專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有提高的熱穩(wěn)定性、嗜熱性和嗜堿性的家族6纖維素酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的纖維素酶。更具體地，本發(fā)明涉及具有提高的熱穩(wěn)定性(thermostability)、嗜堿性(alkalophilicity)和/或嗜熱性(thermophilicity)的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。本發(fā)明還涉及包含編碼經(jīng)修飾家族6纖維素酶的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，用于從宿主菌林中生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的方法，以及經(jīng)修飾的家族6纖維素酶在纖維素水解中的用途。
背景技術(shù)：
：生物圏中最豐富的多糖一一纖維素由通過(guò)p-l,4糖苷鍵在線性鏈中連接在一起的D-葡萄糖單元組成。這些鏈長(zhǎng)度可變化，并經(jīng)常由成千上萬(wàn)個(gè)單元組成。纖維素鏈形成了大量分子內(nèi)和分子間氫鍵，這導(dǎo)致形成不溶的纖維素微原纖維。這種結(jié)晶纖維素是天然半衰期超過(guò)五百萬(wàn)年的堅(jiān)韌材料。為了利用這種重要的可更新碳源，微生物(如細(xì)菌和真菌)產(chǎn)生了將結(jié)晶纖維素分解為葡萄糖的酶混合物。三大類(lèi)纖維素酶協(xié)同作用，將結(jié)晶纖維素水解為簡(jiǎn)單的能源葡萄糖。內(nèi)切-P-1,4-葡聚糖酶(￡〔3.2.1.4)隨機(jī)水解結(jié)晶纖維素的無(wú)定形區(qū)，產(chǎn)生多種長(zhǎng)度的寡糖，并因而產(chǎn)生新鏈末端。纖維二糖水解酶(或外切-p-l，4-纖維二糖水解酶，EC3.2.1.91)從纖維素鏈的一端連續(xù)水解纖維二糖單元。最后，p-l，4-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)將纖維二糖水解為葡萄糖。大部分纖維二糖水解酶和內(nèi)切-P-l,4-葡聚糖酶是由催化核心結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，所述催化核心結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域由柔性的接頭區(qū)隔開(kāi)。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域促進(jìn)該酶吸附至纖維素底物區(qū)域(Tomme.P.等1988.Eur.J.Biochem170:575-581:Lehtio.J.等2003Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100:484-489)，而催化核心結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)纖維素的切割。接頭區(qū)可確保核心結(jié)構(gòu)域與纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間最佳的結(jié)構(gòu)域間距離(Srisodsuk.M.等1993.J.Biol.Chem.268:20756-20761)?；诎被嵝蛄邢嗨菩詫⒋呋Y(jié)構(gòu)域歸類(lèi)為糖苷水解酶家族，該家族包括具有相似的折疊和水解機(jī)制但是底物特異性可能不同的酶。里氏木霉(7Wc/io^/7iMr^w/)含有已知的纖維素酶基因，它們是兩種纖維二糖水解酶，即Cel7A(也稱(chēng)為CBH1,其為家族7的成員)和Cel6A(CBH2);至少八種內(nèi)切-p-l，4-葡聚糖酶，即Cel7B(EGl)、Cel5A(EG2)、Cell2A(EG3)、Cd61A(EG4)、Cel45A(EG5)、Cel74A(EG6)、Cel61B(EG7)和Cel5B(EG8);和至少七種卩-l，4-葡萄糖苷酶，即Cel3A(BGl)、CellA(BG2)、Cel3B(BG3)、Cel3C(BG4)、CellB(BG5)、Cel3D和Cel3E(Foreman.P.K.等2003.J.Biol.Chem.278:31988-31997)。里氏木霉Cel6A(或TrCel6A)是該真菌分泌的兩種主要的纖維二糖水解酶之一，并已顯示在結(jié)晶纖維素的酶促水解中是高效的。TrCel6A是糖苷水解酶家族6的成員，該家族包括通過(guò)倒轉(zhuǎn)端基構(gòu)型(anomericconfiguration)而水解p-l，4糖苷鍵的酶，并包括纖維二糖水解酶以及內(nèi)切畫(huà)p國(guó)1,4-葡聚糖。TrCel6A(Rouvinen.J.等1990.Science249:380-386.Erratum:Science19卯249:1359)、褐色嗜熱裂孢菌(T7^fTM^,y^fl/"sc")內(nèi)p-l，4畫(huà)葡聚糖酶Cel6A(TfCel6A,Spezio.M.等1993.Biochemistry.32:9卯6-9916)、特異腐質(zhì)霉C^"挑ico/fl/fwo/^is)纖維二糖7jC解酶Cel6A(HiCd6A，Varrot.A.等.1999Biochem.J.337:297-304)、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切-卩-1，4-葡聚糖酶Cel6B(HiCel6B,Davies.G.J.等2000.Biochem.J.348:201-207)和結(jié)核分枝桿菌(AfycMfl"w/w附H37RvCel6A(MtCel6A,Varrot.A.等.2005.J.Biol.Chem.280:20181-20184)的三維結(jié)構(gòu)是已知的。纖維素酶在工業(yè)過(guò)程中有多種應(yīng)用，并已證明在以下用途中可商業(yè)應(yīng)用在紡織工業(yè)中用于牛仔布整理(denimfinishing)和棉花軟化；在家用和工業(yè)去污劑中用于色彩增亮、軟化和污漬去除；在紙漿和造紙工業(yè)中用于平滑纖維、增強(qiáng)排水和脫墨(de-inking);在食品工業(yè)中用于從水果和蔬菜中提取和澄清果汁，和用于糖化(mashing);在動(dòng)物飼料工業(yè)中用于改善其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)；以及用于將植物纖維轉(zhuǎn)化為葡萄糖，所述葡萄糖被發(fā)酵和蒸餾用于制造低co2纖維素乙醇，從而降低化石燃料消耗，這是世界范圍內(nèi)的一種新興工業(yè)(例如Gray,K.A.等.2006.Curr.Opin.Chem.Biol.10:141-146)。為了獲得具有提高的穩(wěn)定性特性的酶變體，在本領(lǐng)域中一般使用三種策略l)從生存于極端環(huán)境如極熱或極冷、高鹽濃度或高或低pH條件下的嗜極生物(extremophile)中分離嗜熱酶(例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,677,151,美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.20060053514);2)通過(guò)推理性i殳計(jì)或定點(diǎn)誘變進(jìn)行蛋白質(zhì)工程，其使用本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性原理，依賴(lài)于蛋白質(zhì)家族內(nèi)的序列同一性和結(jié)構(gòu)比對(duì)來(lái)鑒定可能有益的突變(在Eijsink.V.G.等2004.J.Biotechnol.113:105-20.中綜述)；和3)定向進(jìn)化，包括構(gòu)建突變體文庫(kù)并進(jìn)行選擇或篩選以鑒定改進(jìn)的變體，并包括反復(fù)循環(huán)產(chǎn)生具有期望特性的變體的過(guò)程(近期在EijsinkVG等.2005.Biomol.Eng.22:21-30中綜述)。這種方法不需要結(jié)構(gòu)或機(jī)理信息，并可揭示意外的有益突變。已證明將上述策略組合在一起是鑒定改進(jìn)酶的有效方法(Chica.R.A.等.2005.Curr.Opin.Biotechnol.16:378-384)。使用推理性設(shè)計(jì)，Zhang等(ZhangS等，2000.Eur.J.Biochem.267:3101-15)使用兩個(gè)雙突變?cè)赥fCel6B的N端和C端環(huán)之間引入了新的二硫鍵，并選擇四個(gè)甘氨酸殘基突變來(lái)改進(jìn)熱穩(wěn)定性。這些突變均未提高該纖維二糖水解酶的熱穩(wěn)定性，并且大部分突變將熱穩(wěn)定性降低5國(guó)10匸。讓人驚訝的是，雙突變N233C-D506C顯示r5()降低lO"C(ZhangS等，2000.Eur.J.Biochem.267:3101-15),或7^稍提高約2匸(Ai,Y.C.andWilson,D.B.2002.EnzymeMicrob.Technol.30:804-808)。Wohlfahrt(Wohlfahrt.G.等2003.Biochemistry.42:10095國(guó)10103V〉開(kāi)了通過(guò)將羧基-羧酸對(duì)替換為酰胺-羧酸對(duì)而提高TrCel6A在堿性pH范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性。單突變體E107Q和三重突變體E107Q/D170N/D366N在pH7以上具有提高的rm，但是在野生型TrCel6A的最適pH——pH5下具有更低的2^。這些突變存在于N端和C端環(huán)中或其附近。Hughes等(Hughes.S.R.等2006.ProteomeSci.4:10-23)公開(kāi)了一種定向進(jìn)化策略，以在最后四個(gè)密碼子中具有定向變異的0r/w7i(柳j;cMPC-2纖維素酶F(OPC2Cel6F)突變克隆中篩選在較低pH下提高的活性，并鑒定了具有提高的熱穩(wěn)定性并在較低pH下具有提高的活性的兩種突變體。描述家族6纖維素酶推理性設(shè)計(jì)的上述報(bào)道提示，向C端環(huán)中引入氫鍵或二硫鍵不是提高最佳水解條件下熱穩(wěn)定性的良好策略。另外，通過(guò)用突變D241C/D249C引入二石充鍵來(lái)穩(wěn)定里氏木霉7家族纖維二糖水解酶Cel7A的外環(huán)(其形成活性位點(diǎn)通道的頂部)顯示對(duì)熱穩(wěn)定性沒(méi)有改進(jìn)(vonOssowski.I.等.2003.J.Mol.Biol.333:817-829)。具有提高熱穩(wěn)定性的TrCel6A變體描述于美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.20060205042中。使用結(jié)構(gòu)信息和建模程序，基于TrCel6A氨基酸序列與八個(gè)家族6成員序列的比對(duì)鑒定了突變。這種比對(duì)作為確定所謂的共有序列的基礎(chǔ)。選擇TrCel6A的3D-結(jié)構(gòu)模型匹配該結(jié)構(gòu)而無(wú)擾動(dòng)并且很可能改進(jìn)酶的熱穩(wěn)定性的突變作為用于改進(jìn)TrCel6A熱穩(wěn)定性的替換。413位上絲氨酸到酪氨酸的突變(S413Y)包括在被鑒定為改進(jìn)TrCel6A熱穩(wěn)定性的突變之中。該突變將在611C下預(yù)孵育1小時(shí)后保留的酶活性從母體TrCel6A的20-23%提高至TrCel6A-S413Y的39-43%;然而，在65X:預(yù)孵育1小時(shí)后，母體TrCel6A保留其活性的5-9%,而TrCel6A-S413Y保留其活性的6-8%。熔解溫度(或rm)提高了0.2-0.3°C,從母體TrCel6A的66.5。C提高至TrCel6A-S413Y的66.7-66.8。C。盡管在上文和相關(guān)的工業(yè)應(yīng)用中已知纖維素酶的機(jī)制和令人期望的屬性，但是開(kāi)發(fā)具有提高的穩(wěn)定性、催化特性或者同時(shí)具有提高的穩(wěn)定性和催化特性的耐熱纖維素酶會(huì)是有利的。盡管可以在自然界中發(fā)現(xiàn)嗜熱和耐熱的酶，但是有成本效益地大規(guī)模生產(chǎn)這些酶中的困難限制了它們進(jìn)入市場(chǎng)用于工業(yè)用途。因此，需要可以通過(guò)工業(yè)微生物如里氏木霉以高表達(dá)水平經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)的穩(wěn)定性提高的纖維素酶。發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。更具體地，本發(fā)明涉及顯示增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、嗜堿性和/或嗜熱性的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。本發(fā)明還涉及包含編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，用于從宿主菌林中生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的方法，以及經(jīng)修飾的家族6纖維素酶在纖維素水解中的用途。提供具有提高的熱穩(wěn)定性、嗜熱性和嗜堿性的改進(jìn)的纖維素酶是本發(fā)明的一個(gè)目的。本發(fā)明涉及通過(guò)用脯氨酸替換413位的氨基酸來(lái)生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族96纖維素酶的方法。氨基酸替換的位置通過(guò)所述經(jīng)修飾的纖維素酶與SEQIDNO:1中定義的里氏木霉Cel6A氨基酸序列的序列比對(duì)來(lái)確定。所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與產(chǎn)生該家族6纖維素酶的母體家族6纖維素酶相比顯示出增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、嗜堿性、嗜熱性或其組合。所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可來(lái)自絲狀真菌，如里氏木霉。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的纖維素酶并不來(lái)自于413位(TrCel6A編號(hào))上具有天然存在的脯氨酸殘基的纖維素酶，例如413位上含有脯氨酸殘基的天然家族6纖維素酶(來(lái)自O(shè)r/;/"o附j(luò);c"物種PC-2的CeIF)。本發(fā)明還包括這樣的經(jīng)修飾家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且還在選自231、305、410或其組合的位置上包含極性氨基酸。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸，并且還在231位上包含選自絲氨酸或蘇氨酸的替換氨基酸。231位上的替換氨基酸可以是絲氨酸。