常大約100us的持續(xù)時間?？纱嬖趲讉€HV脈沖，即具有本文中公開的技術(shù)指標(biāo)(specification)的2至10個HV脈沖。在該情況下更方便地具有相同的HV脈沖。HV脈沖的頻率可以是1Hz。然而，上面公開的單HV脈沖足以穿透細(xì)胞膜。因此，在優(yōu)選實施方案中，使用單HV脈沖。當(dāng)存在單HV脈沖時，其優(yōu)選是矩形脈沖。在幾個HV脈沖的情況下，可使用單極或雙極脈沖，或使用具有不同方向和/或極性的脈沖，優(yōu)選使用矩形類型。根據(jù)實施方案，至少一個HV場強的脈沖由一個脈沖HV=1500V/cm,100μs，IHz組成。HV和LV脈沖可通過間隔的時間分開，并且該間隔的時間可有利地是300ms至3000s，優(yōu)選500ms至1000s，優(yōu)選500ms至10s，通常大約1000ms。在特定的實施方案中，不存在間隔的時間或只有很短的間隔時間，例如小于300ms，且HV脈沖具有300至1000伏/cm,優(yōu)選400至800伏/cm的場強。單LV脈沖可具有100至200伏/cm，優(yōu)選120至160伏/cm，通常大約140伏/cm的場強。單個LV脈沖可具有300至800ms，優(yōu)選350至600ms，通常大約400ms的持續(xù)時間。LV脈沖可以具有與HV脈沖相同的極性，或可以具有與HV脈沖的極性相反的極性。優(yōu)選，單LV脈沖是矩形脈沖。其還可以是梯形的或不連續(xù)的。根據(jù)實施方案，LV脈沖具有140V/cm的場強并且持續(xù)400ms?？砂凑毡景l(fā)明執(zhí)行的優(yōu)選電轉(zhuǎn)移方案是-HV:1000-1600V/cm,50-200μs,1個脈沖，IHz，-間歇500ms至IOs-LV=100-200V/Cm,300-800ms,1個脈沖。優(yōu)選，可使用下列電轉(zhuǎn)移方案-HV=1300V/cm,100μs,IHz,1個脈沖-間歇=IOOOms-LV=140V/cm,400ms,1個脈沖。備選地，優(yōu)選還可使用下列電轉(zhuǎn)移方案-HV=1500V/Cm,100μs,IHz,1個脈沖-間歇1000ms-LV=140V/Cm,400ms,1個脈沖。將根據(jù)下列圖和實施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。M圖1是pORTIaCMV質(zhì)粒的圖譜。Ml是pORT-RDD質(zhì)粒的圖譜。Ml是pVAXl質(zhì)粒的圖譜。圖4是在基于pORT的載體的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移后，在14天中B16F10皮下腫瘤的腫瘤生長的圖示。當(dāng)腫瘤體積>30mm3(第0天)時，注射50μg質(zhì)粒(于50μ1IOmMTris,ImMEDTA，0.9%NaCl，pH7.5中)并且施以電脈沖。數(shù)據(jù)表示各組(在第0天，pORTIaCMVη=10(在實驗過程中發(fā)生一個自然死亡)和pORT-RDDη=11(在實驗過程中發(fā)生2個自然死亡)；在第14天，對于每一組η=9)的腫瘤體積(平均值士SD)。星號表示統(tǒng)計學(xué)顯著性。■是在基于PORT的載體的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移后，在前7天中B16F10皮下腫瘤的腫瘤生長的圖示。數(shù)據(jù)表示各組的腫瘤體積(平均值士SD)。星號表示統(tǒng)計學(xué)顯著性。_展示利用基于PORT的載體的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移治療的小B16F10皮下腫瘤的以mm3表示的腫瘤體積的監(jiān)控的分析。腫瘤體積在第0天在33.51至65.45mm3之間。數(shù)據(jù)表示各組的腫瘤體積(平均值士SD)。該圖不包括死亡小鼠pORTlaCMVη=6和pORT-RDDη=7。不存在統(tǒng)計學(xué)顯著性。Ml展示利用基于PORT的載體的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移治療的小B16F10皮下腫瘤的以V/V0表示的腫瘤監(jiān)控的分析。腫瘤體積在第0天在33.51至65.45mm3之間。V/V0表示第0天的腫瘤體積與第D天的腫瘤體積之間的比率。數(shù)據(jù)表示各組的腫瘤比率(平均值士SD)。該圖不包括死亡小鼠pORTlaCMVη=6和pORT-RDDη=7。星號表示統(tǒng)計學(xué)顯著性。Μ8展示在不斷增加的劑量的pORT-RDD質(zhì)粒的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移后B16F10皮下腫瘤的腫瘤生長的分析。當(dāng)腫瘤體積在30至50mm3(第0天)之間時，將不斷增加的劑量的PORT-RDD質(zhì)粒注射入預(yù)先建立的B16F10皮下腫瘤并且使用電脈沖。數(shù)據(jù)表示各組的腫瘤體積(平均值士SD)。M9展示利用pORT-RDD質(zhì)粒的重復(fù)瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移治療的B16F10皮下腫瘤的以mm3表示的腫瘤體積的監(jiān)控的分析。數(shù)據(jù)表示各組(TE媒介物η=20；pORT-RDDIXη=10；pORT-RDD2Xη=20)的腫瘤體積(平均值士SD)。圖10顯示在200μgpORT-RDD質(zhì)粒的單次瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移后，通過超聲進(jìn)行的腫瘤體積的監(jiān)控。圖11顯示在200μgpORT-RDD質(zhì)粒的單次瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移后，通過多普勒-超聲進(jìn)行的腫瘤血管的監(jiān)控。圖12顯示在用不斷增加的量的pORT-RDD(ΒΑ015-VCC-Q04)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，B16F10細(xì)胞增殖的抑制。^13展示在用不斷增加的量的pORT-RDD(ΒΑ015-VCC-004)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，C9細(xì)胞增殖的抑制。圖14展示在用不斷增加的量的pORT-RDD(ΒΑ015-VCC-004)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，451Lu細(xì)胞增殖的抑制。圖15顯示關(guān)于非冷凍干燥的和冷凍干燥的質(zhì)粒樣品的質(zhì)粒形式的瓊脂糖凝膠分析的結(jié)果(M:1KbDNA梯標(biāo)志物，Invitrogen)。Si^顯示C9黑素瘤細(xì)胞增殖的分析的結(jié)果。按照Lipofectamin印Ius方案，用不斷增加的劑量的非冷凍干燥的(批次3)和冷凍干燥的(批次4)pORT-RDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(對于每一個劑量，η=4)。數(shù)據(jù)表示平均值士SD。圖17顯示451LU黑素瘤細(xì)胞增殖的分析的結(jié)果。按照Lipofectamineplus方案，用不斷增加的劑量的非冷凍干燥的(批次3)和冷凍干燥的(批次4)pORT-RDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(對于每一個劑量，η=4)。數(shù)據(jù)表示平均值士SD。^18顯示利用非冷凍干燥的或冷凍干燥的pORT-RDD質(zhì)粒的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移治療的B16F10皮下腫瘤的以mm3表示的腫瘤體積的監(jiān)控的分析。數(shù)據(jù)表示各組的腫瘤體積(平均值士SD)。ΜΛ9展示利用pORT-RDD質(zhì)粒和媒介物的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移治療的B16F10皮下腫瘤的腫瘤體積的監(jiān)控。數(shù)據(jù)表示各組的腫瘤體積(平均值士SD)。S20展示從第0天(細(xì)胞注射)至第8天利用pORT-RDD質(zhì)粒和媒介物的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移治療的B16F10皮下腫瘤的腫瘤體積的監(jiān)控。數(shù)據(jù)表示各組的腫瘤體積(平均值士SD)。實施例實施例1pORT-RDD質(zhì)粒的產(chǎn)生·質(zhì)粒CobraBioManufacturing已產(chǎn)生了表達(dá)質(zhì)粒pORT-RDD，其編碼在翻譯上融合至人尿激酶的信號肽的下游的RDD基因。編碼序列在強真核巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的控制之下并且被置于牛生長激素(bGH)多腺苷酸化信號的上游。通過將包含由人尿激酶分泌信號驅(qū)動的RDD基因的基因盒插入CobraBioManufacturing的pORTlaCMV質(zhì)粒(圖1中的圖譜)已設(shè)計了pORT-RDD?；蚝械男蛄腥缦翧AGCTTATGAGAGCCCTGCTGGCGCGCCTGCTTCTCTGCGTCCTGGTCGTGAGCGACTCCAAAGGCATGGCTGCTTTCTGCGGAAATATGTTTGTGGAGCCGGGCGAGCAGTGTGACTGTGGCTTCCTGGATGACTGCGTCGATCCCTGCTGTGATTCTTTGACCTGCCAGCTGAGGCCAGGTGCACAGTGTGCATCTGACGGACCCTGTTGTCAAAATTGCCAGCTGCGCCCGTCTGGCTGGCAGTGTCGTCCTACCAGAGGGGATTGTGACTTGCCTGAATTCTGCCCAGGAGACAGCTCCCAGTGTCCCCCTGATGTCAGCCTAGGGGATGGCGAGTAATCJAGA(348bp)(SEQIDNO3).HindIII和XbaI限制位點以粗體顯示，人尿激酶分泌信號以下劃線顯示，RDD基因以斜體顯示。用HindIII和XbaI降解合成的基因盒和pORTlaCMV，然后連接片段以產(chǎn)生pORT-RDD質(zhì)粒。pORT-RDD載體因而包含下列元件(圖2中的質(zhì)粒圖譜)人巨細(xì)胞病毒立即_早期(CMV)啟動子+內(nèi)含子a(比經(jīng)典CMV(Cobra來源)更強的啟動子)、牛生長激素(bGH)多腺苷酸化信號、用于選擇的LacO序列和在人尿激酶分泌信號的控制下的人RDD基因。然后將pORT-RDD轉(zhuǎn)化入宿主株系DH1-0RT并且通過發(fā)酵來生產(chǎn)。還可使用Cranenburgh等人，2001中提及的DHlLacdapD株系?！ORT-RDD的產(chǎn)生研究工作細(xì)胞庫的產(chǎn)生將已轉(zhuǎn)化的DH1-0RT(CobraBiomanufacturing,CTL2006#0492P)的甘油原液用于接種8X5ml的25ml無菌universal中的無菌LB培養(yǎng)基。將5ml培養(yǎng)物在37°C下于以200rpm振蕩的培養(yǎng)箱中溫育大約16小時。小量制備20Dml樣品來確認(rèn)質(zhì)粒的存在。然后將IODml的經(jīng)選擇的培養(yǎng)物用于接種25mlLB培養(yǎng)基。在以200rpm振蕩的條件下，在37°C下培養(yǎng)該培養(yǎng)物直至其達(dá)到0.8-1.50D單位的光密度(600nm)。使用20%ν/ν甘油冷凍保存培養(yǎng)物。將該培養(yǎng)物以Iml士0.2ml等分入20多個無菌冷凍管，然后在低于-70°C下貯存。