專利名稱：Qtl定位的原理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
QTL定位的原理，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
QTL (quantitative trait locus)，即數(shù)量性狀位點(diǎn)，是指控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置。基于多基因假說的經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)通過一些遺傳設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)模型，把控制某一數(shù)量性狀的多基因系統(tǒng)作為一個(gè)整體來研究，利用一些遺傳參數(shù)如遺傳力和遺傳方差來描述數(shù)量性狀的遺傳特征。但是這些參數(shù)是所有基因效應(yīng)的總和，不能有效地分析控制性狀表達(dá)的基因數(shù)目、具體位置、效應(yīng)大小及其作用方式，因而難以實(shí)現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳操縱(徐建龍等，2001)。遺傳標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)和使用，促進(jìn)了數(shù)量性狀遺傳控制研究的發(fā)展。人們?cè)O(shè)想可以把控制數(shù)量性狀的多個(gè)基因分解成單個(gè)的QTL，像研究質(zhì)量性狀一樣對(duì)其分別進(jìn)行研究，如Thoday在1961年就提出了在分離群體中利用形態(tài)標(biāo)記分析和定位QTL的可能性和方法。但由于標(biāo)記數(shù)量、實(shí)驗(yàn)手段和定位方法的限制，這一設(shè)想很難應(yīng)用于實(shí)際研究工作之中。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為深入研究數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)提供了可能。自Patersonet al. (1988)第一次運(yùn)用分子標(biāo)記進(jìn)行番茄QTL定位以來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展和QTL檢測(cè)手段的日趨完善，有關(guān)QTL定位的報(bào)道日益增多。利用分子標(biāo)記進(jìn)行QTL定位原理，實(shí)質(zhì)上就是檢測(cè)標(biāo)記與QTL之間的連鎖關(guān)系，通過計(jì)算已知座位的標(biāo)記與未知座位的QTL之間的交換率來確定QTL的具體位置，同時(shí)估計(jì)QTL的效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
構(gòu)建一個(gè)特定的分離群體，并獲得該群體的標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)和數(shù)量性狀表型數(shù)據(jù)是開展QTL定位的前提。構(gòu)建分離群體時(shí)，需要考慮親本選配、群體類型和群體大小三個(gè)重要因素。
具體實(shí)施方式
1、親本選配 親本的選配直接影響到所建群體的適用范圍。 一般應(yīng)從三個(gè)方面對(duì)親本進(jìn)行選擇(l)親本間的遺傳差異。用于構(gòu)建群體的親本間的遺傳差異，既不能過大，又不能太小。若差異過大，雜種染色體之間的配對(duì)和重組就會(huì)受到抑制，導(dǎo)致連鎖座位之間的重組率偏低，造成嚴(yán)重的偏分離現(xiàn)象，降低所建群體的可信度，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致雜交后代不育，影響群體的構(gòu)建；若差異太小，親本間DNA多態(tài)性就會(huì)比較低，使可用于QTL定位的多態(tài)性探針數(shù)量下降，影響定位的精度。親本間的遺傳差異與其親緣關(guān)系有著密切關(guān)系，選配親本時(shí)，其親緣關(guān)系以多遠(yuǎn)為宜因物種而異。 一般而言，異交作物的多態(tài)性高，自交作物的多態(tài)性低。如玉米的多態(tài)較好(Helentjaris et al. ， 1986)， 一般自交系間就可構(gòu)建理想的群體，而番茄的多態(tài)性極差，要選用不同種間的后代來構(gòu)建群體(Miller & Tanksley， 1990) 。 (2)親本的純度。選擇親本應(yīng)盡量選用純度高的材料，并進(jìn)一步通過自交進(jìn)行純化。(3)選配親本時(shí)還應(yīng)對(duì)親本及其巳雜種進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。若雙親間存在相互易位或多倍分離群體材
