專利名稱：利用活性污泥生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可降解材料生物工程領(lǐng)域，具體地說涉及一種以活性污泥水解 酸化產(chǎn)物為原料利用基因工程菌生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法。
技術(shù)背景聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates， fflAs)是一類具有生物可降解 性、生物相容性、壓電性等許多優(yōu)良性能的新型塑性聚酯，可作為化學(xué)合成塑 料的理想替代品，在生物醫(yī)學(xué)、制藥、電子等眾多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。 PHAs是微生物在營養(yǎng)不平衡條件下合成的胞內(nèi)能量和碳源儲藏性物質(zhì)，廣泛存 在于細(xì)菌體內(nèi)，其分子量多為50，000到1，000，000道爾頓(Da)，其單體皆為 R構(gòu)型。其結(jié)構(gòu)通式如下所示其中x二l， 2， 3等，n為100-30000。目前生產(chǎn)PHA的主要方法是利用純菌發(fā)酵，如美國Monsanto公司利用發(fā)酵 方法生產(chǎn)PHBV，年產(chǎn)約lOOOt，此種方法存在的主要問題是價格昂貴，制約了 大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用；此外有利用馴化活性污泥為菌種，以外加純碳源或污水為 原料生產(chǎn)PHAs的方法，但存在馴化時間長(IO多天)，碳源利用效率低，工藝 條件難以控制、合成的PHAs質(zhì)量不穩(wěn)定、產(chǎn)量低等缺點，制約了這些方法的推 廣應(yīng)用。因此降低生產(chǎn)成本、篩選或者構(gòu)建合成PHA效率高的菌種成為解決問 題的關(guān)鍵。污水處理過程中所產(chǎn)生的活性污泥是污水處理系統(tǒng)中自然形成的微生物與 有機物的聚集體，含有大量碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)、維生素等有機物和不 同種類的微生物，這些含碳物質(zhì)經(jīng)一定處理(如水解酸化)后，可以轉(zhuǎn)化為丁 酸、丙酸、乙酸等小分子物質(zhì)，成為合成PHA的良好底物，并且使用乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等小分子脂肪酸的混合物可以得到3-羥基丁酸(HB)與3-羥基戊酸 (HV)的共聚物，PHVB是目前市場上PHA生產(chǎn)中最主要的的產(chǎn)品之一。因此利用 活性污泥作為生產(chǎn)PHA的廉價原料來源，不僅可以大大降低PHAs的生產(chǎn)成本，同 時解決了剩余活性污泥造成的環(huán)境污染和占用耕地的問題。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有90多個種屬的微生物具有合成PHA的功能，并且已經(jīng)從40 多株菌中克隆到了PHAs合成酶及其相關(guān)酶基因(應(yīng)嬌妍等.微生物學(xué)報，2007， 47 (4) : 616 621)。 PHA的種類以及合成途徑的多樣性是由不同菌種中調(diào)節(jié) PHA合成的相關(guān)酶基因的差異及底物的不同決定的。根據(jù)合成短、中鏈PHA的不 同，以及來源菌株的不同，PHA合成相關(guān)酶系的家族組成和命名也有很大的不同。 目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)短鏈PHA的合成途徑有四條，中長鏈PHA的合成途徑有兩條(Laral 等.Microbiology and Molecular biology reviews, Mar, 1999,21 53)。其 中有一條B—氧化途徑是以脂肪酸為底物，通過酯酰輔酶A、酯酰輔酶A脫氫酶以 及PHA合成酶的作用來合成PHA的。在大腸桿菌中，/a^Z基因編碼了乙酰輔酶連 接酶，參與催化B—氧化途徑中脂肪酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的反應(yīng)，/a必基因編碼 酯酰輔酶A脫氫酶，催化脂肪酸酯酰輔酶A脫氫生成烯酰輔酶A的反應(yīng)。提高 /a必基因的表達(dá)活性有助于提高PHA的合成效率(Si Jae Park等.Macromol， s萍2005， 224， 1-9)。底物的種類和組成的不同也會影響PHAs的種類和產(chǎn)量。活性污泥經(jīng)過水解 酸化后可以產(chǎn)生丁酸、丙酸、乙酸以及乳酸等小分子有機酸。