專利名稱：一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法，具體涉及通過(guò)稀酸球磨、結(jié)合纖維 素酶復(fù)配來(lái)提高纖維素酶催化木質(zhì)纖維素糖化的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙醇是一種很有希望替代有限石油的燃料。日前燃料乙醇主要原料是糧食，然而糧 食生產(chǎn)乙醇產(chǎn)量有限。真正可大量轉(zhuǎn)化乙醇的應(yīng)是纖維質(zhì)材料。纖維質(zhì)材料轉(zhuǎn)化乙醇的 挑戰(zhàn)性問(wèn)題是產(chǎn)量偏低、成本偏高。纖維質(zhì)材料的預(yù)處理是轉(zhuǎn)化乙醇過(guò)程中的關(guān)鍵步驟， 該步驟的優(yōu)化可明顯提高纖維素的水解率，進(jìn)而降低乙醇的生產(chǎn)成本。
對(duì)利用木質(zhì)纖維素類物質(zhì)生產(chǎn)乙醇工藝中，通常都要對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理，此 步驟的主要目的是改變木質(zhì)纖維素的表面結(jié)構(gòu)，破壞木質(zhì)素和半纖維素構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié) 構(gòu)，脫去木質(zhì)素，降低纖維素的結(jié)晶度。而目前已經(jīng)實(shí)施產(chǎn)業(yè)化的木質(zhì)纖維素預(yù)處理工 藝主要有兩類酸水解和酶水解。單一酸或堿處理需要10% 77%左右的濃度，由于其
污染重、腐蝕大、酸堿回收困難、后處理難度大等問(wèn)題依然還在突破中。與酸水解相比， 酶解法是近年來(lái)剛起步的新方法，由于其條件溫和、效率高以及不存在污染等優(yōu)勢(shì)，成 為全球公認(rèn)的最有發(fā)展前景的方法之一。然而，纖維素酶的使用成本較高，而目前酶解 轉(zhuǎn)化的效率又低，這些都成為制約秸稈酶解發(fā)酵制備乙醇的關(guān)鍵因素。
纖維質(zhì)材料必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，才能在纖維素的酶水解過(guò)程中獲得較高的轉(zhuǎn)化率， 并且對(duì)前期工序和后期工序的成本都會(huì)產(chǎn)生重要影響。因?yàn)槟举|(zhì)素、半纖維素對(duì)纖維素 的保護(hù)作用以及纖維素本身的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，天然的纖維質(zhì)原料直接進(jìn)行水解時(shí)，其水解程 度是很低的，即纖維素水解成糖的百分比很低。因此必需對(duì)木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行一定的 預(yù)處理，將木質(zhì)素和半纖維素去除，減小纖維素的結(jié)晶度和增加多孔性，增大纖維素的 可接觸面積，進(jìn)而提高水解效率。較好的預(yù)處理方法還可以減少酶的用量。因此提高酶 催化效率以及降低酶用量從而降低成本都是目前木質(zhì)纖維素糖化工藝存在的主要問(wèn)題。
中國(guó)專利CN1806945公開(kāi)了一種利用秸稈預(yù)處理和酶解工藝使秸，纖維素完全酶 解的方法，將秸稈首先經(jīng)汽爆處理，然后用熱水洗滌，除去半纖維素多糖，干燥后與離 子液體混合，微波加熱或直接加熱，然后將處理后的秸稈用水反復(fù)沖洗，洗滌液中的溶 劑可以通過(guò)蒸餾等方法回收，沖洗干凈的處理秸稈在5(TC下，pH4.8的緩沖液中用纖維素酶酶解48 72小時(shí)，纖維素的酶解率可達(dá)到100%,但是汽爆處理的上述缺陷仍然存 在，且汽爆后仍需要加熱，能耗極大，生產(chǎn)成本過(guò)高，且工藝繁瑣；美國(guó)專利US5562777 公開(kāi)了一種強(qiáng)酸水解纖維素和半纖維素的方法，將濃度為70% 77%的濃硫酸與纖維素 和半纖維素的混合物按1.25:1混合均勻后形成凝膠狀，然后加水使凝膠物中的硫酸濃度 稀釋至20% 30%，然后加熱至80。C 10(TC，處理40 min 480 min，該工藝有效破壞 了纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，有利于提高后續(xù)處理時(shí)纖維素的降解率，但該工藝同樣存在處理 溫度高、強(qiáng)酸用量大、生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)；中國(guó)專利CN1970781公開(kāi)了一種超聲波協(xié) 同改性纖維素酶催化木質(zhì)纖維素糖化的方法，通過(guò)粉碎(20目)和堿處理(常溫，3%~ 8%)分離原料中的木質(zhì)素，用活化后的單甲氧基聚乙二醇與纖維素酶在檸檬酸-檸檬酸 鈉緩沖溶液中反應(yīng)得到改性纖維素酶，將改性纖維素酶與p-葡萄糖苷酶、淀粉酶和果膠 酶混合得到復(fù)配酶液，將復(fù)配酶按照相應(yīng)的比例加入預(yù)處理后的原料中，配合超聲波(80 W 