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸，并且還在305位上包含選自絲氨酸和蘇氨酸的替換氨基酸。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸，并且還在410位上包含選自谷氨酰胺和天冬酰胺的替換氨基酸。本發(fā)明還包括這樣的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且還包括用絲氨酸殘基替換231和305位上的氨基酸(即231S、305S),并將410位氨基酸替換為谷氨酰胺。包含這些突變的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可來(lái)自絲狀真菌，例如里氏木霉。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且相對(duì)于母體纖維素酶具有提高的熱穩(wěn)定性，通過(guò)"7^"來(lái)衡量，比相應(yīng)的母體纖維素酶高約5X:到約30"C，或高約9n到約20x:。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且最高活性溫度(T。pt)比母體家族6纖維素酶的T一提高約1.5C到約30C，或高約2.5"C到約20"C。本發(fā)明還涉及這樣的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，其在413位上包含脯氨酸殘基，并且其最高活性pH(pH。pt)相對(duì)于母體纖維素酶提高約0.5單位到約6.0單位。本發(fā)明還涉及選自下組的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶TrCel6A-S413P(SEQIDNO:12);TrCel6A-G82E-G231S畫(huà)固5S畫(huà)R410Q畫(huà)S413P(SEQIDNO:13);TrCel6A-G231S國(guó)S413P(SEQIDNO:14);TrCel6A-廳5S-S413P(SEQIDNO:15);TrCel6A國(guó)R410Q國(guó)S413P(SEQIDNO:16);TrCel6A隱G231S漏廳5S-S413P(SEQIDNO:17);TrCel6A-G231S-R410Q國(guó)S413P(SEQIDNO:18);TrCel6A-廳5S畫(huà)R410Q-S413P(SEQIDNO:19);TrCel6A-G231S-廳5S國(guó)R410Q國(guó)S413P(SEQIDNO:20);HiCel6A國(guó)Y420P(SEQIDNO:21);和PcCel6A-S407P(SEQIDNO:22)。本發(fā)明還涉及用于指導(dǎo)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶從宿主微生物中表達(dá)和分泌的遺傳構(gòu)建體，所述宿主微生物包括但不限于里氏木霉菌林。本發(fā)明還涉及包含下述DNA序列的遺傳構(gòu)建體，所述DNA序列編碼在413位上包含脯氨酸殘基的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，所述DNA序列與調(diào)節(jié)其從宿主微生物中表達(dá)和分泌的DNA序列有效連接。優(yōu)選地，調(diào)節(jié)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶表達(dá)和分泌的DNA序列來(lái)自用于表達(dá)該經(jīng)修飾的纖維素酶的宿主微生物。宿主微生物可以是酵母例如釀酒酵母CSflcc/mfo附j(luò);c"ce/rWsiV^)或者絲狀真菌如里氏木霉。本發(fā)明還涉及包含編碼經(jīng)修飾家族6纖維素酶之DNA序列的遺傳構(gòu)建體，所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶在413位上包含脯氨酸殘基，并且還包含用絲氨酸替換231和305位上的氨基酸以及用谷氨酰胺替換410位上的氨基酸。該DNA序列與調(diào)節(jié)其從宿主微生物中表達(dá)和分泌的DNA序列有效連接。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶表達(dá)和分泌的DNA序列來(lái)自絲狀真菌，包括但不僅限于里氏木霉。本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳修飾的微生物，其能夠表達(dá)和分泌在413位上包含脯氨酸殘基的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶，并且包含編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶還在231位和305位上包含絲氨酸殘基，并在410位上包含谷氨酰胺殘基。優(yōu)選地，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物是酵母或絲狀真菌。所述經(jīng)遺傳修飾的微生物可以是酵母屬(5Vi"酞附j(luò);c^)、畢赤酵母屬C/c/r/fl)、漢遜酵母屬(jy"M5e""/fl)、木霉屬(THcAorfmw")、曲霉屬(^4s/7"g"/MS)、鐮孢菌屬CFwsfl"w挑)、腐質(zhì)霉屬Cffwiii/co/fl)、務(wù)么孢菌屬(7VeMms/^fl)或原毛平革菌屬(^P/ifl/imc/ifl^)的物種。本發(fā)明還涉及413位上包含脯氨酸殘基的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶用于處理纖維素底物的用途。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的方法，包括轉(zhuǎn)化酵母或真菌宿主，選擇表達(dá)所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的重組酵母或真菌菌林，并在誘導(dǎo)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶表達(dá)的條件下在深層液體發(fā)酵(submergedliquidfermentation)中培養(yǎng)所選擇的重組菌林。413位上包含脯氨酸殘基的本發(fā)明家族6纖維素酶相對(duì)于野生型家族6纖維素酶顯示出提高的熱穩(wěn)定性以及嗜熱性或嗜堿性。不希望受理論的束縳，經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的熱穩(wěn)定性提高是由于通過(guò)提高小ci-螺旋的穩(wěn)定性而穩(wěn)定家族6纖維二糖水解酶中C端環(huán)的氨基酸替換。這類(lèi)纖維素酶可用于需要在高于天然酶的溫度和/或pH值下的酶穩(wěn)定性及活性的多種工業(yè)應(yīng)用中。例如，如本文所述的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可用于以下目的使木質(zhì)纖維原料糖化，以生產(chǎn)可發(fā)酵糖和燃料醇，改進(jìn)飼料在反芻和非反芻動(dòng)物中的可消化性，制紙漿和造紙，從牛仔布中釋放染料并使其軟化。本發(fā)明概述不一定描述了本發(fā)明的所有特征。從以下的描述可更加明確本發(fā)明的這些特征和其他特征，其中參考以下附圖，其中圖l顯示家族6纖維素酶之間的氨基酸序列比對(duì)。將各個(gè)纖維素酶的氨基酸編號(hào)與里氏木霉Cel6A(TrCel6A;SEQIDNO:l)的編號(hào)相比，如各序列左側(cè)和右側(cè)所指示的。213、305、410和413位(相對(duì)于TrCel6A)上的殘基用星號(hào)標(biāo)出。與TrCel6A中相應(yīng)氨基酸相同的殘基為黑體。對(duì)具有纖維素酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的纖維素酶而言，只展示了其催化核心序列。CfCel6B(SEQIDNO:2);HiCel6A(SEQIDNO:4);HiCel6B(SEQIDNO:ll);MtCel6A(SEQIDNO:9);NpCd6A(SEQIDNO:5);OpC2Cel6F(SEQIDNO:6);PE2Cel6A(SEQIDNO:8);TfCel6A(SEQIDNO:10);TfCel6B(SEQIDNO:3)。圖2描繪了質(zhì)粒載體a)YEp352/PGK91-lA7V/^I-xylss-cM2載體，b)YEpFLAGAf/mlO-cM2，其指^天然和經(jīng)修飾的TrCel6A從重組釀酒酵母中表達(dá)和分泌(如果發(fā)現(xiàn)針對(duì)克隆進(jìn)相同載體的TrCel6變體則具有相同的結(jié)構(gòu))，c)YEpFLAGAA)9"l(KPcCWl",其指導(dǎo)天然和經(jīng)修飾的PcCel6A從重組釀酒酵母中表達(dá)和分泌(如果發(fā)現(xiàn)針對(duì)克隆進(jìn)相同載體的PcCel6變體則具有相同的組織)，d)YEpFLAGA7T/mlO-/f/CW6J,其指導(dǎo)天然和經(jīng)修飾的HiCel6A從重組釀酒酵母中表達(dá)和分泌(如果發(fā)現(xiàn)針對(duì)克隆進(jìn)相同載體的HiCel6變體則具有相同的組織)。圖3描述了用于轉(zhuǎn)化和指導(dǎo)經(jīng)修飾的TrCel6A從重組的里氏木霉中表達(dá)和分泌的載體pC/X-S413P-TV。如所示，TrCel6A-S413P基因與(TrCel7A)基因的啟動(dòng)子、x/"2(TrXylllB)基因的分泌信號(hào)肽和天然cM2(TrCel6A)基因的轉(zhuǎn)錄終止子^"效連接。選擇標(biāo)記是粗糙鏈孢霉C/Ve"ns"r"基因。圖4顯示預(yù)孵育溫度對(duì)相對(duì)殘余活性(％)的影響，其通過(guò)在45X:和75匸之間的溫度下孵育15分鐘后在以下溫度下在30分鐘的測(cè)定中從p-葡聚糖釋放的還原糖來(lái)測(cè)量，a)65n，天然TrCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶TrCel6A畫(huà)S413P、TrCel6A國(guó)R410Q-S413P、TrCel6A畫(huà)G231S-N305S-S413P、TrCel6A-G231S-R410Q-S413P、TrCel6A畫(huà)N305S-R410Q-S413P和TrCel6A國(guó)G231S國(guó)N305S-R410Q-S413P;b)60"C,天然PcCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶PcCel6A-S407P;c)65。C,天然HiCel6A和經(jīng)<奮飾的家族6纖維素酶HiCel6A-Y420P。圖5顯示了增加預(yù)孵育時(shí)間對(duì)相對(duì)殘余活性(％)的影響，其通過(guò)30分鐘測(cè)定中從p-葡聚糖底物釋放的還原糖來(lái)測(cè)量，a)在601C下孵育0-120分鐘后，65n下天然TrCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶TrCel6A-S413P、TrCel6A醒R410Q畫(huà)S413P、TrCel6A-G231S-廳5S-S413P、TrCel6A國(guó)G231S畫(huà)R410Q國(guó)S413P、TrCel6A國(guó)N305S國(guó)R410Q誦S413P和TrCel6A-G231S-N305S國(guó)R410Q-S413P和b)在55"C孵育0-120分鐘后，601C下天然PcCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶PcCel6A-S407P。圖6顯示在pH5.0下孵育30分鐘期間溫度對(duì)酶活性的影響，a)天然TrCel6A和經(jīng){務(wù)飾的家族6纖維素酶TrCel6A-S413P、TrCel6A-G82E畫(huà)G231S-N305S-R410Q-S413P、TrCel6A國(guó)R410Q國(guó)S413P,TrCel6A國(guó)G231S-固5S-S413P、TrCel6A-G231S-R410Q-S413P、TrCel6A畫(huà)N305S國(guó)R410Q陽(yáng)S413P和TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P、b)天然PcCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶PcCel6A-S407P和c)天然HiCel6A和經(jīng)l奮飾的家族6纖維素酶HiCel6A-Y420P的酶活性。將數(shù)據(jù)針對(duì)在對(duì)各酶的最適溫度下所觀察到的活性進(jìn)行歸一化。圖7顯示在pH3.95-7.45下孵育30分鐘期間pH對(duì)酶活性的影響，a)天然TrCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素^TrCel6A-S413P、TrCel6A國(guó)G82E國(guó)G231S-廳5S畫(huà)R410Q畫(huà)S413P、TrCel6A畫(huà)R410Q畫(huà)S413P、TrCel6A國(guó)G231S國(guó)固5S畫(huà)S413P、TrCel6A-G231S-R410Q隱S413P、TrCel6A-N305S國(guó)R410Q畫(huà)S413P和TrCel6A畫(huà)G231S-N305S-R410Q-S413P、b)天然PcCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶PcCel6A-S407P和c)天然HiCel6A和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶HiCel6A-Y420P的酶活性。將數(shù)據(jù)針對(duì)各酶在最適pH下所)f見(jiàn)察到的活14性進(jìn)行歸一化。圖8顯示50X:下在50mM檸檬酸鹽緩沖液pH5.0中不存在底物時(shí)預(yù)孵育0、4、20.5、28、40.5、52、68、76和96小時(shí)后，包含TrCel6A或TrCel6A-S413P(以及所有其余的天然里氏木霉纖維素酶組分)的完整木霉屬纖維素酶在經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素底物的酶促水解中的相對(duì)活性。優(yōu)選的實(shí)施方案描述本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的纖維素酶。更具體地，本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、嗜堿性和/或嗜熱性的經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。本發(fā)明還涉及包含編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，用于從宿主菌林中生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的方法，以及經(jīng)修飾的家族6纖維素酶在纖維素水解中的用途。