酸化條件直接影 響所獲得的小分子有機酸的組成，另一方面，細(xì)菌對不同有機酸的利用效率有 很大的不同，并受有機酸組成的影響(嚴(yán)群等.化工學(xué)報，2003， 54(11) :1580-1585)。因此，將/a必、/a必與高表達(dá)啟動子聯(lián)接構(gòu)建高表達(dá)質(zhì) 粒，并轉(zhuǎn)入合適的宿主中，就可以通過對外源功能基因的強化表達(dá)提高基因工 程菌對小分子有機酸的利用效率以及PHA的合成效率。而且還能通過改變工程 菌中不同單體的比例來改善PHA產(chǎn)品的品質(zhì)。利用構(gòu)建的具有高產(chǎn)、高轉(zhuǎn)化率、 合成產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點的基因工程菌，可成為商品化的PHA生產(chǎn)有效途徑。目前，構(gòu)建聚羥基脂肪酸酯工程菌的專利主要有《一株用于生產(chǎn)聚羥基脂 肪酸酯的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用》(申請?zhí)?3146663.X)公開了一株具有 以脂肪酸為底物合成PHA能力的微生物，是重組嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)WQ CGMCC N2 0911;《一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的重組菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用》(專利號ZL03120769.3)公開了一種構(gòu)建具有以脂肪酸為底物 合成PHA能力的基因工程菌的方法；《表達(dá)聚羥基脂肪酸酯的工程菌及其構(gòu)建方 法與應(yīng)用》(申請?zhí)?00710100153.3)公開了利用抑制或敲除產(chǎn)聚羥基脂肪酸 酯細(xì)菌中的與脂肪酸e氧化代謝途徑相關(guān)的一個或多個基因后得到的產(chǎn)聚羥 基脂肪酸酯菌基因工程菌的方法；《一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法及其專用工 程菌》(申請?zhí)?00710098516.4)公開了一種在缺氧條件下可發(fā)酵得到聚羥基 脂肪酸酯的基因工程菌；《一種重組的產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌及其應(yīng)用》(申請?zhí)?200510133634.5)公開了一種重組的產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯菌GBR008，可用于工業(yè) 化生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯；提取聚羥基脂肪酸酯的方法的專利主要有《從細(xì)菌菌體中分離提純細(xì)菌胞 內(nèi)聚羥基脂肪酸酯的方法》(專利號ZL98100266.8)、《從細(xì)菌發(fā)酵液中直接 分離提純胞內(nèi)聚羥基脂肪酸酯的方法》(專利號ZL02112208.3)、《一種提取微 生物胞內(nèi)聚羥基脂肪酸酯的方法》(申請?zhí)?00610072867.3)。經(jīng)檢索，沒有發(fā)現(xiàn)以活性污泥為原料利用基因工程菌生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯 的報道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一在于提供一種以活性污泥為原料利用基因工程菌生產(chǎn)聚羥 基脂肪酸酯的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種能以活性污泥為原料生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的 基因工程菌。本發(fā)明的還一目的是提供一種能以活性污泥為原料生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的 基因工程菌的構(gòu)建方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案如下 利用活性污泥生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，包括如下步驟(1) 活性污泥的水解酸化；(2) 有機酸分離；(3) 利用基因工程菌合成PHAs;(4) PHAs提取。上述方法步驟(1)中所述的活性污泥的水解酸化是指將活性污泥在40 60°C、 pH為5. 5 6. 