300W)進(jìn)行酶催化反應(yīng)，最后經(jīng)過(guò)濾、減壓蒸發(fā)，得到濃縮糖液(25% 35%)， 該方法采用酶改性結(jié)合復(fù)配的方法，提高了綜纖維素的轉(zhuǎn)化率，但該方法的堿液濃度過(guò) 大，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)和生產(chǎn)成本造成了巨大壓力，由于前期堿處理效果不良，造 成了后期酶解工藝的復(fù)雜化，超聲處理和減壓等操作進(jìn)一步增加了能耗及生產(chǎn)成本；中 國(guó)專利CN101255479公開(kāi)了一種將木質(zhì)纖維素高效糖化的預(yù)處理方法，具體涉及一種 常溫低濃度堿液預(yù)處理木質(zhì)纖維素的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于整個(gè)操作不需要加熱，且利用濃 度為0.1% 3%的超低濃度堿液濕磨的預(yù)處理方式，而且堿液可以回收使用，大大節(jié)約 了操作成本，但是該方法對(duì)酶的使用未作優(yōu)化，使得其酶解效率相對(duì)低下；中國(guó)專利 CNI01092639公開(kāi)了一種生物酶降解糖化作物秸稈的方法，將經(jīng)粉碎后的秸稈采用微生 物和稀酸聯(lián)合預(yù)處理后，再用中性木聚糖酶和酸性纖維素酶進(jìn)行降解糖化，且其纖維質(zhì) 的酶水解分兩步進(jìn)行，該方法轉(zhuǎn)化率較高，污染輕，但是在預(yù)處理階段采用微生物發(fā)酵 和稀酸聯(lián)合處理， 一定程度上延長(zhǎng)了操作時(shí)間，而且酶水解分兩步進(jìn)行，并不算是實(shí)質(zhì) 上的復(fù)配操作，其繁瑣的工藝和冗長(zhǎng)的時(shí)間，并不適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。
現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題可歸結(jié)為(O大多工藝需要使用高溫高壓處理方法，能耗高、 糖收率低；(2)化學(xué)處理與蒸汽爆破、超聲波、微生物發(fā)酵等特殊操作結(jié)合提高了處理 效果，但是生產(chǎn)成本也相應(yīng)增加；(3)預(yù)處理階段普遍使用酸處理或堿處理方法，但酸 /堿濃度均高于3%,對(duì)設(shè)備的耐腐蝕性能要求較高，因而增加了維護(hù)和保養(yǎng)費(fèi)用，以及 酸/堿的大量使用，以及未反應(yīng)的酸/堿無(wú)法回收等問(wèn)題，均增加了生產(chǎn)成本；(4)有的 方法雖然提到了酶復(fù)配，但是沒(méi)有一個(gè)可以定量說(shuō)明和分析酶復(fù)配的方法，而且酶解效率提高不明顯，仍需要在超聲波等輔助條件下操作，無(wú)形中進(jìn)一步增加了操作成本；(5) 或者有的工藝使用了復(fù)配酶，但是酶解效率不高，仍需要再進(jìn)行二次單酶酶解，并不能 達(dá)到省時(shí)省力、節(jié)約經(jīng)濟(jì)的目的。因此，改進(jìn)預(yù)處理方法是目前木質(zhì)纖維素預(yù)處理的關(guān) 鍵問(wèn)題以及發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法，通過(guò)該方法具有反應(yīng)條 件溫和、操作簡(jiǎn)單、酶解效率高，處理后得到的糖液對(duì)后續(xù)發(fā)酵無(wú)抑制、可以綜合利用、 無(wú)環(huán)境污染等特點(diǎn)。
為達(dá)到以上目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法，其特征在于包括稀酸預(yù)處理、球磨粉碎、纖維 素酶復(fù)配和酶解糖化過(guò)程將粉碎后的木質(zhì)纖維素原料用稀酸在常溫下浸泡預(yù)處理、球 磨粉碎后得到酸解糖液，將至少兩種纖維素酶與木聚糖酶混合得到復(fù)配纖維素酶，并對(duì) 酸解球磨后剩余的固體進(jìn)行一步酶解糖化處理后得到酶解糖液。
本發(fā)明技術(shù)方案的具體步驟包括-
(1) 稀酸預(yù)處理
將木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行粗粉碎，取粉碎后的原料按照1:5 1:15 (kg:L)的比例與 H+濃度為0.01 mol/L 0.1 mol/L的稀酸在常溫下浸泡4 h 12 h;
(2) 球磨粉碎
將稀酸浸泡后的原料加入球磨罐，裝料量為球磨罐容積的50% 80%，其中研磨介 質(zhì)填充率為10% 50%，裝入球磨機(jī)進(jìn)行球磨，球磨15min 30min后，用一價(jià)金屬堿 液溶液或者Ca(OH)2中和、過(guò)濾、水洗，得到酸解糖液；
(3) 纖維素酶復(fù)配
確定各種纖維素酶的濾紙酶活、CMC酶活和fi-葡萄糖苷酶酶活，以及木聚糖酶的 酶活后，將至少兩種纖維素酶與木聚糖酶按照
濾紙酶活:CMC酶活:B-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活- 6:(1 3):(100 130):(0 55) 的比例混合，得到各酶系比例一定的復(fù)配纖維素酶；