以下的描述是一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其僅用于舉例，而不限制實(shí)踐本發(fā)明所必需特征的組合。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶家族6(先前稱(chēng)作B家族)纖維素酶是通過(guò)倒轉(zhuǎn)化端基異構(gòu)碳的構(gòu)型來(lái)水解纖維素中p-l,4糖苷鍵的一組酶(Claeyssens,M.andHenrissat,B.1992，ProteinScience1:1293-1297)。家族6纖維素酶共享廣泛的氨基酸序列相似性(圖1)。如果一種纖維素酶包含其他家族6纖維素酶共有的氨基酸(包括可作為催化殘基的兩個(gè)天冬氨酸(D)殘基)，則其被分類(lèi)為家族6纖維素酶。這些天冬氨酸殘基存在于175和221位(見(jiàn)圖1;基于TrCel6A(里氏木霉Cel6A酶)氨基酸編號(hào))上。迄今為止鑒定的大部分家族6纖維素酶是嗜溫的。然而，該家族也包含來(lái)自褐色嗜熱裂孢菌的熱穩(wěn)定纖維素酶(TfCel6A和TfCel6B)和來(lái)自特異腐質(zhì)霉的嗜堿纖維素酶(HiCel6A和HiCel6B)。家族6催化結(jié)構(gòu)域的拓樸結(jié)構(gòu)是帶有中心|5桶的a/p桶，含有通過(guò)五個(gè)a螺旋連接的七條平行的p鏈。家族6纖維二糖水解酶與內(nèi)p-1,4-葡聚糖酶之間一個(gè)重要的差異是N端和C端環(huán)的長(zhǎng)度，所述N端和C端環(huán)存在于活性位點(diǎn)兩側(cè)并且負(fù)責(zé)它們對(duì)纖維素的功能性作用。在纖維二糖水解酶中，廣闊的C端環(huán)與帶有活性位點(diǎn)的N端環(huán)形成通道。這賦予了纖維二糖水解酶攻擊結(jié)晶纖維素末端的獨(dú)特特性，其中N端和C端環(huán)將單個(gè)纖維素鏈保持在活性位點(diǎn)中，并有利于底物的連續(xù)降解。在內(nèi)切-P-l,4-葡聚糖酶中，C端環(huán)長(zhǎng)度減少，N端環(huán)將其拉離活性位點(diǎn)，并且也可以更短，導(dǎo)致更開(kāi)放的活性位點(diǎn)，允許接近纖維素的內(nèi)部P-l，4糖苷鍵進(jìn)行水解。通過(guò)缺失CW份/o附wfls纖維二糖水解酶Cel6BC端環(huán)的十五個(gè)氨基酸來(lái)模擬內(nèi)切-P-l，4-葡聚糖酶的性質(zhì)，從而證實(shí)了這些環(huán)在6家族酶對(duì)纖維素的功能性作用中的功能(Meinke.A.等.1995.J.Biol.Chem.270:4383-4386)。該突變?cè)鰪?qiáng)了酶對(duì)可溶纖維素(例如羧曱基纖維素)的內(nèi)切-p-l，4-葡聚糖酶活性，并改變了其對(duì)不溶性纖維素的纖維二糖水解酶活性。可按照本文列出的一般策略和方法修飾的家族6纖維素酶的非限制性實(shí)例在下表l中描述。表l:家族6纖維素酶<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>優(yōu)選的家族6纖維素酶的實(shí)例(其并非旨在限制)包括里氏木霉Cel6A、特異腐質(zhì)霉Cel6A、黃孢原毛平革菌(i^朋ewc/^e^c/r，os/70f7.M/if)Cel6A、糞月巴纖維單胞菌(CW/^附^m"s^附/)Cel6B、褐色嗜熱裂孢菌Cel6B。更優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)修飾纖維素酶包括經(jīng)修飾的里氏木霉Cel6A酶。"經(jīng)修飾的家族6纖維素酶"或"經(jīng)修飾的纖維素酶"指這樣的家族6纖維素酶，其中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)將413位上的氨基酸(所述位置根據(jù)所述經(jīng)修飾纖維素酶與SEQIDNO:l中定義的里氏木霉Cel6A氨基酸序列之間的序列比對(duì)來(lái)確定)改變?yōu)楦彼?，并且所述酶顯示超過(guò)相應(yīng)未修飾家族6纖維素酶的熱穩(wěn)定性、嗜熱性、嗜堿性或其組合的改進(jìn)。用于改變氨基酸序列的技術(shù)包括但不限于定點(diǎn)誘變、盒誘變、隨機(jī)誘變、合成寡核苷酸構(gòu)建、克隆和其他遺傳工程技術(shù)(EijsinkVG等.2005.Biomol.Eng.22:21-30，通過(guò)參考并入本文)。應(yīng)當(dāng)理解，經(jīng)修飾的纖維素酶可衍生自任何家族6纖維素酶。經(jīng)修飾的纖維素酶可衍生自野生型纖維素酶，或者衍生自已含有其他氨基酸替換的纖維素酵。就本發(fā)明目的而言，母體纖維素酶是這樣的纖維素酶，其原始氨基酸中413位上不含有脯氨酸替換(所述位置根據(jù)所述經(jīng)修飾纖維素酶與SEQIDNO:l中定義的里氏木霉Cel6A氨基酸序列的序列比對(duì)來(lái)確定)，并且在其他方面與該經(jīng)修飾的纖維素酶相同。因此，母體纖維素酶可以是這樣的纖維素酶，其在其他位置上含有通過(guò)遺傳工程或其他技術(shù)引入的氨基酸替換。然而，母體纖維素酶不包括其中413位上天然存在的氨基酸是脯氨酸的那些纖維素酶。"TrCel6A編號(hào)，，表示以TrCel6A的氨基酸序列(表l;圖1;SEQIDNO:l)為基礎(chǔ)，對(duì)應(yīng)于氨基酸位置的編號(hào)。如下文所公開(kāi)并如圖1所示的，家族6纖維素酶顯示顯著的序列相似性程度。因此，通過(guò)將氨基酸比對(duì)以優(yōu)化纖維素酶之間的序列相似性和通過(guò)使用TrCel6A的氨基酸編號(hào)作為編號(hào)的基礎(chǔ)，可以相對(duì)于TrCel6A來(lái)確定其他纖維素酶中氨基酸的位置。酶的熱穩(wěn)定性可以通過(guò)其熔解溫度(meltingtemperature,rm)、在確定溫度下的半衰期(tm)和孵育確定的時(shí)間后喪失50%原始酶活性的溫度(rs。)來(lái)定義。與其嗜溫對(duì)應(yīng)物相比，嗜熱酶一般顯示被鑒定為對(duì)酶熱穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)因子(contributingfactor)的共有結(jié)構(gòu)元件(參閱如Sadeghi，M.等.2006.Biophvs.Chem.119:256-270)。這些結(jié)構(gòu)元件包括更高的疏水性、更好的包裝(packing)、增加的極性表面積、環(huán)的缺失或減短、相互作用、更小并且更少量的空腔、(X螺旋穩(wěn)定性、芳族相互作用的提高、額外的二硫鍵或金屬結(jié)合位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)、降低的甘氨酸含量和提高的脯氨酸含量、增加的氫鍵和鹽橋、改善的靜電相互作用、減少的不耐熱殘基以及構(gòu)象應(yīng)變的釋放。就本發(fā)明的目的而言，如果纖維素酶具有與母體纖維素酶的rso相比至少高約4x:或至少高約9x:的r5Q，或例如纖維素酶具有與母體纖維素酶的rso相比高約41C到約30匸或其間任意量，或高約9匸到約30匸或其間任意量，則所述纖維素酶關(guān)于相應(yīng)的母體纖維素酶顯示提高的熱穩(wěn)定性。rso是所述經(jīng)修飾酶或天然酶在預(yù)孵育15分鐘后保留50%殘余活性的溫度，并可通過(guò)實(shí)施例10.4中詳述的測(cè)定法測(cè)定。如實(shí)施例10.4中所公開(kāi)的，將65C下30分鐘測(cè)定中p-葡聚糖的殘余活性歸一化為100%。所述經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有這樣的r5Q，其比相應(yīng)母體纖維素酶的rs。高約4匸到約30r:或其間任何范圍，高約5t:到約20匸或其間任何范圍，高約8匸到約15n或其間任何范圍，或高約9C到約15匸或其間任何范圍。例如，所述經(jīng)修飾的纖維素酶可具有比相應(yīng)母體纖維素酶至少高約4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30n的r50。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶也可以被表征為具有高于65"C(或比相應(yīng)母體家族6纖維素酶高至少5匸)的r5。，例如，經(jīng)修飾的纖維素酶可具有從約651C到約卯1C或其間任意量的r5Q。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有高于70"C(或比母體家族6纖維素酶高至少9n)的r5。，例如經(jīng)修飾的纖維素酶可具有從約70x:到約卯ic或其間任意量的r5Q。家族6纖維素酶可具有50、55、60、65、70、75、80、85或90X:或其間任意量的r5Q。就本說(shuō)明書(shū)的目的而言，如果纖維素酶顯示比相應(yīng)母體纖維素酶的最適溫度(T宇)至少高約1.5C的T。pt，則該纖維素酶相對(duì)于相應(yīng)母體纖維素酶顯示提高的嗜熱性。例如，如果纖維素酶顯示比相應(yīng)母體纖維素酶的T豐高約1.51C到約30t:或其間任意量的最適溫度(T。pt)，則該纖維素酶具有提高的嗜熱性。最適溫度或T。pt表示纖維素酶顯示其最高活性的最高溫度。就本說(shuō)明書(shū)的目的而言，如實(shí)施例10.1中所詳述的，通過(guò)測(cè)量針對(duì)P-葡聚糖底物之活性的溫度曲線來(lái)測(cè)定家族6纖維素酶的T。pt。纖維素酶活性的溫度曲線在其最適pH下測(cè)量。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有比相應(yīng)母體家族6纖維素酶的T。pt至少高約1.5n到約30匸的T。pt。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)^務(wù)飾的家族6纖維素酶的T—比母體家族6纖維素酶的T豐至少高約2.5匸到約20*€。例如，經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有比相應(yīng)母體纖維素酶的T豐至少高約1.5、2.5、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0、25.0或30"C的Topt。術(shù)語(yǔ)"熱穩(wěn)定性"和"嗜熱性"在文獻(xiàn)中可相互交換使用。然而，本文所定義術(shù)語(yǔ)的使用是與本領(lǐng)域中這些術(shù)語(yǔ)的用法一致的(Mathrani，I和Ahring,B.K.1992Appl.Microbiol.Biotechnol.38:23-27)。就本發(fā)明的目的而言，如果纖維素酶顯示比母體纖維素酶的pHQpt至少高約0.5個(gè)單位的pH。pt，則該纖維素酶相對(duì)于相應(yīng)母體纖維素酶顯示提高的嗜堿性。pH。pt表示纖維素酶展示其最高活性的最高pH。就本說(shuō)明書(shū)的目的而言，如實(shí)施例10.2中所公開(kāi)的，通過(guò)測(cè)量家族6纖維素酶的pH曲線來(lái)測(cè)定pH。pt。經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可具有比母體家族6纖維素酶的pH—至少高約0.5單位到約6.0單位或其間任意量的pH。pt。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的pH。pt比母體家族6纖維素酶的pH。pt至少高約0.8單位到約5.0單位或其間任意量。例如，纖維素酶的pH。pt可比母體纖維素酶的pH叩t高約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0個(gè)單位。如本文進(jìn)一步詳述的，已制備了顯示增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、嗜熱性、嗜堿性或其組合的若干突變體家族6纖維素酶。表2中展示了若干突變體的列表，這不應(yīng)以任何方式被認(rèn)為是限制性的。表2:經(jīng)修飾的家族6纖維素酶<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>包含經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體本發(fā)明還涉及遺傳構(gòu)建體，其包含編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的DNA序列，所述DNA序列與指導(dǎo)該經(jīng)修飾的家族6纖維素酶從宿主微生物中表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)DNA序列有效連接。調(diào)節(jié)序列優(yōu)選地在真菌宿主中發(fā)揮功能。調(diào)節(jié)序列可來(lái)自在工業(yè)發(fā)酵條件下在宿主微生物中高度表達(dá)和分泌的基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)序列來(lái)自任何一個(gè)或多個(gè)里氏木霉纖維素酶或半纖維素酶基因。如本領(lǐng)域所公知的，遺傳構(gòu)建體可進(jìn)一步包含選擇標(biāo)記，使得能夠分離用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的經(jīng)遺傳修飾的微生物。選擇標(biāo)記可賦予宿主生物對(duì)抗生素的抗性或在缺乏特定營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力，否則所述宿主生物不能夠在這些條件下生長(zhǎng)。本發(fā)明不受限于對(duì)選擇標(biāo)記的選擇，技術(shù)人員可容易地確定合適的標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記賦予對(duì)潮霉素、腐草霉素、卡那霉素、遺傳霉素或G418的抗性，補(bǔ)回宿主微生物在吵、tff*g、/e々、/yW、/>t2、"m3、w/yi5、A/s或基因之一中的缺陷，或賦予在乙酰胺作為唯一氮源時(shí)生長(zhǎng)的能力。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記是編碼乳清苷-5，-脫羧酶的粗糙鏈孢霉/^W基因。包含經(jīng)修飾家族6纖維素酶的經(jīng)遺傳修飾的微生物經(jīng)修飾的家族6纖維素酶可由經(jīng)遺傳修飾的微生物表達(dá)和分泌，所述經(jīng)遺傳修飾的微生物通過(guò)用編碼經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主微生物來(lái)產(chǎn)生。宿主微生物優(yōu)選是酵母或絲狀真菌，包括但不限于酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、木霉屬、肉座菌屬(gy/^c^a)、曲霉屬、鐮孢菌屬、腐質(zhì)霉屬、脈孢菌屬或原毛平革菌屬的物種。宿主微生物一般是其中編碼任何或所有家族6纖維素酶的基因都已被缺失的微生物。