專利名稱：：使用遺傳工程化的微生物菌株的改進(jìn)的鞘氨醇類堿的生產(chǎn)的制作方法使用遺傳工程化的微生物菌株的改進(jìn)的鞘氨醇類堿的生產(chǎn)鞘脂(sphingolipid)是一組脂類，所述脂類的膜全部具有衍生自鞘氨醇類石咸(sphingoidbases)例如植物革肖氨醇(phytosphingosine)或鞘氨醇(sphingosine)這一共同特征。鞘脂經(jīng)常存在于動(dòng)物、植物和真菌、甚至一些細(xì)菌的細(xì)胞膜中。神經(jīng)酰胺是一組特殊的鞘脂，其含有與脂肪酸以酰胺鍵連接的鞘氨醇類堿。在人類皮膚中，神經(jīng)酰胺與膽固醇、膽固醇硫酸酯和游離脂肪酸一起形成一道阻滯水和保護(hù)皮膚避免物理和化學(xué)有害物(noxas)所必需的通透性屏障。作為所述通透性屏障的成份，這些神經(jīng)酰胺最常見于角質(zhì)層(皮膚上層)，并且它們含有鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氫鞘氨醇或6-羥基鞘氨醇作為鞘氨醇類堿。局部應(yīng)用含有鞘脂的組合物(例如神經(jīng)酰胺)提高皮膚的屏障功能和保濕性質(zhì)(Curratolo，1987.Pharm.Res.4:271-277;Kerscher"1991.Eur.J.Dermatol.1:39-43)。另外，鞘氨醇類堿同樣已知介導(dǎo)一些生理學(xué)作用例如抑制蛋白激酶C的活性，并因此由于其抗炎和抗微生物活性而被包含在美容或皮膚病用組合物中。由于鞘氨醇是人體中鞘脂的主要鞘氨醇類堿成份，因此其有相當(dāng)?shù)纳虡I(yè)吸引力用于生產(chǎn)用于食品的鞘氨醇和含有鞘氨醇的鞘脂、以及藥物學(xué)和美容應(yīng)用。當(dāng)前，已經(jīng)開發(fā)了一些化學(xué)合成鞘氨醇的途徑。然而，由于存在兩個(gè)立構(gòu)中心，化學(xué)合成會(huì)產(chǎn)生外消旋體混和物，其中只有25%是天然存在的D-蘇式-(2R,3S)-構(gòu)型。另外，由于在分子中存在三個(gè)官能團(tuán)，因此需要應(yīng)用廣泛的保護(hù)化學(xué)。因此，通過化學(xué)合成生產(chǎn)鞘氨醇是極端昂貴的，無法用于食品和化妝品中的摻入。對(duì)于從天然來源例如腦或雞蛋分離的純鞘氨醇也是這樣。從動(dòng)物來源提取的非均質(zhì)鞘脂制備物也是可用的。盡管比純化合物便宜，但是它們受限于組成上的非均質(zhì)性，因此由于其可能含有病原物而具有潛在危險(xiǎn)。已經(jīng)顯示微生物例如酵母P/cWa"ybT/(WickerhamandStodola，1960，J.6Bacteriol.80:484-491)產(chǎn)生高水平的鞘氨醇類堿及其衍生物，但主要是C18-植物鞘氨醇及其乙?；苌?。這些物質(zhì)可以提取出來并化學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的神經(jīng)酰胺，因此含有純的美容成份(參見例如WO93/20038)。但是，這些菌株僅產(chǎn)生非常少量的植物鞘氨醇或其衍生物之外的鞘氨醇類堿。同樣，在其他酵母中，所產(chǎn)生的式I所示的鞘氨醇類堿的量很低，并且僅存在于脂質(zhì)的葡糖神經(jīng)酰胺部分，即不以游離形式存在而是結(jié)合至長鏈N-酰基基團(tuán)和糖類。酵母中葡糖神經(jīng)酰胺的含量是0至1.2mg每克細(xì)胞干重(celldryweight,CDW)(Saito"a/.，2005)?？紤]到鞘氨醇類堿質(zhì)量占全部質(zhì)量的比例(40%;Kaufman1971)，即使這些葡糖神經(jīng)酰胺中的全部鞘氨醇類堿都是式I所示的鞘氨醇類堿，以每克CDW計(jì)，也僅有0.5mg。然而，在解脂耶氏酵母(^7w^印o/,^)的葡糖神經(jīng)酰胺中，只有25%的鞘氨醇類堿(RupcicWa/.，1998.ApplMicrobiol.Biotechnol.50:583-588)是式I所示的鞘氨醇類堿，以每克CDW計(jì)，相應(yīng)于在這種酵母物種中為0.13mg。在過表達(dá)來自白假絲酵母(Ca"A^a/^'cara)(Ternes"a/"2002.J.Biol.Chem.277:25512-25518)禾口粟酒裂殖酵母(5"c/7feo雄c/w,雷戸s戸*)(Garton"a/.,2003.FEBSLett.538192-538196)的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的重組釀酒酵母(&cc/zaramyc^cemv^ae)A矽r2細(xì)胞中，低于20%的二氫鞘氨醇轉(zhuǎn)變?yōu)榍实?。釀酒酵母?xì)胞每mg蛋白質(zhì)含有346pmol二氫鞘氨醇(Bae"a/.,2004)。假設(shè)60。/。每克細(xì)胞干重(CDW)是蛋白質(zhì)，這相當(dāng)于0.2mg二氫鞘氨醇CDW。因此在所述重組釀酒酵母Ay;r2細(xì)胞中含有低于0.04mg鞘氨醇每克細(xì)胞干重。盡管還沒有具體分析，但是即使這樣微量的鞘氨醇也很可能不以游離鞘氨醇類堿的形式存在，而是結(jié)合至長鏈N-?；鶊F(tuán)，即神經(jīng)酰胺，因?yàn)閺亩淝拾贝己铣汕拾贝嫉拿?，二氫神?jīng)酰胺去飽和酶，不能作用于游離鞘氨醇類堿，而是作用于其N-?；男问健亩淝拾贝忌锖铣捎坞x鞘氨醇需要三個(gè)酶的順序作用神經(jīng)酰胺合酶、二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶和神經(jīng)酰胺酶。神經(jīng)酰胺合酶用游離鞘氨醇類堿和脂肪酰-CoA硫酯作為底物形成鞘氨醇類堿N-?；ァＩ窠?jīng)酰胺合酶可以由一個(gè)(小鼠中；LahiriandFuterman,2005.J.Biol.Chem.280:33735-33738)或兩個(gè)亞基(酵母中；Schorling^2001.Mol.Biol.Cell12:3417-3427)組成。Schorling"a/"2001(Mol,Biol.Cdl12:3417-3427)描述了在釀酒酵母中過量產(chǎn)生神經(jīng)酰胺合酶以提高神經(jīng)酰胺合酶活性并由此提高細(xì)胞神經(jīng)酰胺含量。盡管兩個(gè)亞基都過量產(chǎn)生，但是沒有觀察到神經(jīng)酰胺合酶活性或細(xì)胞神經(jīng)酰胺含量的提高。同時(shí)，在釀酒酵母中異源過表達(dá)哺乳動(dòng)物神經(jīng)酰胺合酶沒有實(shí)現(xiàn)神經(jīng)酰胺量的提高，盡管觀察到了鞘脂組成的改變(Guillas"a/.，2003.J.Biol.Chem.278:37083-37091)。在釀酒酵母中異源過表達(dá)來自幾種生物的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶(Ternes"a/"2002.J.Biol,Chem.277:25512-25518;Garton"a/"2003.FEBSLett.538192-538196)引起痕量鞘氨醇的形成。但是多數(shù)前體分子(>80%)(鞘氨醇類堿二氫鞘氨醇)沒有轉(zhuǎn)變。過表達(dá)釀酒酵母的兩種神經(jīng)酰胺酶Ypcl和Ydcl(Mao"a/.,2000.J.Biol.Chem.275:6876-6884，禾QMaoda/.,2000.J.Biol.Chem.275:31369-31378)也沒有提高鞘氨醇產(chǎn)量。在人細(xì)胞系中提高特異性或優(yōu)先水解具有式I所示鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺的小鼠神經(jīng)酰胺酶的表達(dá)和/或酶活性水平使得鞘氨醇水平提高僅僅1.5倍(Mao"a/.,2003.J.Biol.Chem.278:31184-31191)。通過將表達(dá)這種小鼠神經(jīng)酰胺酶的酵母突變體的微體與各種外源添加的底物接觸進(jìn)一步研究這種神經(jīng)酰胺酶的底物特異性。因此，基于過量產(chǎn)生神經(jīng)酰胺酶而提高的鞘氨醇水平的相關(guān)數(shù)據(jù)都是得自人細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)。與釀酒酵母相比，大多數(shù)其他酵母物種例如乳酸克魯維酵母(A7z<yveraw_ycesAacto)、多形漢遜酵母(7/arae"w/apo/〕wo/p/za)、巴其萬德畢赤氏酵母CP/c/z/a戶加n'"、尸/c/^a/m77、解脂耶氏酵母、白假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母(Ca"^fe油7&)、漢遜德巴利酵母(De6aow^ycw/7朋化m7)和棉桃阿舒氏囊霉04Wtyflgaw;^")僅含有一種單一神經(jīng)酰胺酶。這種酶的特征和生理學(xué)作用仍然未知。本發(fā)明現(xiàn)在令人驚訝地示出可以通過修飾神經(jīng)酰胺合酶和/或神經(jīng)酰胺酶和/或鞘脂A8去飽和酶的表達(dá)和/或酶活性水平而產(chǎn)生具有提高的式I所示的鞘氨醇類堿的生產(chǎn)力的菌株。優(yōu)選地這些修飾伴有對(duì)二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的表達(dá)和/或酶活性水平的修飾。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了制備能夠產(chǎn)生植物鞘氨醇和二氫鞘氨醇之外的鞘氨醇類堿特別是鞘氨醇的遺傳工程化的微生物菌株。本發(fā)明還有助于制備能夠比本領(lǐng)域已知的其他微生物菌株更有效地產(chǎn)生含有鞘氨醇類堿特別是神經(jīng)酰胺類、腦苷脂類、神經(jīng)節(jié)苷脂類和肌醇磷8酰基神經(jīng)酰胺類(inositolphosphorylceramides)的復(fù)合鞘脂的遺傳工程化的微生物菌株。例如，被修飾為顯示出提高的神經(jīng)酰胺合酶和(任選地)提高的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的遺傳工程化的微生物菌株可用于產(chǎn)生這些復(fù)合鞘脂。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種微生物菌株，特別是一種酵母株，所述微生物菌株產(chǎn)生，以每克CDW計(jì)，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇類堿或其鹽或酯，其中R是X-(CH2)m-Y-(CH2)n-CH3，其中a)X是CH2或CHOH，并且b)m在0和4之間，最優(yōu)選地m是l，并且c)Y是CH2-CH2、chk:h或ci^cch3，并且d)n在4和14之間，優(yōu)選地n是8或10。