(4) 酶解糖化
向球磨后過(guò)濾得到的固體中以料液比1:5 1:15加入標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH 值為4.5 5.0，反應(yīng)溫度5(TC，按照5.0 30.0 FPIU (濾紙酶活)/g纖維素的量加入第(3)步的復(fù)配纖維素酶，攪拌酶解36 h 50 h后過(guò)濾得到酶解糖液。
本發(fā)明所述的木質(zhì)纖維素原料包括秸稈類、草類、木材類、玉米芯、甘蔗渣、或者
其它各種糧食和水果加工殘?jiān)?br> 本發(fā)明所述的稀酸預(yù)處理步驟中使用的稀酸溶質(zhì)包括HC1或H2S04; 本發(fā)明所述的一價(jià)金屬堿液溶液包括NaOH溶液、KOH溶液。 本發(fā)明所得的酸解糖液含有半纖維素分解得到木糖和葡萄糖，酶解糖液含有纖維素
分解得到的葡萄糖，將兩種糖液合并后，可以將其減壓蒸發(fā)濃縮，直接用于燃料乙醇的
發(fā)酵生產(chǎn)。
本發(fā)明的有益效果在于-
(1) 整個(gè)糖化處理工藝在常溫下進(jìn)行，而且不需要任何的諸如超聲波、蒸汽爆破、 超聲波、微生物發(fā)酵等輔助操作，既避免了高溫高壓，又縮短了整個(gè)工藝的操作時(shí)間， 且采用的超低濃度的稀酸處理方法，避免了濃酸濃堿的處理過(guò)程，設(shè)備損耗和成本低， 污染?。?br> (2) 采用對(duì)超低濃度稀酸預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行濕磨的方法，不僅可以
將包裹在纖維外表面起保護(hù)作用的木質(zhì)素破壞掉，使木質(zhì)纖維原料微觀結(jié)構(gòu)更加松散破 壞其晶體結(jié)構(gòu)增加纖維素酶的接觸比表面積，而且可以將木質(zhì)素半纖維素少量水解，更
有利于后續(xù)纖維素水解酶的作用；
(3) 纖維素酶是多組分的復(fù)合酶系，主要包括三種組分內(nèi)切型葡聚糖酶、外切 型葡聚糖酶、J3-葡萄糖苷酶，每一組分又有若干亞組分組成。纖維素水解生成葡萄糖的 過(guò)程必須依靠這三組分的協(xié)同作用才能完成，單獨(dú)的都不能有效降解天然纖維素。目前 人們比較認(rèn)同的纖維素酶協(xié)同作用觀點(diǎn)認(rèn)為內(nèi)切葡聚糖酶優(yōu)先水解底物的較小部分， 然后作用于纖維素分子的非結(jié)晶區(qū)，剪切纖維素產(chǎn)生很多非還原性末端，但它不易于作 用于結(jié)晶區(qū)；外切葡聚糖酶可從纖維素的非還原端以纖維二糖為單位，將纖維素分子進(jìn) 一步水解，可釋放葡萄糖或纖維二糖，纖維三糖單元，纖維二糖對(duì)外切酶和內(nèi)切酶有強(qiáng) 烈抑制作用；B-葡萄糖苷酶將纖維二糖和纖維三糖水解為葡萄糖，從反應(yīng)混合物中除去 抑制劑。
由于產(chǎn)纖維素酶的微生物不同，因此每種微生物所產(chǎn)的纖維素酶濃度和酶系比例都
有差異，即市售和發(fā)酵得到的各種纖維素酶的三種酶系的含量都是有差異的。利用將不 同種纖維素酶復(fù)配的方法得到的內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶、6-葡萄糖苷酶的比
例一定的復(fù)配纖維素酶，并結(jié)合木聚糖酶對(duì)半纖維素的酶解，克服了現(xiàn)有技術(shù)中粗放地
6對(duì)酶的使用，不僅精確計(jì)算了用酶總量的問(wèn)題，避免了對(duì)酶的浪費(fèi)，而且可消除使用單 一的纖維素酶的個(gè)體差異性，顯著提高了復(fù)合酶對(duì)木質(zhì)纖維素的水解效率，保證了工廠
各批次生產(chǎn)的穩(wěn)定性；
(4) 由于稀酸處理后的原料經(jīng)過(guò)濕磨處理后，己經(jīng)破壞了原半纖維素和纖維素的 結(jié)構(gòu)，因此，為復(fù)配酶的有效酶解提供了便利，采取濕磨法與復(fù)配酶的酶解雙重處理方 法，可以使復(fù)配酶一次性徹底酶解酸解后剩余的纖維素和半纖維素，無(wú)需現(xiàn)有技術(shù)中使 用的兩步酶解操作，因此大大提高了酶解效率縮短酶解時(shí)間，進(jìn)一步節(jié)省了操作成本和 時(shí)間。利用稀酸球磨和復(fù)配酶一步酶解結(jié)合的工藝，木質(zhì)纖維素原料的水解糖得率可以 高達(dá)卯％以上；
(5) 酸解和酶解的糖液合并后最終得到的糖化液可以直接用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，且 不含對(duì)發(fā)酵酵母有害的毒性成分，為乙醇發(fā)酵工業(yè)進(jìn)一步減低了操作成本。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施例中使用到的相關(guān)計(jì)算公式和測(cè)定方法如下
1、 水解液中糖濃度測(cè)定 DNS (3,5-二硝基水楊酸)法。
2、 濾紙酶活力的測(cè)定——纖維素酶的總體酶活力測(cè)定