遺傳穩(wěn)定性試驗評估質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和分離穩(wěn)定性，進(jìn)行多于40個胞世代。通過將相同數(shù)目的細(xì)胞(0.100Dml)接種入新鮮LB培養(yǎng)基(5ml)中，然后以24小時的間隔進(jìn)行傳代培養(yǎng)來進(jìn)行該評估。在37°C和200rpm下在軌道振蕩器中溫育培養(yǎng)物。在各24小時間隔上，測量光密度(600nm)并且將其用于計算經(jīng)過的細(xì)胞倍增次數(shù)(或世代)細(xì)胞世代的數(shù)目=Ln(終光密度/接種時的光密度)/1η2重復(fù)該過程直至已進(jìn)行多于40個細(xì)胞世代。在各傳代培養(yǎng)期，通過離心沉淀已知數(shù)目的細(xì)胞(20Dml)，并且使用兩種小量制備方法(由Birnboim和Doly設(shè)計的小量制備方法(NucleicAcidsRes.1979Nov24；7(6)1513-23)和使用QIAprepMiniprep方法及試劑盒(Qiagen))來提取pDNA。然后將等體積的來自各個傳代培養(yǎng)的分離的pDNA裝載至用溴化乙錠染色的0.8%瓊脂糖凝膠上，然后定性顯現(xiàn)分離或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的跡象。通過連續(xù)傳代培養(yǎng)和經(jīng)歷44代的取樣分析，未發(fā)現(xiàn)顯著的總體分離或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的跡象。5-升發(fā)酵罐的評估在FTApplikon5/71發(fā)酵罐容器中以51的規(guī)模評估包含pORT-RDD的DHl-ORT株系。所使用的復(fù)合培養(yǎng)基和發(fā)酵方案是具有下列改進(jìn)的Varley等人(Bioseparation.1999；8(1-5)209-17)中的復(fù)合培養(yǎng)基和發(fā)酵方案。Varley等人描述的培養(yǎng)基由終濃度KH2P043g/l、Na2HPO46g/l、NaCl0.5g/l、聚丙二醇MW2025g0.2%、微量元素溶液0·05%[由CoCl2.6H202g/l、CuCl2.2H201.9g/l、H3BO3L6g/l、MnSO4.H2O1.6g/l、Na2MoO4.2H202g/l、ZnCl2.7H202g/l、Fe2(SO4)3.xH20lg/UCaCl2.2H20lg/1和檸檬酸60g/l組成]、CaCl2.2H200.03g/l、FeS04.7H200.04g/l、檸檬酸0.02g/l、MgS040.5g/l、維生素溶液5ml/l[由生物素0.6g/l、葉酸0.04g/l、吡哆醇-HCl1.4g/l、核黃素0.42g/l、泛酸5.4g/l和煙酸6.lg/1組成]、四環(huán)素12mg/l以及蛋白胨2g/1、酵母提取物20g/l、(NH4)2SO410g/l和甘油2.8%組成。然而，用于線性補料分批發(fā)酵的甘油、植物蛋白胨、酵母提取物和硫酸銨不包括在大量培養(yǎng)基(bulkmedia)中，而是以60、40和30ml/小時的恒定進(jìn)料速度添加入容器。通過將IOOgBacto酵母提取物、IOg植物蛋白胨、176.5g甘油、25g硫酸銨混合并且用純化水加至740ml來制備進(jìn)料液。在0.2μm過濾器上進(jìn)一步過濾進(jìn)料液。在發(fā)酵的整個時間過程中收集用于分析的樣品。就光密度(600nm)、分離或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性以及PDNA的個別產(chǎn)量分析樣品。通過在21長頸Erlenmeyer振蕩培養(yǎng)瓶(baffledErlenmeyershakeflask)中將來自研究工作細(xì)胞庫(ResearchWorkingCelIBank)的200μ1細(xì)胞用于200mlT-Broth培養(yǎng)基(11.8g/l植物蛋白胨、23.6g/l酵母提取物、2.2g/lKH2PO4,9.4g/lK2HPO4,5.04g/1甘油)中來制備接種物。在以200rpm振蕩的條件下在37°C下溫育接種物大約12小時。然后將12000Dml用于接種51的容器。物理參數(shù)在整個發(fā)酵時間過程中連續(xù)地監(jiān)控溶解氧、pH、攪拌速度和溫度。收獲使用提供有自來水(mainswater)的冷卻套將容器冷卻至10°C。將培養(yǎng)物收集入11離心罐(centrifugepot)，然后通過在SorvallRC3BPlus離心機中于4°C下以4500rpm離心20分鐘來沉淀細(xì)胞。輕輕倒出上清液，然后用2%Tego2000消毒。然后在低于-70°C下冷凍細(xì)胞沉淀。分析在整個發(fā)酵時間過程中測量光密度(600nm)以獲得生長動力學(xué)。沿著發(fā)酵的時間過程在幾個時間間隔處沉淀已知量的細(xì)胞(即0D_xml)(1000Dml)。將這些樣品于_20°C下貯存。使用Qiagen-SOOMaxi-pi^p試劑盒和方案(Qiagen)從這些細(xì)胞分離質(zhì)粒。通過測量DNA在260nm處的OD來計算pDNA的濃度。由此，通過將PDNA濃度(yg/ml)除以樣品的ODml數(shù)來計算培養(yǎng)物的個別質(zhì)粒產(chǎn)量。對每一個發(fā)酵進(jìn)行該計算，對每一個樣品進(jìn)行使用溴化乙錠染色的0.8%的瓊脂糖凝膠電泳以定性顯現(xiàn)pDNA。最終發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中40ml/小時的進(jìn)料速度對于質(zhì)粒產(chǎn)量(大約1μg/0Dml)是最適宜的?！ORT-RDD的純化除非另外指出，否則所有緩沖鹽和試劑購自VWRInternational(Leicestershire,UK)并且為分析級的(AnalaR)。使用純化水和注射用水(WFI)級水(Hyclone，UK)制備所有緩沖液和消毒液。使用DU800分光光度計(BeckmanCoulter,UK)進(jìn)行光密度測量。使用SorvallEvolutionRC(Kendro,UK)進(jìn)行離心。在ECCSSU1214Turn&CastGel系統(tǒng)(VWRInternational,UK)中，使用ElectrophoresisPowerSupply600(AmershamBiosciences,UK)進(jìn)行瓊月旨糖凝膠電泳。QiagenPlasmidMaxi試劑盒的組分(Qiagen-tip500、緩沖劑QBT、QC和QF)(Qiagen5UK)用于裂解滴定法。細(xì)胞裂解和裂解物的澄清向101不銹鋼容器中的冷凍的細(xì)胞沉淀(對于批次1，終濃度為120g/l，對于批次2為150g/l)中加入21細(xì)胞懸浮緩沖液，用不銹鋼刮鏟人工混合直至懸浮物表現(xiàn)為不含聚集物(aggregate)。通過將細(xì)胞與41裂解液(0.155MNaOH,1%SDS于20_22°C下)混合3分鐘(對于批次1)和10分鐘(對于批次2)來裂解細(xì)胞。向裂解物中加入21中和溶液(3M醋酸鉀和IOmMEDTA，pH5.5)，同時溫和地攪拌。然后使用500μm網(wǎng)袋過濾器(meshbagfilter)(L1NM500BBSS,Plastok,UK)和標(biāo)稱50μm、5μm和0·3μm深度的過濾器(KR50A05HH1、KR05A05HH1和KRK3A05TT1，Millipore,UK)來除去沉淀的細(xì)胞碎片。離子交換層析用354ml經(jīng)純化水清洗的FractogelEMDTMAE(MerckKGaA,Germany)將XK50/30層析柱填充至264.6ml的填充床體積，從而導(dǎo)致13.5cm(對于批次1)的床高。用370ml經(jīng)純化水清洗的FractogelEMDTMAE(MerckKGaA,Germany)將批次2±真充至254.8ml的填充床體積，從而導(dǎo)致13.Ocm(對于批次2)的床高。通過使用2.5ml的丙酮來對填充介質(zhì)進(jìn)行填充試驗，從而導(dǎo)致1.65和1.35(分別對于批次1和2)的可接受的不對稱值(Asymmetryvalue)0然后用兩倍柱體積的0.5MNaOH對介質(zhì)進(jìn)行消毒，接觸時間超過1小時。然后泵入平衡緩沖液使之通過柱子直至流出物的PH已達(dá)到彡8.5。用6312.5ml(批次1)和6393.3ml(批次2)的澄清的原料(feedstock)裝載柱子，以IOOcm/小時的恒定線流速度運行。在通過以IOOcm/小時的流速使用洗脫緩沖液來回收pDNA之前，重新使用平衡緩沖液洗掉未結(jié)合的和污染的材料。通過切向流過濾進(jìn)行的離子交換后的中間產(chǎn)物的濃縮使用MilliporeLabScaleTFF系統(tǒng)，該系統(tǒng)適配有新型50cm2，30kDa再生纖維素PelliconXL膜(Millipore，UK)。使用純化水清洗系統(tǒng)和膜，進(jìn)行10分鐘，然后使用離子交換洗脫緩沖液進(jìn)行平衡(2X500ml，10分鐘)。將離子交換后的pDNA溶液輕輕倒入貯器。在應(yīng)用15psi的跨膜壓力差之前，打開泵，并且讓系統(tǒng)運行10分鐘。連續(xù)充注貯器直至所有洗脫的材料已被加入并且體積減小至大約2mg/mlpDNA的最終標(biāo)稱濃度。然后在最終的緩沖液漂洗之前從系統(tǒng)引流出濃縮物，確保從膜回收最大量的PDNA。計算漂洗緩沖液的體積以獲得lmg/ml的終pDNA濃度。在使用之間，用純化水清洗系統(tǒng)和膜。然后用水漂洗系統(tǒng)，并將其貯存在0.IMNaOH中。離子對反相層析在該方法中使用包含大約850ml的Perfluorosorb-S介質(zhì)的VS60層析柱(Millipore,UK)。通過泵入兩倍柱體積的0.5MNaOH(接觸時間超過1小時)來進(jìn)行柱子和介質(zhì)的消毒。然后在使用前平衡介質(zhì)(直至PH達(dá)到7士0.2)。用69.Oml(批次1)和200.8ml離子交換后的TFF濃縮物裝載柱子，然后以70cm/小時的恒定線流速度運行。然后在將洗脫緩沖液用于回收捕獲的PDNA之前，向柱子中導(dǎo)入兩倍柱體積的清洗緩沖液1和4倍柱體積的清洗緩沖液2來除去殘留的內(nèi)毒素、RNA和未結(jié)合的材料。收集洗脫峰，使用UV分光光度法分析洗脫峰以測定回收的PDNA的濃度。通過切向流過濾進(jìn)行的濃縮/滲濾以及產(chǎn)品配制如之前所述制備系統(tǒng)。連續(xù)充注貯器直至所有pDNA溶液都已加入。當(dāng)pDNA溶液被濃縮至需要的濃度后，立即針對配制緩沖液(formulationbuffer)(IOmMTris堿、ImMEDTA.0.9%w/vNaClpH7.5)進(jìn)行滲濾，直至滲透物(permeate)的pH和導(dǎo)電率等于滲濾緩沖液。然后在2x緩沖液漂洗之前從系統(tǒng)引流出經(jīng)滲濾的濃縮物，確保從膜回收最大量的pDNA。使用0.2μm過濾器過濾回收的pDNA等分，然后在無菌條件下將其注入無菌冷凍管。純化方法概述于表1中。表1純化概要表pORT-RDD細(xì)胞裂解<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>陰離子交換層析<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>·用于懸浮緩沖液變換的DNA沉淀表2用于DNA沉淀的混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>制備兩管各上述混合物，將其于_20°C下溫育過夜。以12000rpm，4°C離心混合物30分鐘。棄去上清液，加入乙醇70%。對溶液進(jìn)行離心，棄去上清液。干燥沉淀，然后使用25μ1無菌NaCl0.9%(1個管)或25μ1無菌IOmMTris-ImMEDTA-NaCl0·9%、ρΗ7·5(稱為TE-NaCl)(另一個管)重懸浮沉淀。