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主微生物是里氏木霉的工業(yè)菌可通過(guò)任何微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法將遺傳構(gòu)建體引入宿主微生物中，包括但不限于用CaCl2處理細(xì)胞、電穿孔、生物射彈、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合(例如White等，WO2005/093072，其通過(guò)參考并入本文)。在選擇了表達(dá)經(jīng)修飾家族6纖維素酶的重組真菌菌林后，可在誘導(dǎo)該經(jīng)修飾家族6纖維素酶表達(dá)的條件下在深層液體發(fā)酵中培養(yǎng)所選擇的重組菌抹。纖維素底物的水解本發(fā)明還涉及本文描述的經(jīng)修飾家族6纖維素酶用于水解纖維素底物的用途。術(shù)語(yǔ)"纖維素底物"表示來(lái)自植物生物量并包含纖維素的任何底物，包括但不限于用于生產(chǎn)乙醇或其他高價(jià)值產(chǎn)品的木質(zhì)纖維素(lignocellulosic)原料、動(dòng)物飼料、林業(yè)廢物如紙漿和木片以及紡織品。術(shù)語(yǔ)"木質(zhì)纖維素原料"表示任何類(lèi)型的植物生物量，例如但不限于非木本植物生物量；栽培作物，例如但不限于草，例如但不限于C4草,例如柳枝稷(switchgrass)、大米草(cordgrass)、黑麥草(ryegrass)、芒草(miscanthus)、草聲(reedcanarygrass)或其組合；糖加工殘余物，例如但不限于蔗渣、甜菜漿(beetpulp)或其組合；農(nóng)業(yè)殘余物，例如但不限于大豆稈、玉米稈、稻稈、稻殼、大麥稈、玉米芯、麥稈、蕓苔稈、燕麥稈、燕麥殼、玉米纖維或其組合；林業(yè)生物量，例如但不限于再循環(huán)的木漿纖維、鋸屑、硬木(例如白楊)、軟木或其組合。在用于生產(chǎn)乙醇或其他產(chǎn)品的木質(zhì)纖維素原料的糖化中，本發(fā)明的纖維素酶可用于水解經(jīng)預(yù)處理的原料，所述原料例如但不限于通過(guò)蒸汽暴破(steamexplosion)產(chǎn)生(見(jiàn)Foody,美國(guó)專(zhuān)利No.4,461,648，其通過(guò)參考并入本文，并指定讀者參考)。預(yù)處理可包括用蒸汽、酸、或通常用蒸汽和酸的組合來(lái)處理原料，從而當(dāng)纖維原料被轉(zhuǎn)化為漿狀的結(jié)構(gòu)時(shí)纖維素酶表面積大幅增加，期間幾乎沒(méi)有纖維素被轉(zhuǎn)化為葡萄糖。然后本發(fā)明的纖維素酶可被用于在后續(xù)步驟中將纖維素酶水解為葡萄糖。隨后葡萄糖可被轉(zhuǎn)化為乙醇或其他產(chǎn)品。可向木漿或木片中添加本發(fā)明的經(jīng)修飾纖維素酶，以增強(qiáng)木漿的漂白或降低其精制(refining)能量。木漿可通過(guò)化學(xué)制漿過(guò)程或通過(guò)機(jī)械精制產(chǎn)生。提高家族6纖維素酶的熱穩(wěn)定性通過(guò)在不同的溫度下在無(wú)底物時(shí)預(yù)孵育酶來(lái)比較突變體家族6纖維素酶的熱穩(wěn)定性。15分鐘后，使用可溶性p-葡聚糖作為底物，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法測(cè)定纖維素酶的殘余活性。通過(guò)對(duì)經(jīng)修飾的TrCel6A-S413P與母體TrCel6A進(jìn)行比較研究，測(cè)定了S413P突變(單獨(dú)或與G231S、N305S和R410Q中一個(gè)或多個(gè)組合)對(duì)家族6纖維素酶熱穩(wěn)定性的影響。在更高的溫度下預(yù)處理高達(dá)120分鐘后，前者比后者保留更高的殘余活性(圖5a)。測(cè)定使家族6纖維素酶保留50%殘余活性的預(yù)處理溫度r5。。對(duì)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶TrCel6A-S413P而言，75。為64.1匸，相比之下，母體TrCel6A為59^C(圖4a)。這代表通過(guò)引入S413P突變將熱穩(wěn)定性提高超過(guò)51C。其他TrCel6A變體的r5Q比野生型TrCel6A至少高3.2°C。PcCel6A-S407P和Hicel6A-Y420P與其各自的母體酶相比也顯示了r5。的提高(圖4b和c)。22提高家族6纖維素酶的嗜熱性通過(guò)測(cè)量測(cè)定溫度對(duì)p-葡聚糖水解的影響來(lái)測(cè)定經(jīng)修飾家族6纖維素酶的嗜熱性。與其各自野生型相比，所有經(jīng)修飾的家族6纖維素酶均顯示對(duì)j5-葡聚糖水解而言提高的T。pt，只有變體TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P例外，而在另一方面，該變體顯示在廣闊的溫度范圍內(nèi)具有高于80%的最大活性(圖6)。在所有的TrCel6A變體中，TrCel6A-S413P具有72.2。C的較高最適溫度，與野生型TrCel6A相比嗜熱性提高5.6°C(圖6a)。PcCel6A-S407P和HiCel6A-Y420P與其各自的野生型相比也顯示最適溫度的提高(圖6b和c)。提高家族6纖維素酶的嗜堿性還研究了S413P突變(單獨(dú)或與G231S、N305S和R410Q中的一個(gè)或多個(gè)組合)對(duì)家族6纖維素酶pH/活性曲線的影響。所有經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與其野生型相比均顯示提高的嗜堿性。對(duì)TrCel6A而言，變體TrCel6A-G231S-R410Q-S413P，見(jiàn)察到顯著的遷移(+1.25pH單位)、然后是TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P(+1.01pH單位)。包含與非家族6纖維素酶組合的經(jīng)修飾家族6纖維素酶的纖維素酶系顯示提高的熱穩(wěn)定性。包含TrCel6A-S413P的木霉纖維素酶系在無(wú)底物時(shí)于50t:下孵育96小時(shí)后維持其最高活性的至少80%，而包含母體TrCel6A的相應(yīng)纖維素酶系僅維持其最高活性的50%(圖8)?？偠灾?，本發(fā)明改進(jìn)的熱穩(wěn)定、嗜堿和/或嗜熱突變體家族6纖維素酶在413位上包含脯氨酸殘基，并可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)以下的氨基酸替換(i)231位上的替換氨基酸，如極性氨基酸，包括但不僅限于絲氨酸；(ii)305位上的替換氨基酸，如極性氨基酸，包括但不限于絲氨酸；23(iii)410位上的替換氨基酸，例如極性氨基酸，包括但不限于谷氨酰胺；和(iv)(i)到(iii)中所述的任何上述突變的組合。優(yōu)選的家族6纖維素酶突變體的非限制性實(shí)例在表2中給出，其包含與上文所列氨基酸替換組合的S413P。另夕卜，本發(fā)明的經(jīng)修飾家族6纖維素酶可包含與S413P組合的上文未列出的氨基酸替換。上文的描述不旨在以任何方式限制所要求保護(hù)的本發(fā)明。另外，對(duì)于本發(fā)明的方案而言，所討論的特征組合可能不是絕對(duì)必需的。實(shí)施例本發(fā)明將在以下的實(shí)施例中進(jìn)一步闡述。然而，應(yīng)當(dāng)理解這些實(shí)施例僅用于闡述的目的，并且不應(yīng)被用于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1描述了以下實(shí)施例中使用的菌林和載體。實(shí)施例2-5描述了TrCel6A基因的隨機(jī)誘變、將隨機(jī)誘變文庫(kù)克隆進(jìn)酵母載體以及用于鑒定具有提高的熱穩(wěn)定性的經(jīng)修飾家族6纖維素酶的高通量篩選。實(shí)施例6-8描述了在替代酵母載體中克隆、重組和表達(dá)經(jīng)修飾的和天然的家族6纖維素酶基因用于更高表達(dá)。實(shí)施例9描述了經(jīng)修飾家族6纖維素酶的酶特征。實(shí)施例10描述了用于在絲狀真菌中表達(dá)和分泌經(jīng)修飾家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體。實(shí)施例11描述了用表達(dá)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化真菌原生質(zhì)體。實(shí)施例12描述了在深層液體培養(yǎng)中由經(jīng)修飾的微生物生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶。實(shí)施例13描述了對(duì)完整木霉纖維素酶(包含經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與來(lái)自其他家族的纖維素酶的組合)的表征。實(shí)施例1:菌林和載體釀酒酵母菌林DBY747(Zi/s3-Al/ei/2畫(huà)3/ew2-112"ni3-52&/;1-289(琥珀型突變)g"/(s)CUP(r))得自ATCC。釀酒酵母菌林BJ35050^/4::HIS3/w^-A1.6RHIS3/"2誦208^pl畫(huà)A101wni3-52g/2c"wl)得自Sigma，并且是氨基端酵母FLAG表達(dá)試劑盒的一部分。本文所述的實(shí)驗(yàn)中4吏用來(lái)源于RutC30(ATCC#56765;Montenecourt.B.andEveleigh.D.1979.Adv.Chem.Ser.181:289-301)的包含已破壞的天然TrCel6A基因的里氏木霉菌株。大腸桿菌(五scAccA/fl"/,〕菌林HB101(F-/isrfS20(rB-，mB)sii/7E44recA13flr-14/ewB6/;jyA2/"cY1gfl/K2，L20(strr)a^,-5附W-l)和DH5a(F^80/ctcZAM15A(/acZYA國(guó)"^F)U169z^cAle"rfAl/^汲17(r"mk+)/7/^A考E44由-1^A96m/A1X)得自Invitrogen。特異腐質(zhì)霉和黃孢原毛平革菌菌林得自ATCC⑧(分別為W2082TM和#201542TM)。YEp352/PGK91-l載體得自國(guó)立衛(wèi)生研究院。YEpFLAG-l載體作為氨基端酵母FLAG表達(dá)試劑盒的一部分得自Sigma。pALTER-l載體作為AlteredSiteII體外謙變系統(tǒng)的一部分得自Promega。pBluescriptIIKS國(guó)載體得自Stratagene。實(shí)施例2:將TrCel6A基因克隆進(jìn)YEp352/PGK91-l中并轉(zhuǎn)化酵母2.1從里氏木霉中分離總RNA并產(chǎn)生總cDNA。在如實(shí)施例13中所述的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)里氏木霉生物量，然后使用50mg生物量，用AbsolutelyRNA⑧小量制備試劑盒(Stratagene)根據(jù)制造商的方法提取總RNA。使用SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)根據(jù)制造商的方法從總RNA產(chǎn)生總cDNA。2.2克隆并轉(zhuǎn)化酵母為了便于使用7VAel和JT/ml限制性酶進(jìn)行克隆，使用DNA聚合酶I大(Klenow)片段將YEp352/PGK91-l載體1936位上的單一7V/^I位點(diǎn)補(bǔ)平，得到Y(jié)Ep352/PGK91-lANhel。4吏用向編碼序列上游引入5^I-2V/iel位點(diǎn)和向下游引入f/mKB^II-5^1位點(diǎn)的引物C2STU5和C2STU3，通過(guò)PCR從總cDNA(如實(shí)施例2.1中所述產(chǎn)生)中擴(kuò)增編碼TrCel6A的c6Zi2基因。平行地，使用向擴(kuò)增子5'端引入5^H并在3，端引入7V/irf位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR從TrXylllB的基因組克隆(pXYN2K2，實(shí)施例11.3)中擴(kuò)增TrXylllB基因的分泌信號(hào)肽，隨后使用這些限制性位點(diǎn)將其克隆進(jìn)pBluescript⑧IIKS-(Stratagene)中，得到質(zhì)粒pXYNSS-Nhe。然后將該擴(kuò)增子克隆進(jìn)pXYNSS-Nhe中單一TV/^I和位點(diǎn)中。隨后使用引物(BGL2XYF和C2STU3))通過(guò)PCR從其中間構(gòu)建體中擴(kuò)增片段，該片段包含與5，和3'端具有5g瓜位點(diǎn)的TrXylllB分泌信號(hào)肽有效連接的TrCel6A基因。將該擴(kuò)增子克隆進(jìn)YEp352/PGK91-lA7V/^1載體的丑g氾位點(diǎn)中，得到Y(jié)Ep352/PGK91-lAA7^I-xylss-cbh2載體(圖2a)，并使用Gietz,R.D.和Woods,R.A.(Gietz.R.D.和Woods,R.A.2002.Meth.Enzvm.350:87-96)所述方法轉(zhuǎn)化酵母菌林DBY747并涂板到SC-Ura平板上。引物序列如下贏IC2STU5:5'GATAGGCCTGCTAGCTGCTCAAGCGTCTGGGGC(SEQIDNO:24)C2STU3:5'ATCAGGCCTAGATCTGGTACCTTACAGGAACGATGG(SEqIDNO:25)BGL2XYF:5'GATCAGATCTATGGTCTCCTTCACCTCCCTC(SEQIDNO:26)SC-Ura平板含有組分g/L不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮源(BD)1.7(NH4)2S04(Sigma)不含尿苷的完全補(bǔ)充培養(yǎng)基(Clontech)瓊脂(BD)葡萄糖(Fisher)5.00.7717.020.0pH5.6實(shí)施例3:產(chǎn)生cM2的易錯(cuò)PCR文庫(kù)4吏用兩種方法產(chǎn)生隨機(jī)i秀變文庫(kù)Mn2+/dITP方法和偏向(biased)核苷酸方法。對(duì)]\1112+/(101方法而言，使用上述C2STU3和BGL2XYF引物在兩步式PCR法中從YEp352/PGK91-lAA7^I-xylss-cbh2載體中擴(kuò)增TrCel6A基因。在第一步中，擴(kuò)增在20jiMMnCl2存在下進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。第二步用相同的引物進(jìn)行，但是使用來(lái)自第一步的產(chǎn)物作為模板，并使用0、25、50、75或100nMdlTP(0fiM作為對(duì)照)。對(duì)偏向核苷酸方法而言，分別使用1:3、1:5或1:10摩爾比的噪呤堿基和嘧咬堿基進(jìn)行PCR。為主要得到酶核心中的突變，使用A7^I和X/ml限制性位點(diǎn)將兩種情況下的最終擴(kuò)增子克隆進(jìn)YEp352/PGK91-lAA7ieI-xylss-cbh2載體(AT^I恰好在編碼酶連接子中S55密碼子的序列后切割)中并轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌林DBY747。