0條件下進(jìn)行水解酸化8 18h;同時以50 150rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌；澄清4 8h，得沉淀殘留物和上清液。上述方法中所述的活性污泥是指污水處理過程中所產(chǎn)生的剩余活性污泥。 上述方法中所述的活性污泥的水解酸化可通過水解酸化系統(tǒng)進(jìn)行，所述的水解酸化系統(tǒng)包括酸化池、酸化池上有進(jìn)水口和出水口、此外有加熱器、溫控器、攪拌器等(見圖2)。上述方法中所述的溫度可通過置于酸化池中的加熱器和溫控器控制。 上述方法中所述的pH值可通過加水或者加入活性污泥來控制。 上述方法步驟(2)中所述的有機酸分離是指將步驟(l)所得水解酸化后產(chǎn)物沉淀澄清，取上清液，并置于發(fā)酵罐中。上述方法中所述的水解酸化池殘留物可以返回水解酸化池繼續(xù)利用。 上述方法步驟(3)中所述的利用基因工程菌合成raAs是指按照10 20%比例將具有PHA合成能力的基因工程菌加入到發(fā)酵罐中，并在25 4(TC、 pH為5.0 9.0條件下發(fā)酵培養(yǎng)80 120小時，得發(fā)酵液。在不添加任何外加營養(yǎng)物質(zhì)的條件下，基因工程菌利用活性污泥水解酸化后的小分子有機酸合成PHAs。 上述方法步驟(4)中所述的PHA提取是指將所得發(fā)酵液在10000 15000rpm下離心1 5分鐘，將沉淀物冷凍干燥，然后加入氯仿(每0.12 g凍干細(xì)胞加入10 15ml氯仿)破壁，并在55 65。C下保溫12 36h，過濾，所得濾液自然晾干，得本發(fā)明PHAs。上述具有PHAs合成能力的基因工程菌是指能以活性污泥水解酸化產(chǎn)物為原料合成PHA的基因工程菌。所述的基因工程菌是指含有T7啟動子和A必和A必基因的基因工程菌。 上述能以活性污泥水解酸化產(chǎn)物為原料合成PHAs的基因工程菌可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法構(gòu)建。所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1) 、通過PCR從EcoliJM109 (ATCC編號53323)中擴增獲得/a必和 /a必基因片段；(2) 、用和v^/II雙酶切pRSET B質(zhì)粒和/a必和/a必基因片段；(3) 、用T4連接酶將/ad"和/ao^和pRSET B質(zhì)粒連接，得重組質(zhì)粒；(4) 、將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，即得本發(fā)明能以活性污泥為原料合成 PHAs的基因工程菌。上述構(gòu)建方法步驟(1)中所述的PCR擴增所用的引物為-上游引物5， -TATGGTACCGACCTGAAGTGCGGATAA—3， 下游引物5， -AATCTCGACCATGGTCCAAATCTGA-3，。上述構(gòu)建方法中所述的/&辺和/^識基因為合成PHA的基因，這些基因來 自大腸桿菌，可以EcoliJM109的DNA為模板進(jìn)行PCR擴增獲得。其中，/a必 基因編碼了乙酰輔酶連接酶，參與催化B —氧化途徑中脂肪酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A的反應(yīng)，/^近基因編碼酯酰輔酶A脫氫酶，催化脂肪酸酯酰輔酶A脫氫生成 烯酰輔酶A的反應(yīng)。上述構(gòu)建方法步驟(2)中所述的載體質(zhì)粒pRSET B上帶有IPTG誘導(dǎo)的高 表達(dá)噬菌體T7啟動子，在載體質(zhì)粒上插入PHAs合成酶基因，如大腸桿菌JM109 中的/^辺和/欲忍，可使所獲得的基因工程菌具有同時高效利用乙酸、丙酸、 丁酸和乳酸合成羥基丁酸酯(PHB)和羥基戊酸酯(PHV)等共聚物的能力。上述構(gòu)建方法步驟(4)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法是多種多樣的，如化學(xué)轉(zhuǎn)化法、 電轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法以及冷凍轉(zhuǎn)化法等。上述構(gòu)建方法步驟(4)中所述的宿主菌是指大腸桿菌f "力'，如￡ BL21(DE3)，或假單胞菌/^ewob歷o/70M印.等。上述基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法可以采用分批培養(yǎng)的方式，上述基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括如下步驟大腸桿菌按照5 15%重量比將工程菌接種到LB培養(yǎng)基上，然后在30 40 °C、轉(zhuǎn)數(shù)為260 300rpm的搖床上培養(yǎng)8 16h，得培養(yǎng)液；再在4000 6000 離心10 20min，接著用生理鹽水洗滌3 5次，得基因工程菌液。