DNA濃度通過26(V280nm處的光密度讀數(shù)來測量。按照之前的轉(zhuǎn)染方案轉(zhuǎn)染pORTlaCMV-NaCl、ρORTlaCMV-TENaCl,pORT-RDD-NaCl和pORT-RDD-TENaClDNA，每質(zhì)粒6個孔。進(jìn)行該實驗一次?！DDWestern印跡法按照經(jīng)設(shè)計用于增殖測定的方案，將人C9黑素瘤細(xì)胞涂布在24孔板(60，000個細(xì)胞/孔)中，然后用1μg質(zhì)粒和LipofectaminePlus試劑(GibcoLifetechnologies)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在于無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行4小時的轉(zhuǎn)染后，用補充有10%血清的培養(yǎng)基更換轉(zhuǎn)染上清液。在轉(zhuǎn)染后72小時收集上清液。對于細(xì)胞提取物，通過刮擦收集細(xì)胞，然后將其與50μ1裂解緩沖液(10mlRIPA緩沖液+1個抗蛋白酶完全小片(antiproteaseCompleteminitablet)[ref.11836153，Rochel)一起溫育30分鐘。在以10OOOrpm離心10分鐘后，將裂解物等分并且在-80°C下貯存。利用Bradford測定法測定各上清液的蛋白質(zhì)濃度。通過將18μ1上清液或18μ1PBS中的30μg的總蛋白(對于提取物)與6μ1NuPageLDS樣品緩沖液4Χ(ΝΡ0007，Invitrogen)和2.5μ1NuPage樣品還原劑(ΝΡ0004，Invitrogen)混合來進(jìn)行Western印跡。將樣品在70°C下加熱10分鐘。按照NuPageNovex方案將樣品裝載在NuPageNovexBis_Trisl2%凝膠(NP0341B0X,Invitrogen)上，然后在MOPSSBS緩沖液中進(jìn)行遷移。使用轉(zhuǎn)移緩沖液Tris48mM_甘氨酸39mM_SDS0.037%-甲醇20%在硝酸纖維素膜OptitranBA-S850，22μ(Schleicher&Schuell)上進(jìn)行半干轉(zhuǎn)移(semi-drytransfer)，然后在4°C下在PBS-5%牛奶(印跡級封閉劑(blottinggradeblocker)脫脂奶粉，ref170-6404,BioRad)中封閉過夜。用PBS-0.1%Tween20清洗膜，然后將其與在PBS-0.1%Tween20-2%牛奶中稀釋至12000的一抗Neosystem抗血清一起在室溫下溫育1個半小時。在清洗后，將膜與在PBS-0.Tween20-2%牛奶中稀釋至15000的HRP驢抗兔IgG(NA934，Amersham)一起在室溫下溫育1小時。清洗膜并用ECL(RPN2209，Amersham)顯現(xiàn)?！そy(tǒng)計分析使用SigmaStat3.1軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計分析。學(xué)生氏t檢驗(studentttest)用于比較在用對照質(zhì)?；騌DD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。ρ值<0.05被認(rèn)為是顯著的?！そY(jié)果由poRT-RDD質(zhì)粒驅(qū)動的RDD的分泌在pORT-RDD轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞提取物和上清液中都在預(yù)期的大小(IOkDa)處特異地檢測到條帶。然而，在pVAX-RDD轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液中未檢測到RDD肽。因此，與來自pVAX載體的經(jīng)典CMV啟動子相比，來自pORT載體的完全CMV-內(nèi)含子A啟動子誘導(dǎo)更強的AMEP肽的產(chǎn)生和分泌。在pORT-RDD轉(zhuǎn)染后C9增殖的抑制為了證明從pORT-RDD產(chǎn)生的RDD肽的抗增殖活性，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后建立增殖測定。也將新型pORT-RDD質(zhì)粒與用作陽性對照的組成型質(zhì)粒pVAX-RDD相比較。該實驗的結(jié)果示于表3中。表3:攜帶RDD的質(zhì)粒與對照質(zhì)粒的C9抗增殖活性的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>與pORTlaCMV對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，pORT-RDD轉(zhuǎn)染顯著地抑制了C9黑素瘤細(xì)胞增殖達(dá)65.5%(學(xué)生氏t檢驗ρ<0.001)。該抑制是極具可再現(xiàn)性的，因為對于兩個實驗都獲得該相同的結(jié)果。在相同的條件下，PVAX-RDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不能抑制C9增殖。DNA重懸浮緩沖液的作用將pORT-RDD質(zhì)粒懸浮于IOmMTris-ImMEDTA-150mMNaCl,pH7.5(TENaCl)中。為了了解EDTA是否可干擾RDD活性，測定在TENaCl或生理血清(physiologicserum)(NaCl0.9%)中制備的pORT-RDD質(zhì)粒的抗增殖活性。表4使用兩種DNA重懸浮緩沖液進(jìn)行的C9增殖測定<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>無論對于哪一種重懸浮緩沖液，都獲得了C9細(xì)胞的強增殖抑制。差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性(p=0.291，學(xué)生氏t檢驗)。這表明Tris和EDTA都不干擾AMEP的活性。在pORT-RDD轉(zhuǎn)染后B16F10增殖的抑制為了證明pORT-RDD對黑素瘤細(xì)胞的抗增殖活性，用基于pORTlaCMV的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠B16F10黑素瘤細(xì)胞，然后進(jìn)行MTT增殖測定。表5:B16F10增殖測定(兩個實驗的平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>與pORTlaCMV對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，pORT-RDD轉(zhuǎn)染顯著地抑制了B16F10細(xì)胞的增殖達(dá)74.5%(學(xué)生氏t檢驗ρ<0.001)。綜合起來，這些結(jié)果證明pORT-RDD質(zhì)粒比經(jīng)典的pVAX-RDD質(zhì)粒更有效地誘導(dǎo)AMEP肽的強產(chǎn)生和分泌，以及抑制黑素瘤細(xì)胞(人C9和鼠B16F10)的增殖。此外，該抗增殖效應(yīng)不依賴于用于制備DNA的重懸浮緩沖液。TENacl緩沖液中包含的EDTA不干擾該活性。實施例3單次pORT-RDD瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移在皮下B16F10黑素瘤中的抗腫瘤功效的研究本研究的目的是調(diào)查與空對照pORTlaCMV載體相比，新型pORT-RDD質(zhì)粒在預(yù)先建立的皮下B16F10腫瘤中的單次有療效的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移的功效。通過腫瘤體積的監(jiān)控來評估對腫瘤生長的效應(yīng)?！げ牧虾头椒?xì)胞系和培養(yǎng)條件將B16F10黑素瘤細(xì)胞在37°C下于增濕的5%CO2大氣中培養(yǎng)于補充有10%的熱滅活的胎牛血清、1.5g/l碳酸氫鈉和抗生素(100UI/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素；InvitrogenGibco,ref15140—122)的Dulbecco，sModifiedEagles'Medium+GlutaMAX中。從單個小瓶產(chǎn)生多瓶冷凍的細(xì)胞并且將其保持在液氮中。取決于匯合率(confluenceratio)，如實施例2中所描述每周傳代培養(yǎng)細(xì)胞兩次或三次。動物由Janvier(LeGenest-St-Isle，F(xiàn)rance)提供雌性6至8周齡的C57BL/6小鼠。所有動物實驗按照動物實驗的倫理指導(dǎo)原則(Directiven°86/609CEE)來進(jìn)行并且經(jīng)BioAlliancePharma倫理委員會批準(zhǔn)。在腫瘤細(xì)胞植入前使動物在進(jìn)行實驗的區(qū)域適應(yīng)新環(huán)境，進(jìn)行至少4天。將動物在溫度(21°C)、光周期(12h光照/12h黑暗)和空氣交換(airexchange)(每小時12次換氣(airrenewal))的受控條件下供養(yǎng)于室內(nèi)。濕度保持在30至70%之間。在無特定病原體條件下供養(yǎng)動物，持續(xù)監(jiān)控室溫和濕度。統(tǒng)計分析使用SigmaStat3.1軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計分析。為了比較兩個組，當(dāng)成功地通過正態(tài)性和等方差性檢驗(normalityandequalvariancetest)時，軟件運行學(xué)生氏t檢驗。如果這些檢驗中的一個檢驗失敗，軟件運行Marm&Whitney秩和檢驗。對于每一個分析，用戶自由接受每一個統(tǒng)計檢驗。P值<0.05被認(rèn)為是顯著的?！嶒炑芯吭O(shè)計和治療細(xì)胞注射在注射入小鼠之前，使B16F10細(xì)胞保持在培養(yǎng)物中直至5代。在注射當(dāng)天前48h傳代培養(yǎng)細(xì)胞。用PBS漂洗亞匯合的B16F10細(xì)胞，然后將其與胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起溫育直到細(xì)胞脫落。加入新鮮培養(yǎng)基，以1200rpm離心細(xì)胞，進(jìn)行5分鐘，然后將其重懸浮于25ml新鮮培養(yǎng)基中。在0.04%臺盼藍(lán)中對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)用于成活力定量(viabilityquantification)0將細(xì)胞離心，然后重懸浮于足夠體積的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100μ1中具有IO6個B16F10細(xì)胞(在PBS緩沖液中細(xì)胞死亡率更高)。通過SC途徑在小鼠的右脅腹上注射ΙΟΟμ1細(xì)胞。在細(xì)胞注射的前一天，先用電動剃刀剃除小鼠脅腹上的毛。質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)移(第O天)在細(xì)胞接種后7天首次檢查腫瘤體積。此時，一些腫瘤已良好地建立，然后將它們用于此類第一組。為了在第O天最大限度地限制腫瘤體積的差異性，對第一組14只小鼠(p0RTlaCMV，7只和p0RT_RDD，7只)進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，兩天后，對第二組7只小鼠(p0RTlaCMV，3只和pORT-RDD，4只)進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒的稀釋每個腫瘤施用在50μ1無菌緩沖液中的50μg質(zhì)粒。