實(shí)施例4:產(chǎn)生TrCel6A的定點(diǎn)半隨機(jī)文庫(kù)甘氨酸殘基不具有P-碳，因此具有顯著更大的主鏈構(gòu)象自由度。通過(guò)分析TrCel6A的三維結(jié)構(gòu)，靶向了4個(gè)甘氨酸殘基來(lái)降低該自由度，即G90、G85、G231和G384。將除G231以外的所有位置飽和，通過(guò)大引物PCR將G231隨機(jī)突變?yōu)楸彼?、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，所述PCR使用以下引物CCAACAAAAGGGTTNNNTGAATACGTAGCGG(SEQIDNO:27)CCCAAGGAGTGACNNNAACAAAAGGGTTG(SEQIDNO:28)GGTGACCAACCTCNCNACTCCAAAGTGTG(SEQIDNO:29)CCGCAAACACTNNNGACTCGTTGCTG(SEQIDNO:30)將所有擴(kuò)增子克隆在如實(shí)施例3中所述的YEp352/PGK91-lAiV/^I-xylss-cbh2載體中。實(shí)施例5:在TrCel6A基因文庫(kù)中篩選具有提高的熱穩(wěn)定性的經(jīng)修飾家族6纖維素酶如下篩選按照實(shí)施例3和4產(chǎn)生的總計(jì)3371個(gè)TrCel6A變體在G9。toXxx:G85toXxx:G231toA/P/S/T:G384toXxx:27Vortemp設(shè)備(Labnet)中，于650rpm和30匸下將每個(gè)酵母菌落在96-深孔平板的孔中培養(yǎng)2天，所述孔含有l(wèi)mLYPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)培養(yǎng)基和一個(gè)1.5mm玻璃珠。將平板以3,000xg離心5分鐘，然后使用Bio-Dot設(shè)備(Bio-Rad)將300jiL上清液各濾過(guò)兩張BiodyneB帶正電尼龍膜(PallGelman)。將膜置于含50mM檸檬酸鈉、pH4.8的潮濕(不滴水的)Whatman紙上。將一張?jiān)?2匸下孵育12分鐘，另一張?jiān)谑覝叵路跤?對(duì)照)。然后將膜置于含P-葡聚糖底物的瓊脂平板上，并在潮濕培養(yǎng)箱中于50匸下孵育過(guò)夜組分g/L(NH4)2S04(Sigma)5.0(3-葡聚糖(Barley，MediumViscosity;Megazyme)2.0瓊脂(BD)17.0葡萄糖(Fisher)20.0pH5.6然后通過(guò)用0.1%(w/v)剛果紅溶液覆蓋瓊脂平板來(lái)染色30-60分鐘，然后用軟化水漂洗2-3次以去除未結(jié)合的染料，并用1MNaCl覆蓋10-15分鐘。可以觀察亮區(qū)，并在對(duì)照和用熱處理膜覆蓋的平板之間進(jìn)行比較。每塊平板至少由兩個(gè)人仔細(xì)察看，與野生型TrCel6A對(duì)照相比，每個(gè)在62匸下孵育12分鐘后顯示維持其活性的陽(yáng)性變體都被認(rèn)為可能是陽(yáng)性的。在微量培養(yǎng)物中再次產(chǎn)生每個(gè)可能的陽(yáng)性克隆，以允許在另外的情況下觀察表型并降低假陰性的可能性。將來(lái)自該篩選的五個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序，以鑒定其含有的突變。克隆E6含有S413P突變，克隆G3和F7均含有G231S突變，克隆A3含有N305S突變，克隆7含有連接肽末端的G82E突變以及R410Q突變。實(shí)施例6:將經(jīng)修飾的TrCel6A基因克隆進(jìn)YEpFLAG-l載體中，以用于由釀酒酵母更高地表達(dá)為了便于將實(shí)施例5中鑒定的經(jīng)修飾TrCd6A基因克隆進(jìn)YEpPLAG-l載體中從而將這些基因與a接合因子分泌信號(hào)肽有效連接，兩種修飾是必需的。首先，去除YEpFLAG-l載體的分泌信號(hào)肽序列(bp1457)中存在的單一f/;wl位點(diǎn)。這使用兩個(gè)互補(bǔ)的誘變引物(5'-FLAGAiT/ml和3'-FLAGA^/ml)通過(guò)PCR完成。然后用Z)/ml將誘變反應(yīng)物在37C下消化1小時(shí)，通過(guò)將管置于沸水中并允許其緩慢冷卻至室溫而使質(zhì)粒重新環(huán)化。將該反應(yīng)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)僅用f/ml消化一次的克隆進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證想要的突變，將其用于進(jìn)一步工作并命名為YEpFLAGA^/;"I。引物序列如下AATp"I5'孔AGAA:/j"I:5'ctaAAGAAGAAGGGGTACATTTGGATAAAAGAGAC(SEQIDNO:31)3'-FLAG崎"I:5'GTCTCTTTTATCCAAATGTACCCCTTCTTCTTTAG(SEQIDNO:32)其次，使用在擴(kuò)增片段的5，端引入A7^I-7V/^I位點(diǎn)和在3'端引入7T/ml-y^fll位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR從pCOR132(實(shí)施例11.2)中擴(kuò)增里氏木霉c6/fl基因。然后將該片段作為A7ioIM/;fll片段插入經(jīng)」V7^I厶4/ml線性化的YEpFLAG-l表達(dá)載體中。得到的載體YEpFLAGAI/;w10允許將實(shí)施例5中鑒定的經(jīng)修飾TrCel6A基因作為A7iel/X/ml片段插入，從而使編碼區(qū)與a分泌信號(hào)肽有效連接。使用從Hoffman和Winston(Hoffman,C.S.和Winston,F.1987.Gene57:267-272)的方法修改而來(lái)的方法，從酵母菌林DBY747的轉(zhuǎn)化體中分離含有天然或經(jīng)修飾的TrCel6A基因的YEp352/PGK91-lA7V/^I-xylss-cbh2載體，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌HB101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)用TV/^I和l/ml消化，從YEp352/PGK91-lA7V/ieI-xylss-cbh2載體中移出經(jīng)修飾的TrCel6A基因，并使用相同的限制性酶克隆進(jìn)YEpFLAGAf/mlO中。使用Gietz和Woods(Gietz，R.D.和Woods,R.A.2002.Meth.Enzym.350:87-96)所述的方法將最終的構(gòu)建體YEpFLAGAf/7"10國(guó)cbh2、YEpFLAGA^/mlO-G82E畫(huà)R410Q、YEpFLAGA爭(zhēng)10-漏5S、YEpFLAGA爭(zhēng)10-S413P和YEpFLAGAJT/7"10-G231S(圖2b)轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母菌森BJ3505中，并在SC-trp平板上涂板。通過(guò)DNA序列分析來(lái)驗(yàn)證所有變體的克隆區(qū)域的完整性。該酵母載體所產(chǎn)生的母體TrCel6A的氨基酸序列(SEQIDNO.23)顯示出含有FLAG肽的C端延伸。然而，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，該小肽延伸不以任何方式促進(jìn)母體或經(jīng)修飾的TrCel6A纖維素酶的熱穩(wěn)定性、嗜熱性或嗜堿性。SC-trp平板含有組分g/L不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮源(BD)1.7(NH4)2S04(Sigma)5.0無(wú)色氨酸的酵母合成缺失培養(yǎng)基補(bǔ)充劑(YeastSynthetic1Drop國(guó)OutMediaSupplementwithoutTryptophan)(Sigma)瓊脂(BD)20葡萄糖(Fisher)20實(shí)施例7:產(chǎn)生其他TrCel6A變體PcCel6A、PcCel6A-S407P、HiCel6A和HiCel6A-Y420P并將其克隆進(jìn)YEpFLAG-l載體中7.1產(chǎn)生其他TrCel6A變體。通過(guò)TrCel6A-S413P變體的易錯(cuò)PCR獲得TrCel6A變體R410Q-S413P，使用MutazymeIIDNA聚合酶(Stratagene)克隆進(jìn)YEp352/PGK91-lA7V/^1中。然后使用引物5'FLAG-Cel6A-GR和3'FLAG-Cel6A-GR將其從該來(lái)源中擴(kuò)增，所述引物分別在7V/^I位點(diǎn)上游和J/7fll位點(diǎn)下游引入與YEpFLAG-l載體同源的序列。使用誘變引物與引物3'FLAG-Cel6A-GR的組合產(chǎn)生以下TrCel6A突變組合的大引物PCR:G231S曙S413P、謂5S-S413P、G231S畫(huà)畫(huà)5S畫(huà)S413P、G231S國(guó)R410Q-S413P、廳5S國(guó)R410Q畫(huà)S413P和G231S-N305S-R410Q-S413P。分離得到的PCR產(chǎn)物，并將其作為反向引物與正向引物5'FLAG-Cel6A-GR組合，產(chǎn)生最終的構(gòu)建體。引物序列如下5'G231SCBH25'GGTGACCAACCTCTCTACTCCAAAGTGTG(SEQIDNO:35)5'畫(huà)5SCBH25'CAATGTCGCCAGCTACAACGGG(SEQIDNO:36)5，Cel6A-E82G5'GTACCTCCAGTCGGATCGGGAACCGCT(SEQIDNO:38)5，F(xiàn)LAG-Cel6A-GR5'AGAGACTACAAGGATGACGATGACAAGGAATTCCTCGAGGCTAGCTGCTCAAGCG(SEQIDNO:39)3，F(xiàn)LAG-Cel6A-GR5，GACGGATCAGCGGCCGCTTACCGCGGGTCGACGGGCCCGGTACCTTACAGGAACG(SEQIDNO:40)7.2產(chǎn)生PcCel6A和PcCel6A-S407P。將凍干的黃孢原毛平革菌重懸于300nL無(wú)菌水中，并將50jiL涂布在PDA平板上。將平板在24匸孵育4天。用玻璃紙環(huán)(cell叩hanecircle)將黃孢原毛平革菌的孢子接種在PDA平板上，并在241C培養(yǎng)4-6天后收集生物量。然后使用50mg生物量，用AbsolutelyRNA⑧小量制備試劑盒(Stratagene)根據(jù)制造商的方法分離總RNA。使用SuperscriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)根據(jù)制造商的方法從總RNA產(chǎn)生總cDNA。使用以下的引物從cDNA中擴(kuò)增編碼PcCel6A的基因5，PcCel6A-cDNA5'CTATTGCTAGCTCGGAGTGGGGACAGTGCGGTGGC(SEQIDNO:41)3，PcCel6A-cDNA5'CTATTGAATTCGGTACCCTACAGCGGCGGGTTGGCAGCAGAAAC(SEQIDNO:42)通過(guò)TA-克隆，根據(jù)制造商的建議將PCR擴(kuò)增子克隆進(jìn)pGEM⑧-TEasy載體中。然后使用引物5'FLAG-PcCel6A-GR和3，F(xiàn)LAG-PcCel6A-GR從該來(lái)源擴(kuò)增編碼PcCel6A的基因，所述引物分別在7V/iel位點(diǎn)的上游和SWII位點(diǎn)的下游引入與YEpFLAG-1載體同源的序列。l吏用i秀變引物5TcCel6A-S407P與引物3'FLAG-PcCel6A-GR的31組合來(lái)產(chǎn)生大引物PCR。分離得到的PCR產(chǎn)物，并作為反向引物與正向引物5，F(xiàn)LAG-PcCel6A-GR組合，產(chǎn)生最終的構(gòu)建體。引物序列如下5，F(xiàn)LAG-PcCel6A-GR3，F(xiàn)LAG-PcCel6A-GR5'PcCel6A-S407P5'AAGGATGACGATGACAAGGAATTCCTCGAGGCTAGCTCGGAGTGGGGACAGTGC(SEQIDNO:43)5,TGGGACGCTCGACGGATCAGCGGCCGCTTACCGCGGCTACAGCGGCGGGTTGGC(SEQIDNO:44)5'CCCCGCTACGACCCTACTTGTTCTCTG(SEQIDNO:45)7.3產(chǎn)生HiCel6A和HiCel6A-Y420P。將凍干的特異腐質(zhì)酶重懸于300fiL無(wú)菌水中，并將50fiL涂布在EmersonYPSSpH7瓊脂平板(0.4%酵母提取物，0.1%K2HP04、0.05%MgS04'7H20、1.5%葡萄糖、1.5%瓊脂)上。將真菌在451C孵育6天，然后將孢子接種在Novo培養(yǎng)基(按照BarbesgaardUSP#4,435,307)中在100mL生長(zhǎng)期培養(yǎng)基(2.4%CSL，2.4%葡萄糖，0.5%大豆油，pH調(diào)節(jié)至5.5，0.5%CaC03)中于37乙下孵育48小時(shí)，然后將6mL預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移進(jìn)100mL生產(chǎn)期培養(yǎng)基(0.25%NH4N03、0.56%KH2P04、0.44%K2HP04、0.075%MgS04'7H20、2%Sigmacell，pH調(diào)節(jié)至7，0.25%CaCO3)，將培養(yǎng)物孵育多達(dá)4天之后收集生物量。然后使用50mg生物量，用AbsolutelyRNA⑧小量制備試劑盒(Stratagene)根據(jù)制造商的方法分離總RNA。使用SuperscriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)才艮據(jù)制造商的方法從總RNA產(chǎn)生總cDNA。使用以下的引物從cDNA中擴(kuò)增編碼HiCel6A的基因5'HiCel6A-cDNA5'CTATTGCTAGCTGTGCCCCGACTTGGGGCCAGTGC(SEQIDNO:46)3，HiCel6A-cDNA5'CTATTGAATTCGGTACCTCAGAACGGCGGATTGGCATTACGAAG(SEQIDNO:47)通過(guò)TA-克隆，根據(jù)制造商的建議將PCR擴(kuò)增子克隆進(jìn)pGEM-TEasy載體中。然后使用引物5，F(xiàn)LAG-HiCel6A-GR和3'FLAG-HiCel6A-GR從該來(lái)源擴(kuò)增編碼HiCel6A的基因，所述引物分別在7V/iel位點(diǎn)的上游和j/ml位點(diǎn)的下游引入與YEpFLAG-l載體同源的序列。使用誘變引物5，HiCel6A-Y420P與引物3'FLAG-HiCel6A-GR的組合來(lái)產(chǎn)生大引物PCR。分離得到的PCR產(chǎn)物，并作為反向引物與正向引物5，F(xiàn)LAG-HiCel6A-GR組合，產(chǎn)生最終的構(gòu)建體。