料存在單體或部分染色體缺失等問題，那么其就不宜用來構(gòu)建分離群體。
2、群體類型 根據(jù)其遺傳穩(wěn)定性，目前QTL定位常用的分離群體可分為兩大類第一類稱為臨時(shí)性分離群體，如F2、 F3、 F4、 BC(backcross)、三交群體等。第二類稱為永久性分離群體，如重組自交系(Recombinant inbred line, RIL)群體和加倍單倍體(Doubled haploid， DH)群體等。這些群體原則上還可用于質(zhì)量性狀基因的定位和分子標(biāo)記連鎖圖譜的繪制(方宣鈞等，2001)。 (1)&群體。&群體是由親本雜交得到巳后再自交得到的。除自交不親和外，^群體容易配制，提供的變異類型最為豐富，能同時(shí)估計(jì)加性和顯性效應(yīng)。但&群體存在兩個(gè)缺點(diǎn)， 一是存在雜合基因型，對(duì)于顯性標(biāo)記，將無法識(shí)別顯性純合基因型和雜合基因型，因此會(huì)降低QTL定位的精度。而為了提高精度，減小誤差，則必須使用較大的群體。二是不易長期保存，群體有性繁殖一代后，遺傳結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生變化。為了延長群體的使用時(shí)間，一種方法是對(duì)其進(jìn)行無性繁殖，如進(jìn)行組織培養(yǎng)擴(kuò)繁，但這種方法并不適用于所有植物，且耗資費(fèi)工。另一種方法是使用&單株的衍生系(&或F》。隨機(jī)選取衍生系內(nèi)多個(gè)單株，混合提取DNA以代表原F2單株的DNA組成。這種方法只適用于那些繁殖系數(shù)較大的自花授粉植物(如水稻、小麥等)，且工作量大。 (2)BQ群體。BQ群體是由巳與親本之一回交產(chǎn)生的。BQ群體中每一分離的基因座只有兩種基因型，它直接反映了 &代配子的分離比例，因而定位精度要高于F2群體。此外，BQ群體還可以用來檢驗(yàn)雌、雄配子在基因間的重組率上是否存在差異。其方法是比較正、反回交群體中基因的重組率是否不同。例如正回交群體為(AXB)XA，反回交群體為AX(AXB)，則前者反映的是雌配子中的重組率，后者反映的是雄配子中的重組率。但BQ群體與F2群體一樣，存在不能長期保存的問題?？梢杂肍2群體使用的類似辦法來延長BQ群體的使用時(shí)間。另外，該群體由于只有兩種基因型，提供的信息量少于F2群體，因此只能估計(jì)顯性效應(yīng)，不能估計(jì)加性效應(yīng)。而且，對(duì)于一些人工雜交比較困難的植物，由于難以建立較大的群體和容易出現(xiàn)假雜種，BQ群體也不太適合。對(duì)于一些自交不親和的材料，可以使用三交群體，即(AXB)XC。由于存在自交不親和性，這樣的三交群體不存在假雜種現(xiàn)象。
(3) RIL群體。RIL群體是雜種后代經(jīng)多代自交而產(chǎn)生，通常從F2代開始，采用單粒傳的方法來建立。由于自交的作用，群體中每個(gè)株系都是純合的，因而RIL群體是一種永久性分離群體，可以長期使用，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，因此特別適合于QTL定位研究。但該群體亦有兩個(gè)不足，其一是異花授粉植物由于存在自交衰退現(xiàn)象，建立RIL群體比較困難。其二是相對(duì)于&群體，RIL群體的構(gòu)建時(shí)間較長。理論上，建立一個(gè)通常使用的包含100-200個(gè)株系的RIL群體，必須自交多代才能達(dá)到完全純合。為了節(jié)省構(gòu)建時(shí)間，在實(shí)際研究中，人們往往使用自交6-7代的"準(zhǔn)"RIL群體。從理論上推算，自交6代后，單個(gè)基因座的雜合率只有大約3%，已基本接近純合。但由于涉及大量的DNA標(biāo)記座位，因而雖然多數(shù)標(biāo)記座位已達(dá)到或接近完全純合，仍然有一些標(biāo)記座位存在較高的雜合率，有的高達(dá)20%以上(李維明等，2000)，盡管如此，實(shí)踐證明，利用這樣的"準(zhǔn)"RIL群體來進(jìn)行QTL定位仍是可行的。
