專利名稱：基于紅細胞載體的fish-in-net固定化酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于無機化學、物理化學和生物化學領(lǐng)域，特別涉及到具有高活性、 高穩(wěn)定性的生物/無機催化反應(yīng)器——基于紅細胞載體的fish-in-net固定化酶， 反應(yīng)器的催化核心是利用紅細胞包封的生物催化材料，是"fish-in-net"制備方
法的延伸和拓展。
背景技術(shù)：
生物催化材料同其它催化材料相比具有高效性、高專一性及反應(yīng)條件溫和的
優(yōu)點，上述優(yōu)點使得生物催化材料在生產(chǎn)生活中有著廣泛的應(yīng)用需求；但是同其 它催化材料相比，生物催化材料同時還具有機械強度差，易于受環(huán)境因素作用而 失去催化活性的缺點，并且由于生物催化材料往往在反應(yīng)體系中難于同反應(yīng)產(chǎn)物 分離，而催化材料和反應(yīng)產(chǎn)物的分離也同時提高了生產(chǎn)的成本，如果不進行分離 將就造成生物催化材料對反應(yīng)產(chǎn)物的污染，同時由于生物催化材料價格較高，如 果不進行催化材料和產(chǎn)物的分離也將提高產(chǎn)品的成本。
為解決生物催化材料成本較高的問題，基因工程手段已經(jīng)得到大量的應(yīng)用，
大量的工程所需催化材料己經(jīng)通過基因工程的手段在原核及真核菌內(nèi)得到表達， 隨著這些研究的進行，生物催化材料的自身價格得以大幅度下降，使其應(yīng)用成為 可能。
為解決生物催化材料的機械強度差、易于失活、難于同反應(yīng)體系分離的問題， 固定化酶技術(shù)得以發(fā)展。傳統(tǒng)的固定化酶手段包括吸附、共價交聯(lián)、溶膠一凝膠 包埋，它們都具有一定的應(yīng)用局限，例如1)吸附法，在使用通過吸附方法固 定的生物催化材料時，不可避免的遇到生物催化材料從固定化介質(zhì)上逃逸的現(xiàn) 象，這將降低固定化材料的重復利用率及使得催化流程不穩(wěn)定；2)共價交聯(lián)， 通過共價交聯(lián)方法固定化生物催化材料時，生物催化材料的結(jié)構(gòu)和功能將受到交 聯(lián)材料的影響，從而無法保持原有的催化活性；3)溶膠一凝膠包埋，這種方法 固定的生物催化材料的穩(wěn)定性較差，易于產(chǎn)生縮塌從而限制催化反應(yīng)的底物和產(chǎn) 物的傳質(zhì)運輸，這一缺點限制了其適用范圍?；谏鲜鰡栴}，本組通過 200510017112.9這一技術(shù)及其相應(yīng)的納米反應(yīng)器，我們較好的解決了生物催化 材料的逃逸、底物/產(chǎn)物的傳質(zhì)、生物催化材料的穩(wěn)定性等生物催化材料應(yīng)用所面臨的關(guān)鍵問題。
但是，在上述方法中依然存在這一點不足，即生物催化材料在固定化進程中 的活性的保護，這一點是多數(shù)固定化酶技術(shù)所難于面對和解決的，本專利針對固 定化進程中生物催化材料的活性的保護構(gòu)建了具有較為廣泛適用性的技術(shù)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，利用基于紅細胞載體技術(shù)的"fish-in-net"的 包埋技術(shù)制備固定化生物催化劑——基于紅細胞載體的fish-in-net固定化酶， 此生物催化劑的特點是在通過低滲析技術(shù)制備紅細胞載體，通過物質(zhì)擴散將目地 生物催化材料封裝到紅細胞載體中，利用我們曾經(jīng)申請的專利200510017112.9 所闡述的技術(shù)方法，在紅細胞表面覆蓋上具有孔道結(jié)構(gòu)的無機外殼，隨反應(yīng)體系 的需求保存或使用溫和變性劑去除紅細胞膜，從而形成以生物催化材料為催化核 心，外殼為含孔道的無機材料的反應(yīng)器，該反應(yīng)器適合工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用。
以紅細胞作為生物催化材料的包封材料，通過調(diào)節(jié)滲透壓的辦法誘導紅細胞 的細胞膜出現(xiàn)20nm—50nm直徑的裂隙，使紅細胞內(nèi)的血紅蛋白從細胞中擴散 出來；離心去除上清液中的血紅蛋白，收集紅細胞體；在紅細胞體所處的低滲液 中加入具有目地催化能力的生物材料；通過調(diào)節(jié)鹽離子濃度的方法，提升低滲液