引物序列如下5，F(xiàn)LAG-HiCel6A-GR5'AAGGATGACGATGACAAGGAATTCCTCGAGGCTAGCTGTGCCCCGACTTGGGGC(SEQIDNO:48)3'FLAG-HiCel6A-GR5'AGCGGCCGCTTACCGCGGGTCGACGGGCCCGGTACCTCAGAACGGCGGATTGGC(SEQIDNO:49)5，HiCe6A-Y420P5,GCCCGCTACGACCCTCACTGCGGTCTC(SEQIDNO:50)7.4將其它TrCel6A變體PcCel6A、PcCel6A-S407P、HiCel6A和HiCel6-Y420P克隆進(jìn)YEpFLAG-l，并轉(zhuǎn)化BJ3505。用TV/^I和j/ml消化YEpFLAGMT/;"10載體(實(shí)施例6)，并分離空載體片段。克隆該線性片段和實(shí)施例8.1和8.3中產(chǎn)生的最終PCR產(chǎn)物，并通過(guò)體內(nèi)重組同時(shí)轉(zhuǎn)化(Butler,T.和Alcalde,M.2003.MethodsinMolecularBiology,第231巻(F.H.Arnold和G.Georgiou編輯)，HumanaPressInc.Totowa(NewJersey),17-22頁(yè))。用7V/iel和&氾消化YEpFLAGA^/mlO載體(實(shí)施例6)并分離空載體片段?？寺≡摼€性片段和實(shí)施例8.2中產(chǎn)生的最終PCR產(chǎn)物，并通過(guò)體內(nèi)重組同時(shí)轉(zhuǎn)化。實(shí)施例8:在酵母中以中等規(guī)模表達(dá)天然和經(jīng)修飾的家族6纖維素酶將含有YEpFLAG-AAp"10-cbh2的一個(gè)分離的BJ3505酵母菌落用于接種20mL試管中的5mL液體SC-trp。在30匸和250rpm過(guò)夜孵育后，測(cè)量600nm處的吸光度，并用最終OD6。。達(dá)到0.045所需的酵母量接種250mL錐形瓶中的50mLYPEM液體培養(yǎng)基。在301!和250rpm孵育72小時(shí)后，通過(guò)3,000xg離心5分鐘的步驟收集上清液。以同樣方式培養(yǎng)表達(dá)TrCel6A變體、野生型HiCel6A和變體、野生型PcCel6A和變體以及空YEpFLAG-l載體的BJ3505菌林。SC-trp液體培養(yǎng)基含有與實(shí)施例7中提到的SC-trp板相同的組分，但是不含瓊脂。YPEM液體培養(yǎng)基含有組分每升酵母提取物(BD)10g蛋白胨(BD)5.0g葡萄糖(Fisher)10g甘油(Fisher)30mL實(shí)施例9:表征來(lái)自酵母培養(yǎng)物上清液的經(jīng)修飾家族6纖維素酶9.1比較經(jīng)修飾的TrCel6A與天然TrCel6A的嗜熱性。通過(guò)測(cè)量不同的溫度下從可溶性P-葡聚糖底物中釋放的還原糖來(lái)測(cè)定每種酶的嗜熱性。具體地，在300fiLPCR板中，將根據(jù)實(shí)施例9獲得的50^L粗制上清液與預(yù)熱的50nL55mM檸檬酸鈉pH5.0中1%(w/v)j5國(guó)葡聚糖(Barley,MediumViscosity;Megazyme)在96孑LPCR板中不同的10列中混合。將混合物在成梯度的10個(gè)不同溫度(56。C、58.1。C、59.8。C、62.6°C、66。C、70。C、73.4。C、76.2。C、78.1"C和80"C)下孵育30分鐘，然后如下測(cè)量所釋放的還原糖向每孔中添加100nLDNS試劑并將平板在95C下孵育20分鐘。DNS試劑含有組分g/L3,5-二硝基水楊酸(Acros)10氫氧化鈉(Fisher)10苯酚(Sigma)2偏亞石克酸鈉(Fisher)0.5一旦溫度降低至低于40n，將135nL每種反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至96孔微孔板的各個(gè)孔中，每孔含有65jiLRochelle鹽(40%酒石酸鈉鉀)，并使用裝配有560nm濾光片的FluostarGalaxy微量培養(yǎng)板讀數(shù)器測(cè)量OD56。。通過(guò)用相同的方式處理來(lái)自帶有空載體的菌林的上清液來(lái)測(cè)量空白值，并從各數(shù)值中減去。然后針對(duì)每個(gè)變體將活性表述為相對(duì)于四參數(shù)多項(xiàng)式擬合最高值的百分比，只有變體TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P例外，針對(duì)其使用四參數(shù)對(duì)數(shù)正態(tài)擬合(圖6)。所有經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與其各自的野生型相比均顯示提高的最適溫度，變體TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P例外，其顯示在寬泛的溫度范圍內(nèi)具有高于80。/。的最大活性(圖6)。在所有TrCel6A變體中，TrCel6A-S413P具有較高的最適溫度72.2°C,與野生型TrCel6A相比提高5.6X:(圖6a)。PcCel6A-S407P和HiCel6A-Y420P與其各自野生型相比時(shí)也顯示最適溫度的提高(圖6b和c)。9.2比較經(jīng)修飾TrCel6A與天然TrCel6A的嗜堿性。通過(guò)測(cè)量不同pH下從可溶性p-葡聚糖底物中釋放的還原糖來(lái)測(cè)定每種酶的嗜堿性。具體地，在300fiLPCR板中，將根據(jù)實(shí)施例9獲得的50nL粗制上清液與預(yù)熱的50jiL1%(w/v)55mM檸檬酸鈉中的卩-葡聚糖(Barley,MediumViscosity;Megazyme)、55mM褲酸鈉pH3.0、4.0、5.0、5.75、6.25、6.75、7.25或8.5^平板不同8列中混合(一旦與上清液混合并在60-65。C下加熱，pH分別為3.95、4.65、5.65、6.25、6.65、6.95、7.15和7.45)。將混合物在65〔(PcCel6A和變體為)下孵育30分鐘，然后根據(jù)實(shí)施例10.1測(cè)量所釋放的還原糖。通過(guò)用相同的方式處理來(lái)自帶有空載體的菌林的上清液來(lái)測(cè)量酵母宿主的背景活性，并從各變體的活性數(shù)值中減去該活性。然后針對(duì)每個(gè)變體將活性表述為相對(duì)于三參數(shù)機(jī)械擬合(mechanisticfit)最高值的百分比(圖7)。所有經(jīng)修飾的家族6纖維素酶與其野生型相比均時(shí)顯示提高的嗜堿性。對(duì)TrCel6A而言，用變體TrCel6A-G231S-R410Q-S413P觀察到顯著的遷移(+1.25pH單位)，然后是TrCel6A-G231S-N305S-R410Q-S413P(+1.01pH單位)。9.3比較經(jīng)修飾TrCel6A與天然TrCel6A的熱穩(wěn)定性。通過(guò)測(cè)量在60X:(對(duì)PcCel6A和變體為55"C)下將上清液預(yù)孵育不同時(shí)間后從可溶性p-葡聚糖底物釋放的還原糖來(lái)測(cè)定每種酶的熱穩(wěn)定性。具體地，在300nLPCR平板中，將根據(jù)實(shí)施例9獲得的50粗制上清液在60n(對(duì)PcCel6A和變體為55n)下孵育0、15、30、45、60、75、卯和120分鐘。然后添加50jiL55mM檸檬酸鈉pH5.0中的1%(w/v)p畫(huà)葡聚糖(Barley,MediumViscosity;Megazyme),并將混合物在651C(對(duì)PcCel6A和變體為60匸)下孵育30分鐘。然后根據(jù)實(shí)施例10.1測(cè)量釋放的還原糖。通過(guò)用相同的方式處理來(lái)自帶有空載體的菌株的上清液來(lái)測(cè)量酵母宿主的背景活性，并從各變體的活性數(shù)值中減去該活性。最后，針對(duì)每個(gè)變體將活性表述為相對(duì)于三參數(shù)單指數(shù)式衰減擬合(singleexponentialdecayfit)最高值的百分比(圖5)。所有TrCel6A變體與野生型TrCel6A相比均顯示提高的熱穩(wěn)定性(圖5a)。S413P突變導(dǎo)致TrCel6A的熱穩(wěn)定性顯著提高。在60匸下60分鐘后TrCel6A-S413P保留其活性的45%，而TrCel6A在60分鐘后僅保留其活性的4%。這代表了與美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2006/0205042中公開(kāi)的TrCel6A-S413Y變體相比更大的熱穩(wěn)定性提高，該TrCel6A-S413Y變體在類(lèi)似的條件下平均保留其活性的41%。TrCel6A-R410Q-S413P和TrCel6A國(guó)G231S-R410Q國(guó)S413P》見(jiàn)察到最高的提高，其在601C下60分鐘后分別保留其活性的58%和60%。與TrCel6A類(lèi)似，PcCel6A-S407P在55X:下60分鐘后保留其活性的38%，而PcCel6A在60分鐘后僅保留其活性的6%(圖5b)。這些結(jié)果證明，與TrCel6A中413位殘基等同位置上的脯氨酸提高熱穩(wěn)定性。9.4比較經(jīng)修飾TrCel6A與天然TrCel6A的T50。7^在本文中定義為粗制酵母上清液在無(wú)底物孵育15分鐘后保留其p-葡聚糖水解活性之50%的溫度。其通過(guò)測(cè)量在不同的溫度下預(yù)孵育15分鐘后從可溶性p-葡聚糖底物釋放的還原糖來(lái)測(cè)定。具體地，在300nLPCR板中，將根據(jù)實(shí)施例9獲得的50粗制上清液在45。C、49.2。C、53.9。C、57.7。C、59.5。C、60.4。C、62.5。C、64.2。C、66.4'C、68.9。C、72.7"C或75"C孵育15分鐘。然后添加50jtL55mM檸檬酸鈉pH5.0中的1%(w/v)(5-葡聚糖(Barley,MediumViscosity;Megazyme)，并將36混合物在65"C(對(duì)PcCel6A和變體為60匸)下孵育30分鐘。然后才艮據(jù)實(shí)施例10.1測(cè)量釋放的還原糖。通過(guò)用相同的方式處理來(lái)自帶有空載體的菌林的上清液來(lái)測(cè)量酵母宿主的背景活性，并從各變體的活性數(shù)值中減去該活性。最后，針對(duì)每個(gè)變體將活性表述為相對(duì)于四參數(shù)S曲線擬合最高值的百分比(圖4)。TrCel6A-S413P的75()被測(cè)定為64.1。C，相比之下，母體TrCel6A為59'C(圖4a)。這代表通過(guò)引入S413P突變將熱穩(wěn)定性提高超過(guò)5"C。這代表與美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2006/0205042的S413Y突變相比酶穩(wěn)定性的顯著提高，所述專(zhuān)利公開(kāi)顯示TrCel6A-S413Y的rm比TrCel6A只是稍微提高0.2-0.3X:。盡管美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2006/0205042中公開(kāi)的測(cè)定T^的方法與本文公開(kāi)的rs。測(cè)定法不同，但是兩種方法均試圖測(cè)定蛋白質(zhì)發(fā)生導(dǎo)致不可逆失活的顯著的和結(jié)構(gòu)上的改變的溫度。其它TrCel6A變體的rso比野生型TrCel6A至少高3.2X:。PcCel6A-S407P和Hicel6A-Y420P與其各自的母體酶相比也顯示150的提高(圖4b和c)。這也支持了家族6纖維素酶中TrCd6A413位殘基的等同位置上的脯氨酸提高熱穩(wěn)定性的主張。實(shí)施例10:制造包含經(jīng)修飾的家族6纖維素酶DNA序列的遺傳構(gòu)建體10.1分離里氏木霉基因組DNA并構(gòu)建里氏木霉基因組文庫(kù)使用下述包含已破壞的天然TrCel6A基因的來(lái)自RutC30的里氏木霉菌林(ATCC#56765;Montenecourt.B.和Eveleigh.D.1979.Adv.Chem.Ser.181:289-301)。RutC30來(lái)自里氏木霉Qm6A(ATCC#13631;Mandels.M.和Reese.E.T.1957.J.Bacteriol.73:269-278)。本領(lǐng)域技術(shù)人員十分了解，本文所述的方法、來(lái)自這些菌林的遺傳構(gòu)建體以及遺傳構(gòu)建體在這些菌林中的表達(dá)適用于所有來(lái)自Qm6A的木霉菌林。為了分離基因組DNA,用里氏木霉孢子接種50mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(Difco)，所述孢子通過(guò)無(wú)菌接種環(huán)從馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上收集。將培養(yǎng)物于28C下在200rpm搖動(dòng)2-3天。將菌絲體過(guò)濾到GFA玻璃微纖維濾紙(Whatman)上并用冷的去離子水洗滌。將真菌餅冷凍在液氮中，用預(yù)冷的研缽和研杵碾成粉末；將0.5g粉碎的生物量重懸于5mL100mMTris、50mMEDTA，pH7.5加上1。/o十二烷基硫酸鈉(SDS)中。將裂解液離心(5000g20分鐘，41C)以沉淀細(xì)胞碎片。用l倍體積緩沖液(IOmMTris，1mMEDTA，pH8.0)飽和的苯酚萃取上清液，然后用1倍體積緩沖液飽和的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)萃取，從而去除可溶的蛋白質(zhì)。通過(guò)添加0.1倍體積的3M乙酸鈉，pH5.2和2.5倍體積的冷95。/。乙醇來(lái)沉淀DNA。在-20t:下孵育至少1小時(shí)后，通過(guò)離心沉淀DNA(5000g20分鐘，4"C)，用10mL70%乙醇沖洗，晾干并重懸于lmL10mMTris、1mMEDTA，pH8.0中。通過(guò)添加核糖核酸酶A(RocheDiagnostics)至0.1mg/mL的終濃度并在37C下賻育1小時(shí)來(lái)消化RNA。使用1倍體積緩沖液飽和的苯酚和1倍體積緩沖液飽和的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)先后萃取，從DNA溶液中去除核糖核酸酶。用0.1倍體積的3M乙酸鈉，pH5.2和2.5倍體積的冷95o/。乙醇再次沉淀DNA，離心沉淀，用70%乙醇沖洗，晾干并重懸于50nL10mMTris、1mMEDTA，pH8.0中。通過(guò)測(cè)量溶液在260nm下的吸光度來(lái)測(cè)定DNA的濃度(Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborPress1989中第CI頁(yè)，其通過(guò)參考并入本文，并在下文+稱(chēng)作Sambrook等)。使用從里氏木霉菌林M2C38分離的基因組DNA構(gòu)建兩種質(zhì)粒文庫(kù)和一種噬菌體文庫(kù)。如下在載體pUC119(Viera和Messing,MethodsEnzymol.153:3,1987)中構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)在37X:下用2單位/jig5"附H1或五coRl限制性酶將100nL體積中的10fig基因組DNA消化20小時(shí)。將經(jīng)消化的DNA在0.75%瓊脂糖凝膠上以0.04MTris-乙酸鹽、1mMEDTA電泳分離并用溴化乙錠染色。切下對(duì)應(yīng)于目的基因大小(基于公開(kāi)的信息和Southern印跡)的凝膠片，并進(jìn)行電洗脫以回收DNA片段(Sambrook等，6.28-6.29頁(yè))。