專利名稱：通過兩步法供氧策略提高發(fā)酵生產(chǎn)l-精氨酸產(chǎn)量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及采用兩步法供氧策略提高發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸產(chǎn)量的方法，更具 體而言，涉及通過在分批發(fā)酵條件下，通過供氧條件的改變，以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-精氨酸的方法。屬于發(fā)酵工程技術領域。
背景技術：
L-精氨酸是人體和動物體內的半必需堿性氨基酸，是合成蛋白質肌酸的重 要原料，也是生物體尿素循環(huán)的一種重要中間代謝產(chǎn)物，具有多種獨特的生理 和藥理作用。L-精氨酸在臨床醫(yī)藥、食品、化妝品以及有關生物研究領域中用 途廣泛。發(fā)酵法是目前L-精氨酸商業(yè)化生產(chǎn)比較有效和經(jīng)濟的方法。
目前發(fā)現(xiàn)供氧水平對于發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸有重要影響。氧氣在好氧發(fā)酵 生產(chǎn)L-精氨酸過程中，通常既是營養(yǎng)因素，又是環(huán)境因素，菌體的新陳代謝與 氧氣呼吸密切有關。氧氣的供應不足可能會導致微生物細胞代謝轉向所不需要 的化合物的產(chǎn)生。
目前利用鈍齒棒桿菌分批發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸采用的是單一供氧模式，但是， 同一種微生物的需氧量隨菌齡和培養(yǎng)條件不同而異，菌體生長和形成代謝產(chǎn)物 時的耗氧量也往往不同。因此，供氧的控制是極其重要的，不僅能合理供氧， 還能為發(fā)酵生產(chǎn)節(jié)約成本。
所以，通過對單一供氧模式下發(fā)酵特征差異的研究，提出一個全新的更適 宜于鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的供氧模式成為持續(xù)的需求。

發(fā)明內容
本發(fā)明的主要目的是建立一個發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的供氧模式來生產(chǎn)高濃度 的L-精氨酸的方法。
本發(fā)明的技術方案 一種通過兩步法供氧策略提高發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸產(chǎn)量 的方法，在鈍齒棒桿菌fCwy"ek "en'wm crem^wmJ SYPW發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸 過程中，0 24h控制轉速600 r/min， 24-30 h控制轉速550 r/min， 30-36 h控制 轉速500r/min， 36-42 h控制轉速450 r/min， 42 h后控制轉速400 r/min，并維持 到發(fā)酵結束。鈍齒棒桿菌^Cw7"Aacfen'wm cww^wmy* SYPW已在中國專利 (03112896.3)公開。
搖瓶培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基以g/L計葡萄糖30，玉米漿20， (NH4)2S04 20，KH2P04 1， MgS04.7H20 0.5，尿素1.5， pH7.0 7.2， 12rC滅菌20min，裝 液量30mL/250mL;培養(yǎng)方法斜面活化培養(yǎng)3rC培養(yǎng)20 24h;種子培養(yǎng) 從斜面上挑取一環(huán)菌體接入液體種子培養(yǎng)基，31°C，于往復搖床上110r/min，培 養(yǎng)15-16h;
發(fā)酵罐培養(yǎng)罐上發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計葡萄糖150，玉米槳4， (NH4)2S04 20， KH2P04 1.5， MgSO4.7H2O0.5, FeS04.7H20 0.02， MnS04.H20 0.02，生 物素8xl(T5， L-組氨酸5x10-4，氨水控制pH 7.0 7.2， 121匸滅菌10 min;裝 液量3L/5L發(fā)酵罐；培養(yǎng)方法5L自控發(fā)酵罐分批發(fā)酵5L發(fā)酵罐中裝液量 3L，接種量5%， 31°C，通風量3L/min，流加氨水控制pH在6.8，通過豆油消 泡，溶氧自動顯示，通過控制所述的攪拌轉速來實現(xiàn)供氧差異。
本發(fā)明運用代謝流量分析的手段，分析了鈍齒棒桿菌(Too^e^cte^w cre"a&m卩SYPW生物合成L-精氨酸的代謝途徑網(wǎng)絡，以及不同溶氧水平對 a^v"e&c&n^m cre"a^m SYPW L-精氨酸合成相關代謝流量分布的影響，溶氧 變化決定和控制L-精氨酸整個代謝網(wǎng)絡，進而在此基礎上提出了合成L-精氨酸 的分階段供氧控制策略。
本發(fā)明的鈍齒棒桿菌分步供氧發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸實驗在5L罐上完成，通過 控制不同的攪拌轉速來實現(xiàn)供氧差異，在鈍齒棒桿菌分批發(fā)酵過程中，在線監(jiān) 測溶氧，離線檢測發(fā)酵過程中菌體干重、葡萄糖消耗、有機酸(丙酮酸、乳酸、 乙酸)和氨基酸的含量。
在已知上述代謝產(chǎn)物的基礎上，運用代謝流量分析的手段，對鈍齒棒桿菌 代謝網(wǎng)絡的流量分布進行分析，探索菌體生長和產(chǎn)酸等發(fā)酵特征對供氧的規(guī)律 性，進而在此基礎上提出新的供氧控制策略，并對該供氧控制策略進行驗證和 分析。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提出了一種新的兩步法供氧策略(NOS)0 24h， 控制轉速600r/min，然后每6h轉速下降50 r/min直至轉速達到400 r/min，并維 持到發(fā)酵結束。運用新的供氧策略后，L-精氨酸的產(chǎn)量比高供氧(HOS)和中供氧 (MOS)分別增加了 16%和51%,而且，葡萄糖的消耗速率的明顯增加，發(fā)酵周 期僅為81h，比HOS條件下提前了 6h。


圖1 C. crenatum SYPW合成L-精氨酸的代謝網(wǎng)絡模型； 圖2溶氧控制模式對L-精氨酸發(fā)酵過程的影響；
I:A:菌體干重;B:葡萄糖濃度；C: L-精氨酸濃度;D: L-精氨酸合成速率；1:
高供氧HOS(令)；2:中供氧MOS—);3:低供氧LOSO).
