專利名稱：：一種用于檢測(cè)甲型流感病毒載量的標(biāo)準(zhǔn)品及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株(A/FM/1/47-MA株)載量的標(biāo)準(zhǔn)品以及用該標(biāo)準(zhǔn)品通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(Real-timeRT-PCR法)檢測(cè)甲型流感病毒A/FM/1/47-MA株載量的方法。
背景技術(shù)：
：流行性感冒(influenza,簡(jiǎn)稱流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一種傳染性強(qiáng)、傳播速度快的疾病。其主要通過空氣中的飛沫、人與人之間的接觸或與被污染物品的接觸傳播。典型的臨床癥狀是急起高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度呼吸道癥狀。一般秋冬季節(jié)是其高發(fā)期，所引起的并發(fā)癥和死亡現(xiàn)象非常嚴(yán)重。流感病毒分為甲、乙、丙三型，甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的。甲型流感病毒(InfluenzaA，F(xiàn)lu-A)是一類致病率極高的上呼吸道感染病毒，發(fā)病人群可達(dá)80%90%。而且其不但會(huì)感染人，也可感染豬、雞等動(dòng)物，常會(huì)引起大規(guī)?；蚓植康牧餍?，甲型流感病毒的持續(xù)流行給人們的健康、生活以及社會(huì)公共防疫系統(tǒng)帶來了極大的干擾和壓力。目前常用來檢測(cè)流感病毒的方法有(1)紅細(xì)胞凝集及凝集抑制試驗(yàn)。這種方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，同時(shí)必須具備一定血凝效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)病毒和新鮮制備的紅細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)者需具備足夠經(jīng)驗(yàn)。(2)免疫學(xué)鑒定。常用免疫組織化學(xué)法和酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)感染組織中的流感的抗原和抗體，這種方法敏感性低，因不同亞型毒株間易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，因此不能做到定量?，F(xiàn)有流感病毒檢測(cè)方法主要用于鑒定流感病毒，尚不能對(duì)流感病毒載量進(jìn)行測(cè)定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)甲型流感病毒A/FM/l/47-MA株載量的標(biāo)準(zhǔn)品，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種用該標(biāo)準(zhǔn)品通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(Real-timeRT-PCR法)檢測(cè)甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株(A/FM/l/47-MA株)載量的方法。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的用于檢測(cè)甲型流感病毒載量的標(biāo)準(zhǔn)品，其包含用引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得核酸片段，其中所述病毒基因序列的引物對(duì)分別是5'-AAACCCAGAATGCGMTCAC-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';5'-AAACCCAGAATGCGAATCAC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-CACCCCATAGCACMGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';或5'-GGCCCAAACACAACATAACC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10所示。本發(fā)明用上述標(biāo)準(zhǔn)品通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)方法(RT-PCR法)檢測(cè)甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株(A/FM/l/47-MA)載量的方法包括如下步驟(1)制作標(biāo)本取小鼠，用乙醚輕度麻醉，以2個(gè)TCID50流感病毒液滴鼻感染，每只小鼠0.05ml,分別在感染后取小鼠解剖取肺組織，凍存于-80'C，備用；(2)甲型流感病毒核酸(RNA)的提取及含量測(cè)定總RNA提取將上述標(biāo)本的肺組織放入研缽中，加入液氮，研磨，待組織變軟，再加液氮，再研磨；將研碎的小鼠肺組織轉(zhuǎn)入離心管中，加入Trizol試劑，每50100mg小鼠肺組織加入lmlTrizol試劑，混合至重懸；水平放置離心管，室溫孵育20min，于4。C下12000rpm離心10min;移上清液入l.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，搖動(dòng)小指管15s,室溫孵育23min;于4。C下12000rpm離心15min;移上層水相到l.5ml離心管中，加入O.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育30min,于4。