如下在無菌條件下用無菌緩沖液(IOmMTris,ImMEDTA，0.9%NaCl，pH7.5)進(jìn)行質(zhì)粒的稀釋第一組:p0RTIaCMV用436μ1TE-NaCl稀釋364μ1的2.2μg/μ1的pORTIaCMV；pORT-RDD用392μ1TE-NaCl稀釋408μ1的1.96μg/μ1的pORT-RDD。第二組P0RTlaCMV由于少量的對照質(zhì)粒，將用于第一組的稀釋物在_20°C下保持冷凍，并且重新用于第二組注射；pORT-RDD用196μ1TE-NaCl稀釋204μ1的1.96μg/μ1的pORT-RDD。研究設(shè)計給攜帶皮下B16F10腫瘤的C57BL/6雌性小鼠分配下列組號表6被治療的小鼠的組<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在麻醉前測量腫瘤。通過腹膜內(nèi)注射0.2ml包含0.5ml甲苯噻嗪2%(Rofflpun，Bayer)、2.Oml氯胺酮50mg/ml(Ketalar；Panpharma,Fougeres,France)、7·5mlNaCl0.9%的氯胺酮/甲苯噻嗪混合物來麻醉動物。電轉(zhuǎn)移治療由50μg的在50μ1TE-NaCl緩沖液中的質(zhì)粒的單次瘤內(nèi)注射組成。選擇該劑量是因為其相應(yīng)于實驗室和電轉(zhuǎn)移文獻(xiàn)中通常使用的劑量。將導(dǎo)電膏(Conductivegel)用于腫瘤上。注射后立即按照下列方案使用Cliniporator裝置，通過在腫瘤上使用相距5mm的兩個不銹鋼板電極來應(yīng)用電脈沖-HV=1500V/cm,100μs,IHz,1個脈沖-間歇=IOOOms-LV=140V/cm,400ms,1個脈沖。腫瘤體積的監(jiān)控和腫瘤生長的研究在電轉(zhuǎn)移后第0、2、5、7、9、12和14天，通過用數(shù)字測徑器測量兩個垂直直徑來監(jiān)控腫瘤大小。按照公式(長度+寬度/2)3Χπ/6來計算腫瘤體積。在實驗過程中未對小鼠稱重。在實驗過程中記錄死亡的小鼠?；谝詍m3表示的腫瘤體積或V/V0比(即第D天的體積/第0天的體積)已建立了腫瘤生長曲線。如下計算腫瘤生長的抑制抑制100X[1-(治療組的腫瘤體積/對照組的腫瘤體積)]?！そY(jié)果死亡率在實驗過程中觀察到自然死亡(第7天P0RTlaCMV，籠子_1；pORT-RDD,籠子_2；和pORT-RDD，籠子-3)。該死亡率與治療沒有明確的聯(lián)系。經(jīng)常在B16F10模型中觀察到自然死亡。腫瘤體積的監(jiān)控所有腫瘤的腫瘤體積結(jié)果概述于表7中和示于圖4中。以mm3表示的所有腫瘤的腫瘤體積的監(jiān)控Λ_O_2_5_7_9_1214PORTlaCMV平·59.2687.93178.02279.02338.89640.13864.31_SD14.1331.56103.36201.88216.33454.42571.78pORT-RDD平■56.0380.99104.11130.28221.48409.07642.71_SD18.6516.5240.9129.9776.86132.96182.96揪'J%_7.941.553.334.636.125.6SigmaStatStudentρ=_0.6620.5290.0410.0260.1440.1630.285在治療的當(dāng)天，經(jīng)pORTlaCMV治療的腫瘤大小在40.19mm3至84.76mm3(平均體積59.26士14.13mm3)之間，經(jīng)pORT-RDD治療的腫瘤大小在33.51mm3至89.51mm3(平均體積56.03士18.65mm3)之間。在第7天，在pORTlaCMV對照組中，腫瘤體積達(dá)到279.02士201.88mm3，在pORT-RDD治療組中腫瘤體積達(dá)到130.28士29.97mm3，從而觀察到53%的抑制(學(xué)生氏t檢驗ρ=0.026)。在第14天，在pORTlaCMV對照組中，腫瘤體積達(dá)到864.31士571.78mm3,在pORT-RDD治療組中腫瘤體積達(dá)到642.71士182.96mm3，相應(yīng)于26%的腫瘤生長抑制(非顯著性的，學(xué)生氏t檢驗ρ=0.285)。在之前的研究中，按照相同的方案，對于在第0天<IOOmm3的腫瘤，在電轉(zhuǎn)移后14天，pVAX-RDD和pBi-RDD質(zhì)粒經(jīng)顯示分別抑制B16F10腫瘤的生長達(dá)20%和29%，但無任何統(tǒng)計學(xué)顯著性。在電轉(zhuǎn)移后7天，抑制小于19%。只針對小腫瘤的腫瘤體積在治療的當(dāng)天在選擇小腫瘤后也進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果概述于表8中和顯示于圖6中。對于體積<50mm3的腫瘤，以mm3表示的腫瘤體積的監(jiān)控Λ___O2_5_7_9_1214pORTlaCMV__平_50.1969.05144.07219.74308.59698.47971.85__SD7.6325.2289.06174.49212.44527.21648.95pORT-RDD__平M48.0575.6181.00121.42199.61363.18590.63__SD11.4911.0220.7629.8151.59107.45155.21鄉(xiāng)姊___43.844.735.348.039.2SigmaStatStudent_0.7050.5450.0950.1680.2130.1260.158經(jīng)pORTlaCMV治療的腫瘤大小在40.19mm3至59.73mm3(平均體積50.19士7.63mm3)之間，經(jīng)pORT-RDD治療的腫瘤大小在33.51mm3至65.45mm3(平均體積48.05士11.49mm3)之間。在第7天，在pORTlaCMV對照組中，腫瘤體積達(dá)到219.74士174.49mm3，在pORT-RDD治療組中腫瘤體積達(dá)到121.42士29.81mm3。在第14天，在pORTlaCMV對照組中，腫瘤體積達(dá)到971.85士648.95mm3,在pORT-RDD治療組中腫瘤體積達(dá)到590.63士155.21mm3。pORT-RDD瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移在電轉(zhuǎn)移后抑制B16F10黑素瘤腫瘤的生長達(dá)45%(第7天)和39%(第14天)。但該差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性。只針對小腫瘤的V/V0比為了減少第0天的腫瘤體積的差異性的影響，將結(jié)果以V/V0比(第D天的體積/第0天的體積)表示。結(jié)果示于表9和圖7中。對于體積彡50mm3的腫瘤的V/V0比<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在第7天，在pORTlaCMV對照組中，腫瘤體積比達(dá)到4.69士3.08mm3,在pORT-RDD治療組中達(dá)到2.55士0.39mm3。在第14天，在pORTlaCMV對照組中，腫瘤體積比達(dá)到20.95士11.87mm3,在pORT-RDD治療組中達(dá)到12.54士3.01mm3。如原始數(shù)據(jù)(表9)中所描述的，在第5天至第14天保持至少40%的腫瘤生長抑制，在第12天具有50%的最大抑制。在第9和12天獲得統(tǒng)計學(xué)顯著性。綜合起來，這些結(jié)果表明pORT-RDD質(zhì)粒顯得比之前的質(zhì)粒更有效，特別是在轉(zhuǎn)移后7天。如果腫瘤在治療的當(dāng)天是小腫瘤(33.51mm3至65.45mm3)，那么該抑制效應(yīng)更重要。pORT-RDD瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移在電轉(zhuǎn)移后抑制B16F10腫瘤的生長達(dá)45%(第7天)和39%(第14天)。但該差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性。該最后一點可通過每組小鼠的減少的數(shù)目(pORTlaCMVη=6，和pORT-RDDn=7)來解釋。此外，觀察到的pORT-RDD治療組的減少的標(biāo)準(zhǔn)差很可能與RDD因子的抗腫瘤效應(yīng)相關(guān)。事實上，已大體上清楚，抗血管生成抗腫瘤因子對于小腫瘤更有效。因此，對于進(jìn)一步實驗，為了治療小的并且經(jīng)校準(zhǔn)的(calibrated)腫瘤，可能必須在早于接種后7天檢查腫瘤的體積。此外，在生理血清中制備B16F10細(xì)胞后觀察到高細(xì)胞死亡率。為了限制該細(xì)胞死亡率，可測定其他重懸浮緩沖液例如無血清培養(yǎng)基。然而，根據(jù)該第一實驗，可得出pORT-RDD質(zhì)粒瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移抑制預(yù)先建立在C57BL/6小鼠上的B16F10黑素瘤腫瘤的腫瘤生長，其功效比基于pBi和pVAX的載體更高。實施例4在皮下B16F10腫瘤中進(jìn)行pORT-RDD的單次瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移的劑量范圍的評估本研究的目的是調(diào)查與媒介物電穿孔相比，不斷增加的劑量的pORT-RDD質(zhì)粒在皮下預(yù)先建立的B16F10黑素瘤腫瘤中進(jìn)行單次瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移后的抗腫瘤功效。為此，腫瘤體積包括在30至50mm3之間，治療6個組1)媒介物(IOmMTrisUmMEDTA、0.9%NaCl、pH7.5無菌緩沖液)、2)25μg、3)50μg、4)100μg、5)200μg禾口6)400μg治療性pORT-RDD質(zhì)粒。在電轉(zhuǎn)移治療后監(jiān)控腫瘤體積至少14天?！嶒炑芯吭O(shè)計和治療細(xì)胞注射在注射入小鼠之前，將B16F10細(xì)胞保持在培養(yǎng)物中直至6代。在注射當(dāng)天前48h傳代培養(yǎng)細(xì)胞。用PBS漂洗亞匯合的B16F10細(xì)胞，然后將其與胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起溫育直至細(xì)胞脫落。加入新鮮培養(yǎng)基，以1200rpm離心細(xì)胞，進(jìn)行5分鐘，然后將其重懸浮于25ml新鮮培養(yǎng)基中。在0.04%臺盼藍(lán)中對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)用于成活力定量。將細(xì)胞離心，然后重懸浮于足夠體積的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100μ1中具有IO6個B16F10細(xì)胞。通過SC途徑在小鼠的右脅腹上注射100μ1細(xì)胞。在細(xì)胞注射的前一天，用電動剃刀剃除小鼠的脅腹上的毛。質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移在細(xì)胞接種后6天，將小鼠隨機分配至pORTlaCMV、pVAX或pORT-RDD組。以50μ1中25-50-100-200-400μg的量注射不斷增加的劑量的質(zhì)粒，從而導(dǎo)致不斷增加的濃度0.5-l-2-4-8mg/ml的質(zhì)粒制劑。研究設(shè)計當(dāng)腫瘤達(dá)到30至50mm3時，選擇C57B1/6小鼠進(jìn)行治療。然后在3個不同的日期中進(jìn)行治療，將準(zhǔn)備好的小鼠隨機分配入各治療組表10被治療的小鼠的組<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>在麻醉前測量腫瘤。