優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物菌株產(chǎn)生，以每克CDW計(jì)，至少5mg的式I所示的鞘氨醇類堿，更優(yōu)選地產(chǎn)生，以每克CDW計(jì)，至少50mg的式I所示的鞘氨醇類堿，更優(yōu)選地產(chǎn)生，以每克CDW計(jì)，至少500mg的式I所示的鞘氨醇類堿。本發(fā)明的微生物菌株的鞘氨醇類堿生產(chǎn)力和組成優(yōu)選地當(dāng)所述生產(chǎn)鞘氨醇類堿的微生物菌株在如下條件下培養(yǎng)，并達(dá)到穩(wěn)定期培養(yǎng)物時(shí)測定。將來自瓊脂平板的微生物細(xì)胞接種于裝有100mlYEPD培養(yǎng)基的500ml帶有擋板的搖瓶中，在30。C以280rpm培育72小時(shí)。接下來，將該培養(yǎng)物的1%轉(zhuǎn)移至裝有100mlLCBNB生產(chǎn)培養(yǎng)基的另一個(gè)500ml帶有擋板的搖瓶中，并在30°C以280rpm培育24-96小時(shí)。或者在裝有100mlMM培養(yǎng)基的500ml帶有擋板的搖瓶中在30。C以120rpm培育24-96小時(shí)完成主培養(yǎng)。對(duì)于使用HPLC確定乙?；拾贝碱悏A(例如長鏈堿如植物鞘氨醇、鞘氨醇和二氫鞘氨醇)，將lml全培養(yǎng)液與4ml丙酮在falcon管中混和。將所述管以每分鐘250轉(zhuǎn)混和10分鐘以提取脂類。將溶液以5,300g離心10分鐘。向C18反相HPLC柱注射10^。在柱溫30。C分析樣品。移動(dòng)相由含有0.05%TFA的水/乙腈(10:90)組成。流速1ml/min，用UV在200nm檢測。在另一個(gè)實(shí)施方案中，式I所示的鞘氨醇類堿處于?；サ男问?。所述?；赏ㄟ^羥基，即"真正的"酯鍵，附著至鞘氨醇類堿。優(yōu)選地，通過酯鍵連接至鞘氨醇類堿的?；?-4個(gè)碳原子的短直鏈?；鼉?yōu)選地是乙?；；蛘撸鲺；赏ㄟ^氨基，即酰胺鍵，附著至所述鞘氨醇類堿。優(yōu)選地，通過酰胺鍵連接至所述鞘氨醇類堿的?；?-4個(gè)碳原子的短直鏈?；?，更優(yōu)選地是乙?；?。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，式I所示的鞘氨醇類堿具有式II所示的D-i式-(2R,3S)-構(gòu)型HOH7CNH2其中R如在式I中所限定。特別優(yōu)選的是式II所示的化合物，其中R是(CH2)12-CH3、CHOH-(CH2)-CH3、(CH2),4-CH3或CHOH-(CH2)13-CH3。所述微生物菌株優(yōu)選地是酵母，更優(yōu)選地來自畢赤氏酵母屬(乃W^)或阿舒氏囊霉屬04AtyG)的酵母，最優(yōu)選地是尸/c/2/a"/em7或棉桃阿舒氏囊霉物種。在第二方面，本發(fā)明提供了用于通過遺傳工程構(gòu)建第一方面的微生物菌株的方法。在親本生物中通過遺傳工程對(duì)鞘脂代謝途徑進(jìn)行工程化可以通過各種途徑進(jìn)行。例如通過修飾(即提高或降低)所述代謝途徑中一或多種酶的細(xì)胞水平進(jìn)行?？梢酝ㄟ^例如對(duì)編碼感興趣的酶的基因進(jìn)行靶定失活降低細(xì)胞水平。另外的或另一種方法，通過提高在宿主生物體內(nèi)天然存在的鞘脂生物合成酶的濃度進(jìn)行。最后，通過導(dǎo)入與在親代生物體中天然存在的酶的氨基酸序列和/或底物特異性不同的鞘脂生物合成酶進(jìn)行。更準(zhǔn)確地，本發(fā)明設(shè)想了神經(jīng)酰胺合酶活性的修飾，任選地與二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的修飾組合，任選地與神經(jīng)酰胺酶的修飾組合，任選地與鞘月旨A8去飽和酶的修飾組合，以此方式獲得了從胞內(nèi)二氫鞘氨醇向游離鞘氨醇，任選地向乙?；拾贝嫉霓D(zhuǎn)變提高。另外，本發(fā)明設(shè)想了神經(jīng)酰胺酶活性的修飾，任選地與二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的修飾組合，任選地與神經(jīng)酰胺合酶的修飾組合，任選地與鞘脂A8去飽和酶的修飾組合，以此方式獲得了從胞內(nèi)二氫鞘氨醇向游離鞘氨醇，任選地向乙?；拾贝嫉霓D(zhuǎn)變提高。同時(shí)，本發(fā)明設(shè)想了鞘脂A8去飽和酶活性的修飾，任選地與二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的修飾組合，任選地與神經(jīng)酰胺合酶的修飾組合，任選地與神經(jīng)酰胺酶的修飾組合，以此方式獲得了從胞內(nèi)二氫鞘氨醇向游離鞘氨醇，任選地向乙?；拾贝嫉霓D(zhuǎn)變提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳工程被用于產(chǎn)生與親本菌株相比顯示出提高的式I所示的鞘氨醇類堿生產(chǎn)力(g卩，以每克CDW計(jì)，至少0.5mg的生產(chǎn)力)的微生物菌株，所述提高的生產(chǎn)力是由于神經(jīng)酰胺合酶和/或神經(jīng)酰胺酶和任選地二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的表達(dá)和/或酶活性水平提高引起。具體地，這些菌株顯示編碼神經(jīng)酰胺合酶和/或神經(jīng)酰胺酶的多核苷酸的表達(dá)提高。所述微生物菌株可以進(jìn)一步修飾以顯示編碼二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的多核苷酸的表達(dá)提高。在這種遺傳工程中使用的神經(jīng)酰胺合酶應(yīng)當(dāng)能夠從其組成成份例如鞘氨醇類堿成份，特別是二氫鞘氨醇，和長鏈?；煞?，特別是脂肪酸或脂肪酰-輔酶A硫酯合成神經(jīng)酰胺。優(yōu)選地所述神經(jīng)酰胺合酶選自a.具有SEQIDNO:2禾B/或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的多肽，b.具有與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列有至少45。/。序列相同性和/或與SEQIDNO:4所示的氨基酸序列有至少45%序列相同性的氨基酸序列的多肽，c.具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的多肽，iid.具有與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列有至少45。/。序列相同性的氨基酸序列的多肽，e.具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的多肽，和f.具有與SEQIDNO:IO所示的氨基酸序列有至少45%序列相同性的氨基酸序列的多肽。優(yōu)選地，與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:9禾口/或SEQIDNO:IO所示的氨基酸序列的序列相同性是50%,更優(yōu)選地60%、70%、80%、90%。具有與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列有至少45%序列相同性或與SEQIDNO:4所示的氨基酸序列有至少45。/。序列相同性的神經(jīng)酰胺合酶的實(shí)例是具有SEQIDNO:12或SEQIDNO:14所示的氨基酸序列的神經(jīng)酰胺合酶。神經(jīng)酰胺合酶可以是具有相當(dāng)變化的氨基酸序列、顯示相同性程度低至15°/。的多肽。因此，適用于本發(fā)明的神經(jīng)酰胺合酶可以得自各種不同來源，例如病毒、真菌、植物或動(dòng)物，更優(yōu)選地得自藻類病毒、酵母或哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選地得自顆石藻類病毒屬(Cocco/"/zov/mO、糖酵母屬OSacc/zarawyces)、裂歹直酵母屬OSc/zZzosacc/wramyc&s)、德巴禾lj酵母屬(DeZ)w7w7^cas)、克魯維酵母屬(iawyveramycM)、畢赤氏酵母屬(Pz'c^'a)、耶羅威亞酵母屬(Kwrow/fl)、假絲酵母屬(Q^AVfo)、阿舒氏囊霉屬、小鼠、大鼠或人類。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)由感染微藻球石藻0Emz7/"^/mx/e少/)的顆石藻類病毒編碼的神經(jīng)酰胺合酶特別適于發(fā)酵生產(chǎn)式I所示的鞘氨醇類堿。在神經(jīng)酰胺酶的表達(dá)和/或酶活性水平提高的實(shí)施方案中，所涉及的神經(jīng)酰胺酶應(yīng)當(dāng)能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有式I所示的鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺。能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有式I所示的鞘氨醇類堿的優(yōu)選的神經(jīng)酰胺酶選自1.具有SEQIDNO:15所示的氨基酸序列的多肽，和2.具有與SEQIDNO:15所示的氨基酸序列有至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%序列相同性的氨基酸序列的多肽。這種神經(jīng)酰胺酶優(yōu)選地可得自動(dòng)物來源，更優(yōu)選地得自哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠或人類。用于這種遺傳工程的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶應(yīng)當(dāng)能夠?qū)⑶拾贝碱悏A，特別是(如神經(jīng)酰胺中、特別是二氫神經(jīng)酰胺中所存在的)二氫鞘氨醇的C-4和C-5之間的鍵去飽和。這種二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶也稱為鞘脂A4去飽和酶。能夠?qū)⑶拾贝碱悏A的C-4和C-5之間的鍵去飽和的優(yōu)選的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶選自a.具有SEQIDNO:17所示的氨基酸序列的多肽，和b.具有與SEQIDNO:17所示的氨基酸序列有至少30。/。