在含有20-50ng/mLDNA(以2:1的載體插入DNA比例)、1mMATP和5單位T4DNA連接酶的總體積10-15的連接反應(yīng)中，于4"C下16小時(shí)將這些富集的DNA級(jí)分連接進(jìn)pUC119中，從而產(chǎn)生基因文庫(kù)。使用CellPoratorSystem(Gibco/BRL)，根據(jù)制造商的方案用連接反應(yīng)物對(duì)大腸桿菌菌林HB101進(jìn)行電穿孔，并在含有70ng/mL氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。如下在載體入DASH(Stratagene，Inc.)中構(gòu)建噬菌體文庫(kù)用2、1、0.5和0.5單位/ng5"附HI將基因組DNA(3pg)在37"C消化1小時(shí)，產(chǎn)生大小9-23kB的片段。如下純化來(lái)自每次消化的DNA:用1倍體積的Tris飽和的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:l)萃取，然后用10fiL3M乙酸鈉，pH5.2和250pl95%乙醇(-20"€)沉淀。通過(guò)微量離心使經(jīng)消化的DNA沉淀，用0.5mL的冷70%乙醇沖洗，晾干并重懸于10jiL無(wú)菌的去離子水中。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證大小為9-23kB的DNA片段的富集(0.04MTris-乙酸鹽，1mMEDTA中0.8%瓊脂糖)。將經(jīng)消化的DNA(0.4ng)與用5"附HI(Stratagene)預(yù)消化的1ngXDASH臂在含有2單位T4DNA連接酶和1mMATP的總體積為5pl的反應(yīng)中于4"C下連接過(guò)夜。使用GigaPackIIGold包裝提取物(Stratagene)根據(jù)制造商的方案將連接混合物包裝進(jìn)噬菌體顆粒中。使用大腸桿菌宿主菌林XL1-BlueMRA(P2)滴定文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)其含有3xl()S個(gè)獨(dú)立克隆。10.2從pUC119文庫(kù)中克隆纖維二糖水解酶I(cbhl)和纖維二糖水解酶II(cbh2)基因通過(guò)菌落轉(zhuǎn)移雜交(colonylifthybridization)鑒定帶有來(lái)自重組pUC119-丑fl附HI-五"RI文庫(kù)的cMJ或克隆的大腸桿菌HB101轉(zhuǎn)化體將l-3xl(^個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至HyBondTM尼龍膜(Amersham)上；菌落面向上將膜置于用0.5MNaOH、1MNaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5分鐘，以裂解細(xì)菌細(xì)胞并變性DNA;然后將膜菌落面向上置于用1.5MTris，pH7.5加1MNaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5分鐘以進(jìn)行中和；將膜晾干30分鐘，然后通過(guò)在80C烘烤2小時(shí)而將DNA固定在膜上。在含有10-50ng耙標(biāo)DNA和0.2mM每種d(GCT)TP、0.5jiMdATP、20-40jiCia-32P-dATP、10皮摩爾寡核苷酸引物和0.5單位Taq聚合酶的總體積20nL的標(biāo)記反應(yīng)中，對(duì)來(lái)自5flwHl或五"Rl片段富集庫(kù)中的cM7和cM2編碼區(qū)的短片段(0.7-1.5kB)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而制備"P標(biāo)記的探針。對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行6-7個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(95X:，2分鐘；56X:,1.5分鐘；70"C，5分鐘)。通過(guò)添加0.5mL10%(w/v)三氟乙酸和0.5mg酵母tRNA來(lái)沉淀擴(kuò)增的32P標(biāo)記DNA。通過(guò)微量離心使DNA沉淀，用1mL70。/。乙醇洗滌兩次，晾干并重懸于1MTrispH7.5、1mMEDTA中。在熱封的袋子中，將固定有重組pUC119質(zhì)粒的尼龍膜于60-65。C下在1MNaCl、1%SDS、50mMTris、1mMEDTApH7.5中與100Hg/mL變性的斷裂鮭精DNA預(yù)雜交l小時(shí)。雜交在熱密封袋中在相同的緩沖液中于60-65X:下進(jìn)行16-20小時(shí)，所述相同的緩沖液僅含有50fig/mL變性的斷裂鮭精DNA和5x106-5x107cpm變性的cM7或cM2探針。將膜用1MNaCl、0.5%SDS在60C下洗滌一次(15分鐘)，用0.3MNaCl、0.5%SDS在60"C下洗滌兩次(每次15分鐘)，并用0.03MNaCl、0.5%SDS在55X:下洗滌一次(15分鐘)。將膜再次置于熱封的袋子中，并在-70n下使KodakRPX射線膠片曝光16-48小時(shí)。根據(jù)制造商的方案將X-射線膠片顯影。挑出顯示強(qiáng)或弱信號(hào)的菌落，并在補(bǔ)充有70ng/mL氨卡青霉素的2XYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用堿裂解方法(Sambrook等.，1.25-1.28頁(yè))從這些培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制性消化、Southern雜交(Sambrook等.，9.38-9.44頁(yè))和PCR分析(Sambrook等.，14.18-14,19頁(yè))來(lái)分牙斤。通過(guò)pUC119-丑"附Hl文庫(kù)與使用下述寡核苷酸引物制備的0.7kb探針之間的菌落轉(zhuǎn)移雜交來(lái)鑒定帶有cMJ基因的克隆，所述寡核苷酸引物被設(shè)計(jì)成擴(kuò)增已公開(kāi)的序列的bp597-1361(Shoemaker等，Bio/Technology1:691-696,1983;其通過(guò)參^"并入本文)。分離cMJ克隆pCOR132，該克隆含有對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子(4.7kb)和1kb的cMJ結(jié)構(gòu)基因(2.3kb)的5.7kb5"柳H1片段。從其中將含有cMJ啟動(dòng)子(2.1kb)和cM/編碼區(qū)5'末端(0.4kb)的2.5kb五coRl片段亞克隆進(jìn)pUC119中，得到pCB152。通過(guò)pUC119-￡"Rl文庫(kù)與^^用下述寡核普酸引物制備的1.5kbcM2探針之間的菌落轉(zhuǎn)移雜交來(lái)鑒定帶有cM2基因的克隆，所述寡核苷酸引物被設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增已公開(kāi)c6Zi2序列的bp580國(guó)2114(Chen等Bio/Technology5:274-278，1987)。分離含有4.8kbEcoRl片段的cM2克隆pZUK600，所述片段對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子(600bp)、結(jié)構(gòu)基因(2.3kb)和終止子(1.9kb)。10.3從XDASH文庫(kù)中克隆木聚糖酶II(x/fi2)基因使用DIG標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(RocheDiagnostics)并按照制造商的方案，通過(guò)隨機(jī)引物標(biāo)記而從PCR擴(kuò)增的x/"2基因編碼區(qū)中制備以地高辛-ll-dUTP標(biāo)記的探針。通過(guò)與3J)ASH文庫(kù)的噬斑轉(zhuǎn)移雜交來(lái)鑒定含有x/w2基因的基因組克隆。對(duì)每個(gè)目的基因而言，將lxl(^個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至Nytran(SchleicherandSchull)尼龍膜。將膜噬斑面向上置于用0.5MNaOH、1MNaCl飽和的印跡紙(VWR238)上5分鐘，以裂解噬菌體顆粒并變性噬菌體DNA。然后通過(guò)將膜噬斑面向上置于用1.5MTris，pH7.5加1MNaCl飽和的印跡紙上5分鐘來(lái)進(jìn)行中和，隨后將其晾干30分鐘。然后通過(guò)在80n烘烤2小時(shí)將DNA固定在膜上。在熱封袋中，將膜在6xSSPE、5xDenhardt，s、1%SDS中加上100ng/mL變性的斷裂鮭精DNA于65C下預(yù)雜交2小時(shí)。然后將膜在熱密封的袋中，在含有50jig/mL變性的斷裂鮭精DNA和0.5jig地高辛-dUTP標(biāo)記探針的相同溶液中，于65匸下雜交過(guò)夜。將膜在2xSSPE、0.1%SDS中于室溫下15分鐘洗滌兩次，在0.2xSSPE、0.1%SDS中于65X:下15分鐘洗滌兩次，并在2xSSPE中5分鐘洗滌一次。根據(jù)制造商的方案，通過(guò)與抗地高辛/堿性磷酸酶抗體綴合物、5-溴-4-氯-3-吲咮磷酸和4-硝基氯化四唑藍(lán)(RocheDiagnostics)反應(yīng)來(lái)鑒定陽(yáng)性雜交克隆。通過(guò)用以地高辛-dUTP標(biāo)記的探針進(jìn)行第二輪篩選來(lái)進(jìn)一步純化陽(yáng)性雜交克隆。如Sambrook等2.118-2.121頁(yè)中所述分離個(gè)體克隆并純化噬菌體DNA，只是將CsCl梯度步驟替換為用1倍體積的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)和1倍體積的氯仿:異戊醇(24:1)萃取。用0.1倍體積的3M乙酸鈉，pH5.2和2.5倍體積的冷95%乙醇沉淀DNA。用0.5mL冷70%乙醇洗滌已沉淀的噬菌體DNA，晾干并重懸于50nL10mMTris，1mMEDTApH8.0中。通過(guò)對(duì)純化的噬菌體DNA進(jìn)行限制性消化和Southern印跡雜交(Sambrook等.，9.38-9.44頁(yè))來(lái)鑒定含有目的基因的限制性片段，所述Southern印跡雜交使用與篩選XDASH文庫(kù)所用相同的以地高辛-dUTP標(biāo)記的探針。將膜雜交并通過(guò)與噬斑轉(zhuǎn)移中相同的方法使陽(yáng)性雜交片段顯影。一旦鑒定了來(lái)自各個(gè)XDASH克隆的期望的限制性片段，則重復(fù)限制性消化，將片段在TAE中的0.8%瓊脂糖凝膠中分離并切下想要的條帶。使用SephaglasBandPrep試劑盒(Pharmacia)根據(jù)制造商的方案將DNA從凝膠片上洗脫。通過(guò)將XDASH文庫(kù)與探針進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交(實(shí)施例7)來(lái)鑒定帶有jc/"2基因的克隆，所述探針包含已公開(kāi)jc/h2序列的bp100-783(Saarelainen等，Mol.Gen.Genet.241:497-503，1993)。通過(guò)對(duì)從XDASH克隆中純化的噬菌體DNA進(jìn)行限制性消化來(lái)分離含有x/w2基因的啟動(dòng)子(2.3kb)、編碼區(qū)(0.8kb)和終止子(2.6kb)的5.7kbjfiT/wI片段。將該片段亞克隆進(jìn)pUC119的f/ml位點(diǎn)中，得到質(zhì)粒pXYN2K-2。10.4構(gòu)建指導(dǎo)經(jīng)修飾家族6纖維素酶在里氏木霉中表達(dá)的載體。使用特異性引物和pUC反向引物(目錄號(hào)18432-013,Gibco/BRL)，用戶m聚合酶從基因組亞克隆pXYN2K-2(實(shí)施例7)中擴(kuò)增含有x/w2基因的啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的2.3kb片段(bp-2150到+99，其中+1表示ATG起始密碼子，+97-99代表TrXylll分泌信號(hào)肽之后的第一個(gè)密碼子)，所述x/"2特異性引物在密碼子33的Gln下游緊鄰處含有7V/^1，所述pUC反向引物與x/m2基因5'端的JT/ml位點(diǎn)下游退火。將該jc/"2PCR聲物作為平末端片段以下述方向插入pUC119多聚接頭(polylinker)的5Vwal位點(diǎn)中，其取向使得該多聚接頭的5fl附HI位點(diǎn)位于7V/^I位點(diǎn)的3，；這產(chǎn)生了質(zhì)粒pUC/XynPSS(Nhe)。通過(guò)用五coRl(其作為pUC119多聚接頭的一部分從pXYN2K-2中擴(kuò)增)和丑"附HI消化，從pUC/XynPSS(7V/ie)中再分離相同的jc/"2PCR產(chǎn)物，并插入也用五"RI和5awHI消化的質(zhì)粒pBR322L(pBR322的衍生物，在bp565和650處的原始SpAl和5W1位點(diǎn)之間含有5^A1-A^1-5W1連接子(adaptor))中，得多j質(zhì)粒pBR322LXN。為了便于高水平表達(dá)經(jīng)修飾的木嚴(yán)糖酶，用通過(guò)歷"孤I消化pCOR132而分離的含有啟動(dòng)子bp-1399到-204的1.2kbH,"^HI>段來(lái)代替pBR322LXN中含有jc/"2啟動(dòng)子bp-1400到畫(huà)121的1.3kbH/"flfinA段；這產(chǎn)生質(zhì)粒pBR322LC/XN。最后，用Klenow將pBR322LXC的五coRl位點(diǎn)補(bǔ)平，并添加5^el接頭(目錄號(hào)1086，NewEnglandBiolabs)，得到pBR322SpXC。通過(guò)7V/iel和iT/ml消化從YEpFLAGAKpwlO-cbh2載體(在上文實(shí)施例6中描述)中分離含有TrCel6A-S413P基因的片段，并插入用TV/^I和5"附HI消化的pCB219N-N中，產(chǎn)生pS413P/C2ter。為了產(chǎn)生pCB219N-N,使用與已公開(kāi)的cM2基因(Chen等，1987)3'非翻譯區(qū)bp2226-2242同源的引物以及pUC正向引物(目錄號(hào)1224，NewEnglandBiolabs)從pZUK600(上文實(shí)施例7中描述)中擴(kuò)增cM2終止子片段，所述同源引物含有在5'末端包含A^al-7V/^KBfl附HI-5"挑flKfiT/ml位點(diǎn)的短多聚接頭，所述pUC正向引物在pZUK600中3'末端五"R1位點(diǎn)上游退火。將該片段在改造的AT^iI和￡"R1位點(diǎn)處消化，并插入pUC119的相應(yīng)位點(diǎn)中，產(chǎn)生pCB219。將五coRl-A^1連接子(目錄號(hào)35310-010，Gibco/BRL)插入pCB219中的單一五coRl位點(diǎn)中，產(chǎn)生pCB219N。通過(guò)用iV/^I和7VWI消化，從pS413P/C2ter中分離包含TrCel6A基因和cM2終止子的片段，并插入用TV/^I和7Vort消化的pBR322SpXC中，產(chǎn)生表達(dá)盒pc/xS413P-EC。