或假單胞菌按照5 15。/。重量比將基因工程菌接種到LB培養(yǎng)基上，然后在 25 35°C、轉(zhuǎn)速180 240 rpm的搖床上培養(yǎng)20 40h;再在4000 6000 rpm下離 心10 20min,接著用生理鹽水洗滌3 5次，得基因工程菌液。所述的LB培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為1L LB培養(yǎng)基中含有胰化蛋白 胨8 10g，酵母提取物4 6g， NaCl 8 12g，瓊脂粉12 18g和氨芐青霉素 50ug。本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果(1)本發(fā)明成本低，本發(fā)明以污水處理過 程中所產(chǎn)生的剩余活性污泥為原料，屬于廢物利用，大大降低了PHAs的生產(chǎn)成 本，使PHAs的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。(2)本發(fā)明生產(chǎn)效率高。本發(fā)明利用高產(chǎn)、高轉(zhuǎn)化基因工程菌，具有同時高效利用乙酸、丙酸、丁酸和乳酸合成羥基丁酸酯(PHB)和羥基戊醇(PHV)等的共聚物的優(yōu)勢。(3)本發(fā)明利用剩 余活性污泥，實現(xiàn)污泥減量化和資源回收利用，減少了環(huán)境污染，具有明顯的 經(jīng)濟效益和社會效益。


圖l是本發(fā)明的工藝流程圖。圖2是活性污泥水解酸化池的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
實施例1、本發(fā)明宿主為大腸桿菌的基因工程菌的構(gòu)建 宿主為大腸桿菌^ cW厶載體為質(zhì)粒pRSET B—GFP，該質(zhì)粒上有IPTG誘導(dǎo) 的高表達(dá)噬菌體T7啟動子。(1)、含有/a必和/a必基因的DNA片段的PCR擴增 上游引物5， -TATGGTACCGACCTGAAGTGCGGATAA_3， 下游引物5， -AATCTCGACCATGGTCCAAATCTGA-3' 以上述引物自大腸桿菌JM109基因組中擴增/^切和/^識基因，具體技術(shù) 方案為在PCR體系中加入Ex TaqDNA聚合酶，93. 8。C解鏈40秒，62。C退火 l分鐘，73'C延伸2分鐘，如此進(jìn)行30個循環(huán)。對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測，經(jīng)擴增獲得了大約為3012bp的DNA片段。(2) 、將/ao^和/ao^基因和載體質(zhì)粒pRSET B同時進(jìn)行AbfelA5WI1雙酶 切，酶切后利用T4連接酶將/ao^和/^近連接到質(zhì)粒pRSET B中，得重組質(zhì)粒。(3) 、將克隆有/a必/ao^基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌A co^BL21(DE3) (ATCC編號64771)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化法。將轉(zhuǎn)化子涂布與LB固體培養(yǎng)平板上，在37。C、 230rpm下培養(yǎng)12h;挑取平板上長出的單克隆，將其接種到LB 液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基的組成成分及其比例為1L培養(yǎng)基中含有胰化蛋白胨 10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，瓊脂粉15g。培養(yǎng)基中需要加入氨芐青霉素 50微克每升)中，在37°C、 200rpm下?lián)u床培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒，并用M/el/Agin 雙酶切鑒定，經(jīng)測序表明正確，菌株命名為WSH—DE1010基因工程菌。(4) 發(fā)酵培養(yǎng)將工程菌接種到LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基的組成成分及其比 例為1L培養(yǎng)基中含有胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，瓊脂粉15g。 培養(yǎng)基中需要加入氨芐青霉素50微克每升)上，100ml三角瓶中裝20ml培養(yǎng)基或2000ml三角瓶中裝1000ml培養(yǎng)基，37。C下?lián)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為280r/min ， 培養(yǎng)時間12h， 4000 rpm離心15min，用生理鹽水洗滌3次后備用。 