在RIL群體中，每一分離座位上只存在兩種基因型，且比例為1 : 1。從這點(diǎn)看，RIL群體的遺傳結(jié)構(gòu)與群體相似，也反映了巳配子的分離比例。但RIL群體中兩個(gè)標(biāo)記座位之間的重組率比例并不等于巳配子的重組值。這是因?yàn)樵诮IL群體的過程中，兩標(biāo)記座位間每一代都會(huì)發(fā)生重組，所以RIL群體中得到的重組率是多代重組率的積累。不過用RIL群體仍然可以估計(jì)重組率，亦即仍然可以進(jìn)行QTL定位。 (4)DH群體。DH群體是由單倍體經(jīng)過染色體加倍形成的。DH群體產(chǎn)生的途徑很多，亦因物種不同而異，最常用的方法是取巳植株的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，然后對(duì)染色體進(jìn)行加倍產(chǎn)生DH植株。DH植株是純合的，自交即產(chǎn)生純系，因而DH群體也是一種永久性分離群體，可以跟RIL群體一樣，長期使用，重復(fù)試驗(yàn)，因此也特別適合于QTL定位研究。另外，由于DH群體的遺傳結(jié)構(gòu)直接反映了 F工配子的分離比例，因此DH群體跟群體一樣，QTL定位的精度是最高的。 DH群體的建立所需時(shí)間不多。但產(chǎn)生DH植株有賴于花藥培養(yǎng)技術(shù)，有些植物的花培非常困難，無法建立DH群體。另外，植物的花培能力跟基因型的關(guān)系較大，因而花培過程中會(huì)對(duì)不同基因型的花粉產(chǎn)生選擇效應(yīng)，從而破壞DH群體的遺傳結(jié)構(gòu)，造成嚴(yán)重的偏分離現(xiàn)象，這會(huì)影響QTL定位的精度。 上述兩類分離群體各有其優(yōu)缺點(diǎn)。臨時(shí)性群體容易獲得，而且能提供豐富的遺傳信息，因此，早期QTL定位多用這類群體。但這類群體中分離單位是個(gè)體， 一經(jīng)自交其遺傳組成就會(huì)發(fā)生變化，無法永久使用，很難進(jìn)行多年多點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。永久性分離群體雖然構(gòu)建時(shí)間較長或難度較大，而且不能估計(jì)顯性效應(yīng)(無雜合基因型)。但這類群體中分離單位是株系，不同株系間存在基因型的差異，而株系內(nèi)個(gè)體間的基因型是相同且純合的，可通過自交或近交繁殖后代，而不會(huì)改變?nèi)后w的遺傳組成，可以永久使用，因此可以進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，減小誤差，增加QTL檢測(cè)的準(zhǔn)確性，因而當(dāng)今QTL定位越來越多地采用永久性分離群體(徐云碧等，1994)。
3、群體大小 QTL定位的精度，很大程度上取決于群體的大小。群體越大，則定位的精度越高。但群體太大，不僅增大實(shí)驗(yàn)工作量，而且增加費(fèi)用。因此確定合適的群體大小是十分必要的，一般常根據(jù)兩個(gè)方面來確定群體的大小(l)研究目的。如果分離群體只是用于構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜，則可以用較小的群體；如果用于定位控制重要農(nóng)藝性狀，尤其是數(shù)量性狀的基因，則需要較大的群體。(2)群體類型。 一般而言，&群體的大小必須比BQ大約大一倍，才能達(dá)到與BQ群體相當(dāng)?shù)木?，這是因?yàn)?amp;群體中存在更多種類的基因型，為了保證每種基因型都有可能出現(xiàn)，就必須使用較大的群體，所以說BQ群體的定位精度比F2高，而DH群體的精度與BQ相當(dāng)，RIL群體則稍差(徐云碧等，1994)?？偟膩碚f，為了達(dá)到彼此相當(dāng)?shù)腝TL定位精度，所需的群體大小的順序?yàn)镕2 > RIL > BQ和DH。
權(quán)利要求
親本選配親本的選配直接影響到所建群體的適用范圍，一般應(yīng)從三個(gè)方面對(duì)親本進(jìn)行選擇(1)親本間的遺傳差異，用于構(gòu)建群體的親本間的遺傳差異，既不能過大，又不能太小，若差異過大，雜種染色體之間的配對(duì)和重組就會(huì)受到抑制，導(dǎo)致連鎖座位之間的重組率偏低，造成嚴(yán)重的偏分離現(xiàn)象，降低所建群體的可信度，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致雜交后代不育，影響群體的構(gòu)建；若差異太小，親本間DNA多態(tài)性就會(huì)比較低，使可用于QTL定位的多態(tài)性探針數(shù)量下降，影響定位的精度，親本間的遺傳差異與其親緣關(guān)系有著密切關(guān)系，選配親本時(shí)，其親緣關(guān)系以多遠(yuǎn)為宜因物種而異，一般而言，異交作物的多態(tài)性高，自交作物的多態(tài)性低，如玉米的多態(tài)較好(Helentjaris et al.，1986)，一般自交系間就可構(gòu)建理想的群體，而番茄的多態(tài)性極差，要選用不同種間的后代來構(gòu)建群體；(2)親本的純度，選擇親本應(yīng)盡量選用純度高的材料，并進(jìn)一步通過自交進(jìn)行純化，(3)選配親本時(shí)還應(yīng)對(duì)親本及其F1雜種進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，若雙親間存在相互易位或多倍分離群體材料存在單體或部分染色體缺失等問題，那么其就不宜用來構(gòu)建分離群體。