、優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%序列相同性的氨基酸序列的多肽。具有與SEQIDNO:17所示的氮基酸序列有至少30y。序列相同性的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶的實(shí)例是具有SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:19所示的氨基酸序列的二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶。這種二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶可以得自病毒、真菌、植物或動(dòng)物，優(yōu)選地得自藻類病毒、酵母或哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地得自顆石藻類病毒、酵母菌、裂殖酵母、德巴利酵母、克魯維酵母、畢赤氏酵母、耶羅威亞酵母、假絲酵母、阿舒氏囊霉、小鼠、大鼠或人類。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳工程被用于產(chǎn)生與親本菌株相比顯示出提高的式I所示的鞘氨醇類堿生產(chǎn)力的微生物菌株，所述提高的生產(chǎn)力是由于鞘脂A8去飽和酶和/或神經(jīng)酰胺酶的表達(dá)和/或酶活性水平降低和/或胞內(nèi)定位改變引起，特別是由于編碼鞘脂A8去飽和酶和/或神經(jīng)酰胺酶的多核苷酸表達(dá)降低引起。用于這種遺傳工程的鞘脂A8去飽和酶應(yīng)當(dāng)能夠?qū)⑶拾贝碱悏A的C-8和C-9之間的鍵去飽和。優(yōu)選的鞘脂A8去飽和酶選自a.具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽，禾口b,具有與SEQIDNO:6所示的氨基酸序列有至少30%、優(yōu)選至少40°/。、更優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%序列相同性的氨基酸序列的多肽。具有與SEQIDNO:6所示的氨基酸序列有至少30%序列相同性的鞘脂△8去飽和酶的實(shí)例是具有SEQIDNO:21所示的氨基酸序列的鞘脂A8去飽和酶。這種鞘脂A8去飽和酶可以得自真菌，優(yōu)選地得自酵母，更優(yōu)選地得自釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母、P/c/^c^^'Z、解脂耶氏酵母、白假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母或棉桃阿舒氏囊霉，最優(yōu)選地得自尸/c/n'a">,"7、棉桃阿舒氏囊霉或解脂耶氏酵母。在神經(jīng)酰胺酶的表達(dá)和/或酶活性水平降低的實(shí)施方案中，所涉及的神經(jīng)酰胺酶應(yīng)當(dāng)能夠優(yōu)先或甚至特異性地將含有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇的神經(jīng)酰胺水解為鞘氨醇類堿。能夠優(yōu)先或甚至特異性地將含有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇的神經(jīng)酰胺水解為鞘氨醇類堿的優(yōu)選的神經(jīng)酰胺酶選自a.SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的多肽，和b.具有與SEQIDNO:8所示的氨基酸序列有至少25%、優(yōu)選至少30%、更優(yōu)選至少40%、50%、60%、70%、80%、90%序列相同性的氨基酸序列的多肽。這種神經(jīng)酰胺酶可以得自真菌，優(yōu)選地得自酵母，更優(yōu)選地得自釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤氏酵母、尸/c/7&":/^r//、解脂耶氏酵母、白假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母或棉桃阿舒氏囊霉，最優(yōu)選地得自尸fc/7/a"/em7、棉桃阿舒氏囊霉或解脂耶氏酵母。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，構(gòu)建微生物菌株，其中如上述相關(guān)酶的表達(dá)水平的提高與如上述其他相關(guān)酶的表達(dá)水平的降低相組合。在上述實(shí)施方案中，特定氨基酸序列與參考氨基酸序列的相同性百分比通過對(duì)所述參考序列進(jìn)行如下分析確定。在本發(fā)明中，遺傳工程化的菌株中鞘氨醇類堿生產(chǎn)力的提高包括與衍生所述遺傳工程化的菌株的親本菌株的生產(chǎn)力相比鞘氨醇類堿的生產(chǎn)力提高，和/或產(chǎn)生所述親本菌株基本不產(chǎn)生或完全不產(chǎn)生的鞘氨醇類堿。在本發(fā)明中，具有符合相同性百分比要求的氨基酸序列的多肽(稱為同源多肽)可以通過用所涉及的參考氨基酸序列篩選合適的序列數(shù)據(jù)庫而方便地鑒別。同源多肽也可以通過對(duì)參考多肽進(jìn)行誘變而衍生自此多肽。合適的應(yīng)用于編碼所涉及的多肽的基因的誘變技術(shù)包括隨機(jī)誘變(例如易錯(cuò)PCR(error-pronePCR))、定點(diǎn)誘變禾口/或基因重排(geneshuffling)。例如，可以使用誘變獲得比野生型多肽對(duì)其底物具有更高親和力、和/或具有更高特異性酶活性和/或具有改變的底物特異性(例如針對(duì)鞘氨醇類堿的烴鏈長度或針對(duì)鞘氨醇類堿本身)的神經(jīng)酰胺合酶多肽、水解含有式I所示的鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺酶多肽、或二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶多肽。同時(shí)，可以使用誘變獲得比野生型多肽對(duì)其底物具有更低的親和力和/或具有更低酶比活性的能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇作為鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺的神經(jīng)酰胺酶多肽，或鞘脂A8去飽和酶多肽。根據(jù)本發(fā)明對(duì)微生物菌株進(jìn)行遺傳工程化以獲得感興趣的酶表達(dá)提高可以通過過表達(dá)編碼所述酶的內(nèi)源基因(即在親本菌株中已經(jīng)天然編碼)(同源過表達(dá))或表達(dá)在親本菌株中非天然存在的基因(異源(過)表達(dá))實(shí)現(xiàn)。編碼感興趣的酶的基因的同源和異源(過)表達(dá)都可以通過將所述基因的一個(gè)拷貝或多個(gè)拷貝整合進(jìn)親本菌株的染色體中或通過提供處于能夠無需親本菌株的染色體復(fù)制即可進(jìn)行自主復(fù)制的DNA元件上的所述基因的一個(gè)拷貝或多個(gè)拷貝實(shí)現(xiàn)。所述自主復(fù)制DNA元件可以是質(zhì)粒、人工染色體或病毒。在本發(fā)明中，降低感興趣的酶的活性包括降低在親本菌株中天然存在的并且編碼所述感興趣的酶的基因的表達(dá)。降低這種基因的表達(dá)可以通過由遺傳學(xué)手段進(jìn)行的所述基因的靶定失活實(shí)現(xiàn)，所述遺傳學(xué)手段包括缺失編碼所述酶的基因的一部分核苷酸序列和/或缺失編碼所述酶的基因的全部核苷酸序列和/或破壞編碼所述酶的基因的核苷酸序列。另一種方法或另外地，可以破壞、缺失或改變負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)編碼酶的基因的表達(dá)的核苷酸序列、負(fù)責(zé)信使RNA的加工、運(yùn)輸至特定亞細(xì)胞腔和翻譯的核苷酸序列，以降低感興趣的酶的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從代表編碼感興趣的酶的基因的一部分或完整基因的核苷酸序列表達(dá)反義RNA，以誘導(dǎo)衍生自編碼這些酶的核苷酸序列的mRNA和反義RNA的雜交體的降解或阻斷衍生自編碼這些酶的核苷酸序列的mRNA的翻譯。在本發(fā)明中，親本菌株可以是不產(chǎn)生式I所示的鞘氨醇類堿的菌株。親本菌株也可以是雖然產(chǎn)生，但是，以每克CDW計(jì)，產(chǎn)生低于0.5mg的式I所示的鞘氨醇類堿的微生物菌株。親本菌株也可以是產(chǎn)生一定量的不同于式I所示的鞘氨醇類堿的鞘氨醇類堿的菌株，例如優(yōu)選地，P/c/7/a/^r//NRRLY-1031F-60-10和/或WO95/12683中公開的任何尸/c/2/acz/m^菌株，它們均主要產(chǎn)生C18-植物鞘氨15醇。特別適于用作本發(fā)明的親本菌株的菌株是在編碼二氫鞘氨醇C-4羥化酶(將二氫鞘氨醇轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锴拾贝嫉拿?的基因中存在缺陷的菌株，特別是衍生自產(chǎn)生大量鞘氨醇類堿植物鞘氨醇的菌株的二氫鞘氨醇C-4羥化酶缺陷菌株?？梢酝ㄟ^將感興趣的菌株暴露于毒素丁香霉素E(syringomycinE)并選擇丁香霉素E抗性菌株獲得二氫鞘氨醇C-4羥化酶缺陷菌株(Grilleyetal.(1998).J.Biol.Chem.273,11062-11068)。在這些菌株中包括二氫鞘氨醇羥化酶缺陷菌株(Asyd菌株)?；蛘?，可以通過使用遺傳學(xué)方法缺失或破壞而使SFi^基因耙定失活來獲得缺乏二氫鞘氨醇C-4羥化酶的菌株。例如，適合用作親本菌株的是P/c/z^c^/r"的突變株，可通過對(duì)戶/c/2/acz/em7進(jìn)行丁香霉素E選擇而獲得(參見未公開的WO2006/048458)。如本文所述編碼多肽的多核苷酸可適于其將被在其中表達(dá)的微生物菌株的密碼子使用。密碼子使用表可以很方便地在數(shù)據(jù)庫中找到，例如數(shù)據(jù)庫如http:〃www.kazusa.or.jp/codon/.。如本文所述的多核苷酸所插入的載體可以是任何可以方便地進(jìn)行重組DNA操作的載體，并且所述載體的選擇通常依賴于其所要被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，所述載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，所述載體的復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒或噬菌體載體，通常具有復(fù)制起點(diǎn)?；蛘?