實施例2、本發(fā)明宿主為假單胞菌的基因工程菌的構(gòu)建(1) 、含有/s必和/a必基因的DNA片段的PCR擴增 上游引物5， -TATGGTACCGACCTGAAGTGCGGATAA—3， 下游引物5， -AATCTCGACCATGGTCCAAATCTGA-3，用上述引物自大腸桿菌JM109基因組中擴增/s必和/s必基因，具體技術(shù)方 案為在PCR體系中加入Ex TaqDNA聚合酶，93. 8"解鏈40秒，62。C退火1 分鐘，73。C延伸2分鐘，如此進(jìn)行30個循環(huán)。對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行1X瓊脂糖 凝膠電泳檢測，經(jīng)擴增獲得了大約為3012bp的DNA片段。(2) 、將/ao^和/a(戀基因和載體質(zhì)粒pRSET B同時進(jìn)行雙酶 切，酶切后利用T4連接酶將/^/Z /欲忠連接到質(zhì)粒pRSET B中，得重組質(zhì)粒。(3) 、利用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到假單胞菌/^ei^^Z70/70iAS ，將轉(zhuǎn)化子涂布與LB固體培養(yǎng)基平板上，在37"、 200rpm下培養(yǎng)16h;挑取平板上 長出的單克隆，將其接種到LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、 200rpm下?lián)u床培養(yǎng)16h， 提取質(zhì)粒，并用vWel/^^II雙酶切鑒定，經(jīng)測序表明正確，菌株命名為WSH— DE1110基因工程菌。(4)該基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)將10%該基因工程菌接種到100ml LB培 養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基的組成成分為1L培養(yǎng)基中含有胰化蛋白胨10g，酵母提取 物5g， NaCl 10g，瓊脂粉15g，并且需加入氨芐青霉素50微克)中，在轉(zhuǎn)速 200 r/min、溫度30。C條件下培養(yǎng)30h;然后在4000 rpm離心15min，用生理 鹽水洗漆3次，備用。實施例3、活性污泥的水解酸化按照圖2所示制造水解酸化池，水解酸化池壁有進(jìn)水孔、出水孔，池頂部 有排氣孔和溫度計孔，加熱器，并裝有攪拌裝置。將30L活性污泥(取自北京清河污水處理廠，污泥濃度(SS)約為20g/L (98%含水率)，其中VSS占70X，約14g/L)置于水解酸化池，水解酸化池內(nèi) 溫度控制在50。C，水力停留時間為8-18h， pH值控制在5.5 6.0之間(pH值 通過調(diào)節(jié)污泥投配量和水力停留時間來調(diào)節(jié))。經(jīng)水解酸化后，約40。/。的VSS轉(zhuǎn) 化為有機酸，也就是5.5/L有機酸。出水的有機酸濃度大約在1500mg/L，實現(xiàn)污泥減量約為55%。沉淀澄清，得上清液和沉淀殘留物，上清液即為活性污泥 水解酸化所得的有機酸溶液。實施例4、基因工程菌(以大腸桿菌為宿主菌)利用剩余活性污泥水解酸 化產(chǎn)物生產(chǎn)PHAs在發(fā)酵培養(yǎng)罐中加入實施例1制備的WSH—DE1010基因工程菌液0. 8升， 然后瞬間加入8升實施例3制備所得上清液，并在溫度為37°C、 pH為6. 0條件 下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)60小時，按照文獻(xiàn)(0uyang等.Biosci. 2007， 7， 227-233)中 記載的方法檢測PHA含量和菌體細(xì)胞干重，結(jié)果PHAs的積累率占細(xì)胞干重的 65%。實施例5、基因工程菌(以假單胞菌為宿主菌)利用剩余活性污泥水解酸 化產(chǎn)物生產(chǎn)PHAs在發(fā)酵培養(yǎng)罐中加入0. 8升實施例2所制備的WSH—DE1110基因工程菌液， 然后瞬間加入8升實施例3所制備的上清液，然后在溫度為30°C、 pH為6. 2的 條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72小時，得發(fā)酵液。檢測(檢測方法同實施例4所引用方 法)結(jié)果表明PHAs的積累率占細(xì)胞干重的60%。實施例6、 raAs的提取試驗取實施例4中所得發(fā)酵液100毫升，然后在10000rpm下離心1分鐘，將其 沉淀物冷凍干燥，再將凍干的菌體加入氯仿(每0. 12g干細(xì)胞加入10毫升氯仿)， 然后在6(TC下保溫24小時，過濾后，蒸去氯仿，稱重，獲得0.65gPHAs。