的滲透壓至生理條件，實現(xiàn)紅細胞的重新封裝。
本方法在制備包封后紅細胞以后，將此紅細胞置于按照我們以前申請 200510017112.9專利所述的硅凝膠體系中，誘導無機微孔籠結(jié)構(gòu)的合成。
方法中使用的紅細胞可以是來自豬、牛、羊、狗等大型哺乳動物，也可以是 來自雞、鴨、鵝等禽類屠宰后的血液。
獲得血液后，在新鮮血液中加入0.4% (w/w)的EDTA，均勻攪拌，鰲合 血液中的鈣離子，阻止血液的凝集；將制得的血液通過截留分子量為80KD的中 空纖維素膜濾器進行分離和洗滌，留取膜上液，洗漆過程中向體系中加入等滲液， 紅細胞等滲液滲透壓約為200mosM/Kg。洗滌過程中檢測膜下液中的蛋白濃度， 直至蛋白濃度小于0.01mg/ml，蛋白濃度的測量選用考馬斯亮蘭法。向膜上液中 加入去離子水，逐漸在200—26mosM/Kg之間調(diào)節(jié)體系滲透壓，誘導紅細胞的 細胞膜出現(xiàn)裂隙，使細胞內(nèi)的血紅蛋白通過裂隙游離出細胞膜。保持在低滲條件下利用過截留分子量為80KD的中空纖維素膜濾器對上述具有裂隙的紅細胞進 行洗滌，洗滌過程中，向體系中不斷添加上述低滲溶液，直至膜上液中卟啉的量 小于1pM，制備紅細胞載體。測量卟啉濃度選用吡啶法。向紅細胞載體低滲溶 液中添加目地催化生物材料，使溶液體系中目地催化材料的濃度大于10mg/ml， 或盡可能達到其最大溶解度，使催化材料順著濃度差擴散到載體紅細胞中。載體 紅細胞和生物催化材料的瑰拌保存時間為40_200分鐘，以完成生物催化材料 充分進入紅細胞這一裝載進程。完成裝載后，向上述低滲體系中加入高濃度的鹽 溶液，提高體系的滲透壓至200mosM/Kg，實現(xiàn)紅細胞的重新包封。紅細胞重 新包封后可以通過中空纖維素膜濾器濃縮，期間不斷加入200mosM/Kg的奪滲 液，洗滌生物催化材料，直至生物催化材料的活性低于檢測限，以制備包封目地 催化生物材料的紅細胞。同時生物催化材料可以通過膜下液濃縮進行回收。用無 機外殼固載上述包封了目地生物催化材料的紅細胞時，依據(jù)我們以前申請的專利 200510017112.9進行。
這里分離和洗滌細胞的操作器具可以是所述的中空纖維素膜的濾膜濾器(包 括濾膜截留分子量大小及濾膜面積)，也可以是任何一種依據(jù)混合材料的質(zhì)量、 粒徑、電荷、親和性等等進行分離的技術(shù)手段。
操作中等滲液和低滲液的滲透壓，依據(jù)采用血液的來源和質(zhì)地的不同，可以 出現(xiàn)±50%的變化。
紅細胞包封的生物催化材料的直徑需要在20—50nm以下，具體直徑限制 同使用的低滲液的濃度及紅細胞的來源和質(zhì)量相關(guān)。
生物催化材料的直徑可以通過該材料的電鏡、晶體結(jié)構(gòu)、核磁結(jié)構(gòu)、體積排 阻色譜等技術(shù)手段得出，也可以通過分子量和蛋白質(zhì)的平均密度1.35g/cmS及球 體體積公式得出。
與背景方法相比，本發(fā)明的方法是先利用紅細胞膜將目地生物催化材料包封 起來，然后利用包封了目地生物催化材料的紅細胞代替生物催化材料用于 "fish-in-net"式的包埋，合成的反應(yīng)器除具有底物傳質(zhì)通道孔徑可控、機械穩(wěn)定性、
水熱穩(wěn)定性高，不易塌陷以及生物實用性的優(yōu)越特性外，經(jīng)本方法固定化的生物 材料還具有更高的生物催化活性保持以及本固定化方法具有更廣的適用范圍，可
用于分子直徑小于20—50nm的多數(shù)的酶及酶系的固定化。通過本方法固載生物催化材料具有如下優(yōu)點
3紅細胞同其它載體相比具有較高的生物兼容性；
b紅細胞容易獲得，且屠宰業(yè)中紅細胞屬于污染環(huán)境的廢物一血液的重要 組成部分；
C目地生物催化材料固載到紅細胞內(nèi)后，可以避免在無機外殼形成過程中體 系內(nèi)的有機分子和無機粒子對生物催化材料的結(jié)構(gòu)和功能的損傷，提高生物催化 材料的活性保持率；
d通過無機外殼的保護，可以提高此生物一無機催化反應(yīng)器的耐壓性和水熱 穩(wěn)定性；
e通過無機外殼上的底物傳質(zhì)通道的孔徑控制，可以使紅細胞內(nèi)的目地生物
催化材料不能逃逸出反應(yīng)器。
具體實施方式
實施例1:包埋半乳糖苷酶的制備
1) 新鮮牛血1Kg中加入4gEDTA，均勻攪拌30分鐘，鰲合血液中的鈣離 子，阻止血液的凝集；