通過腹膜內(nèi)注射0.2ml包含0.5ml甲苯噻嗪2%(RompUn,Bayer)、2.0ml氯胺酮50mg/ml(Ketalar；Panpharma,Fougeres,France)、7.5mlNaCl0.9%的氯胺酮/甲苯噻嗪混合物來麻醉動物。電轉(zhuǎn)移治療由不斷增加的劑量的在50ylTE-NaCl緩沖液中的質(zhì)粒的瘤內(nèi)注射組成。將導(dǎo)電膏用于腫瘤上。注射后立即按照下列方案(之前用于PVAX-RDD瘤內(nèi)實驗)使用Cliniporator裝置，通過在腫瘤上使用相距5mm的兩個不銹鋼板電極來應(yīng)用電脈沖-HV=1500V/cm,100us,1Hz,1個脈沖-間歇=1000ms-LV=140V/cm,400ms,1個脈沖。動物監(jiān)控和殺死腫瘤體積的監(jiān)控在電穿孔治療后，在治療后第0、2、5、7、9、12、14天，通過用數(shù)字測徑器測量兩個垂直直徑(最長和最大的直徑)來監(jiān)控腫瘤大小。按照公式(長度+寬度/2)3Xji/6來計算腫瘤體積。基于以mm3表示的腫瘤體積已建立了腫瘤生長曲線。如下計算腫瘤生長的抑制抑制100X[1-(治療組的腫瘤體積/對照組的腫瘤體積)]。體重的監(jiān)控在細(xì)胞注射前一天記錄動物的體重，然后在與進(jìn)行腫瘤體積監(jiān)控相同的日期記錄動物的體重。自然死亡的監(jiān)控記錄實驗過程中的自然死亡。在實驗過程中，通過C02吸入殺死顯示痛苦(惡病質(zhì)、虛弱和難以運動)的體征并且比它們的初始體重減少超過20%的動物。在實驗結(jié)束時(第14天)通過C02吸入殺死小鼠。統(tǒng)計檢驗使用SigmaStat3.1軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計分析。軟件運行學(xué)生氏t檢驗來比較兩個組，運行AN0VA檢驗來比較所有組。p值<0.05被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果死亡率在實驗過程中觀察到自然死亡，殺死顯示痛苦體征的動物。在第14天，存活率是緩沖液組中為22.2%(9只中7只死亡/被殺死)、25iig組中為55.6%(9只中4只死亡/被殺死)、50iig組中為66.7%(9只中3只死亡/被殺死)、100iig組中為90%(10只中1只死亡/被殺死)、200ug組中為77.8%(9只中2只死亡/被殺死)、400ug組中為77.8%(9只中2只死亡/被殺死)。該死亡率與腫瘤的發(fā)展相關(guān)。未經(jīng)治療的和低劑量治療的腫瘤都顯示最高的死亡率。體重的改變在組之間的體重上未觀察到顯著的差異。第12天的緩沖液組中的少量減少可通過當(dāng)時被殺死的一只小鼠的體重的損失來解釋。腫瘤體積的監(jiān)控的比較兩個操作者在監(jiān)控的每一天測量各腫瘤的兩個垂直直徑。在由每一個操作者測量的腫瘤體積之間觀察到非常小的差異。治療對腫瘤體積的效應(yīng)將來自一個操作者的腫瘤體積的測量用于分析。結(jié)果示于圖8中。與對照腫瘤相比，觀察到經(jīng)pORT-RDD治療的腫瘤的生長的劑量依賴性抑制。抑制在第7天最大，特別地對于200yg的劑量具有80.3%的抑制表11經(jīng)pORT-RDD治療的腫瘤的生長的劑量依賴性抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在第7天后，所有腫瘤再次生長，特別是經(jīng)對照、25和50yg治療的腫瘤。由于小鼠數(shù)目太少(自第12天開始觀察到高死亡率)，對照腫瘤生長曲線在第14天減少。統(tǒng)計分析(單因素方差分析)顯示對于pORT-RDD治療組在第5、7和9天抑制高度顯著(P<0.001)。通過學(xué)生氏t檢驗進(jìn)行的兩兩比較(two-and-twocomparison)顯示在100、200和400ug組之間不存在統(tǒng)計學(xué)顯著性。在第12天，由于腫瘤的再生長，在單因素方差分析后獲得統(tǒng)計學(xué)顯著性。但是，學(xué)生氏t檢驗分析顯示對于50和200yg劑量的比較，達(dá)到了統(tǒng)計學(xué)顯著性。在用于之前研究的初始方案中，施用單劑量的50yg的pORT-RDD質(zhì)粒。這導(dǎo)致最多50%的腫瘤生長抑制。已決定估計不斷增加的劑量的質(zhì)粒的抗腫瘤效應(yīng)。綜合起來，pORT-RDD質(zhì)粒的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移以劑量依賴的方式顯著抑制在C57BL/6小鼠上預(yù)先建立的B16F10黑素瘤腫瘤的生長。200iig的劑量表現(xiàn)為治療50mm3腫瘤的最有效劑量，因為與緩沖液、25和50iig組相比較，我們獲得最高的抑制和最好的顯著性。該劑量相應(yīng)于4ug/mm3腫瘤。此外，治療不誘導(dǎo)任何毒性效應(yīng)，即使以最高的劑量(400yg)治療時亦如此，因為死亡率和體重不受影響。實施例5pORT-RDD質(zhì)粒在皮下B16F10腫瘤中的重復(fù)瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移的評估實施例4中描述的劑量范圍實驗顯示與25、50、100和400iig的劑量相比，200iigpORT-RDD質(zhì)粒的單次瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移是最有效的劑量，其在電轉(zhuǎn)移后第7天對皮下黑素瘤B16F10腫瘤的生長具有大約80%的抑制(p<0.001)。在該時間后，腫瘤再次生長。這些結(jié)果促使估量重復(fù)治療對腫瘤生長的益處。因此，本研究的目的是調(diào)查在第0天和第7天的重復(fù)治療的抗腫瘤功效。治療由在第0天和第7天的200ugpORT-RDD質(zhì)粒在預(yù)先建立的B16F10黑素瘤腫瘤中的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移組成，所述腫瘤的體積在第一次治療時包括在30至50mm3之間。已確定三組小鼠1)媒介物(10mMTrisUmMEDTA、0.9%NaCl、pH7.5無菌緩沖液)、2)pORT-RDD單次注射、3)pORT-RDD重復(fù)注射。實驗研究設(shè)計和治療細(xì)胞注射在注射入小鼠之前，將B16F10細(xì)胞保持在培養(yǎng)物中直至5代。在注射的當(dāng)天前48h傳代培養(yǎng)細(xì)胞。在細(xì)胞接種的當(dāng)天，用PBS漂洗亞匯合的B16F10細(xì)胞，然后將其與胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起溫育直至細(xì)胞脫落。加入新鮮培養(yǎng)基，以1200rpm離心細(xì)胞，進(jìn)行5分鐘，然后將其重懸浮于25ml新鮮培養(yǎng)基中。在0.04%臺盼藍(lán)中對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)用于成活力定量。將細(xì)胞離心，然后重懸浮于足夠體積的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100u1中具有106個B16F10細(xì)胞。通過SC途徑在小鼠的右脅腹上注射100ill細(xì)胞。在細(xì)胞注射的前一天，用電動剃刀剃除小鼠脅腹上的毛。質(zhì)粒的制備以50ill注射200ug的質(zhì)粒，導(dǎo)致通過乙醇沉淀pORT-RDD質(zhì)粒，然后將其重懸浮于10mMTris,lmMEDTA,0.9%NaCl,pH7.5無菌緩沖液來產(chǎn)生0.4yg/yl的質(zhì)粒制劑。研究設(shè)計研究包括50只在它們的右脅腹上攜帶30至50mm3的腫瘤的C57BL/6雌性小鼠。隨機確定治療分配并且治療分配如下表12被治療的小鼠的組CN101802186A說明書29/40頁<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*由于太大的腫瘤大小，對于對照組不進(jìn)行第二次治療。在第7天，不再可能將腫瘤插入板電極之間。電轉(zhuǎn)移方案通過腹膜內(nèi)注射0.2ml包含()5ml甲苯噻嗪2%(RompUIl，Bayer)、2.0ml氯胺麗50mg/ml(Ketalar；Panpharma,Fougeres,France)禾口7.5mlNaCl0.9%的氣胺麗/甲苯噻嗪混合物來麻醉動物。第0和7天的治療由200iig的在50illTE-NaCl緩沖液中的質(zhì)粒的瘤內(nèi)注射組成。將導(dǎo)電膏用于腫瘤上。注射后立即按照下列方案使用Cliniporator裝置，通過在腫瘤上使用相距5mm的兩個不銹鋼板電極來應(yīng)用電脈沖-HV=1500V/cm,100us,1Hz,1個脈沖-間歇=1000ms-LV=140V/cm,400ms,1個脈沖。第0天相應(yīng)于電轉(zhuǎn)移治療的第1天。動物的監(jiān)控和殺死通過用數(shù)字測徑器測量兩個垂直直徑來監(jiān)控腫瘤大小。按照公式(長度+寬度/2)3Xji/6來計算腫瘤體積。如下計算腫瘤生長的抑制抑制100X[1-(治療組的腫瘤體積/對照組的腫瘤體積)]。結(jié)果首先，證明了使用pORT-RDD質(zhì)粒的兩次瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移是安全的并且被動物良好地耐受，因為未觀察到對小鼠體重和死亡率的影響。最重要的是，在第12天，重復(fù)的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)了與媒介物組(稱為TE)相比，97%的腫瘤生長抑制，和與pORT-RDD單次組(稱為pORT-RDDIX)相比，76.7%的抑制，如圖9和表13中顯示的。表13腫瘤生長抑制的百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>此外，完全的腫瘤消退在第9天開始出現(xiàn)，在第21天達(dá)到40%的完全消退(表14)。這些消退在第一次治療后保持達(dá)80天。表14完全腫瘤消退的百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>綜合起來，最佳的治療方案可確定為在第0和7天使用200yg(對于50mm3-腫瘤)的最佳pORT-RDD劑量進(jìn)行的兩次連續(xù)瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移。實施例6皮下B16F10黑素瘤腫瘤中單次pORT-RDD瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移的抗腫瘤和抗血管生成功效的研究本發(fā)明的目的是調(diào)查與媒介物相比，pORT-RDD質(zhì)粒在預(yù)先建立的皮下B16F10腫瘤中的單次有療效的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移的功效。通過使用多普勒超聲檢查進(jìn)行的腫瘤體積和腫瘤血管監(jiān)控來估量對腫瘤生長的作用。材料和方法細(xì)胞系和培養(yǎng)條件將B16F10黑素瘤細(xì)胞在37°C下于增濕的5%C02大氣中培養(yǎng)于補充有10%的熱滅活的胎牛血清、1.5g/l碳酸氫鈉和抗生素(100UI/ml青霉素和lOOyg/ml鏈霉素；InvitrogenGibco,ref15140—122)的Dulbecco，sModifiedEagles'Medium+GlutaMAX中。動物由Janvier(LeGenest-St-Isle，F(xiàn)rance)提供雌性6至8周齡的C57BL/6小鼠。所有動物實驗按照動物實驗的倫理指導(dǎo)原則(Directiven°86/609CEE)來進(jìn)行并且由BioAlliancePharma倫理委員會批準(zhǔn)。在腫瘤細(xì)胞植入前使動物在進(jìn)行實驗的區(qū)域適應(yīng)新環(huán)境至少4天。