II:溶氧.l:高供氧HOS;2:中供氧MOS;3:低供氧LOS.
圖3兩步供氧模式與高溶氧(HDO)和中溶氧(MDO)發(fā)酵過程比較
I: A:菌體干重;B:葡萄糖濃度；C: L-精氮酸濃度;D: L-精氨酸合成速率.溶 氧1:高供氧HOS(令)；2:中供氧MOS—); 3:兩步供氧策略NOS ( )。 II:溶氧l:高供氧HOS;2:中供氧MOS;3:兩步供氧策略(NOS)。
圖4HOS、 MOS和NOS條件下不同發(fā)酵階段，a-KG節(jié)點處，TCA循環(huán) Glu/TCA流量分配比(r24/r22)，葡萄糖消耗速率以及ATP生產(chǎn)速率的比較
A:TCA流量分配(r22); B: r24/r22比率；C:葡萄糖消耗速率；D: ATP生成速率。
1:高供氧HOS(令)；2:中供氧MOS(隱)；3:兩步供氧策略NOS (參)。
具體實施例方式
實施例l:溶氧控制模式對L-精氨酸發(fā)酵過程的影響
為了更準確地分析溶氧水平對L-精氨酸發(fā)酵的影響，發(fā)明人將整個發(fā)酵過
程分為四個階段，每個階段都對應于該階段特有的生理狀態(tài)。第一個階段phase I(0~21h)，是從零時刻開始，該階段營養(yǎng)物質基本全部用于菌體生長，尚無目的 產(chǎn)物L-精氨酸合成；第二個階段phase H(21 45h)， L-精氨酸的合成速率及葡萄 糖的消耗速率開始增加，菌體生長趨于穩(wěn)定；第三個階段phase m(45 69h)，產(chǎn) 物合成速率達到最大后迅速下降，并維持在一穩(wěn)定速率；第四個階段phase IV(69 87h)，為衰亡期，菌濃開始下降。
供氧方式的改變對C. cww"&mSYPW的生長，葡萄糖的消耗，L-精氨酸的 合成以及各種因素的相互作用都有很大影響。如圖2所示，在高供氧(以下簡 稱HOS)條件下L-精氨酸的產(chǎn)量為31.1g/L，而在中供氧(以下簡稱MOS)和 低供氧(以下簡稱LOS)條件下的L-精氨酸產(chǎn)量只分別達到16.0g/L和3g/L。 然而，在42 84h (發(fā)酵后期)內，HOS下的L-精氨酸合成速率下降迅速(圖 2.I-D)，而MOS下的L-精氨酸合成速率卻明顯比HOS下穩(wěn)定。這說明高溶氧 水平并不有利于后期L-精氨酸的合成。另外，菌體干重的最大值也是在MOS 條件下的第二階段獲得，這與通常認為的HOS更有利于菌體生長相悖。葡萄糖 作為發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的唯一碳源，菌體對葡萄糖的消耗量越大，L-精氨酸的 合成速率越快，這與實驗結果一致(圖2.1-B)。圖2.11描述了不同供氧模式下， 發(fā)酵過程中溶氧的變化。發(fā)酵開始，三種供氧模式的初始溶氧均設定為100%， 經(jīng)過菌體生長階段，HOS、 MOS、 LOS的溶氧分別下降為70%， 0%和5%。然
后逐漸反彈到75%， 60%和20%，并保持穩(wěn)定直到發(fā)酵結束。
實施例2:不同供氧模式對C. c^"a似m SYPW代謝流量分布的影響 接下來，運用代謝流量分析的方法對MOS和HOS條件下的胞內碳流分布 情況進行分析。
在發(fā)酵過程的第一階段，HOS條件下，用于細胞合成的代謝流量比MOS 條件下多36.3%。從第一階段的代謝流量分布來看，磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PP途徑)在這一階段最為活躍，尤其是流向PP途徑的第一 個反應Q。隨后，無論是HOS還是MOS條件下，隨著發(fā)酵時間的延續(xù)，^逐 漸下降。這是由于中間代謝產(chǎn)物核糖-5-磷酸R5P以及PP途徑的主要作用是合成 核酸和細胞相關成分，另外細胞合成所需的NADPH，有至少40%來自于 NADPH。而&同樣受到供氧水平的影響，也就是說，供氧越大&的值也越大。 在HOS條件下，流入&的流量(55.8)比MOS條件下(47.1)增加18.3%。另 一方面，以葡萄糖作為唯一碳源的發(fā)酵過程，同樣需要相當活躍的糖酵解途徑 EMP來產(chǎn)生合成各種氨基酸和細胞成分的前體物質葡萄糖-6-磷酸G6P，果糖-6-磷 酸F6P， T3P， PG3和磷酸烯醇式丙酮酸PEP。丙酮酸Pyr作為EMP途徑的最后一 個物質和三羧酸循環(huán)TCA的前體物質，流向它的流量(r6)同樣隨供氧的增加 而增加。；另外，HOS下TCA循環(huán)流經(jīng)的代謝流量比MOS條件下小，這可能是 因為流向PP途徑用于合成細胞的流量增多引起的。從以上的分析來看，HOS 條件更有利于細胞生長。