C下12000rpm離心10min，棄上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4t:下7500rpni離心5min，棄上清液，干燥沉淀，得總RNA;總RNA含量測(cè)定總RNA用DEPC處理水(RNase-free)稀釋60倍，用核酸定量?jī)x內(nèi)置的RNA測(cè)定程序讀取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白質(zhì)含量，0D260/0D280比值為1.82.0的RNA保留，備用；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將上述提取的RNA用30p1焦碳酸二乙酯處理滅菌，用蒸餾水溶解，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用隨機(jī)引物法合成互補(bǔ)DNA;(4)標(biāo)準(zhǔn)品的制備以互補(bǔ)DNA為模板，加入引物對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，其中使用的引物對(duì)是-5'-AAACCCAGAATGCGMTCAC-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';5,-AAACCCAGAATGCGMTCAC-3,和5,-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-CACCCCATAGCACMGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';或5'-GGCCCAAACACAACATAACC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:IO所示;將擴(kuò)增完畢的PCR產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi).5%的5XTris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物切下，采用PCR產(chǎn)物純化柱提取純化PCR產(chǎn)物，用紫外分光光度法計(jì)測(cè)260nm處的吸光度值的值(A26。)，計(jì)算每mlPCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)，公式為拷貝數(shù)/ml=6.02X1023XCXA26。/MW"其中C=5X1(T5/ml,MW產(chǎn)PCR產(chǎn)物的分子量二堿基數(shù)X6.58X102,用無菌超純水將PCR產(chǎn)物調(diào)整至每ml1.0X1(T拷貝，得標(biāo)準(zhǔn)品，置-2(TC保存，備用；(5)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)(Real-timePCR)檢測(cè)反應(yīng)總體積為25li1，反應(yīng)體系含10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品的互補(bǔ)DNA或以同法制備的樣品的互補(bǔ)DNA2ul，濃度為20pmol/ul的每種引物各lyl，PowerSYBRGREEN12.5yl,用滅菌雙蒸水補(bǔ)足到25u1;Real-timePCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，循環(huán)條件為95。C預(yù)變性10min;95°C，15s變性；60°C，60s退火與延伸，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，分別得到標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的擴(kuò)增曲線和Ct值。(6)結(jié)果計(jì)算與分析利用樣本擴(kuò)增后的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)其起始拷貝數(shù)，數(shù)值使用0pticonMonitor3軟件得出。圖l:常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果；圖2:Real-timePCR的動(dòng)力學(xué)曲線；圖3:Real-timePCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4:Real-timePCR擴(kuò)增流感病毒基因的溶解曲線圖5:不同時(shí)間點(diǎn)甲型流感病毒載量比較。本發(fā)明屬于分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種用于檢測(cè)甲型流感病毒載量的質(zhì)粒以及用該質(zhì)粒通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)方法(RT-PCR法)檢測(cè)甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株載量的方法。本發(fā)明檢測(cè)甲型流感病毒載量與常規(guī)PCR檢測(cè)方法相比，具有高度的靈敏度，并且具有較好的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明檢測(cè)方法還具有較好的特異性和重復(fù)性，適合應(yīng)用于對(duì)甲型流感病毒載量的檢測(cè)。下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例1Real-timePCR檢測(cè)方法的靈敏度常規(guī)PCR檢測(cè)方法的靈敏度用10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(1.0X1011.0X107拷貝)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)3次，結(jié)果顯示1.0X1031.0X107拷貝檢出率為3/3，1.0X102拷貝檢出率為l/3，PCR產(chǎn)物經(jīng)2呢瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如附圖l所示。Real-timePCR檢測(cè)方法的靈敏度用10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品aOXl(V1.0Xl()7拷貝)為模板，用本發(fā)明建立的Rea1-timePCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示濃度在102拷貝以上的反應(yīng)體系有明顯的熒光增加，而101拷貝和陰性對(duì)照均無熒光增加，如附圖2。結(jié)果表明以PCR模板濃度來定義，常規(guī)PCR反應(yīng)最低檢出限為1.0X103拷貝，而本發(fā)明Real-timePCR檢測(cè)體系的最低檢出限為102拷貝，即Real-timePCR檢出限比常規(guī)PCR低1個(gè)數(shù)量級(jí)。