含有選擇盒的質(zhì)粒pNCBglNSNB(r)來(lái)自含有粗糙鏈孢霉/;j^/的質(zhì)粒pFB6(Radford，A.，Buston，F(xiàn).P"Newbury,S.F.和Glazebrook,J.A.(1985)RegulationofpyrimidinemetabolisminNeurospora.InMolecularGeneticsofFilamentousFungi(Timberlake，W.E.編輯),AlanR，Liss(NewYork),127-143頁(yè))。將來(lái)自pFB6的3.2kb5g/11片段克隆進(jìn)被修飾為在多聚接頭中(五"RI和Sfld之間)含有A^I、Smal、A7iel和5gfll位點(diǎn)的pUC119的忍fl附HI位點(diǎn)中，得到pNCBgl-NSNB(r)，所述Bg/II片段含*粗糙鏈孢霉的pj;M基因(GenBank登錄號(hào)M13448)及其啟動(dòng)子、終止子和一些5，UTR序列。從表達(dá)盒載體pc/xS413P-EC中分離Spel/JVort片段并插入用7V/iel(5^I和A7iel具有兼容的5'突出端序列)和7VWI消化的pNCBgl-NSNB(r)中，得到p7x-S413P-TV，所述Spel/Wort片段包含與啟動(dòng)子、x/"2分泌信號(hào)肽和cM2轉(zhuǎn)錄終止子有效連接的TrCel6A-S413P基因。在轉(zhuǎn)化里氏木霉之前，用7VWl將該最終構(gòu)建體線性化。實(shí)施例11:轉(zhuǎn)化里氏木霉。11.1分離/y;"營(yíng)養(yǎng)缺陷型為了使用粗糙鏈孢霉/y;"基因作為選擇標(biāo)記，如下分離自發(fā)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型將1x106個(gè)里氏木霉的孢子涂布在如前述的含5mM尿苷和0.15%(w/v)尿苷類(lèi)似物5-氟乳清酸(FOA)的基本培養(yǎng)基上，用于選擇里氏木霉的/^"營(yíng)養(yǎng)缺陷型(Berges.T.和Barreau.C.1991CurrGenet.19(5):359-65)。在含F(xiàn)OA的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力會(huì)允許選擇在編碼乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的；^2基因或編碼乳清普5'-磷酸脫羧酶的/^W基因中發(fā)生破壞的突變體。對(duì)自發(fā)的FOA抗性菌落在含和不含尿苷的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇。然后用pNCBglNSNB(r)(在實(shí)施例11.4中描述)轉(zhuǎn)化不能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的FOA抗性菌落的孢子，并針對(duì)在基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)進(jìn)行選擇。只有被pNCBglNSNB(r)中的粗糙鏈孢霉/;f4基因補(bǔ)回的菌林會(huì)在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且是真正的/7J"營(yíng)養(yǎng)缺陷型。使用這些方法獲得了里氏木霉的穩(wěn)定/^W營(yíng)養(yǎng)缺陷型。11.2轉(zhuǎn)化里氏木霉/y;W營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原生質(zhì)體。將5x106個(gè)里氏木霉的孢子涂布在補(bǔ)充有5mM尿苷的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上的無(wú)菌玻璃紙上，并在30"C孵育20小時(shí)以便于孢子萌發(fā)和菌絲體生長(zhǎng)。將帶有菌絲體的玻璃紙盤(pán)轉(zhuǎn)移至10mL原生質(zhì)體化溶液中，該溶液在含0.6M硫酸銨的50mM磷酸氫二鉀緩沖液pH6.5(緩沖液P)中含有7.5g/L崩潰酶(Driselase)和125單位的無(wú)蛋白酶卩-葡聚糖酶(InterSpexProductsInc.,目錄號(hào)分別為0465-1和0410-3)。通過(guò)在60rpm搖動(dòng)5小時(shí)消化菌絲體塾。通過(guò)以無(wú)菌No.30MIRACLOTHTM過(guò)濾將原生質(zhì)體與未消化的菌絲體分離，收集在無(wú)菌的50mL圓底離心管中并通過(guò)在室溫下1000-1500xg離心10分鐘回收。用5mL緩沖液P洗滌原生質(zhì)體，并在室溫下1000-1500xg再次離心IO分鐘。將原生質(zhì)體重懸于lmLSTC緩沖液(1.2M山梨醇、10mMCaCl2、10mMTris-HCL，pH7.5)中。為進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將0.1mL重懸的原生質(zhì)體與10jig載體DNA和25nLPEG溶液(25%PEG4000、50mMCaCl2、10mMTris-HCl,pH7.5)合并。在水水浴中孵育30分鐘后，添加1mLPEG溶液，并將混合物在室溫下孵育5分鐘。用2mLPEG溶液中1.2M山梨醇稀釋轉(zhuǎn)化混合物，將整個(gè)混合物添加進(jìn)冷卻至約47IC的25mL熔化的MMSS瓊脂培養(yǎng)基(見(jiàn)下文)，并將原生質(zhì)體懸液倒在MMSS瓊脂上。將平板在30C孵育直到菌落生長(zhǎng)可見(jiàn)。將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至含有MM瓊脂的個(gè)體平板并允許孢子形成。收集孢子并以高稀釋度涂布在MM瓊脂上，以分離同核體轉(zhuǎn)化體，然后將同核體轉(zhuǎn)化體涂布在PDA上，允許其生長(zhǎng)并充分形成孢子，以如下文實(shí)施例13中所述接種篩選培養(yǎng)物。基本培養(yǎng)基(MM)瓊脂含有以下組分試劑每LKH2P0410g(NH4)2S046g檸檬酸鈉'211203gFeS04.7H205mgMnS04.H20.6mgZnS047H201.4mgCaCl2.2H202mg瓊脂20g20。/。葡萄糖f,s.50mL1MMgS04'7H20f.s.4mLpH調(diào)節(jié)至5.5MMSS瓊脂含有與MM瓊脂相同的組分，再加上1.2M山梨醇、1g/LYNB(來(lái)自DIFCO目錄號(hào)291940的無(wú)氨基酸的酵母氮源)和0.12g/L氨基酸(來(lái)自BDBiosciences目錄號(hào)630416的-UraDO補(bǔ)充劑)。實(shí)施例12:在液體培養(yǎng)物中生產(chǎn)經(jīng)修飾的家族6纖維素酶將木霉的個(gè)體菌落轉(zhuǎn)移至PDA平板用于擴(kuò)增每種培養(yǎng)物。孢子形成對(duì)于均勻接種微量培養(yǎng)物是必需的，所述微量培養(yǎng)物用于測(cè)試培養(yǎng)物產(chǎn)生具有提高的熱穩(wěn)定性的經(jīng)修飾TrCelA變體的能力。培養(yǎng)基由以下組成組分g/L412.7KH2P048.00MgS04'7H204.00CaCl22H201.02玉米浸出液5,00CaC0320.00碳源**30-35微量元素*2mL/L*微量元素溶液含有5g/LFeS04.7H20;1.6g/LMnS04H20;1.4g/LZnS04.7H20。**葡萄糖、Solkafloc、乳糖、纖維二糖、槐糖、玉米糖漿或Avicel。碳源可作為水溶液在pH2到7下獨(dú)立滅菌，并在最開(kāi)始時(shí)添加到其余的培養(yǎng)基中，或在發(fā)酵過(guò)程中添加。將個(gè)體轉(zhuǎn)化體在上述培養(yǎng)基中于24孔微孔板中的1mL培養(yǎng)物中培養(yǎng)。初始pH為5.5，并在接種前將培養(yǎng)基于121X:下蒸汽高壓滅菌30分鐘。對(duì)天然的和經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，都從PDA平板中分離孢子，懸浮于水中，并將每mL104-105個(gè)孢子用于接種每份培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在30"C的溫度下于500rpm搖動(dòng)6天時(shí)間。通過(guò)在12,000rpm離心，從含有所分泌蛋白質(zhì)的濾液中分離生物量。使用Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定法(目錄號(hào)500-0001)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。如實(shí)施例14中所述測(cè)定TrCelA-S413P的表達(dá)。實(shí)施例13:表征包含經(jīng)修飾家族6纖維素酶的里氏木霉培養(yǎng)物濾液通過(guò)SDS-PAGE凝膠的Western印跡雜交來(lái)測(cè)定里氏木霉轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)濾液中的TrCel6A-S413P表達(dá)。具體地，將來(lái)自TrCel6A-S413P轉(zhuǎn)化體、母體菌株P(guān)107B和表達(dá)天然的未修飾TrCel6A的菌林(菌林BTR213)的10-20nL培養(yǎng)物濾液中等量的總分泌蛋白質(zhì)加入等體積的2xLaemmli緩沖液(0.4gSDS/2mL甘油/1mL1MTris-HCl,pH6.8/0.3085gDTT/2mL0.5%溴酚藍(lán)/0.25mL卩-巰基乙醇/10mL總體積)中。在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離10nL每種制備的樣品，使用24mMTris、192mM甘氨酸pH6.8、10mMSDS作為電泳緩沖液。在含20%曱醇的25mMTris/192mM甘氨酸緩沖液中，將分離的蛋白質(zhì)從丙烯酰胺凝膠上電轉(zhuǎn)移至用曱醇預(yù)濕潤(rùn)的PVDF膜上。隨后在30mLBLOTTO緩沖液(50mMTris-HCl，pH8.0中5%脫脂乳粉)中洗滌膜。用30mLTrCel6A特異性多克隆抗體的1:20,000稀釋液在BLOTTO中室溫過(guò)夜標(biāo)記該膜，在室溫下用等體積的BLOTTO再洗滌兩次，每次10分鐘，然后在室溫下用山羊抗兔/堿性磷酸酶綴合物的1:3000稀釋液在BLOTTO中標(biāo)記1小時(shí)。最后，將該膜在室溫下用過(guò)量的50mMTris-HCl,pH8.0洗滌兩次，每次15分鐘。如下使含有TrCel6A的雜交復(fù)合物顯影室溫下用10mL含有45fil4-硝基氯化四唑藍(lán)(RocheDiagnostics)和35fiL5畫(huà)溴國(guó)4畫(huà)氯畫(huà)3-P引咮磷酸(RocheDiagnostics)的100mMNaCl/100niMTris-HCl，pH9.5緩沖液處理膜，直到條帶清晰可見(jiàn)。在來(lái)自多數(shù)轉(zhuǎn)化體、陽(yáng)性對(duì)照菌林BTR213的培養(yǎng)物上清液中觀察到60kDa的陽(yáng)性雜交條帶，但是來(lái)自菌林P107B的培養(yǎng)物上清液中則沒(méi)有。轉(zhuǎn)化體P474B表達(dá)和分泌了與對(duì)照菌林BTR213所表達(dá)和分泌的未經(jīng)修飾TrCel6A量大致相同水平的TrCel6A-S413P。如下評(píng)價(jià)含有TrCel6A或TrCel6A-S413P的木霉纖維素酶的穩(wěn)定性將纖維素酶在50mM檸檬酸鹽緩沖液，pH4.8中于50。C下孵育多達(dá)96小時(shí)，然后通過(guò)濁度法測(cè)量纖維素酶的殘余活性(Enari.T.M.和Niku畫(huà)Paavola.ML.1988.Meth.Enzym.160:117-126)。盡管未處理的TrCel6A和TrCe16A-S413P纖維素酶的纖維素水解速率是相同的，但是在無(wú)底物條件下孵育多達(dá)96小時(shí)后，TrCel6A-S413P纖維素酶比TrCel6A纖維素酶維持高得多的活性(圖8)。因此，TrCel6A熱穩(wěn)定性的提高也提高了包含經(jīng)修飾家族6纖維素酶和其它組分的整體木霉纖維素酶系的熱穩(wěn)定性。已通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，可進(jìn)行大量變更和修改，而不偏離本文所述本發(fā)明的范圍。所有的參考文獻(xiàn)和引用內(nèi)容均通過(guò)參考并入本文。參考文獻(xiàn)Ai，Y.C.andWilson,D.B.2002.EnzymeMicrob.Technol.30:804-808.Atomi,H.2005.Curr.Opin.Chem.Biol.9:166-173.Berges,T.andBa訂eau，C.1991CurrGenet.19(5):359-65Bhat,M.K.2000.Biotechnol.Adv.18:355-383.Butler,T.andAlcalde,M.2003.InMethodsinMolecularBiology,vol.231:(F，H.ArnoldandG.Georgiou,editors),HumanaPressInc.Totowa(NewJersey),pages17-22.Chica，R.A,etal.2005.Curr.Opin.Biotechnol.16:378-384.Claeyssens,M.andHenrissat,B.1992，ProteinScience1:1293-1297).Claeyssens,M.,etal.1997.Eds.;TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge.Davies,G丄，etal.2000.Biochem.J.348:201-207.Eijsink,V.G.,etal.2004.JBiotechnol.113:105-20.EijsinkVG，etal.2005.Biomol.Eng.22:21-30.Foreman,P.K.，etal.2003.J.Biol.Chem.278:31988-31997.Gietz，R.D.andWoods,R.A.2002.Meth,Enzym.350:87-96.Gray,K.A.,etal.2006.Curr.Opin.Chem.Biol.10:141-146.Hoffinan，C.S.,andWinston,F.1987.Gene57:267-272.Hughes,S.R.，etal.2006.ProteomeSci.4:10-23.Lehtio,J.，etal.2003.ProcNatlAcadSciUSA.100:484-489.Li,W.F.，etal.2005Biotechnol.Adv.23:271-281.Lin，Y.andTanaka，S.2006.Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642.Mathrani,IandAhring，B.K.1992Appl.Microbiol.Biotechnol.38:23-27.Meink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