將動物在溫度(21°C)、光周期(12h光照/12h黑暗)和空氣交換(每小時12次換氣)的受控條件下供養(yǎng)在室內(nèi)。濕度保持在30至70%之間。統(tǒng)計檢驗使用SigmaStat3.1軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計分析。為了比較兩個組，當(dāng)成功地通過正態(tài)性和等方差性檢驗時，軟件運行學(xué)生氏t檢驗。如果這些檢驗中的一個檢驗失敗，軟件運行Marm&Whitney秩和檢驗。對于每一個分析，用戶自由接受每一個統(tǒng)計檢驗。p值<0.05被認(rèn)為是顯著的。實驗研究設(shè)計和治療細(xì)胞注射在注射的當(dāng)天前48h傳代培養(yǎng)B16F10細(xì)胞。用PBS漂洗亞匯合的B16F10細(xì)胞，然后將其與胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起溫育直到細(xì)胞脫落。加入新鮮培養(yǎng)基，以1200rpm離心細(xì)胞，進(jìn)行5分鐘，然后將其重懸浮于25ml新鮮培養(yǎng)基中。在0.04%臺盼藍(lán)中對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)用于成活力定量。將細(xì)胞離心，然后重懸浮于足夠體積的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100u1中具有106個B16F10細(xì)胞。通過SC途徑在小鼠的右脅腹上注射100ill細(xì)胞。在細(xì)胞注射的前一天，用電動剃刀剃除小鼠的脅腹上的毛。質(zhì)粒的制備以50ill注射200yg質(zhì)粒，導(dǎo)致通過乙醇沉淀pORT-RDD質(zhì)粒，然后將其重懸浮于10mMTris，ImMEDTA，0.9%NaCl,pH7.5無菌緩沖液中來產(chǎn)生4.0ug/u1的質(zhì)粒制劑。研究設(shè)計給攜帶皮下B16F10腫瘤的C57BL/6雌性小鼠分配下列組號表15被治療的小鼠的組<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)移(第0天)通過腹膜內(nèi)注射0.2ml包含()5ml甲苯噻嗪2%(Rompun,Bayer)、2.0ml氯胺酮50mg/ml(Ketalar；Panpharma,Fougeres,France)、7.5mlNaCl0.9%的氯胺酮/甲苯噻嗪混合物來麻醉動物。治療由200iig的在50illTE-NaCl緩沖液中的質(zhì)粒的單次瘤內(nèi)注射組成。將導(dǎo)電膏用于腫瘤上。注射后立即按照下列方案使用Cliniporator裝置，通過在腫瘤上使用相距5mm的兩個不銹鋼板電極來應(yīng)用電脈沖-HV=1500V/cm,100us,1Hz,1個脈沖-間歇=1000ms-LV=140V/cm,400ms,1個脈沖。腫瘤體積的監(jiān)控和腫瘤生長的研究使用配備兩個線性探針(用于B模式和能量多普勒超聲檢查(更好的靈敏度和分辨率)的14MHz探針和在VRI模式(血管識別成像)中用于使用造影劑(contrastagent)的灌注檢查的9MHz探針)的Aplio超聲裝置(Toshiba)進(jìn)行所有監(jiān)控。通過在第0天腹膜內(nèi)注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物以及通過在第1、2、3、4和7天進(jìn)行異氟烷吸入來麻醉小鼠。腫瘤體積的監(jiān)控通過在B模式中測量腫瘤的寬度、長度和深度來測定腫瘤的體積。B模式超聲允許根據(jù)灰度等級描繪器官的形態(tài)和質(zhì)地。在這樣的B模式圖像上，可測量腫瘤的大小，并且可根據(jù)低回聲區(qū)的范圍定性鑒別壞死。超聲測量在于使用14MHz線性探針掃描時發(fā)現(xiàn)最大的橫向和縱向腫瘤截面。針對小鼠身體，確定橫向和縱向截面。在縱向截面上測量長度，在橫向截面上測量寬度和深度。使用測徑器直接在聲譜儀(sonograph)上進(jìn)行這些測量。記錄和打印最大橫向和縱向掃描。按照公式以mm3表示的體積=(長度X寬度X深度)/2來計算腫瘤體積。腫瘤血管的數(shù)目在多普勒能量模式中使用14MHz探針在橫向和縱向截面上掃描各腫瘤，以將血管的數(shù)目計算入腫瘤體積。多普勒能量模式在色度上(與B模式圖像疊加)顯示了由血管腔中循環(huán)的紅細(xì)胞反散射的超聲能量。記錄相應(yīng)于通過連續(xù)探針位移(probedisplacement)進(jìn)行的腫瘤掃描的視頻序列(videosequence)，從而允許對整個腫瘤體積進(jìn)行3D量化。由操作者事后審查這些序列以測定瘤內(nèi)血管的數(shù)目。當(dāng)這些像素重復(fù)發(fā)現(xiàn)于顯示血流的連續(xù)追蹤觀察的連續(xù)腫瘤截面中時，這些彩色像素群(Colorpixelclot)被認(rèn)為是瘤內(nèi)血管的標(biāo)志。然后將血管的平均數(shù)目計算為在橫向截面和縱向截面中計數(shù)的血管的平均數(shù)目。結(jié)果腫瘤體積的監(jiān)控與媒介物組相比，腫瘤體積被pORT-RDD治療顯著抑制達(dá)77.5%(第4天)和89.2%(第7天)(學(xué)生氏t檢驗，分別地p<0.001和p=0.006)(圖10)。血管的監(jiān)控與媒介物組相比，腫瘤血管的數(shù)目被pORT-RDD治療顯著抑制達(dá)70.(第4天)和78.(第7天)(學(xué)生氏t檢驗，分別地p<0.001和p=0.001)(圖11)。綜合起來，這些結(jié)果表明pORT-RDD的瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移顯著抑制腫瘤血管的數(shù)目達(dá)78%，這與腫瘤生長的抑制相關(guān)。這些結(jié)果確認(rèn)了解聯(lián)蛋白片段對內(nèi)皮細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞的雙重活性。實施例7用于表征pORT-RDD質(zhì)粒批次的體外功效測定法的開發(fā)黑素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的增殖測定法本研究的目的是開發(fā)基于使用不斷增加的劑量的pORT-RDD質(zhì)粒(也稱為BA015-VCC-004)和LipofectaminePlus方案對黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)染的體外功效測定法。在轉(zhuǎn)染后96小時用MTT試劑顯示測定，以測定存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。材料和方法poRT-RDD質(zhì)粒在培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中的宿主株系DH1-0RT中產(chǎn)生pORT-RDD質(zhì)粒，然后如之前所述純化質(zhì)粒。將質(zhì)粒配制于10mMTrisUmMEDTA、0.9%NaCl、pH7.5中，然后在_20°C下保持冷凍。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件將人C9黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)于補充有10%的熱滅活的胎牛血清(InvitrogenGibco,ref10270-106)白勺Dulbecco’sModifiedEagles'Medium(DMEM+GlutaMAX,InvitrogenGibco,ref61965-026)中。將B16F10鼠黑素瘤細(xì)胞(ATCCCRL-6475)培養(yǎng)于補充有10%的熱滅活的胎牛血清、1.5g/l碳酸氫鈉(InvitrogenGibco,ref25080-060)的Dulbecco，sModifiedEagles'Medium+GlutaMAX中。將人451Lu黑素瘤細(xì)胞(ATCCCRL-2813)培養(yǎng)于2%腫瘤培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基包含含有1.5g/l碳酸氫鈉(InvitrogenGibco,Catno.25080-060)的MCDB153培養(yǎng)基(Sigma,M7403)和含有2mML-谷氨酰胺(Invitrogen，Catno.25030-024)的Leibovitz，sL-15培養(yǎng)基(Invitrogen，Catno.11415-049)的41的混合物，并且補充有0.005mg/ml牛胰島素(Sigma，ref.I0516-5ML)、1.68mMCaCl2(Cambrex,Catno.CC-4202)和2%的熱滅活的胎牛血清(Invitrogen，Catno.10270-106)。從單個小瓶產(chǎn)生多瓶冷凍的細(xì)胞，并且將其保持在液氮中。將細(xì)胞在37°C下于增濕的5%C02大氣中進(jìn)行每周2次的傳代培養(yǎng)(對于C9細(xì)胞稀釋度為110，對于B16F10細(xì)胞稀釋度為115，以及對于451Lu細(xì)胞稀釋度為1:4)。關(guān)于傳代培養(yǎng)，除去培養(yǎng)基，用PBS漂洗，然后加入2ml(對于75cm2培養(yǎng)瓶)的胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)。讓培養(yǎng)瓶在室溫下靜置直至細(xì)胞脫離。加入新鮮培養(yǎng)基，以1200rpm離心5分鐘，然后抽吸出培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞分配入新的培養(yǎng)瓶。轉(zhuǎn)染和增殖測定法在轉(zhuǎn)染的前一天，用每孔15000個B16F10細(xì)胞、30000個C9細(xì)胞或30000個451Lu細(xì)胞(于500yl中)準(zhǔn)備24孔多孔板。在轉(zhuǎn)染的當(dāng)天(涂板后的第一天)，對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)以確認(rèn)每孔的細(xì)胞數(shù)目(至少前一天涂板的細(xì)胞數(shù)目)。細(xì)胞應(yīng)當(dāng)處于大約50%的匯合。在無血清培養(yǎng)基:DMEM(Invitrogen,Catno.61965-026)(對于B16F10和C9細(xì)胞)和Opti-MEM(Invitrogen,Catno.51985-026)(對于451Lu細(xì)胞)中制備轉(zhuǎn)染樣pBFIo轉(zhuǎn)染不斷增加的劑量的pORT-RDD質(zhì)粒(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8、0.9、1.0、1.5和2.0iig/孔)，每個條件4個孔。對于所有DNA劑量，從單個DNA溶液(批次的110稀釋物)制備樣品。2u1Lipofectamine/5u1試劑Plus的比率被選擇用來限制細(xì)胞毒性并且不隨著不斷增加的量的DNA而改變(如廠商方案中推薦的)。按照下列方案在無菌的5ml聚苯乙烯圓底管中制備轉(zhuǎn)染混合物。通過用食指溫和地輕打管的底部兩次來進(jìn)行振蕩。-混合物制備平行地制備混合物混合物1:DNA/試劑Plus對于各實驗，制備只包含試劑PlusTM/Lipofectamine培養(yǎng)基的管作為不含DNA的Lipofectamine對照。MM混合物1(DNA/試劑Plus)的制備-一般方案<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表17描述了詳細(xì)的依賴于DNA體積的樣品制備(稀釋至0.196mg/mL的質(zhì)粒批次的實例)。