采用國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)(IUPAC)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定[Ghose,T.K., Wa/. Pure &Appl.Chem.， 1987,59，257 268]， 一個(gè)濾紙酶活力的國(guó)際單位(FPIU)等于在標(biāo)準(zhǔn)反 應(yīng)條件下每分鐘生成1 pmol葡萄糖量的酶量。測(cè)定方法如下.-
取6支試管在其中W 5存支小試管中加入50mg巻成筒狀的濾紙條，適當(dāng)稀釋酶液， 取6支試管按表1操作
表1濾紙酶活力的測(cè)定操作標(biāo)準(zhǔn)
項(xiàng) 目1#2#3#4#5# 6#
稀釋酶液/mL0.20.30.40.50 0.5
0.05M檸檬酸緩沖液/mL1.31.2U1.01.5 1
注5弁有底物無(wú)酶，6#為有酶無(wú)底物空白對(duì)照
將上述試管置于恒溫水浴器中，保持在振幅100和溫度50 。C下保溫60min后立即取出加入3mLDNS試劑，在沸水中反應(yīng)5min，冷卻后加水至25 mL搖勻，于550nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值。反應(yīng)生成的葡萄糖的量根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得；
以0.2mL、 0.3 mL、 0.4 mL、 0.5 mL酶量所生成葡萄糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，酶量的 對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，從圖中找出生成2 mg葡萄糖的酶量，按下式計(jì)算樣品的濾紙酶活 力(FPIU):
2 iug葡萄糖
濾紙瞎活力- _^_
'' 60minX0.1S(mg^mol)X生成2mg葡萄糖的酶量(mL)
其中， 一個(gè)濾紙酶活力單位定義為每分鐘生成1 i^mol葡萄糖所需的酶量，單位 IU/mL。
3、羧甲基纖維素(CMC)酶活力測(cè)定——內(nèi)切葡聚糖酶活力測(cè)定 (1 )在試管中加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液和1.0 mL用0.05 mol/L檸檬酸緩沖液配
制的1 % (w/v)羧甲基纖維素懸浮液；
(2) 將試管置于恒溫水浴器中，保持在振幅100和溫度50 。C下保溫30 min后立 即取出加入3mLDNS試劑，在100 。C沸水中煮沸5 min，冷卻到室溫后，加水定容至 25mL，充分搖勻后于550nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值；
(3) 反應(yīng)生成的葡萄糖的量根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。按下式計(jì)算CMC酶活力
生成的菊菊糖的墾(m^
CMC fll活力=-
30minx 0 18(mg/ (Jinol〕x 0.5raL
CMC酶活力單位定義為每分鐘生成1 Mmol葡萄糖所需的酶量，單位IU/mL。
一水
4、 (3-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定
采用pNPG (對(duì)硝基苯酚-卩-D-葡萄糖苷)試劑測(cè)定。
一個(gè)(3-葡萄糖苷酶酶活力單位定義為每分鐘水解生成l nmol對(duì)硝基苯酚所需要 的酶量。計(jì)算公式如下
,萄糖昔酷薛活--生成對(duì)=:，。1〉 ( 。5、木聚糖酶活力的測(cè)定
用0.05 mol/L檸檬酸緩沖液配制的1% (w/v)樺木木聚糖(Sigma公司制造)溶液。 適當(dāng)稀釋酶液，取6支25 mL刻度試管按表2操作(5#有底物無(wú)酶、6#為有酶無(wú)底物空 白對(duì)照)
表2木聚糖酶活力的測(cè)定操作標(biāo)準(zhǔn)
項(xiàng) 目
1# 2#
3#
4弁
5#
6#
稀釋酶液/mL 0.2 0.3 0.4 0.5 0 0.5
0.05M檸檬酸緩沖液/mL0.3 0.2 0.1 0 0.5 1 P/。樺木木聚糖/mL 111110 注5#有底物無(wú)酶、6#為有酶無(wú)底物空白對(duì)照
將上述試管置于恒溫水浴器中，保持在振幅100和溫度50 'C下保溫30 min后立即 取出加入3 mL DNS試劑，在沸水中反應(yīng)5min，冷卻到室溫后，加水到25 mL，搖勻 后于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值。計(jì)算反應(yīng)所產(chǎn)生的木糖量；
以0.2mL、 0.3 mL、 0.4 mL、 0.5 mL酶量所生成木糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，酶量的對(duì) 數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，從圖中找出生成2mg木糖的酶量，按下式計(jì)算木聚糖酶活力
2mg木糖
木聚糖酶活力=-
30 mhix0.15(ing^mol)x生成2mg木糖的酶量