實(shí)驗(yàn)例2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(1.oxi(yi.oxio7拷貝)為模板，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增結(jié)束后，用0pticonMonitor3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為x軸，Ct值為y軸做回歸曲線，即得流感病毒A/FM/1/47-MA株的檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見附圖3)。該曲線的斜率為-3.294，相關(guān)系數(shù)為0.984，擴(kuò)增效率為101.2%。結(jié)果顯示在102107拷貝范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)例3Real-timePCR檢測(cè)方法的特異性對(duì)Real-timePCR擴(kuò)增流感病毒基因的溶解曲線圖(附圖4)的分析可見，流感病毒基因的PCR產(chǎn)物為單一峰，Tm值的標(biāo)準(zhǔn)差很小為O.28(見表l)，PCR產(chǎn)物大小經(jīng)凝膠電泳進(jìn)行確定均為預(yù)期大小(見附圖l)。對(duì)溶解曲線的分析顯示引物二聚體的Tm值較特異性產(chǎn)物低，二者可以區(qū)分(見附圖4)。因此，所建立的Real-timePCR體系具有很好的特異性。表lPCR產(chǎn)物溶解溫度表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>用3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了批內(nèi)(6批重復(fù)試驗(yàn))和批間(3批)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的比較，結(jié)果見表2:_表2Real-timePCR檢測(cè)的批內(nèi)和批間實(shí)驗(yàn)的Ct值及其變異系數(shù)_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a-c:不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品；d:陽性肺組織樣本；AvgCt:Ct值均值；CV:Ct值變異系數(shù)批內(nèi)實(shí)驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)(CV)分別為1.26%、1.63%和0.28%，批間實(shí)驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)相應(yīng)為1.05%、0.28%和0.49%。任取1份樣品分6次進(jìn)行RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行Real-timePCR檢測(cè)，Ct值平均數(shù)為21.90±0.85，CV是3.88%。上述結(jié)果說明，在相同條件下，所建立的Real-timePCR檢測(cè)體系具有很好的重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)例5小鼠肺組織標(biāo)本的病毒載量檢測(cè)在流感病毒A/FM/l/47-MA株感染小鼠第l、2、3、5、7、10、12天后檢測(cè)肺組織病毒載量，對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行了比較。結(jié)果見附圖5:結(jié)果表明在感染后第1天即可檢測(cè)到病毒載量，24天表達(dá)量較高，第3天病毒載量達(dá)到高峰，隨后病毒載量降低，第12天時(shí)已檢測(cè)不到病毒表達(dá)。下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:檢測(cè)甲型流感病毒A/FM/l/47-MA株載量的方法(1)制作標(biāo)本昆明小鼠42只，1215g，雌性，健康；用乙醚輕度麻醉，以2個(gè)TCID50流感病毒液滴鼻感染，每只小鼠0.05ml，分別在感染后第l、2、3、5、7、10、12天取小鼠解剖取肺組織，凍存于-80'C，備用；(2)甲型流感病毒核酸(RNA)的提取及含量測(cè)定總RNA提取將上述標(biāo)本的肺組織放入研缽中，加入液氮，研磨，待組織變軟，再加液氮，再研磨；將研碎的小鼠肺組織轉(zhuǎn)入離心管中，加入Trizol試劑，每50100mg小鼠肺組織加入lmlTrizol試劑，混合至重懸；水平放置離心管，室溫孵育20min，于4。C下12000rpm離心10min;移上清液入l.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，搖動(dòng)小指管15s，室溫孵育23min;于4'C下12000rpm離心15min;移上層水相到l.5ml離心管中，加入O.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育30min，于4。C下12000rpm離心10min，棄上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下7500rpm離心5min，棄上清液，干燥沉淀，得總RNA;總RNA含量測(cè)定總RNA用DEPC處理水(RNase-free)稀釋60倍，用核酸定量?jī)x內(nèi)置的RNA測(cè)定程序讀取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白質(zhì)含量，OD260/OD280比值為1.82.0的RNA保留，備用；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將上述提取的RNA用30u1焦碳酸二乙酯處理滅菌，用蒸餾水溶解，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用隨機(jī)引物法合成互補(bǔ)DNA;(4)標(biāo)準(zhǔn)品的制備以互補(bǔ)DNA為模板，加入引物對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，其中使用的引物對(duì)是5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';上述引物依次如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。