2. 群體類型根據(jù)其遺傳穩(wěn)定性，目前QTL定位常用的分離群體可分為兩大類第一類稱為臨時(shí)性分離群體，如F2、 F3、 F4、 BC(backcross)、三交群體等。第二類稱為永久性分離群體，如重組自交系(Recombinant inbred line, RIL)群體和加倍單倍體(Doubled haploid， DH)群體等。這些群體原則上還可用于質(zhì)量性狀基因的定位和分子標(biāo)記連鎖圖譜的繪制(方宣鈞等，2001)。(1) F2群體，F(xiàn)2群體是由親本雜交得到巳后再自交得到的，除自交不親和外，F(xiàn)2群體容易配制，提供的變異類型最為豐富，能同時(shí)估計(jì)加性和顯性效應(yīng)，但F2群體存在兩個(gè)缺點(diǎn)，一是存在雜合基因型，對(duì)于顯性標(biāo)記，將無法識(shí)別顯性純合基因型和雜合基因型，因此會(huì)降低QTL定位的精度。而為了提高精度，減小誤差，則必須使用較大的群體。二是不易長期保存，群體有性繁殖一代后，遺傳結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生變化，為了延長群體的使用時(shí)間，一種方法是對(duì)其進(jìn)行無性繁殖，如進(jìn)行組織培養(yǎng)擴(kuò)繁，但這種方法并不適用于所有植物，且耗資費(fèi)工，另一種方法是使用F2單株的衍生系(F3或F4)，隨機(jī)選取衍生系內(nèi)多個(gè)單株，混合提取DNA以代表原F2單株的DNA組成，這種方法只適用于那些繁殖系數(shù)較大的自花授粉植物(如水稻、小麥等)，且工作量大；(2) BQ群體，群體是由巳與親本之一回交產(chǎn)生的，群體中每一分離的基因座只有兩種基因型，它直接反映了巳代配子的分離比例，因而定位精度要高于F2群體，此外，群體還可以用來檢驗(yàn)雌、雄配子在基因間的重組率上是否存在差異，其方法是比較正、反回交群體中基因的重組率是否不同，例如正回交群體為(AXB)XA，反回交群體為AX (AXB)，則前者反映的是雌配子中的重組率，后者反映的是雄配子中的重組率，但群體與F2群體一樣，存在不能長期保存的問題，可以用F2群體使用的類似辦法來延長群體的使用時(shí)間，另外，該群體由于只有兩種基因型，提供的信息量少于F2群體，因此只能估計(jì)顯性效應(yīng)，不能估計(jì)加性效應(yīng)，而且，對(duì)于一些人工雜交比較困難的植物，由于難以建立較大的群體和容易出現(xiàn)假雜種，群體也不太適合，對(duì)于一些自交不親和的材料，可以使用三交群體，即(AXB)XC，由于存在自交不親和性，這樣的三交群體不存在假雜種現(xiàn)象，(3) RIL群體，RIL群體是雜種后代經(jīng)多代自交而產(chǎn)生，通常從F2代開始，采用單粒傳的方法來建立，由于自交的作用，群體中每個(gè)株系都是純合的，因而RIL群體是一種永久性分離群體，可以長期使用，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，因此特別適合于QTL定位研究。但該群體亦有兩個(gè)不足，其一是異花授粉植物由于存在自交衰退現(xiàn)象，建立RIL群體比較困難，其二是相對(duì)于F2群體，RIL群體的構(gòu)建時(shí)間較長，理論上，建立一個(gè)通常使用的包含100-200個(gè)株系的RIL群體，必須自交多代才能達(dá)到完全純合，為了節(jié)省構(gòu)建時(shí)間，在實(shí)際研究中，人們往往使用自交6-7代的"準(zhǔn)"RIL群體，從理論上推算，自交6代后，單個(gè)基因座的雜合率只有大約3%，已基本接近純合，但由于涉及大量的DNA標(biāo)記座位，因而雖然多數(shù)標(biāo)記座位已達(dá)到或接近完全純合，仍然有一些標(biāo)記座位存在較高的雜合率，有的高達(dá)20%以上(李維明等，2000)，盡管如此，實(shí)踐證明，利用這樣的"準(zhǔn)"RIL群體來進(jìn)行QTL定位仍是可行的，在RIL群體中，每一分離座位上只存在兩種基因型，且比例為1 : l，從這點(diǎn)看，RIL群體的遺傳結(jié)構(gòu)與BQ群體相似，也反映了^配子的分離比例。