一個(gè)木聚糖酶活力單位定義為每分鐘生成lnmol木糖所需的酶量，單位IU/mL。
6、水解糖得率的計(jì)算:
水解様?shù)寐盛?原 |||量x鵬
其中，綜纖維素為纖維素和半纖維素的總稱c
下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法作詳細(xì)說(shuō)明，但對(duì)本發(fā)明沒(méi)有限制。
實(shí)施例l
將玉米秸稈粉碎成0.5 mm粒徑。取3.00 g粉碎好的原料，加入45 mL H+濃度為0.1 mol/L的HC1溶液室溫浸泡8 h后，用行星式球磨機(jī)球磨，60 mL瑪瑙球磨罐，轉(zhuǎn)速340r/min，瑪瑙研磨球裝量為填充率為10%,交替運(yùn)行間隔3min,球磨15min;原料經(jīng)過(guò) 球磨后，用10。/。的NaOH溶液中和后過(guò)濾、水洗，收集水洗液得到酸解糖液。 選擇進(jìn)行復(fù)配的纖維素酶和木糖酶-
A、 纖維素酶Accellerase 1000 (購(gòu)自杰能科國(guó)際公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/mL纖維素酶)濾紙酶活93FPIU， CMC酶活7.38 IU， B-葡萄 糖苷酶1632.9 IU;
B、 纖維素酶ZSL-1300 (山東澤生生物科技公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/mL纖維素酶)濾紙酶活77FPnj， CMC酶活17.35 IU， J3-葡萄 糖苷酶1356,5 IU;
C、 木聚糖酶(山東澤生生物科技公司)，酶活為964IU/mL。 將上述三種酶按體積配比為A:B:C=3:2:2的配比混合，得到濾紙酶活:CMC酶活:IJ-
葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活-6:1:110:44的復(fù)配酶。
向球磨原料中加入標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為4.8，料液比1:8，按照5.0FPIU (濾紙酶活)/g纖維素加入復(fù)配酶，置恒溫震蕩水浴鍋50'C， 100r/min，攪拌酶解36 h。 酶解液用布氏漏斗過(guò)濾分離，該酶解糖液和酸解糖液合并后經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后可以 直接用于燃料乙醇的發(fā)酵工藝。通過(guò)測(cè)量水解液中糖濃度，可以算出木質(zhì)纖維原料水解 后糖得率91.1%。
實(shí)施例2
將鋸末粉碎成0.5 mm粒徑。取3.00 g粉碎好的原料，加入30 mL H+濃度為0.01 mol/L 的H2SO4溶液室溫浸泡12h后，用行星式球磨機(jī)球磨，60mL瑪瑙球磨罐，轉(zhuǎn)速340r/min， 瑪瑙研磨球填充率為50%，交替運(yùn)行間隔3min，球磨30min;原料經(jīng)過(guò)球磨后，用10% 的Ca(OH)2溶液中和后過(guò)濾、水洗，收集水洗液得到酸解糖液。
選擇進(jìn)行復(fù)配的纖維素酶和木糖酶
A、 纖維素酶R-IO (購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/g纖維素酶)濾紙酶活9FPIU, CMC酶活24IU， B-葡萄糖苷 酶859IU;
B、 纖維素酶(購(gòu)自無(wú)錫高潤(rùn)潔生物工程有限公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/g纖維素酶)濾紙酶活22FPIU， CMC酶活7.8IU， J3-葡萄糖苷 酶919.5 IU;
10C、 纖維素酶EN0029 (購(gòu)自上海斯高勒生物科技有限公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/g纖維素酶)濾紙酶活52 FPIU, CMC酶活105 IU， fi-葡萄糖 苷酶910.5 IU;
D、 木聚糖酶(購(gòu)自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司)，酶活為1246IU/g。 將上述四種酶按體積配比為A:B:C:D-3:2:4:3的配比混合，得到濾紙酶活:CMC酶
活:J3-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活-6:2:130:55的復(fù)配酶。
向球磨原料中加入標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為5.0，料液比1:15，按照30 FPIU (濾紙酶活)/g纖維素加入復(fù)配酶，置恒溫震蕩水浴鍋50'C， 100r/min，攪拌酶解50h。 酶解液用布氏漏斗過(guò)濾分離，該酶解糖液和酸解糖液合并后經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后可以 直接用于燃料乙醇的發(fā)酵工藝。通過(guò)測(cè)量酶解后固體殘?jiān)|(zhì)量，可以算出木質(zhì)纖維原料 水解后糖得率94.1%。