，所述載體可以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并與其所整合進(jìn)的染色體一起復(fù)制的載體。所述載體可以是環(huán)狀的，例如質(zhì)粒，或者是線狀的，例如表達(dá)盒(expressioncassette)。整合載體可以隨機(jī)或在預(yù)定靶位點(diǎn)整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體。對(duì)于靶定整合，所述整合載體包含與宿主基因組中預(yù)定靶基因座的DNA序列同源的DNA片段。為了促進(jìn)靶定整合，所述載體在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞前優(yōu)選地被線性化。優(yōu)選地進(jìn)行線性化，由此所述克隆載體的至少一個(gè)但是優(yōu)選地每一個(gè)末端的側(cè)翼是與靶基因座同源的序列。靶基因座側(cè)翼的同源序列的長度優(yōu)選地至少0.1kb，更優(yōu)選地至少0.2kb，更優(yōu)選地至少0.5kb，更優(yōu)選地至少lkb，最優(yōu)選地至少2kb。同源序列不需要與靶基因座嚴(yán)格相同。所需要的相同程度可依賴于同源序列的長度。典型地，所述相同百分比至少是大約80%。根據(jù)使用的多核苷酸在本發(fā)明的遺傳工程中所希望的用途，如果目的是希望表達(dá)一個(gè)基因的話，可以將所述多核苷酸插入表達(dá)盒中，或如果目的是希望失活一個(gè)基因的話，則插入失活盒中。在表達(dá)盒中，將編碼序列可操縱地連接至能夠使宿主細(xì)胞從所述編碼序列表達(dá)多肽的調(diào)控序列。術(shù)語"可操縱地連接"是指并置，其中所述成份處于使它們以其希望的方式發(fā)揮功能的相關(guān)聯(lián)的狀態(tài)。與編碼序列"可操縱地連接"的調(diào)控序列例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或另一個(gè)表達(dá)調(diào)控信號(hào)被置于使得在與所述調(diào)控序列相容的條件下得以實(shí)現(xiàn)從其編碼序列表達(dá)多肽的位置。失活盒被構(gòu)建為使其能夠靶向整合到需要失活的基因中。所述失活盒典型地包含需要失活的基因的非功能性對(duì)應(yīng)物(coimterpart)。所述非功能性對(duì)應(yīng)物可以是多核苷酸，其中缺失所涉及的基因的編碼序列的一部分或全部，從而耙向整合會(huì)引起天然編碼序列被缺陷編碼序列取代。用于基因失活的多核苷酸序列應(yīng)當(dāng)與包含需要失活的基因的靶序列至少80%相同。在第三方面，本發(fā)明提供了顯示神經(jīng)酰胺合酶活性、鞘脂A8去飽和酶活性或神經(jīng)酰胺酶活性的新的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了顯示神經(jīng)酰胺合酶活性的多肽，所述多肽選自由具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽和具有與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列有至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%序列相同性的氨基酸序列的多肽組成的一組，和/或選自由具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的多肽和具有與SEQIDNO:4所示的氨基酸序列有至少55%、優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、最優(yōu)選至少90%序列相同性的氨基酸序列的多肽組成的一組。所述多肽優(yōu)選地得自畢赤氏酵母，更優(yōu)選地得自cz/図7。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了顯示鞘脂A8去飽和酶活性的多肽，所述多肽選自由具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽和具有與SEQIDNO:6所示的氨基酸序列有至少65。/。、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、最優(yōu)選至少90%序列相同性的氨基酸序列的多肽組成的一組。所述多肽優(yōu)選地得自畢赤氏酵母，更優(yōu)選地得自尸/c/z/ac^/r//。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了顯示神經(jīng)酰胺酶活性的多肽，所述神經(jīng)酰胺酶優(yōu)先或甚至特異性地將具有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇的神經(jīng)酰胺水解為鞘氨醇類堿，所述多肽選自由具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的多肽和具有與SEQIDNO:8所示的氨基酸序列有至少60%、優(yōu)選至17少70%、更優(yōu)選至少80%、最優(yōu)選至少90%序列相同性的氨基酸序列的多肽組成的一組。所述多肽優(yōu)選地得自畢赤氏酵母，更優(yōu)選地得自/%/2/"術(shù)語"同源性"或"相同性百分比"在本文中可互換使用。為了本發(fā)明的目的，本文中對(duì)其進(jìn)行限定以確定兩個(gè)氨基酸序列的相同性百分比，所述序列為了最佳對(duì)比目的進(jìn)行排列(例如為了最佳排列可以在每一個(gè)序列中引入缺口)。之后對(duì)比在對(duì)應(yīng)氨基酸位置的氨基酸殘基。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械囊粋€(gè)位置在第二序列中的對(duì)應(yīng)位置被相同氨基酸殘基占據(jù)時(shí)，這兩個(gè)分子在該位置是相同的。兩個(gè)序列之間的相同性百分比是兩個(gè)序列之間相同位置數(shù)目的函數(shù)(即％相同性=相同位置數(shù)目/位置總數(shù)(即包括缺口的重疊位置)x100)。優(yōu)選地，所述兩個(gè)序列具有相同長度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解多個(gè)不同的計(jì)算機(jī)程序可用于確定兩個(gè)序列之間的同源性。例如對(duì)比序列并確定兩個(gè)序列之間的相同性百分比可使用數(shù)學(xué)算法進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)氨基酸序列之間的相同性百分比用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法確定，所述算法已經(jīng)并入AccelrysGCG軟件包中的GAP程序中(可在www.accelrys.com/products/gcg得至(i)，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，缺口加權(quán)為16、14、12、10、8、6、或4，長度加權(quán)為0.5、1、2、3、4、5、或6。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解全部這些不同的參數(shù)會(huì)得到有輕微差異的結(jié)果，但是當(dāng)使用不同算法時(shí)兩個(gè)序列的整體相同性百分比并未顯著改變。優(yōu)選地，矩陣是具有缺口加權(quán)10.0和長度加權(quán)0.5的Blossom62矩陣。本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可進(jìn)一步用作"查詢序列"對(duì)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，以例如鑒別其他同族成員或相關(guān)序列。這些檢索可使用Altschul,etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的blastp、psi-blast、phi-blast和tblastn程序(2.0版)進(jìn)行。當(dāng)使用blastp、psi-blast、phi-blast和tblastn程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如blastp、psi-blast、phi-blast和tblastn程序)的默認(rèn)參數(shù)。參見美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的主頁www.ncbi.nlm.nih.gov。具有顯示與參考氨基酸序列有相同性百分比的氨基酸序列的多肽稱為同源多肽。同源多肽可以是從其他生物體特別是酵母或動(dòng)物獲得的天然存在的變體，或者可以是工程化的變體。在第四方面，本發(fā)明提供了包含編碼第三方面的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸可以包含編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和減SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的核苷酸序列。例如，分別編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6禾QSEQIDNO:8所示的氨基酸序列的核苷酸序列分別是SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:7。針對(duì)宿主生物的密碼子使用優(yōu)化核苷酸序列是有利的。所述優(yōu)化的核苷酸序列的實(shí)例是編碼具有SEQIDNO:15所示的氨基酸序列的堿性神經(jīng)酰胺酶的SEQIDNO:32、編碼具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的神經(jīng)酰胺合酶的SEQIDNO:33、和編碼具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的神經(jīng)酰胺合酶的SEQIDNO:34。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了通過在使本發(fā)明的鞘氨醇類堿和(如果需要)待用的多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的第一方面的微生物細(xì)胞(可由本發(fā)明第二方面的方法獲得)和/或用本發(fā)明第四方面的(例如如上述克隆在表達(dá)盒和/或失活盒中的)多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞制備式I所示的鞘氨醇類堿，以及任選地收集所述鞘氨醇類堿的方法。