權(quán)利要求
1、利用活性污泥生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，包括如下步驟(1)活性污泥的水解酸化；(2)有機酸分離；(3)利用基因工程菌合成PHAs；(4)PHAs提取。
2、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(1)中所述的活性污 泥的水解酸化是指將活性污泥在40 60°C、 pH為5. 5 6. 0條件下進(jìn)行水解酸 化8 18h;同時以50 150rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌；澄清4 8h，得沉淀殘留物和上 清液。
3、 按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于其步驟(2)中所述的有 機酸分離是指將步驟(1)所得水解酸化后產(chǎn)物沉淀澄清，取上清液。
4、 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于其步驟(3)中所述的利用基 因工程菌合成PHAs是指按照10 20%比例將具有PHAs合成能力的基因工程菌 加入到發(fā)酵罐中，并在25 40。C、 pH為5.0 9. 0條件下發(fā)酵培養(yǎng)80 120小 時，得發(fā)酵液。
5、 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于其步驟(4)中所述的PHAs提 取是指將所得發(fā)酵液在10000 15000rpm下離心1 5分鐘，將沉淀物冷凍干燥， 然后加入氯仿，并在55 65"C下保溫12 36h，過濾，所得濾液自然晾干，得 本發(fā)明PHAs。
6、 權(quán)利要求1所述的基因工程菌是指能以活性污泥水解酸化產(chǎn)物為原料合 成PHAs的基因工程菌。
7、 按照權(quán)利要求1或6所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌 含有T7啟動子和/at/"和/ao^基因。
8、 權(quán)利要求7所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1) 、通過PCR從EcoliJM109中擴增獲得/<3必和/ac^基因片段；(2) 、用7Vofel和雙酶切pRSET B質(zhì)粒和/ad"和/ao^基因片段；(3) 、用T4連接酶將/a必和/ao^和pRSET B質(zhì)粒連接，得重組質(zhì)粒；(4) 、將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，即得本發(fā)明能以活性污泥為原料合成 PHAs的基因工程菌。
9、按照權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，其特征在于其步驟(1)中所述的 PCR擴增所用的引物為上游引物5， -TATGGTACCGACCTGAAGTGCGGATAA—3， 下游引物5， -AATCTCGACCATGGTCCAAATCTGA-3，。 10、按照權(quán)利要求8或9所述的構(gòu)建方法，其特征在于其步驟(4)中所述 的宿主菌是指大腸桿菌(f 或假單胞菌(/^wA/^/70M ，)等。
全文摘要
本發(fā)明屬于可降解生物材料領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種以活性污泥為原料利用基因工程菌生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，包括(1)活性污泥的水解酸化；(2)有機酸分離；(3)利用基因工程菌合成PHAs；(4)PHAs提取。本發(fā)明還公開了能以活性污泥為原料生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的基因工程菌以及構(gòu)建方法。本發(fā)明方法利用污水處理過程中所產(chǎn)生的剩余活性污泥為原料，大大降低了PHAs的生產(chǎn)成本；其次所用基因工程菌生產(chǎn)效率高，能同時高效利用乙酸、丙酸、丁酸和乳酸合成羥基丁酸酯(PHB)和羥基戊醇(PHV)等；另外本發(fā)明所用活性污泥屬于廢物利用，減少了環(huán)境污染，具有明顯的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號C12R1/38GK101235400SQ20081010125
公開日2008年8月6日 申請日期2008年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者施漢昌, 慧 王 申請人:清華大學(xué)