首先導(dǎo)入培養(yǎng)基，然后加入試劑Plus，最后加入DNA。Mdl混合物1(DNA/試劑Plus)的制備-詳細(xì)的方案<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>混合物2:Lipofectamine對于所有轉(zhuǎn)染條件制備1個管表18混合物2的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>將各混合物在室溫下溫育15分鐘。然后將預(yù)先復(fù)合的DNA(混合物1)和稀釋的lipofectamine(混合物2)混合逐滴向混合物1中加入200u1混合物2(混合物1+2終體積=400u1)，從而制備復(fù)合的DNA。將具有不同量的DNA的每一個混合物在室溫下溫育15分鐘。用無血清培養(yǎng)基500U1/孔清洗細(xì)胞。向混合物1+2中加入1600u1無血清培養(yǎng)基，從而獲得用于4個孔的2ml的終體積。從細(xì)胞中除去無血清培養(yǎng)基，然后每孔加入500yl稀釋在無血清培養(yǎng)基中的混合物1+2。逐個條件地(4個孔接著4個孔地)進(jìn)行該步驟。在37°C、5%C02下精確地溫育細(xì)胞4小時。然后用每孔750u1完全培養(yǎng)基更換轉(zhuǎn)染混合物，并且將細(xì)胞在37°C、5%C02下溫育96小時?！涝矷lJ定的顯現(xiàn)(Proliferationassayrevelation)在96小時溫育后，用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑_2_基)_2，5_二苯基四氮唑溴化物)試劑顯現(xiàn)存活細(xì)胞。將細(xì)胞與250iUPBS和25iilMTT(Sigma)(5mg/ml)—起溫育。在于37°C下溫育2小時后，加入250ill裂解緩沖液(20%SDS-33%二甲基甲酰胺-2%醋酸-0.025NHC1-0.05NNaOH)，進(jìn)行過夜。將200yl的各樣品分配入96孔板以在570nm處讀取光密度。結(jié)果對于3個細(xì)胞系，觀察到劑量依賴性細(xì)胞增殖抑制(圖12、13和14)。實施例8:pORT-RDD質(zhì)粒的冷凍干燥和體外評估為了能夠注射高劑量的pORT-RDD質(zhì)粒，已開發(fā)了能夠提供pORT-RDD質(zhì)粒的高濃度溶液的冷凍干燥法。冷凍-干燥方案按照下列冷凍-干燥方案，以每5ml玻璃瓶2mg的量將配制于lOmMTrisUmMEDTA，pH7.5中的40mgpORT-RDD與2%甘露醇和葡萄糖一起冷凍干燥。表19pORT-RDD質(zhì)粒的冷凍-干燥方案溫度持續(xù)時間壓力冷凍*+20°C0-50°C1或2小時-50°C(板T°=-52°C)2小時+10°C3小時250iibars***升華*+10°C(板T°)12小時250iibars+20°C直至平衡250iiBars第二次干燥*+20°C(板T°)最長加小時50iiBars貯存+5°C通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行的質(zhì)粒分析通過加入無菌0.9%NaCl在無菌條件下將一瓶質(zhì)粒(2mg)重構(gòu)至2mg/ml。在1%瓊脂糖凝膠上分析1iigDNA樣品(非冷凍干燥的和冷凍干燥的質(zhì)粒)加水至10ii1加入1ill上樣緩沖液裝載在凝膠上并且遷移(平行地，1Kbladder,Invitrogen)將冷凍干燥的pORT-RDD重構(gòu)的質(zhì)粒的DNA質(zhì)粒形式與pORT-RDD非冷凍干燥的質(zhì)粒相比較。如圖15中所示，在相同量的冷凍干燥的和非冷凍干燥的質(zhì)粒遷移后在瓊脂糖凝膠上未觀察到可見的差異。不存在降解的跡象，存在等量的各質(zhì)粒形式。通過細(xì)胞增殖測定進(jìn)行的質(zhì)粒分析為了證明冷凍-干燥法不影響pORT-RDD的生物活性，按照實施例7中描述的最優(yōu)化的LipofectaminePlus方案，用不斷增加的劑量的冷凍干燥的和非冷凍干燥的pORT-RDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人C9和451Lu黑素瘤細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后96小時，通過MTT試劑顯現(xiàn)活細(xì)胞。結(jié)果示于圖16和17中。批次3相應(yīng)于非冷凍干燥的pORT-RDD質(zhì)粒，批次4相應(yīng)于冷凍干燥的質(zhì)粒。對于兩個細(xì)胞系在冷凍干燥的質(zhì)粒和非冷凍干燥的質(zhì)粒之間獲得相似的抑制特征。因此，證明了開發(fā)的冷凍-干燥法對于質(zhì)粒的完整性(因為沒有觀察到降解的跡象)和生物活性是安全的。冷凍干燥的和非冷凍干燥的批次經(jīng)顯示在轉(zhuǎn)染后展示相當(dāng)?shù)膶谒亓黾?xì)胞增殖的抑制作用。綜合起來，這些結(jié)果允許將冷凍_干燥法用于另外的pORT-RDD質(zhì)粒批次。實施例9冷凍干燥的pORT-RDD質(zhì)粒在皮下B16F10腫瘤中的單次瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移的評估本研究的目的是證明在其終制劑(于2%甘露醇-1%葡萄糖中冷凍_干燥的)中的并且以最佳的200ug的劑量施用的pORT-RDD質(zhì)粒，以與非冷凍干燥的質(zhì)粒相同的方式抑制B16F10腫瘤的生長。治療由媒介物(TE-NaCl緩沖液)、冷凍干燥的安慰劑(2%甘露醇-1%葡萄糖的冷凍-干燥的溶液)或200iigpORT-RDD質(zhì)粒(冷凍干燥的或非冷凍干燥的)在皮下預(yù)先建立的B16F10黑素瘤腫瘤中的單次瘤內(nèi)電轉(zhuǎn)移組成。為此目的，腫瘤體積包括在30至50mm3之間，并且治療三個組1)媒介物、2)以4mg/ml通過沉淀制備的200ugpORT-RDD和3)以4mg/ml制備的200ug冷凍干燥的pORT-RDD批次。在治療后的14天中監(jiān)控腫瘤的體積。實驗研究設(shè)計和治療細(xì)胞注射在注射的當(dāng)天前48h傳代培養(yǎng)B16F10細(xì)胞。在細(xì)胞接種的當(dāng)天，用PBS漂洗亞匯合的B16F10細(xì)胞，然后將其與胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco,ref25300-096)一起溫育直至細(xì)胞脫落。加入新鮮培養(yǎng)基，以1200rpm離心細(xì)胞，進(jìn)行5分鐘，然后將其重懸浮于25ml新鮮培養(yǎng)基中。在0.04%臺盼藍(lán)中對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)用于成活力定量。將細(xì)胞離心，然后重懸浮于足夠體積的0.9%NaCl(Versol,LaboratoireAguettant,Lyon,France)中以在100u1中具有106個B16F10細(xì)胞。通過SC途徑在小鼠的右脅腹上注射100ill細(xì)胞。在細(xì)胞注射的前一天，用電動剃刀剃除小鼠的脅腹上的毛。39質(zhì)粒的制備對于用非冷凍干燥的質(zhì)粒注射的組，以50ill注射200ugpORT-RDD質(zhì)粒，導(dǎo)致通過乙醇沉淀，然后重懸浮于10mMTris，lmMEDTA,0.9%NaCl,pH7.5無菌緩沖液來產(chǎn)生4.0ug/u1的質(zhì)粒制劑。對于用重構(gòu)的冷凍干燥的質(zhì)粒注射的組，用無菌0.9%NaCl以4yg/yl重構(gòu)需要的小瓶質(zhì)粒。研究設(shè)計研究包括50只在它們的右脅腹上具有30至50mm3的腫瘤的C57BL/6雌性小鼠。隨機決定治療分配，且治療分配如下表20被治療的小鼠的組<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>電轉(zhuǎn)移方案如之前所述麻醉動物。治療由200iig的在50illTE-NaCl緩沖液中的質(zhì)粒的單次瘤內(nèi)注射組成。將導(dǎo)電膏用于腫瘤上。注射后立即按照下列方案使用Cliniporator裝置，通過在腫瘤上使用相距5mm的兩個不銹鋼板電極來進(jìn)行電脈沖應(yīng)用-HV=1500V/cm,100us,1Hz,1個脈沖-間歇=1000ms-LV=140V/cm,400ms,1個脈沖第0天相應(yīng)于電轉(zhuǎn)移治療的當(dāng)天。動物的監(jiān)控和殺死通過用數(shù)字測徑器測量兩個垂直直徑來監(jiān)控腫瘤大小。按照公式(長度+寬度/2)3Xji/6來計算腫瘤體積。如下計算腫瘤生長的抑制抑制100X[1-(治療組的腫瘤體積/對照組的腫瘤體積)]。結(jié)果如圖18和表21中所示，冷凍干燥的和非冷凍干燥的質(zhì)粒顯著抑制B16F10腫瘤生長。對于冷凍干燥的和非冷凍干燥的質(zhì)粒獲得相似的腫瘤生長曲線。最重要的是，在所有實驗過程中，在非冷凍干燥的pORT-RDD和冷凍干燥的P0RT-RDD治療組之間未觀察到顯著的差異。表21腫瘤牛長抑制的百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>綜合起來，這些結(jié)果證明冷凍-干燥法對于pORT-RDD質(zhì)粒的生物活性是有效的。冷凍干燥的和非冷凍干燥的批次經(jīng)顯示展示相當(dāng)?shù)膶16F10皮下腫瘤生長的抑制效應(yīng)。實施例10:pORT-RDD質(zhì)粒的預(yù)防性肌內(nèi)電轉(zhuǎn)移對B16F10皮下腫瘤生長的功效的評估本研究的目的是測定當(dāng)pORT-RDD質(zhì)粒在腫瘤細(xì)胞的接種之前被電轉(zhuǎn)移入小鼠肌肉時，其對B16F10皮下腫瘤生長的潛在預(yù)防性作用。治療由在第1天在脛骨前肌中電轉(zhuǎn)移400ugpORT-RDD質(zhì)粒(每一個脛骨前肌中200i!g(于50iU中))組成。對照動物在相同的實驗條件下接受媒介物。然后，在電轉(zhuǎn)移治療(第0天)后的第一天將腫瘤細(xì)胞注射入C57B1/6J小鼠的右脅腹。定期監(jiān)控腫瘤的發(fā)生，然后定期監(jiān)控腫瘤體積。實驗研究設(shè)計和治療質(zhì)粒的制備以100ill的體積對每只小鼠注射400ug冷凍干燥的pORT-RDD質(zhì)粒的總量(每一個脛骨前肌中50ill)。通過加入注射用水將無菌冷凍-干燥瓶中的質(zhì)粒重構(gòu)至4mg/ml。在注射期間在4°C下保持質(zhì)粒懸浮液。研究設(shè)計研究包括30只C57BL/6J雌性小鼠。隨機確定治療分配，且治療分配如下表22被治療的小鼠的組<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在電穿孔之前，通過腹膜內(nèi)注射0.2ml氯胺酮/甲苯噻嗪混合物來麻醉動物。治療由在小鼠的每一個脛骨前肌中肌內(nèi)注射200iig的在50iU注射用水中的質(zhì)粒，之后立即進(jìn)行電穿孔組成。在腿上使用導(dǎo)電膏。注射之后立即按照下列方案使用Cliniporator裝置，通過在腿上使用相距5mm的兩塊不銹鋼板電極來進(jìn)行電脈沖應(yīng)用-HV=700V/cm(即350V),100us,1Hz,1個脈沖-間歇=1000ms-LV=100V/cm(即50V)，400ms,1個脈沖第1天相應(yīng)于電轉(zhuǎn)移治療的當(dāng)天。在肌內(nèi)電轉(zhuǎn)移的前一天，用電動剃刀剃除背部的毛。在治療的當(dāng)天，通過指刺紋(fingertattoo)鑒別小鼠，剃除腿上的毛。細(xì)胞注射在電轉(zhuǎn)移治療(第0天)后的第一天注射B16F10細(xì)胞。在注射入小鼠之前將B16F10細(xì)胞保持在培養(yǎng)物中直至8代。在注射的當(dāng)天前48-72h傳代培養(yǎng)細(xì)胞。