本發(fā)明的細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)。對(duì)于啟動(dòng)子和宿主細(xì)胞的每一種組合，已有有助于表達(dá)本發(fā)明的多肽的培養(yǎng)條件。在達(dá)到所希望的細(xì)胞密度后，停止培養(yǎng)并使用已知的方法收集本發(fā)明的多肽或鞘氨醇類堿。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可包括含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜)、氮源(例如氨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、有機(jī)氮源例如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨)、以及其他無機(jī)營養(yǎng)源(例如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵等等)的已知培養(yǎng)基。.任選地，可以包括誘導(dǎo)物。合適的培養(yǎng)基的選擇可以基于表達(dá)宿主和/或基于表達(dá)構(gòu)建體的調(diào)控要求和/或基于與本發(fā)明的鞘氨醇類堿的最優(yōu)生產(chǎn)相關(guān)的要求進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些培養(yǎng)基。所述發(fā)酵可以以0.5-30天的周期進(jìn)行。其可以是合適地在0至45°C的溫度范圍之間和例如在pH2和10之間進(jìn)行的分批、連續(xù)或補(bǔ)料過程。優(yōu)選的發(fā)酵條件是20至37°C的溫度范圍之間和/或pH3和9之間。合適的條件通常基于表達(dá)宿主和需要表達(dá)的蛋白質(zhì)的選擇進(jìn)行選擇。在發(fā)酵之后，如果需要，可以將細(xì)胞從發(fā)酵液中通過離心或過濾手段分離。之后可以從細(xì)胞和/或發(fā)酵液中收集本發(fā)明的鞘氨醇類堿，并且如果需要，可以通過常規(guī)手段純化和分離。本發(fā)明有利地示出了式I所示的鞘氨醇類堿或其鹽或酯的完全發(fā)酵生產(chǎn)可以通過在發(fā)酵過程中提高活性神經(jīng)酰胺合酶的胞內(nèi)濃度而被顯著提高。具體地，示出了鞘氨醇或其鹽或酯的發(fā)酵生產(chǎn)通過提高活性神經(jīng)酰胺合酶多肽的胞內(nèi)濃度或通過在發(fā)酵過程中產(chǎn)生對(duì)于宿主來說新的(對(duì)于氨基酸序列來說)具有神經(jīng)酰胺合酶活性的酶而被顯著提高。方便地，本發(fā)明的鞘氨醇類堿可與合適的賦形劑組合以產(chǎn)生鞘氨醇類堿組合物。本發(fā)明的鞘氨醇類堿可用作起始材料以制備其他鞘氨醇類堿或鞘脂，例如神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂或腦苷脂。圖1示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中靶定失活SFi2的質(zhì)粒pUG6-AgSUR2::kanMX的圖示。示出了棉桃阿舒氏囊霉7EF啟動(dòng)子(水平陰影)、棉桃阿舒氏囊霉7EF終止子(對(duì)角線陰影)、/oxP位點(diǎn)(黑體)、卡那霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重組的棉桃阿舒氏囊霉sr/2的上游區(qū)域(US)和下游區(qū)域(DS)(網(wǎng)格線)、和氨芐青霉素抗性基因(Wa;淺灰色)。也示出了克隆步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖2示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中由04尸啟動(dòng)子靶定取代前面的天然啟動(dòng)子的質(zhì)粒pAG32-hyg-PAgGAP-AgDESl的圖示。示出了棉桃阿舒氏囊霉r五F啟動(dòng)子(水平陰影)、棉桃阿舒氏囊霉r五F終止子(對(duì)角線陰影)、潮霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重組的棉桃阿舒氏囊霉Z^W的上游區(qū)域(US)(網(wǎng)格線)和棉桃阿舒氏囊霉D^S7的5'區(qū)域(黑色)、和氨芐青霉素抗性基因(Wfl;淺灰色)。也示出了克隆步驟和轉(zhuǎn)化相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖3示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中由GL4尸啟動(dòng)子靶定取代DEW前面的天然啟動(dòng)子和在棉桃阿舒氏囊霉啟動(dòng)子的控制下過表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉丄」G7的質(zhì)粒pAG-LAGl-l的圖示。示出了棉桃阿舒氏囊霉7EF啟動(dòng)子(水平陰影)、棉桃阿舒氏囊霉7EF終止子(對(duì)角線陰影)、潮霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重組的棉桃阿舒氏囊霉/)￡67的上游區(qū)域(US)(網(wǎng)格線)和棉桃阿舒氏囊霉D五W的5，區(qū)域(黑色)、棉桃阿舒氏囊霉Z^G/(黑色)和氨芐青霉素抗性基因(W";淺灰色)。也示出了克隆步驟和轉(zhuǎn)化相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖4示出了用于在棉桃阿舒氏囊霉中由啟動(dòng)子靶定取代Z)五57前面的天然啟動(dòng)子和在棉桃阿舒氏囊霉五AW啟動(dòng)子的控制下過表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉^LF7的質(zhì)粒pAG-LAFl-1的圖示。示出了棉桃阿舒氏囊霉r五F啟動(dòng)子(水平陰影)、棉桃阿舒氏囊霉7^尸終止子(對(duì)角線陰影)、潮霉素抗性基因(深灰色)、用于同源重組的棉桃阿舒氏囊霉D五W的上游區(qū)域(US)(網(wǎng)格線)和棉桃阿舒氏囊霉DEW的5'區(qū)域(黑色)、棉桃阿舒氏囊霉i^F/(黑色)和氨芐青霉素抗性基因(W";淺灰色)。也示出了克隆步驟和轉(zhuǎn)化相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖5示出了用于靶定取代棉桃阿舒氏囊霉SW2和在棉桃阿舒氏囊霉啟動(dòng)子的控制下分別過表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉"」KS7和^4F7的質(zhì)粒pSSTH-LAFl-2的圖示。示出了棉桃阿舒氏囊霉T^尸啟動(dòng)子(水平陰影)、棉桃阿舒氏囊霉r五F終止子(對(duì)角線陰影)、kanMX抗性基因(深灰色)、棉桃阿舒氏囊霉的啟動(dòng)子區(qū)域(AgSUR2-P)和終止子區(qū)域(AgSUR2-T)(網(wǎng)格線)、棉桃阿舒氏囊霉DM7(黑色)、棉桃阿舒氏囊霉"F7(黑色)和氨芐青霉素抗性基因(6to;淺灰色)。也示出了克隆步驟和轉(zhuǎn)化相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖6示出了用于靶定破壞棉桃阿舒氏囊霉SZ^S的質(zhì)粒pAG32-D8D的圖示。示出了棉桃阿舒氏囊霉r五F啟動(dòng)子(水平陰影)、棉桃阿舒氏囊霉7EF終止子(對(duì)角線陰影)、潮霉素抗性基因(深灰色)和氨芐青霉素抗性基因(Wa;淺灰色)。也示出了克隆步驟和轉(zhuǎn)化相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖7示出了分離完整P/c/n'ac^rn7^L4G/基因座的三步方法。擴(kuò)增尸c^4G/的內(nèi)部一部分(I.)，之后進(jìn)行兩輪反向PCR(II.和III.)。標(biāo)出了在各個(gè)步驟中使用的寡核苷酸，并且在不同陰影中表示的序列示出了.戶ci^G7基因座的幾個(gè)部分，所述部分的DNA序列在各個(gè)步驟中確定。也示出了實(shí)驗(yàn)步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖8示出了分離完整AcWaci/br"^4F7基因座的三步方法。擴(kuò)增尸c丄^F7的內(nèi)部一部分(I.)，之后進(jìn)行兩輪反向PCR(II.和m.)。標(biāo)出了在各個(gè)步驟中使用的寡核苷酸，并且在不同陰影中表示的序列示出了尸c丄^F7基因座的幾個(gè)部分，所述部分的DNA序列在各個(gè)步驟中確定。也21示出了實(shí)驗(yàn)步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖9示出了分離完整戶/c/^c^rn7ZYC7基因座的六步方法。擴(kuò)增PclXC7的內(nèi)部一部分(I.)，之后進(jìn)行五輪反向PCR(II,V.)。標(biāo)出了在各個(gè)步驟中使用的寡核苷酸，并且在不同陰影中表示的序列示出了戶cZZC7基因座的幾個(gè)部分，所述部分的DNA序列在各個(gè)步驟中確定。也示出了實(shí)驗(yàn)步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖10示出了分離完整P/c/z/a"/em7SD五51基因座的四步方法。擴(kuò)增的內(nèi)部一部分(I.)，之后進(jìn)行三輪反向PCR(II.-IV.)。標(biāo)出了在各個(gè)步驟中使用的寡核苷酸，并且在不同陰影中表示的序列示出了尸MDES基因座的幾個(gè)部分，所述部分的DNA序列在各個(gè)步驟中確定。也示出了實(shí)驗(yàn)步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖11示出了用于在尸/c//a"/emY中過表達(dá)戶cZ^5V、Jg丄Ji^和JgZJG/的質(zhì)粒pPC-DESl-AgLAFl畫AgLAGl的圖示。