將擴(kuò)增完畢的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5呢的5XTris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物切下，采用PCR產(chǎn)物純化柱提取純化PCR產(chǎn)物，用紫外分光光度法計(jì)測(cè)260nm處的吸光度值的值(A26Q)，計(jì)算每mlPCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)，公式為拷貝數(shù)/ml=6.02X1023XCXA26。/MW"其中C=5X10—5/ml，匿FPCR產(chǎn)物的分子量^堿基數(shù)X6.58X102，用無菌超純水將PCR產(chǎn)物調(diào)整至每ml1.0X10"拷貝，得標(biāo)準(zhǔn)品，置-2(TC保存，備用；(5)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)(Real-timePCR)檢測(cè)反應(yīng)總體積為25u1，反應(yīng)體系含10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品的互補(bǔ)DNA或以同法制備的樣品的互補(bǔ)DNA2ixl，濃度為20pmol/ul的每種引物各lul，PowerSYBRGREEN12.5ul，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足到25u1;Real-timePCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，循環(huán)條件為95"C預(yù)變性10min;95°C，15s變性；60°C,60s退火與延伸，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，分別得到標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的擴(kuò)增曲線和Ct值。(6)結(jié)果計(jì)算與分析利用樣本擴(kuò)增后的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)其起始拷貝數(shù)，數(shù)值使用OpticonMonitor3軟件得出，六批小鼠肺組織中甲型流感病毒A/FM/1/47-MA株載量分別是見表3:表3實(shí)施例1得出的六批小鼠肺組織中甲型流感病毒A/FM/l/47-MA株載量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例2:檢測(cè)甲型流感病毒A/FM/l/47-MA株載量的方法(1)制作標(biāo)本取小鼠，用乙醚輕度麻醉，以2個(gè)TCID50流感病毒液滴鼻感染，每只小鼠0.05ml，分別在感染后取小鼠解剖取肺組織，凍存于-8(TC，備用；(2)甲型流感病毒核酸(RNA)的提取及含量測(cè)定總RNA提取將上述標(biāo)本的肺組織放入研缽中，加入液氮，研磨，待組織變軟，再加液氮，再研磨；將研碎的小鼠肺組織轉(zhuǎn)入離心管中，加入Trizol試劑，每50100mg小鼠肺組織加入lmlTrizol試劑，混合至重懸；水平放置離心管，室溫孵育20min，于4。C下12000rpm離心10min;移上清液入l.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，搖動(dòng)小指管15s，室溫孵育23min;于4'C下12000rpm離心15min;移上層水相到l.5ml離心管中，加入O.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育30min，于4。C下12000rpm離心10min，棄上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下7500rpm離心5min，棄上清液，干燥沉淀，得總RNA;總RNA含量測(cè)定總RNA用DEPC處理水(RNase-free)稀釋60倍，用核酸定量?jī)x內(nèi)置的RNA測(cè)定程序讀取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白質(zhì)含量，OD260/OD280比值為1.82.O的RNA保留，備用；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將上述提取的RNA用30yl焦碳酸二乙酯處理滅菌，用蒸餾水溶解，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用隨機(jī)引物法合成互補(bǔ)DNA;(4)標(biāo)準(zhǔn)品的制備以互補(bǔ)DNA為模板，加入引物對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，其中使用的引物對(duì)是5,-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';上述引物依次如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示;將擴(kuò)增完畢的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5y。的5XTris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物切下，采用PCR產(chǎn)物純化柱提取純化PCR產(chǎn)物，用紫外分光光度法計(jì)測(cè)260nm處的吸光度值的值(A26。)，計(jì)算每mlPCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)，公式為拷貝數(shù)/ml=6.02X1023XCXA26。/MW"其中C=5X1(T5/ml,麗產(chǎn)PCR產(chǎn)物的分子量=堿基數(shù)乂6.58X102，用無菌超純水將PCR產(chǎn)物調(diào)整至每ml1.0X1(T拷貝，得標(biāo)準(zhǔn)品，置-2(TC保存，備用；(5)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)(Real-timePCR)檢測(cè)反應(yīng)總體積為25u1，反應(yīng)體系含10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品的互補(bǔ)DNA或以同法制備的樣品的互補(bǔ)DNA2ul，濃度為20pmol/yl的每種引物各lul，PowerSYBRGREEN12.5ul，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足到25u1;Real-timePCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，循環(huán)條件為95。