實(shí)施例3
將椰殼粉碎成2.5 mm粒徑。取160.0 g粉碎好的原料，加入800 mL H+濃度為0.01 mol/L的H2S04室溫浸泡4h后，用行星式球磨機(jī)球磨，lOOOmL瑪瑙球磨罐，轉(zhuǎn)速390 r/min，瑪瑙研磨球填充率為50%，交替運(yùn)行間隔3min，球磨15min;原料經(jīng)過(guò)球磨后， 用10。/。的KOH溶液中和后過(guò)濾、水洗，收集水洗液得到酸解糖液。
選擇進(jìn)行復(fù)配的纖維素酶和木糖酶
A、 纖維素酶Accellerase 1000 (購(gòu)自杰能科國(guó)際公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/mL纖維素酶)濾紙酶活93 FPIU, CMC酶活7.38 IU， B-葡萄 糖苷酶1632.9 IU;
B、 纖維素酶(購(gòu)自無(wú)錫高潤(rùn)潔生物工程有限公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/g纖維素酶)濾紙酶活22FPIU， CMC酶活7.8IU， J5-葡萄糖苷 酶919.5 IU;
C、 纖維素酶EN0029 (購(gòu)自上海斯高勒生物科技有限公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/g纖維素酶)濾紙酶活52 FPIU， CMC酶活105 IU， 1J-葡萄糖 苷酶910.5 IU;
將上述四種酶按體積配比為A:B:C-2:5:3的配比混合，得到濾紙酶活:CMC酶活.-fi-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:1:100:0的復(fù)配酶。
向球磨原料中加入標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為4.5，料液比1:5，按照5.0FPIU(濾紙酶活)/g纖維素加入復(fù)配酶，置恒溫震蕩水浴鍋50'C， 100r/min，攪拌酶解36h。 酶解液用布氏漏斗過(guò)濾分離，該酶解糖液和酸解糖液合并后經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后可以 直接用于燃料乙醇的發(fā)酵工藝。通過(guò)測(cè)量酶解后固體殘?jiān)|(zhì)量，可以算出木質(zhì)纖維原料 水解后糖得率92.3%。
實(shí)施例4
將甘蔗渣粉碎成0.5 mm粒徑。取80 g粉碎好的原料，加入800 mL H+濃度為0.08 mol/LHCl溶液室溫浸泡8h后，用行星式球磨機(jī)球磨，lOOOmL瑪瑙球磨罐，轉(zhuǎn)速400 r/min，瑪瑙研磨球填充率為10%，交替運(yùn)行間隔3min，球磨15min;原料經(jīng)過(guò)球磨后， 用10。/。的NaOH溶液中和后過(guò)濾、水洗，收集水洗液得到酸解糖液。
選擇進(jìn)行復(fù)配的纖維素酶和木糖酶
A、 纖維素酶EN0029 (購(gòu)自上海斯高勒生物科技有限公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/g纖維素酶)濾紙酶活52 FPIU， CMC酶活105 IU， 13-葡萄糖 苷酶910.5 IU;
B、 纖維素酶ZSL-1300 (購(gòu)自山東澤生生物科技公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/mL纖維素酶)濾紙酶活77FPIU， CMC酶活17.35 IU， 13-葡萄 糖苷酶1356.5 IU;
C、 木聚糖酶(購(gòu)自山東澤生生物科技公司)，酶活為964IU/mL。 將上述三種酶按體積配比為A:B:C-4:2:5配比混合，得到濾紙酶活:CMC酶活:B-葡
萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:2:125:45的復(fù)配酶。
向球磨原料中加入標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為4.8，料液比1:15，按照30 FPIU (濾紙酶活)/g纖維素加入復(fù)配酶，置恒溫震蕩水浴鍋5(TC， 100r/min，攪拌酶解50h。 酶解液用布氏漏斗過(guò)濾分離，該酶解糖液和酸解糖液合并后經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后可以 直接用于燃料乙醇的發(fā)酵工藝。通過(guò)測(cè)量酶解后固體殘?jiān)|(zhì)量，可以算出木質(zhì)纖維原料 水解后糖得率95.1%。
實(shí)施例5
將稻草粉碎成3.5 mm粒徑。取4.00 g粉碎好的原料，加入40 mL H+濃度為0.04 mol/L 的HC1溶液室溫浸泡8 h后，用行星式球磨機(jī)球磨，60 mL瑪瑙球磨罐，轉(zhuǎn)速340 r/min， 瑪瑙研磨球填充率為10%，交替運(yùn)行間隔3min，球磨15min;原料經(jīng)過(guò)球磨后，用10%的NaOH溶液中和后過(guò)濾、水洗，收集水洗液得到酸解糖液。 選擇進(jìn)行復(fù)配的纖維素酶和木糖酶-