示出了P/c/z/acz/em7rD/f/(對(duì)角線陰影)和尸A47啟動(dòng)子(水平陰影或白色)、棉桃阿舒氏囊霉和基因(都是深灰色)、尸/c/n'a"/e/t//Z)五W(對(duì)角線陰影)和丄47基因(深灰色)、用于同源重組的5S-26SrDNA基因間區(qū)域(網(wǎng)格線)和氨芐青霉素抗性基因(Z)/a;淺灰色)。也示出了克隆步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖12示出了用于在尸z'c/z/a"/e/T//中過表達(dá)尸cD五W、尸c丄JF/和owC五7的質(zhì)粒p-mCER-natl-PcLAFl的圖示。示出了P/c/z/a"/em77Z>//7啟動(dòng)子(白色)和PA4/啟動(dòng)子(水平陰影)、戶/c/z/a":/^T/"^7(對(duì)角線陰影)、密碼子優(yōu)化的omC五i(豎直陰影)和密碼子優(yōu)化的w〃基因(深灰色)、用于同源重組的5S-26SrDNA基因間區(qū)域(網(wǎng)格線)和氨芐青霉素抗性基因(^;淺灰色)。也示出了克隆步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖13示出了用于在尸/c/h'""y^rz7中過表達(dá)戶c^4G/和owC五i的質(zhì)粒p-mCER-natl-PcLAGl的圖示。示出了P/c/n'acz/em7啟動(dòng)子(白色)和戶Zi"啟動(dòng)子(水平陰影)、乃'c/z/aci/bT"五A。/終止子(深灰色)、TEF終止子(對(duì)角線陰影)、巧c/^cz/m^Z^(^(對(duì)角線陰影)、密碼子優(yōu)化的owC5i(豎直陰影)和密碼子優(yōu)化的朋"基因(深灰色)、用于同源重組的5S-26SrDNA基因間區(qū)域(網(wǎng)格線)和氮芐青霉素抗性基因(W化淺灰色)。也示出了克隆步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖14示出了用于在中過表達(dá)oCvZ^4G7和owC五i的質(zhì)粒p-mCER-natl-oCvLAGl的圖示。示出了尸/c/w'aci/br/z'7DH7啟動(dòng)子(白色)和戶A心啟動(dòng)子(水平陰影)、尸/c/w'ac^/t//￡VO/終止子(深灰色)、TEF終止子(對(duì)角線陰影)、密碼子優(yōu)化的oCv^4G7(對(duì)角線陰影)、密碼子優(yōu)化的,C￡i(豎直陰影)和密碼子優(yōu)化的""〃基因(深灰色)、用于同源重組的5S-26SrDNA基因間區(qū)域(網(wǎng)格線)和氨芐青霉素抗性基因(Z^;淺灰色)。也示出了克隆步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖15示出了用于在尸fc/n'a"/e/r//中過表達(dá)om丄J51515和omCE7的質(zhì)粒p-mCER-natl-omLASS5的圖示。示出了P/c/甴cz/。t//77)77/啟動(dòng)子(白色)和PDJ7啟動(dòng)子(水平陰影)、戶/c/2/a"/ern7￡iV07終止子(深灰色)、TEF終止子(對(duì)角線陰影)、密碼子優(yōu)化的om丄^S!S5(對(duì)角線陰影)、密碼子優(yōu)化的omC￡i(豎直陰影)和密碼子優(yōu)化的加W基因(深灰色)、用于同源重組的5S-26SrDNA基因間區(qū)域(網(wǎng)格線)和氨芐青霉素抗性基因(Wa;淺灰色)。也示出了克隆步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖16示出了用于耙定整合進(jìn)尸/c/z^c7/e/r/z'5S-26SrDNA基因間區(qū)域并過表達(dá)戶/c/n'a"y^r"D￡57、過表達(dá)密碼子優(yōu)化的omC￡i和過表達(dá)密碼子優(yōu)化的00^40的質(zhì)粒pTH-LP-l的圖示，所述基因中的每一個(gè)都處于Ac/w'acz/em77D/W啟動(dòng)子的控制之下。示出了尸/c/z/acz/en^ri)i//啟動(dòng)子(白色)、戶/c/z/acz/emY0V(9/終止子(黑色)、戶/c/z/a"/em'/Z)^S7(豎直陰影)、密碼子優(yōu)化的omC五i(豎直陰影)、密碼子優(yōu)化的oCv^L4G7(豎直陰影)、戶/c/n'a"/em7放線菌酮抗性基因(黑色)、5S-26SrDNA基因間區(qū)域整合位點(diǎn)(ZS;點(diǎn)線)和氨芐青霉素抗性基因(W";淺灰色)。也示出了克隆步驟和轉(zhuǎn)化相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖17示出了用于革巴定破壞尸fc/^ci/bW/編碼鞘脂A8-去飽和酶的基因SZ)五S并過表達(dá)尸/c/z/aci/^r"D五57、過表達(dá)密碼子優(yōu)化的omC五i和過表達(dá)密碼子優(yōu)化的oCv￡JG/的質(zhì)粒pTH-deltaD8D的圖示，所述基因中的每一個(gè)都處于巧c/u'ac^rn777〕//7啟動(dòng)子的控制之下。示出了Pi'c/n'acz/ern'!'7Pif7啟動(dòng)子(白色)、尸/c/z/flci/^r"￡7^(97終止子(黑色)、戶/c/2/ac^t"(豎直陰影)、密碼子優(yōu)化的owC五i(豎直陰影)、密碼子優(yōu)化的00^4G7(豎直陰影)、Pz'c/^"/m7戶cZ^放線菌酮抗性基因(黑色)、染色體整合位點(diǎn)SD五S(點(diǎn)線)和氨芐青霉素抗性基因(W";淺灰色)。也示出了克隆步驟和轉(zhuǎn)化相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖18示出了用于靶定失活巧c/H'ac^m7堿性神經(jīng)酰胺酶基因(尸cFZC7)并在戶/c/H'a"/ern7中同時(shí)過表達(dá)oCVZ^4G7、尸cZ^57、和owC五i的質(zhì)粒pSo-5的圖示。示出了P/c/H'acz/em'/77)///啟動(dòng)子(尸rom，白色)、乃'c/z^"/ew7終止子(7W^，黑色)、乃'c/z/ac^m'/Z^S7(對(duì)角線陰影)、密碼子優(yōu)化的簡CM(豎直陰影)和密碼子優(yōu)化的oCVi^C^基因(水平陰影)、用于靶定整合的"/em7KYC7堿性神經(jīng)酰胺酶內(nèi)部片段(網(wǎng)格線)，和氨芐青霉素抗性基因(Wfl;淺灰色)。也示出了克隆步驟相關(guān)的限制位點(diǎn)。圖19示出了棉桃阿舒氏囊霉菌株中鞘氨醇類堿組成的RP-HPLC分析結(jié)果。所分析的菌株是野生型ATCC19895(WT)及其衍生物，具有如下基因型A^,'2(As,2)、Asj^2尸ro/o-D五^(Ay,2OPDeslp)、尸tw^-Z)五W尸層-(一2OPDeslpOPLaflp)和一dP磨-D孤尸腦-"P7SDES::pAG32-D8D(A一ASZ)^S1OPDeslpOPLaflp)。實(shí)施例實(shí)施例1分別同時(shí)過量產(chǎn)生棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Deslp或Laglp和Desl。的棉桃阿舒氏囊霉外^突變株的構(gòu)建質(zhì)粒pUG6-AgSUR2::kanMX被設(shè)計(jì)為用&"皿抗性基因取代棉桃阿舒氏囊霉^STi^基因，從而使其失活；質(zhì)粒pAG-LAGl-l或pAG-LAFl-l是為了分別同時(shí)過表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉和或WF/。棉桃阿舒氏囊霉SFi2序列通過使用被功能性鑒定的釀酒酵母二氫鞘氨醇C4-羥化酶(稱為5T7i2/ST/^)(GrilleyWa/"1998;NCBI編號(hào)NC—001136.7)作為模板針對(duì)AshbyaGenomeDatabase(http:〃ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)進(jìn)今亍BLASTP檢索得到，檢索結(jié)果是與棉桃阿舒氏囊霉基因AAL066W(GenBank編號(hào)存AAS50300，位于I號(hào)染色體上232310-233326位)顯著匹配，分值為409字節(jié)(bit)(位置相同性和相似性分別是62%和78%)。由MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成如下寡核苷酸，以通過使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增棉桃阿舒氏囊霉S1^2編碼序列的下游區(qū)域，之后克隆進(jìn)pUG6(EUROSCARF，Oberursel,GERMANY):AgSUR2T勘NO:23中的核苷酸1719-1741;包含//pal識(shí)別位點(diǎn))AgSUR2T-rv:TATATAACTAGTATGGACGCTGCAGTGCAGAACC(SEQIDNO:23中的核苷酸2500-2521;包含^;d[識(shí)別位點(diǎn))所述寡核苷酸用于豐艮據(jù)Innisetal.,(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中根據(jù)生產(chǎn)商說明使用PhusionTMHighFidelityPCRMasterMix(Finnzymes,cat.#F-531L)。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)815bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit(QIAGEN,cat.#28606)根據(jù)生產(chǎn)商說明進(jìn)行純化。之后用//pal(NewEnglandBiolabs,cat.#R0138L)禾口—I(NewEnglandBiolabs,cat.#R0151S)消化2小時(shí)并與￡coRV(NewEnglandBiolabs，cat.#R0195L)和切割的pUG6用T4DNALigase(NewEnglandBiolabs，cat.#M0202L)根據(jù)生產(chǎn)商說明進(jìn)行連接。將2.5^連接產(chǎn)物根據(jù)生產(chǎn)商的方案中所描述的化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(五co//)(InvitrogenOneShotTOP10，cat.#C4040-03)。同樣得到質(zhì)粒pUG6-AgSUR2-T(4806bp)。