C預(yù)變性10min;95°C，15s變性；6CTC，60s退火與延伸，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，分別得到標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的擴(kuò)增曲線和Ct值。(6)結(jié)果計(jì)算與分析利用樣本擴(kuò)增后的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)其起始拷貝數(shù)，數(shù)值使用OpticonMonitor3軟件得出，六批小鼠肺組織中甲型流感病毒A/FM/l/47-MA株載量分別是見表4:表4實(shí)施例2得出的六批小鼠肺組織中甲型流感病毒A/FM/l/47-MA株載量<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例3:檢測(cè)甲型流感病毒A/FM/l/47-MA株載量的方法(1)制作標(biāo)本取小鼠，用乙醚輕度麻醉，以2個(gè)TCID50流感病毒液滴鼻感染，每只小鼠0.05ml，分別在感染后取小鼠解剖取肺組織，凍存于-80°C，備用；(2)甲型流感病毒核酸(RNA)的提取及含量測(cè)定總RNA提取將上述標(biāo)本的肺組織放入研缽中，加入液氮，研磨，待組織變軟，再加液氮，再研磨；將研碎的小鼠肺組織轉(zhuǎn)入離心管中，加入Trizol試劑，每50100mg小鼠肺組織加入lmlTrizol試劑，混合至重懸；水平放置離心管，室溫孵育20min，于4"下12000rpm離心10min;移上清液入l.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，搖動(dòng)小指管15s，室溫孵育23min;于4'C下12000rpm離心15min;移上層水相到l.5ml離心管中，加入O.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育30min，于4T:下12000rpni離心10min，棄上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下7500rpm離心5min，棄上清液，干燥沉淀，得總RNA;總RNA含量測(cè)定總RNA用DEPC處理水(RNase-free)稀釋60倍，用核酸定量?jī)x內(nèi)置的RNA測(cè)定程序讀取RNA含量、0D260值、OD260/OD280、蛋白質(zhì)含量，0D260/0D280比值為1.82.0的RNA保留，備用；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將上述提取的RNA用30ul焦碳酸二乙酯處理滅菌，用蒸餾水溶解，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用隨機(jī)引物法合成互補(bǔ)DNA;(4)標(biāo)準(zhǔn)品的制備以互補(bǔ)DNA為模板，加入引物對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，其中使用的引物對(duì)是5'-GGCCCAAACACAACATAACC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';上述引物依次如SEQIDNO:9和SEQIDNO:IO所示;將擴(kuò)增完畢的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.59()的5XTris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物切下，采用PCR產(chǎn)物純化柱提取純化PCR產(chǎn)物，用紫外分光光度法計(jì)測(cè)260nm處的吸光度值的值(A26。)，計(jì)算每mlPCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)，公式為拷貝數(shù)/ml=6.02X1023XCXA260/MW"其中C=5X10-5/ml,MWfPCR產(chǎn)物的分子量二堿基數(shù)X6.58X102，用無菌超純水將PCR產(chǎn)物調(diào)整至每ml1.0X1(T拷貝，得標(biāo)準(zhǔn)品，置-20'C保存，備用；(5)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)(Real-timePCR)檢測(cè)反應(yīng)總體積為25u1，反應(yīng)體系含10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品的互補(bǔ)DNA或以同法制備的樣品的互補(bǔ)DNA2u1，濃度為20pmol/yl的每種引物各lu1，PowerSYBRGREEN12.5ul，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足到25u1;Real-timePCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，循環(huán)條件為95。C預(yù)變性10min;95°C,15s變性；60°C，60s退火與延伸，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，分別得到標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的擴(kuò)增曲線和Ct值。(6)結(jié)果計(jì)算與分析利用樣本擴(kuò)增后的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)其起始拷貝數(shù)，數(shù)值使用OpticonMonitor3軟件得出，六批小鼠肺組織中甲型流感病毒A/FM/l/47-MA株載量分別是見表5:表5實(shí)施例3得出的六批小鼠肺組織中甲型流感病毒A/FM/1/47-MA株載量<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>SEQIDNO:15-AAACCCAGAATGCGAATCAC-3'SEQIDNO:25-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC隱3'SEQIDNO:35-AAACCCAGAATGCGAATCAC-3'SEQIDNO:45-CACCCCATAGCACAAGGACT-3'SEQIDNO:55-GGAGCATGTTACCCAGGAGA隱3'SEQIDNO:65-CACCCCATAGCACAAGGACT-3'SEQIDNO:75-