A、 纖維素酶Accellerase 1000 (購(gòu)自杰能科國(guó)際公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/mL纖維素酶)濾紙酶活93 FPIU， CMC酶活7.38 IU， J3-葡萄 糖苷酶1632.9 IU;
B、 纖維素酶EN0029 (購(gòu)自上海斯高勒生物科技有限公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/g纖維素酶)濾紙酶活52 FPIU， CMC酶活105 IU, J3-葡萄糖 苷酶910.5 IU;
C、 木聚糖酶(購(gòu)自山東澤生生物科技公司)，酶活為964IU/mL。 將上述三種酶按體積配比為A:B:C=2:3:2配比混合，得到濾紙酶活:CMC酶活:J3-葡
萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:1:115:35的復(fù)配酶。
向球磨原料中加入標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為4.8，料液比1:8，按照5.0FPIU (濾紙酶活)/g纖維素加入復(fù)配酶，置恒溫震蕩水浴鍋5(TC， 100r/min，攪拌酶解36h。
酶解液用布氏漏斗過(guò)濾分離，該酶解糖液和酸解糖液合并后經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后可以 直接用于燃料乙醇的發(fā)酵工藝。通過(guò)測(cè)量酶解后固體殘?jiān)|(zhì)量，可以算出木質(zhì)纖維原料 水解后糖得率95.7%。
實(shí)施例6
將玉米芯粉碎成1.5 mm粒徑。取5.00 g粉碎好的原料，加入30 mL 0.2%的HC1溶 液室溫浸泡4h后，用行星式球磨機(jī)球磨，60mL瑪瑙球磨罐，轉(zhuǎn)速340r/min，瑪瑙研 磨球填充率為40%，交替運(yùn)行間隔3 min，球磨30 min;原料經(jīng)過(guò)球磨后，用10%的NaOH 溶液中和后過(guò)濾、水洗，收集水洗液得到酸解糖液。
選擇進(jìn)行復(fù)配的纖維素酶和木糖酶
A、 纖維素酶R-IO (購(gòu)自上海楷洋生物技術(shù)有限公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/g纖維素酶)濾紙酶活9 FPIU， CMC酶活24 IU， J3-葡萄糖苷 酶859IU;
B、 纖維素酶(購(gòu)自無(wú)錫高潤(rùn)潔生物工程有限公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/g纖維素酶)濾紙酶活22FPIU， CMC酶活7.8IU, 15-葡萄糖苷 酶919.5 IU;
C、 纖維素酶ZSL-1300 (購(gòu)自山東澤生生物科技公司)
13酶活測(cè)定結(jié)果為(/mL纖維素酶)濾紙酶活77FPIU， CMC酶活17.35 IU， fi-葡萄 糖苷酶1356.5 IU;
D、木聚糖酶(購(gòu)自山東澤生生物科技公司)，酶活為964IU/mL。 將上述四種酶按體積配比為A:B:C:D=4:3:1:3的配比混合，得到濾紙酶活:CMC酶 活:B-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:3:120:45的復(fù)配酶。
向球磨原料中加入標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為4.5，料液比1:15，按照15.0 FPIU (濾紙酶活)/g纖維素加入復(fù)配酶，置恒溫震蕩水浴鍋5(TC, 100r/min，攪拌酶解45h。 酶解液用布氏漏斗過(guò)濾分離，該酶解糖液和酸解糖液合并后經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后可以 直接用于燃料乙醇的發(fā)酵工藝。通過(guò)測(cè)量酶解后固體殘?jiān)|(zhì)量，可以算出木質(zhì)纖維原料 水解后糖得率93.1%。
實(shí)施例7
將蘆葦粉碎成1.0 mm粒徑。取3.00 g粉碎好的原料，加入45 mLH+濃度為0.01 mol/L 的H2S04溶液室溫浸泡8 h后，用行星式球磨機(jī)球磨，60 mL瑪瑙球磨罐，轉(zhuǎn)速390 r/min， 瑪瑙研磨球填充率為20%，交替運(yùn)行間隔3 min，球磨15 min;原料經(jīng)過(guò)球磨后，用10% 的NaOH溶液中和后過(guò)濾、水洗，收集水洗液得到酸解糖液。
選擇進(jìn)行復(fù)配的纖維素酶和木糖酶
A、 纖維素酶Accellerase 1000 (購(gòu)自杰能科國(guó)際公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/mL纖維素酶)濾紙酶活93FPIU， CMC酶活7.38 IU， B-葡萄 糖苷酶1632.9 IU;
B、 纖維素酶ZSL-1300 (購(gòu)自山東澤生生物科技公司)
酶活測(cè)定結(jié)果為(/mL纖維素酶)濾紙酶活77FPIU， CMC酶活17.35 IU， fi-葡萄 糖苷酶1356.5 IU;