但RIL群體中兩個(gè)標(biāo)記座位之間的重組率比例并不等于巳配子的重組值，這是因?yàn)樵诮IL群體的過程中，兩標(biāo)記座位間每一代都會(huì)發(fā)生重組，所以RIL群體中得到的重組率是多代重組率的積累，不過用RIL群體仍然可以估計(jì)重組率，亦即仍然可以進(jìn)行QTL定位，(4)DH群體，DH群體是由單倍體經(jīng)過染色體加倍形成的，DH群體產(chǎn)生的途徑很多，亦因物種不同而異，最常用的方法是取巳植株的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，然后對(duì)染色體進(jìn)行加倍產(chǎn)生DH植株，DH植株是純合的，自交即產(chǎn)生純系，因而DH群體也是一種永久性分離群體，可以跟RIL群體一樣，長期使用，重復(fù)試驗(yàn)，因此也特別適合于QTL定位研究，另外，由于DH群體的遺傳結(jié)構(gòu)直接反映了F工配子的分離比例，因此DH群體跟BQ群體一樣，QTL定位的精度是最高的，DH群體的建立所需時(shí)間不多，但產(chǎn)生DH植株有賴于花藥培養(yǎng)技術(shù)，有些植物的花培非常困難，無法建立DH群體，另外，植物的花培能力跟基因型的關(guān)系較大，因而花培過程中會(huì)對(duì)不同基因型的花粉產(chǎn)生選擇效應(yīng)，從而破壞DH群體的遺傳結(jié)構(gòu)，造成嚴(yán)重的偏分離現(xiàn)象，這會(huì)影響QTL定位的精度，上述兩類分離群體各有其優(yōu)缺點(diǎn)，臨時(shí)性群體容易獲得，而且能提供豐富的遺傳信息，因此，早期QTL定位多用這類群體，但這類群體中分離單位是個(gè)體， 一經(jīng)自交其遺傳組成就會(huì)發(fā)生變化，無法永久使用，很難進(jìn)行多年多點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，永久性分離群體雖然構(gòu)建時(shí)間較長或難度較大，而且不能估計(jì)顯性效應(yīng)(無雜合基因型)，但這類群體中分離單位是株系，不同株系間存在基因型的差異，而株系內(nèi)個(gè)體間的基因型是相同且純合的，可通過自交或近交繁殖后代，而不會(huì)改變?nèi)后w的遺傳組成，可以永久使用，因此可以進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，減小誤差，增加QTL檢測(cè)的準(zhǔn)確性，因而當(dāng)今QTL定位越來越多地采用永久性分離群體(徐云碧等，1994)。3.群體大小QTL定位的精度，很大程度上取決于群體的大小，群體越大，則定位的精度越高，但群體太大，不僅增大實(shí)驗(yàn)工作量，而且增加費(fèi)用，因此確定合適的群體大小是十分必要的，一般常根據(jù)兩個(gè)方面來確定群體的大小(l)研究目的如果分離群體只是用于構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜，則可以用較小的群體；如果用于定位控制重要農(nóng)藝性狀，尤其是數(shù)量性狀的基因，則需要較大的群體；(2)群體類型一般而言，F(xiàn)2群體的大小必須比BQ大約大一倍，才能達(dá)到與BQ群體相當(dāng)?shù)木?，這是因?yàn)镕2群體中存在更多種類的基因型，為了保證每種基因型都有可能出現(xiàn)，就必須使用較大的群體，所以說群體的定位精度比F2高，而DH群體的精度與相當(dāng)，RIL群體則稍差，總的來說，為了達(dá)到彼此相當(dāng)?shù)腝TL定位精度，所需的群體大小的順序?yàn)镕2 > RIL > BC!和DH。
全文摘要
本發(fā)明QTL定位原理，QTL(quantitative trait locus)即數(shù)量性狀位點(diǎn)，是指控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置，基于多基因假說的經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)通過一些遺傳設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)模型，把控制某一數(shù)量性狀的多基因系統(tǒng)作為一個(gè)整體來研究，利用一些遺傳參數(shù)如遺傳力和遺傳方差來描述數(shù)量性狀的遺傳特征。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101760541SQ20081023863
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者李祥 申請(qǐng)人:李祥