第一階段結束以后，rs由于細胞合成對能量和碳源的需求量下降而降低。而 在第二、三、四、階段，TCA循環(huán)的流量(r21， r22， r23)在HOS和MOS條件 下都有所增加。這表明，活躍的TCA循環(huán)能產(chǎn)生更多的ATP來用于合成L-精 氨酸(L-Arg)，以及維持細胞代謝，供氧越大TCA循環(huán)也越活躍。
從a-酮戊二酸(a-KG)流向谷氨酸(Glu)的"24是一個很重要的反應，這 是因為，谷氨酸是合成L-精氨酸的前體氨基酸。a-KG是TCA循環(huán)中的一個關 鍵的分支點。假設TCA循環(huán)流經(jīng)這個節(jié)點以后的流量足夠維持細胞所有的代謝， 而更多的流量可以流向Glu來合成L-精氨酸的流量越多越好。代謝流量分析表 明，在第三、四階段，TCA循環(huán)于ot-KG節(jié)點之前的流量在HOS和MOS條件 下相當，但是在MOS條件下，從a-KG流向Glu的流量卻更多。這個結果從代 謝流量分析的角度進一步論證了 MOS更有利于在第三、四階段獲得穩(wěn)定的 L-Arg積累。
實施例3:基于代謝流量分析的新的供氧策略的提出及驗證 從上述分析可以得出，要增加L-精氨酸產(chǎn)量必須滿足以下條件(1)整個 發(fā)酵過程的高TCA流量；(2)在發(fā)酵后期(第三、四階段)，a-KG節(jié)點處的高
Glu/TCA (r24/r22)流量分配比；(3)，維持代謝運轉的足夠的ATP生成量。這 意味著，發(fā)酵前期，HOS條件產(chǎn)生的高細胞生長速率和L-精氨酸合成速率；發(fā) 酵后期，MOS條件產(chǎn)生的穩(wěn)定的L-精氨酸合成速率，可能是能獲得更高L-精氨 酸產(chǎn)量的供氧策略。于是，接下來，作者提出了一種新的兩步法供氧策略(NOS): 0 24h，控制轉速600 r/min，然后每6h轉速下降50 r/min直至轉速達到400 r/min,并維持到發(fā)酵結束。這種漸變的供氧模式可以避免發(fā)酵過程中，由于瞬 間的供氧氧變化造成溶氧突變而產(chǎn)生的負面影響。
兩步法供氧策略與單一供氧模式發(fā)酵過程曲線(包括菌體干重、葡萄糖消 耗、L-精氨酸生成及溶氧)的比較如圖3所示。運用新的供氧策略后，L-精氨酸 的產(chǎn)量比HOS和MOS分別增加了 16%和51%，結果如圖4.1所示。而且，發(fā)酵 后期L-精氨酸的比增長速率也比在HOS條件下的穩(wěn)定。另外，葡萄糖的消耗速 率也明顯增加，在起始葡萄糖含量相等的前提下，新供氧策略下分批發(fā)酵，葡 萄糖耗盡只用了 81h，比HOS條件下提前了 6h。
如圖3.II所示，描述了不同供氧模式下，整個發(fā)酵過程中溶氧的變化情況。 顯然，在MOS條件下，前l(fā) 24h內，溶氧迅速下降并反彈，特別是在20h時， 溶氧一度降到O，這對發(fā)酵是不利的。而在兩步法供氧策略下，發(fā)酵過程中的溶 氧一直保持比較穩(wěn)定和平緩的狀態(tài)，只是在12 20h內有小幅的上升，在24 36h內有小幅的下降。溶氧從36h到發(fā)酵結束，基本一直保持在30%的水平?？?調節(jié)轉速和通氣量來保持整個發(fā)酵過程中穩(wěn)定的溶氧， 一直被認為是最簡單而 且最好的控制或優(yōu)化有氧發(fā)酵的方法。但是，如何選擇和變化溶氧是溶氧控制 中一個重要的問題。因為溶氧設定點與所期望的代謝流量的模式之間的關系是 不清楚的。
接下來，對NOS下的代謝流量變化進行了描述和分析，如圖3所示，在 NOS和HOS條件下，作為基準進行代謝流量分析的絕對葡萄糖消耗速率，TCA 循環(huán)中的反應速率。2之間存在相互影響。然而，在NOS條件下的第三、四階 段，TCA循環(huán)中的a-KG節(jié)點流向Glu的流量r22，以及"24和。2的流量分配比 都明顯增加。在NOS條件下Q4/^的值已經(jīng)到達了 MOS條件下的水平。更重 要的是，ATP的生產(chǎn)量沒有因為增加了a-KG流向Glu的流量(r24/r22比率增加) 而降低，相反，在NOS條件下，ATP的生產(chǎn)速率在整個發(fā)酵過程中都有所增加。 因此，兩步供氧策略由于增加a-KG到Glu的流量(r24/r22)，增加ATP生產(chǎn)速 率以及維持了在HOS條件下TCA循環(huán)的高流量，而增加了 L-精氨酸的產(chǎn)量。