將上述三種酶按體積配比為A:B:C=3:2配比混合，得到濾紙酶活:CMC酶活:B-葡萄 糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:2:119:0的復(fù)配酶。
向球磨原料中加入標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為4.8，料液比1:8，按照25.0 FPIU (濾紙酶活)/g纖維素加入復(fù)配酶，置恒溫震蕩水浴鍋5(TC, 100r/min，攪拌酶解42h。 酶解液用布氏漏斗過(guò)濾分離，該酶解糖液和酸解糖液合并后經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后可以 直接用于燃料乙醇的發(fā)酵工藝。通過(guò)測(cè)量酶解后固體殘?jiān)|(zhì)量，可以算出木質(zhì)纖維原料 水解后糖得率91.1%。
權(quán)利要求
1、一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法，其特征在于包括稀酸預(yù)處理、球磨粉碎、纖維素酶復(fù)配和酶解糖化過(guò)程將粉碎后的木質(zhì)纖維素原料用稀酸在常溫下浸泡預(yù)處理、球磨粉碎后得到酸解糖液，將至少兩種纖維素酶與木聚糖酶混合得到復(fù)配纖維素酶，并對(duì)酸解球磨后剩余的固體進(jìn)行一步酶解糖化處理后得到酶解糖液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法，其特征在于其具體步 驟包括(1) 稀酸預(yù)處理將木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行粗粉碎，取粉碎后的原料按照1:5 1:15 (kg:L)的比例與 H+濃度為0.01 mol/L 0.1 mol/L的稀酸在常溫下浸泡4 h 12 h;(2) 球磨粉碎將稀酸浸泡后的原料加入球磨罐，裝料量為球磨罐容積的50% 80%，其中研磨介 質(zhì)填充率為10% 50%，裝入球磨機(jī)進(jìn)行球磨，球磨15min 30min后，用一價(jià)金屬堿 液溶液或者Ca(OH)2中和、過(guò)濾、水洗，得到酸解糖液；(3) 纖維素酶復(fù)配確定各種纖維素酶的濾紙酶活、CMC酶活和15-葡萄糖苷酶酶活，以及木聚糖酶的 酶活后，將至少兩種纖維素酶與木聚糖酶按照濾紙酶活:CMC酶活:Ji-葡萄糖苷酶酶活沐聚糖酶酶活二6:(l 3):(100 130):(0 55) 的比例混合，得到各酶系比例一定的復(fù)配纖維素酶；(4) 酶解糖化向球磨后過(guò)濾得到的固體中以料液比1:5 1:15加入標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH 值為4.5 5.0，反應(yīng)溫度50。C，按照5.0 30.0FPIU (濾紙酶活)/g纖維素的量加入第 (3)步的復(fù)配纖維素酶，攪拌酶解36h 50h后過(guò)濾得到酶解糖液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法，其特征在于所述 的木質(zhì)纖維素原料包括秸稈類、草類、木材類、玉米芯、甘蔗渣、或者其它各種糧食和 水果加工殘?jiān)?br> 4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法，其特征在于所述 的稀酸預(yù)處理步驟中使用的稀酸溶質(zhì)包括HC1或H2S04。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法，其特征在于所述 的一價(jià)金屬堿液溶液包括NaOH溶液、KOH溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種糖化處理木質(zhì)纖維素的新方法，包括稀酸預(yù)處理、球磨粉碎、纖維素酶復(fù)配和酶解糖化過(guò)程，具體方法為將粉碎后的木質(zhì)纖維素原料用H⁺濃度0.01mol/L～0.1mol/L的稀酸預(yù)處理、球磨粉碎后得到酸解糖液，將至少兩種纖維素酶與木聚糖酶混合得到復(fù)配纖維素酶，并對(duì)酸解球磨后剩余的固體進(jìn)行一步酶解糖化處理后得到酶解糖液。利用稀酸球磨和復(fù)配酶一步酶解結(jié)合的工藝，木質(zhì)纖維素原料的水解糖得率可以高達(dá)90％以上。本方法具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、酶解效率高，處理后得到的糖液對(duì)后續(xù)發(fā)酵無(wú)抑制、可以綜合利用、無(wú)環(huán)境污染等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/10GK101434976SQ20081024355
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者嚴(yán)立石, 于文濤, 張紅漫, 林增祥, 亮 瞿, 齡 胡, 鄭榮平, 強(qiáng) 金, 陳敬文, 和 黃 申請(qǐng)人:中國(guó)石油化工股份有限公司