在細(xì)胞接種的當(dāng)天，用PBS漂洗亞匯合的B16F10細(xì)胞，然后將其與胰蛋白酶-EDTA溶液(InvitrogenGibco，ref25300-096)一起在37°C下溫育直至細(xì)胞脫落。加入新鮮培養(yǎng)基，以1200rpm離心細(xì)胞，進(jìn)行5分鐘，然后將其重懸浮于50ml新鮮培養(yǎng)基中。在0.04%臺盼藍(lán)中對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)用于成活力定量。將細(xì)胞離心，然后重懸浮于足夠體積的0.9%NaCl中以在100u1中具有106個B16F10細(xì)胞。通過皮下途徑將100U1細(xì)胞注射入小鼠背部。動物的監(jiān)控和殺死在B16F10腫瘤細(xì)胞注射(第0天)后，定期監(jiān)控小鼠直至腫瘤可觸知(大約第5天至第7天)。然后，通過用數(shù)字測徑器測量兩個垂直直徑(最長和最大的直徑)來定期監(jiān)控腫瘤的體積。按照公式(長度+寬度/2)3XJi/6來計算腫瘤體積。如下計算腫瘤生長的抑制抑制100X[1-(治療組的腫瘤體積/對照組的腫瘤體積)]。結(jié)果^23腫瘤生長抑制的百分?jǐn)?shù)天678912141619pORT-RDD對媒介物75.9%35.1%35.9%34.5%25.1%28.7%33.6%28.7%P檢驗student0.07330.34430.14140.11350.10320.07560.00240.0315使用GraphPadPrism4.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。P值<0.05被認(rèn)為是顯著的。如圖19和20中以及表23中所示，400iigpORT-RDD質(zhì)粒的肌內(nèi)電轉(zhuǎn)移在第6天誘導(dǎo)了75.9%的腫瘤生長的抑制(與對照媒介物組相比)，并且從第7天開始直至研究結(jié)束誘導(dǎo)了大約25-35%的腫瘤生長的抑制。pORT-RDD治療組和對照組之間在第6天上的該差異可通過治療組中皮下腫瘤植入的延遲來解釋。事實上，在實驗的該時間點上，在小鼠中檢測到更少的腫瘤(具有更小的體積)。42治療組和對照組之間的差異在第16天(33.6%)和第19天(28.7%)是顯著的(p值<0.05)。此外，如表24中所顯示的，pORT-RDD質(zhì)粒治療顯著減慢了B16F10皮下腫瘤的生長。事實上，與對照組相比，治療組中達(dá)到1000mm3和2000mm3的腫瘤體積的平均時間減少。表24媒介物組和pORT-RDD質(zhì)粒治療組中1000mm3和2000mm3的皮下B16F10腫瘤的生長的平均時間<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>使用GraphPadPrism4.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。P值<0.05被認(rèn)為是顯著的。這些結(jié)果表明由于pORT-RDD的肌肉電轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的全身性AMEP能夠抑制B16F10腫瘤生長植入。以7天的間隔進(jìn)行的重復(fù)肌肉電轉(zhuǎn)移治療能夠增加該全身性保護(hù)效應(yīng)。權(quán)利要求包含編碼在強巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子控制下的完整或部分metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域或其衍生物的序列的pORT質(zhì)粒，其中所述序列被插入。2.權(quán)利要求1的質(zhì)粒，其包含編碼序列SEQIDNO1的metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域或其變體的序列，在所述變體中一個或多個核苷酸被從SEQIDNO:1置換、添加、缺失，所述變體與SEQIDN01具有至少80%的序列同一性并且保持在體外和/或體內(nèi)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或抑制血管發(fā)生的能力。3.權(quán)利要求1或2的質(zhì)粒，其包含編碼metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域(RDD)的序列，其中所述質(zhì)粒具有SEQIDNO2中顯示的序列。4.用權(quán)利要求1至3的任一項的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。5.權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌。6.權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞，其為哺乳動物細(xì)胞。7.產(chǎn)生pORT-RDD質(zhì)粒的方法，其包括由培養(yǎng)權(quán)利要求4至6的任一項的宿主細(xì)胞，和從培養(yǎng)的宿主細(xì)胞回收P0RT-RDD質(zhì)粒組成的步驟。8.權(quán)利要求7的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求4或5的宿主細(xì)胞，并且其還包括通過下列步驟純化pORT-RDD質(zhì)粒(a)堿性裂解培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(b)網(wǎng)袋過濾；(c)陰離子交換層析；(d)濃縮；(e)離子對反相和尺寸排阻層析，和(f)過濾。9.從權(quán)利要求4或5的宿主細(xì)胞純化pORT-RDD質(zhì)粒的方法，該方法包括步驟(a)堿性裂解宿主細(xì)胞；(b)網(wǎng)袋過濾；(c)陰離子交換層析；(d)濃縮；(e)離子對反相和尺寸排阻層析，和(f)過濾。10.在哺乳動物細(xì)胞中體內(nèi)或體外表達(dá)RDD肽的方法，該方法包括用pORT-RDD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述哺乳動物細(xì)胞，由此在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)RDD肽。11.權(quán)利要求10的方法，其中哺乳動物細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。12.包含權(quán)利要求1至3的任一項的質(zhì)粒和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。13.權(quán)利要求1至3的任一項的質(zhì)粒用于治療腫瘤的用途。14.權(quán)利要求13的用途，其中所述質(zhì)粒意欲用于預(yù)防和/或治療轉(zhuǎn)移性腫瘤。15.權(quán)利要求13或14的用途，其中將所述質(zhì)粒與腫瘤或肌肉細(xì)胞接觸并且如下電刺激腫瘤或肌肉-首先，使用至少一個具有200至2000伏/cm的高電壓(HV)場強的脈沖-其次，使用具有50至200伏/cm的低電壓(LV)場強和300至2000ms的持續(xù)時間的單脈沖。16.權(quán)利要求15的用途，其中通過瘤內(nèi)注射將所述質(zhì)粒與腫瘤細(xì)胞接觸。17.權(quán)利要求15的用途，其中通過肌內(nèi)注射將所述質(zhì)粒與腫瘤或肌肉細(xì)胞接觸。18.權(quán)利要求15至17的任一項的用途，其中通過包括在300ms至3000s之間的時間間隔分開HV和LV脈沖。19.權(quán)利要求15至18的任一項的用途，其中如下電刺激腫瘤或肌肉-HV=1000-1600V/cm,50-200us,1個脈沖，1Hz-間歇:500ms至10sLV=100-200V/cm,300-800ms,1個脈沖。20.用于測定權(quán)利要求1至3的任一項的pORT-RDD質(zhì)粒對腫瘤細(xì)胞增殖的體外抑制功效的方法，該方法包括步驟a)提供腫瘤細(xì)胞系的亞匯合培養(yǎng)物；b)用不斷增加的量的根據(jù)本發(fā)明的pORT-RDD質(zhì)?；蛴脤φ辗謩e轉(zhuǎn)染步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物；c)在適合于獲得用對照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的增殖的條件下培養(yǎng)步驟b)的被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；d)對于每一個特定量的被轉(zhuǎn)染的pORT-RDD質(zhì)粒，測定與步驟a)中提供的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞的數(shù)目相比，存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，所述細(xì)胞培養(yǎng)物被提供用于用所述特定量的pORT-RDD質(zhì)粒進(jìn)行的轉(zhuǎn)染；e)對于用對照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，測定與步驟a)中提供的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞的數(shù)目相比，存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，所述細(xì)胞培養(yǎng)物被提供用于用所述對照進(jìn)行的轉(zhuǎn)染；由此如果步驟d)中計算的存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)低于步驟e)中計算的存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，則pORT-RDD質(zhì)粒被確定為具有抑制功效。21.制備冷凍干燥的pORT-RDD質(zhì)粒的方法，該方法包括步驟a)將pORT-RDD質(zhì)粒的溶液冷凍至_40°C至_60°C；b)升華步驟，其通過在200至300μbar的壓力下將溫度增加至+5°C至+15°C的溫度，進(jìn)行10至20小時的時間來進(jìn)行；和c)第二干燥步驟，其在室溫下，在200至300μbar下進(jìn)行，直至pORT-RDD質(zhì)粒達(dá)到室溫，然后在30-70μbar下進(jìn)行直至20小時。22.權(quán)利要求21的方法，其包括步驟a)在1至2小時內(nèi)將pORT-RDD質(zhì)粒的溶液從+20°C冷凍至_50°C，然后將溫度保持在-50°C，進(jìn)行2小時；b)升華步驟，其在+10°C下在250μbar的壓力下進(jìn)行3小時，然后在+10°C下進(jìn)行12小時；c)在+20°C下進(jìn)行直至20小時的第二干燥步驟。23.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述pORT-RDD質(zhì)粒的溶液包含甘露醇1.9-2.Omg/ml和葡萄糖4.8-4.9mg/ml。全文摘要本發(fā)明涉及包含編碼在強巨細(xì)胞病毒啟動子控制下的完整或部分metargidin的解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域(RDD)或其衍生物的序列的pORT質(zhì)粒，特別地具有SEQIDNO2中顯示的序列的質(zhì)粒。文檔編號C12N15/85GK101802186SQ200880013989公開日2010年8月11日申請日期2008年3月5日優(yōu)先權(quán)日2007年3月6日發(fā)明者C·波奎特,S·勒拜爾-比內(nèi)申請人:生物聯(lián)合制藥公司