合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增同樣需要克隆進(jìn)pUG6的上游區(qū)域AgSUR2P-Rv2:TATATACAGCTGCGTCTGTACCAGAACCTGTGC(SEQIDNO:23中的核苷酸1-21;包含尸vwll識(shí)別位點(diǎn))AgSUR2P誦rv2:TATATAGTCGACCTACGTCATCCATGAACGACACT(SEQIDNO:23中的核苷酸800-821;包含識(shí)別位點(diǎn))所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)840bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。之后用Sa/I(NewEnglandBiolabs,cat.#R0138L)和尸vwll(NewEnglandBiolabs,cat.#R0151S)消化2小時(shí)并與&//和/Vw/7切割的如上所述的pUG6-AgSUR2-T進(jìn)行連接，產(chǎn)生圖1所示的質(zhì)粒pUG6-AgSUR2::kanMX(5537bp)。這個(gè)質(zhì)粒適于在轉(zhuǎn)化進(jìn)棉桃阿舒氏囊霉之后由^"皿取代棉桃阿舒氏囊霉5Ti2，從而使5Ti2失活。棉桃阿舒氏囊霉Z)ES7序列通過使用被功能性鑒定的白假絲酵母二氫神經(jīng)酰胺A4-去飽和酶(Ternes2002;NCBI編號(hào)NW一139432.1)作為模卞及ff對(duì)AshbyaGenomeDatabase(http:〃ashbya.genome.duke,edu/blast.htm1/)進(jìn)行BLASTP檢索得到，檢索結(jié)果是與棉桃阿舒氏囊霉基因AGR025W(GenBank編號(hào)存AAS54514，位于VII號(hào)染色體上761515-762654bp)顯著匹酉己，分值為378字節(jié)(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分別是52%和65%)。合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增棉桃阿舒氏囊霉D五W編碼序列的上游DNA區(qū)域AgDESl-US-fw:TATATAGTTAACTCCATCAGCGCGACAACAGG(SEQIDNO:22中的核苷酸1-20;包含i^al識(shí)別位點(diǎn))AgDESl-US-rv:TATATAGAGCTCTCCGAATCGAGGCGTGTGTAG(SEQIDNO:22中的核苷酸830-850;包含Sacl識(shí)別位點(diǎn))所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)874bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。之后用/^"I(NewEnglandBiolabs,cat.#R0105S)和SacI(NewEnglandBiolabs，cat.#R0156S)消化2小時(shí)并與分別切割的載體pAG32(EUROSCARF,Oberursel,GERMANY)進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pAG32-AgDESl-US(4916bp)，所述質(zhì)粒是用于進(jìn)一步克隆步驟的中間質(zhì)粒。接下來合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增棉桃阿舒氏囊霉DES7編碼序列的5'-一山禾頓AgDESl-DS誦fW:ATGAACCAACGGGGTATAGCGAC(SEQIDNO:22中的核苷酸26905-927)AgDESI-DS-rv:TATATAAAGCTTCTCTTCAATGCTGAAGAGGTAGTG(SEQIDNO:22中的核苷酸1652-1675;包含//fwffll識(shí)別位點(diǎn))所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)783bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。通過用PhusionHighFidelityPCRMasterMix進(jìn)行交叉PCR將棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脫氫酶的啟動(dòng)子(SEQIDNO:24)融合至前面擴(kuò)增的棉桃阿舒氏囊霉D五W編碼序列的5'-末端。所述啟動(dòng)子序列通過使用被功能性鑒定的釀酒酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶(Hollandafl/.，1979;NCBI編號(hào)NC—001142.6)作為模板針對(duì)AshbyaGenomeDatabase(http:〃ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)進(jìn)行BLASTP檢索得到，檢索結(jié)果是與棉桃阿舒氏囊霉基因AER031C(GenBank編號(hào)#AAS52715,位于V號(hào)染色體上695233-696228bp)顯著匹配，分值為530字節(jié)(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分別是78%和89%)。合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼序列起始密碼子的上游啟動(dòng)子區(qū)域PGAP-fW:TATATAGTCGACGGCTCTCCTCGCTCTGCTCAAG(SEQIDNO:24中的核苷酸1-23;識(shí)別位點(diǎn))PGAP-rv:GTCGCTATACCCCGTTGGTTCATTGTGCGGTGTGTATGTGTGGAC(SEQIDNO:24中的核苷酸497-518和SEQIDNO:22中的核苷酸1-23)所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)550bp片段。所述片段使用MinEluteGd27ExtractionKit進(jìn)行純化。使用寡核苷酸PGAP-fw和AgDESl-DS-rv以及1pi前面擴(kuò)增并純化的棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因的啟動(dòng)子和棉桃阿舒氏囊霉DES7編碼序列的5'-末端進(jìn)行交叉PCR。通過進(jìn)行此方法得到的1310bp片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。之后用Sa/I(NewEnglandBiolabs,cat,#R0138S)禾卩歷"郝(NewEnglandBiolabs，cat.#R0104S)消化并與分別切割的如上所述的載體pAG32-AgDESl-US進(jìn)行連接，產(chǎn)生圖2所示的質(zhì)粒pAG32-hyg-PAgGAP-AgDESl(6192bp)。這個(gè)質(zhì)粒適于用棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因的啟動(dòng)子取代天然棉桃阿舒氏囊霉Z)&S7啟動(dòng)子以獲得提高的Deslp活性。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉DEW基因的DNA上游區(qū)域、所克隆的棉桃阿舒氏囊霉基因的5'-末端和所克隆的棉桃阿舒氏囊霉3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因的啟動(dòng)子的真實(shí)性通過由Sequiserve(Vaterstetten,GERMANY)進(jìn)行的DNA測序進(jìn)行確認(rèn)，所述DNA測序使用Sanger"a/.(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,U.S.A.,74:5463-5467)開發(fā)的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。在相應(yīng)克隆的質(zhì)粒pAG32-hyg-PAgGAP-AgDESl的DNA序列中缺少公開的D五^編碼序列(GenBank編號(hào)#AAS50300;在AshbyaGenomeDatabase:http:〃ashbya.genome.duke.edu/blast.html/中AGR025W)的核苷酸382、489和405，導(dǎo)致公開的蛋白質(zhì)序列在氨基酸位置29-34改變?yōu)锳NLPI，這與其他所有酵母Deslp中的相應(yīng)區(qū)域相同。因此，公開的棉桃阿舒氏囊霉DNA序列很可能含有序列錯(cuò)誤。棉桃阿舒氏囊霉WC^序列通過使用被功能性鑒定的稱為Z^C7的釀酒酵母神經(jīng)酰胺合酶成份(Schorling"2001;NCBI編號(hào)NC—001143.7)作為t莫板辛十對(duì)AshbyaGenomeDatabase(http:〃ashbya,genome.duke.edu/blast.html/)進(jìn)行BLASTP檢索得到，檢索結(jié)果是與棉桃阿舒氏囊霉基因ABR009W(NP一982955，位于II號(hào)染色體上408463-409704bp)顯著匹配，分值為531字節(jié)(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分別是64%和79%)。棉桃阿舒氏囊霉丄JG7序列通過使用被功能性鑒定的稱為丄AF7的釀酒酵母神經(jīng)酰胺合酶成份(Schorlingefa/.，2001;NCBI編號(hào)NC—001140,5)作為模板針對(duì)AshbyaGenomeDatabase(http:〃ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)進(jìn)《亍BLASTP檢索得到，檢索結(jié)果是與棉桃阿舒氏囊霉基因ADL206W(GenBank編號(hào)#AAS51714，位于IV號(hào)染色體上340556-341674bp)顯著匹配，分值為11728字節(jié)(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分別是32%和48%)。合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增wa/編碼序列AgLACl-fw:酸1-25)AgLACl-PacI-rv:TATATATTAATTAAGACCTGTATATATTCTAGTAGTG(SEQIDNO:ll中的核苷酸1388-1410;包含戶flcl識(shí)別位點(diǎn))所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)1241bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。