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'SEQIDNO:85-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3'SEQIDNO:95-GGCCCAAACACAACATAACC-3'SEQIDNO:10:5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3'Untitledl.ST25.txtSEQUENCELISTING〈110〉崔，曉蘭〈120>—種用于檢測(cè)甲型流感病毒載量的標(biāo)準(zhǔn)品及其檢測(cè)方法〈130〉000〈160〉10〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉1gLgLgicccagaeitgcgaatcac20〈210〉2〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉2gctcagctttgggtatgagcUntitledl.ST25.txt〈210〉3〈211〉20〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉3犯acccsg8atgcg88tcac20〈210〉4〈211〉20〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉4caccccatagcacaaggact20〈210〉5〈211〉20〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉5ggagcatgttacccaggaga20Untitledl.ST25.txt〈210〉6〈211〉20〈212〉腿〈213>人工序列〈400〉6caccccatagcacaaggact20〈210〉7〈211>20〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉7ggagCgltgtt2LCCCaggaga20〈210〉8〈211〉20〈212>腿〈213〉人工序列〈400〉8gctcagctttgggtatgagc20Untitledl.ST25.txt〈210〉9〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9ggcccaaacacaacataacc1:20〈210〉10〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉10caccccatagcacggact20權(quán)利要求1、一種用于檢測(cè)甲型流感病毒載量的標(biāo)準(zhǔn)品，是用引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得核酸片段，其特征在于所述病毒基因序列的引物對(duì)分別是5′-AAACCCAGAATGCGAATCAC-3′和5′-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3′；5′-AAACCCAGAATGCGAATCAC-3′和5′-CACCCCATAGCACAAGGACT-3′；5′-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3′和5′-CACCCCATAGCACAAGGACT-3′；5′-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3′和5′-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3′；或5′-GGCCCAAACACAACATAACC-3′和5′-CACCCCATAGCACAAGGACT-3′；上述引物依次如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10所示。2、如權(quán)利要求l所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于該標(biāo)準(zhǔn)品由如下方法制成:(1)制作標(biāo)本取小鼠，用乙醚輕度麻醉，以2個(gè)TCID50流感病毒液滴鼻感染，每只小鼠0.05ml，分別在感染后取小鼠解剖取肺組織，凍存于-8(TC，備用；(2)甲型流感病毒核酸RNA的提取及含量測(cè)定總RNA提取將上述標(biāo)本的肺組織放入研缽中，加入液氮，研磨，待組織變軟，再加液氮，再研磨；將研碎的小鼠肺組織轉(zhuǎn)入離心管中，加入Trizol試劑，每50100mg小鼠肺組織加入lmlTrizol試劑，混合至重懸；水平放置離心管，室溫孵育20min，于4。C下12000rpm離心10min;移上清液入l.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，搖動(dòng)小指管15s，室溫孵育23min;于4。C下12000rpm離心15min;移上層水相到l.5ml離心管中，加入O.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育30min，于4。C下12000rpm離心10min，棄上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下7500rpm離心5min，棄上清液，干燥沉淀，得總RNA;總RNA含量測(cè)定總RNA用DEPC處理水稀釋60倍，用核酸定量?jī)x內(nèi)置的RNA測(cè)定程序讀取RNA含量、OD260值、0D260/0D280、蛋白質(zhì)含量，0D260/0D280比值為1.82.0的RNA保留，備用；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將上述提取的RNA用30ixl焦碳酸二乙酯處理滅菌，用蒸餾水溶解，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用隨機(jī)引物法合成互補(bǔ)DNA;(4)標(biāo)準(zhǔn)品的制備以互補(bǔ)DNA為模板，加入引物對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，其中使用的引物對(duì)是-5'-AAACCCAGAATGCGAATCAC-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';5'-嵐CCCAGAATGCGAATCAC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';或5'-GGCCCAAACACAACATAACC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10所示；將擴(kuò)增完畢的PCR產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi).5%的5XTris-硼酸TBE瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物切下，采用PCR產(chǎn)物純化柱提取純化PCR產(chǎn)物，用紫外分光光度法計(jì)測(cè)260nm處的吸光度值的值，即A26。