本發(fā)明在國內首次成功提出一個全新的更適宜于鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精 氨酸的供氧模式。
權利要求
1、一種通過兩步法供氧策略提高發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸產(chǎn)量的方法，其特征在于在鈍齒棒桿菌Corynebacterium crenatum SYPW發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸過程中，0～24h控制轉速600r/min，24-30h控制轉速550r/min，30-36h控制轉速500r/min，36-42h控制轉速450r/min，42h后控制轉速400r/min，并維持到發(fā)酵結束；搖瓶培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)基以g/L計葡萄糖30，玉米漿20，(NH4)2SO4 20，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，尿素1.5，pH7.0～7.2，121℃滅菌20min，裝液量30mL/250mL；培養(yǎng)方法斜面活化培養(yǎng)31℃培養(yǎng)20～24h；種子培養(yǎng)從斜面上挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基，31℃，于往復搖床上110r/min，培養(yǎng)15-16h；發(fā)酵罐培養(yǎng)罐上發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計葡萄糖150，玉米漿4，(NH4)2SO420，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，生物素8×10-5，L-組氨酸5×10-4，氨水控制pH7.0～7.2，121℃滅菌10min；裝液量3L/5L發(fā)酵罐；培養(yǎng)方法5L自控發(fā)酵罐分批發(fā)酵5L發(fā)酵罐中裝液量3L，接種量5％，31℃，通風量3L/min，流加氨水控制pH在6.8，通過豆油消泡，溶氧自動顯示，通過控制所述的攪拌轉速來實現(xiàn)供氧差異。
全文摘要
通過兩步法供氧策略提高發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程技術領域。本發(fā)明在鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)SYPW發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸過程中，0～24h控制轉速600r/min，24-30h控制轉速550r/min，30-36h控制轉速500r/min，36-42h控制轉速450r/min，42h后控制轉速400r/min，并維持到發(fā)酵結束。本發(fā)明提出了一種新的兩步法供氧策略(NOS)0～24h，控制轉速600r/min，然后每6h轉速下降50r/min直至轉速達到400r/min，并維持到發(fā)酵結束。運用新的供氧策略后，L-精氨酸的產(chǎn)量比高供氧(HOS)和中供氧(MOS)分別增加了16％和51％，而且，葡萄糖的消耗速率明顯增加，發(fā)酵周期僅為81h，比HOS條件下提前了6h。
文檔編號C12R1/15GK101381748SQ20081015513
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權日2008年10月23日
發(fā)明者張曉梅, 竇文芳, 虹 許, 許正宏, 許泓瑜, 饒志明 申請人:江南大學