2) 將制得的血液通過截留分子量為80KD的中空纖維素膜濾器進行分離和洗 滌，留取膜上液，洗滌過程中向體系中加入等滲液，紅細胞等滲液組成為10mM Na2HP04/KH2P04, 145 mM Na CI, 3.5 mM KCI禾B 0.5 mM MgCI2 6H20 pH 8.0.含有5mM葡萄糖。洗滌過程中檢測膜下液中的蛋白濃度，直至蛋白濃度 小于0.01mg/ml，蛋白濃度的測量選用考馬斯亮蘭法。
3) 向膜上液中加入去離子水，使膜上液中離子強度下降為原來的10%左右 造成低滲條件，誘導紅細胞的細胞膜出現(xiàn)裂隙，使細胞內(nèi)的血紅蛋白通過裂隙游 離出細胞膜。
4) 保持在低滲條件下利用過截留分子量為80KD的中空纖維素膜濾器對上 述具有裂隙的紅細胞進行洗滌，洗滌過程中，向體系中不斷添加上述低滲溶液， 直至膜上液中卟啉的量小于VM，制備紅細胞載體。測量卟啉濃度選用吡啶法。
5) 向紅細胞載體低滲溶液中添加半乳糖苷酶，使溶液體系中目地酶的濃度 大于10mg/ml，使催化材料順著濃度差擴散到載體紅細胞中。載體紅細胞和酶的攪拌保存時間為50分鐘，以完成酶充分進入紅細胞這一裝載進程。完成裝載后， 向上述低滲體系中加入高濃度的鹽溶液，提高體系的滲透壓至初始條件，實現(xiàn)紅 細胞的重新包封。
6) 紅細胞重新包封后可以通過中空纖維素膜濾器濃縮，期間不斷加入等滲 液，洗漆游離酶，直至酶的活性低于檢測限，以制備半乳糖苷酶的紅細胞。同時 酶可以通過膜下液濃縮進行回收再利用，酶的包埋率為82%。
7) 包封了半乳糖苷酶的紅細胞的無機外殼固載，依據(jù)我們以前申請的專利 200510017112.9進行。
8) 包封后的生物一無機催化反應(yīng)器使用含10%乙醇的10mM PBS進行洗 滌，去除催化材料上的封堵底物傳質(zhì)通道的模版劑，活化催化材料即可投入使用。 按照投料比計算，生物一無機催化反應(yīng)器的半乳糖苷酶活性為30%;按照每次 催化需在1CTC下48小時計算，此催化材料的可重復使用30次，未見明顯活性 下降。
權(quán)利要求
1、基于紅細胞載體的fish-in-net固定化酶，其由如下方法制備合成無機骨架，它的殼為無機材料，催化活性中心是紅細胞載體中包封的酶、酶系及酶制劑，紅細胞膜用以保護催化中心的活性，降低固定化進程及酶制劑的使用過程中環(huán)境因素對酶的結(jié)構(gòu)和功能的影響。
2、 如權(quán)利要求1所述的基于紅細胞載體的fish-in-net固定化酶，其特征在于 紅細胞的物種來源是豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝屠宰后的血液。
3、 如權(quán)利要求1所述的基于紅細胞載體的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶是天然酶、突變酶、改造酶或是人工模擬酶類及酶制劑。
4、 如權(quán)利要求3所述的基于紅細胞載體的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶的分子直徑小于50nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及到具有高活性、高穩(wěn)定性的生物/無機催化反應(yīng)器——基于紅細胞載體的fish-in-net固定化酶，反應(yīng)器的催化核心是利用紅細胞包封的生物催化材料，其是通過低滲的方法制備載體紅細胞，并將目地具有催化作用的生物材料通過擴散的方法導入上述載體紅細胞，此載體重新封裝后用于后續(xù)的固定化操作；固定化操作得到生物—無機催化反應(yīng)器，殼為無機網(wǎng)格材料，催化中心是紅細胞膜包封的生物材料。本發(fā)明的反應(yīng)器中的生物材料具有較高的活性和穩(wěn)定性，大幅度降低固定化進程中各種有機及無機材料對生物材料的結(jié)構(gòu)及活性的影響，當載入目地起催化作用的生物材料分子尺度(直徑)小于50nm，此反應(yīng)器可以正常構(gòu)建及執(zhí)行催化功能。
文檔編號C12N11/14GK101429506SQ20081005159
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者劉佳音, 明 呂, 呂博群, 吳卓夫, 李正強 申請人:吉林大學