，計(jì)算每mlPCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)，公式為拷貝數(shù)/ml=6.02X1023XCXA26。/麗"其中C=5X10—5/ml,麗產(chǎn)PCR產(chǎn)物的分子量二堿基數(shù)X6.58X102，用無菌超純水將PCR產(chǎn)物調(diào)整至每ml1.0X10"拷貝，得標(biāo)準(zhǔn)品，置-20'C保存，備用。3、如權(quán)利要求1或2任一所述的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，是用引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得核酸片段，其特征在于該方法中所述病毒基因序列的引物對(duì)分別是5'—AAACCCAGAATGCGMTCAC-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';5'-AAACCCAGAATGCGAATCAC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT—3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';或5'-GGCCCAAACACAACATAACC-3,和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10所示。4、如權(quán)利要求1或2任一所述的標(biāo)準(zhǔn)品制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)制作標(biāo)本取小鼠，用乙醚輕度麻醉，以2個(gè)TCID50流感病毒液滴鼻感染，每只小鼠0.05ml,分別在感染后取小鼠解剖取肺組織，凍存于-8(TC，備用；(2)甲型流感病毒核酸RNA的提取及含量測(cè)定總RNA提取將上述標(biāo)本的肺組織放入研缽中，加入液氮，研磨，待組織變軟，再加液氮，再研磨；將研碎的小鼠肺組織轉(zhuǎn)入離心管中，加入Trizol試劑，每50100mg小鼠肺組織加入lmlTrizol試劑，混合至重懸；水平放置離心管，室溫孵育20min,于4。C下12000rpm離心10min;移上清液入l.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，搖動(dòng)小指管15s，室溫孵育23min;于4。C下12000rpm離心15min;移上層水相到l.5ml離心管中，加入O.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育30min，于4。C下12000rpm離心10min，棄上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下7500rpm離心5min，棄上清液，干燥沉淀，得總RNA;總RNA含量測(cè)定總RNA用DEPC處理水稀釋60倍，用核酸定量?jī)x內(nèi)置的RNA測(cè)定程序讀取RNA含量、OD260值、0D260/0D280、蛋白質(zhì)含量，0D260/0D280比值為1.82.0的RNA保留，備用；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將上述提取的RNA用30ul焦碳酸二乙酯處理滅菌，用蒸餾水溶解，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用隨機(jī)引物法合成互補(bǔ)DNA;(4)標(biāo)準(zhǔn)品的制備以互補(bǔ)DNA為模板，加入引物對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，其中使用的引物對(duì)是5'-AAACCCAGAATGCGMTCAC-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';5'-AAACCCAGAATGCGAATCAC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';或5'-GGCCCAAACACAACATAACC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10所示；將擴(kuò)增完畢的PCR產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi).5%的5XTris-硼酸TBE瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物切下，采用PCR產(chǎn)物純化柱提取純化PCR產(chǎn)物，用紫外分光光度法計(jì)測(cè)260nm處的吸光度值的值，即A26。，計(jì)算每mlPCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)，公式為拷貝數(shù)/ml=6.02X1023XCXA260/MW"其中C=5X10-5/ml，麗=PCR產(chǎn)物的分子量:堿基數(shù)X6.58X102，用無菌超純水將PCR產(chǎn)物調(diào)整至每mll.OXl(T拷貝，得標(biāo)準(zhǔn)品，置-2(TC保存，備用。5、如權(quán)利要求1或2任一所述的標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)甲型流感病毒A/FM/1/47-MA株載量中的應(yīng)用。6、一種檢測(cè)甲型流感病毒A/FM/l/47-MA株載量的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)制作標(biāo)本取小鼠，用乙醚輕度麻醉，以2個(gè)TCID50流感病毒液滴鼻感染，每只小鼠0.05ml，分別在感染后取小鼠解剖取肺組織，凍存于-8(TC，備用；(2)甲型流感病毒核酸RNA的提取及含量測(cè)定總RNA提取將上述標(biāo)本的肺組織放入研缽中，加入液氮，研磨，待組織變軟，再加液氮，再研磨；將研碎的小鼠肺組織轉(zhuǎn)入離心管中，加入Trizol試劑，每50100mg小鼠肺組織加入lmlTrizol試劑，混合至重懸；水平放置離心管，室溫孵育20min，于4。C下12000rpm離心10min;移上清液入l.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，搖動(dòng)小指管15s，室溫孵育23min;于4°(3下12000rpm離心15min;移上層水相到l.5ml離心管中，加入O.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育30min，于4"C下12000rpm離心10min，棄上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4r下7500rpm離心5min，棄上清液，干燥沉淀，得總RNA;總RNA含量測(cè)定總RNA用DEPC處理水稀釋60倍，用核酸定量?jī)x內(nèi)置的RNA測(cè)定程序讀取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白質(zhì)含量，0D260/0D280比值為1.82.0的靈保留，備用；(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將上述提取的RNA用30u1焦碳酸二乙酯處理滅菌，用蒸餾水溶解，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用隨機(jī)引物法合成互補(bǔ)DNA;(4)標(biāo)準(zhǔn)品的制備以互補(bǔ)DNA為模板，加入引物對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，其中使用的引物對(duì)是5'-AAACCCAGAATGCGMTCAC-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';5'-AAACCCAGAATGCGMTCAC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';5,-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3,和5'-CACCCCATAGCACMGGACT-3';5'-GGAGCATGTTACCCAGGAGA-3'和5'-GCTCAGCTTTGGGTATGAGC-3';或5'-GGCCCAAACACAACATAACC-3'和5'-CACCCCATAGCACAAGGACT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10所示；將擴(kuò)增完畢的PCR產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi).5%的5XTris-硼酸TBE瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物切下，采用PCR產(chǎn)物純化柱提取純化PCR產(chǎn)物，用紫外分光光度法計(jì)測(cè)260nm處的吸光度值的值，即A腳，計(jì)算每mlPCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)，公式為拷貝數(shù)/ml=6.02X1023XCXA26。/MW"其中C=5X10—5/ml，MW產(chǎn)PCR產(chǎn)物的分子量二堿基數(shù)X6.58X102，用無菌超純水將PCR產(chǎn)物調(diào)整至每mll.OXl(T拷貝，得標(biāo)準(zhǔn)品，置-20'C保存，備用；(5)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)Real-timePCR檢測(cè)反應(yīng)總體積為25u1，反應(yīng)體系含IO倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品的互補(bǔ)DNA或以同法制備的樣品的互補(bǔ)DNA2u1，濃度為20pmol/ul的每種引物各lix1，PowerSYBRGREEN12.5ul，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足到25u1;Real-timePCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，循環(huán)條件為95-C預(yù)變性10min;95°C，15s變性；60°C，60s退火與延伸，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，分別得到標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的擴(kuò)增曲線和Ct值；(6)結(jié)果計(jì)算與分析利用樣本擴(kuò)增后的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)其起始拷貝數(shù)，數(shù)值使用OpticonMonitor3軟件得出。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株(A/FM/1/47-MA株)載量的標(biāo)準(zhǔn)品，以及用該標(biāo)準(zhǔn)品通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(Real-timeRT-PCR法)檢測(cè)甲型流感病毒A/FM/1/47-MA株載量的方法。在檢測(cè)過程中包括甲型流感病毒核酸(RNA)的提取及含量測(cè)定、用引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得核酸片段、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連式反應(yīng)(Real-timePCR)檢測(cè)等步驟，本發(fā)明檢測(cè)甲型流感病毒載量與常規(guī)PCR檢測(cè)方法相比，具有高度的靈敏度，并且具有較好的線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明檢測(cè)方法還具有較好的特異性和重復(fù)性，適合應(yīng)用于對(duì)甲型流感病毒載量的檢測(cè)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101363064SQ20081022362公開日2009年2月11日申請(qǐng)日期2008年9月28日優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日發(fā)明者崔曉蘭,時(shí)宇靜,郭姍姍申請(qǐng)人:崔曉蘭