進(jìn)行交叉PCR以將棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因前面的啟動(dòng)子如前述融合至i^G7編碼序列。所述棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子序列通過使用被功能性鑒定的命名為和￡iV02的釀酒酵母烯醇化酶同工酶(McAlistereM/.,1982;NCBI編號(hào)NC—001139.7和NC一OOl140.5)作為模板針對(duì)AshbyaGenomeDatabase(http:〃ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)進(jìn)行BLASTP檢索得到，檢索結(jié)果是與棉桃阿舒氏囊霉基因AER294C(GenBank編號(hào)#AAS52975，位于V號(hào)染色體上1176724-1178037bp)顯著匹配，對(duì)于釀酒酵母SW刀分值為734字節(jié)(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分別是83%和91%)，對(duì)于釀酒酵母分值為709字節(jié)(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分別是80%和87%)。選擇在￡7V07起始密碼子上游大約455bp的區(qū)域并使用如下寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增P-ENO-PacI-Rv:NO:25中的核苷酸1-21;包含_PflcI識(shí)別位點(diǎn))P-ENO-CO-LAGl-rv:CCTGACTTGGCCCGACATTTTGAATTATTTGAGTTTCGGAGGTGTTAATC(SEQIDNO:25中的核苷酸436-467和SEQIDNO:13中的核苷酸l-18)所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhuskmHighFidelityPCRMasterMix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)475bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。使用寡核苷酸P-ENO-PacI-fw和AgLACl-PacI-rv以及1^前述擴(kuò)增并純化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子和棉桃阿舒氏囊霉丄JG/編碼序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行交叉PCR，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)1716bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。之后用Pac/(NewEnglandBiolabs,cat.#R0547S)消化2小時(shí)，與Pac/切割并去磷酸化的(NewEnglandBiolabs，小牛腸堿性磷酸酶，catJM0290S)載體pAG32-hyg-PAgGAP-AgDESl如生產(chǎn)商的方案中所述進(jìn)行連接，產(chǎn)生圖3所示的質(zhì)粒pAG-LAGl-l(8077bp)。這個(gè)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化進(jìn)棉桃阿舒氏囊霉之后適于同時(shí)過表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉D五W和WG7。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子和棉桃阿舒氏囊霉丄JG7編碼序列的真實(shí)性通過由Sequiserve(Vaterstetten,GERMANY)進(jìn)行的DNA測序進(jìn)行確認(rèn)。接下來合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增^L4F7編碼序列AgLAGl-fW:ATGTCGGGCCAAGTCAGGC(SEQIDNO:13中的核苷酸1-20)AgLAGl-PacI-rv:TATATATTAATTAACTGCATGCGCTGTCTGGCG(SEQIDNO:13中的核苷酸1291-1309;包含尸ad識(shí)別位點(diǎn))所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)1118bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。進(jìn)行交叉PCR以將棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子如上所述融合至編碼序列。使用寡核苷酸P-ENO-PacI-fw和AgLAGl-PacI-rv以及1pl前述擴(kuò)增并純化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子和棉桃阿舒氏囊霉丄^F7編碼序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行交叉PCR，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)1593bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。之后用戶"c/消化2小時(shí)，并與尸"c/切割并去磷酸化的如上所述的載體pAG32-hyg-PAgGAP-AgDESl進(jìn)行連接，產(chǎn)生圖4所示的質(zhì)粒pAG-LAFl-l(7976bp)。這個(gè)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化進(jìn)棉桃阿舒氏囊霉之后適于同時(shí)過表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉D五S7和WF/。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子和棉桃阿舒氏囊霉^4F7編碼序列的真實(shí)性通過由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)進(jìn)行的DNA測序進(jìn)行確認(rèn)。棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895的轉(zhuǎn)化通過電穿孔方法進(jìn)行。為了預(yù)防在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)真菌菌絲體凝結(jié)成塊，將其如下進(jìn)行均質(zhì)化取一滿環(huán)在瓊脂平板(lg/1酵母提取物，10g/1蛋白胨，10g/1葡萄糖，0.3g/1肌醇和20g/l瓊脂)上在30°C生長24h的菌絲體，在15ml反應(yīng)管中重懸于2ml無菌水中。加入直徑為3mm的無菌玻璃珠至充滿凸出部分。將所述溶液在微型振蕩器(IKA,Staufen,GERMANY)上全速振蕩2min。用注射器移出均質(zhì)化的菌絲體懸液并轉(zhuǎn)移至具有隔板的含有70ml液體復(fù)合培養(yǎng)基(lg/1酵母提取物，10g/1蛋白胨，10g/1葡萄糖和0.3g/1肌醇)的250ml搖瓶中。以每分鐘250轉(zhuǎn)在30°C生長過夜，并通過真空過濾(Schleicher&SchuellVacufloPV050/2真空過濾單位)收獲，用含有25mM二硫蘇糖醇(DTT)的50mM磷酸鹽緩沖液漂洗，在相同溶液中在28。C溫育30min,并再次通過真空過濾收集。細(xì)胞接下來用含有270mM蔗糖和1mMMgCl2的10mMTris-HCl(pH7.5)漂洗，重懸于1ml相同溶液中并分為200^小份。根據(jù)生產(chǎn)商的說明用ffpal(NewEnglandBiolabs,cat#R0105S)將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNApUG6-AgSUR2::kanMX、pAG-LAG1-1或pAG-LAFl-l線性化。DNA用標(biāo)準(zhǔn)苯酚:氯仿提取和乙醇沉淀方案進(jìn)行純化。將多至20的純化的DNA加入到菌絲體懸液的200^小份中，不超過體積的10%，裝入預(yù)冷的2mm電穿孔杯中并用設(shè)置在1.5kV/cm，100Q，和25的GenePulser(Bio-Rad,Munich,Germany)電擊。在電穿孔之后，用移液器將菌絲體從電穿孔杯轉(zhuǎn)移至如上述10ml液體復(fù)合培養(yǎng)基中，并在沒有隔板的100ml搖瓶中以每分鐘200轉(zhuǎn)在30。C溫育4-6h以進(jìn)行細(xì)胞再生。為了施加選擇壓力，接下來向再生的細(xì)胞中加入10ml頂層瓊脂(lg/1酵母提取物，10g/1蛋白胨，10g/1葡萄糖和0.3g/1肌醇，含有1%瓊脂糖(w/v)加上750嗎/ml遺傳霉素G418和/或750pig/ml潮霉素B)，混和并鋪至非選擇性復(fù)合培養(yǎng)基瓊脂平板(lg/1酵母提取物，10g/1蛋白胨，10g/1葡萄糖，0.3g/1肌醇和20g/l瓊脂)上。在30°C溫育2-3天后獲得轉(zhuǎn)化子。通過選擇遺傳霉素和/或潮霉素抗性孢子進(jìn)行棉桃阿舒氏囊霉轉(zhuǎn)化子的菌落純化。為此，將轉(zhuǎn)化子在孢子形成平板(iog/1酵母提取物，10g/1葡萄糖和20g/1瓊脂)上劃線并在30°C溫育5天。接下來，將一滿環(huán)真菌菌絲體重懸于含有10mg/ml得自哈茨木霉(7Wc/zoAww/zam'a"w附)(Sigma畫Aldrich，Taufkirchen,Germany)的裂解酶的1ml0.9%(w/v)NaCl中并在室溫溫育1h。通過離心(30s，13.200rpm)沉降的釋放的孢子和細(xì)胞碎片用1ml0.9%(w/v)NaCl溶液漂洗并最后用等體積石蠟提取以通過在混和型研磨儀(Retsch,Hahn，Germany)中在30Hz振蕩30s使兩相徹底混和而富集孢子。不同相通過離心(30s，800rpm)分離。將0.9%(w/v)NaCl中的石蠟相的系列稀釋物鋪板至選擇培養(yǎng)基80030(1g/l酵母提取物，10g/1蛋白胨，10g/1葡萄糖，0.3g/1肌醇和20g/l瓊脂，含有750pg/ml遺傳霉素和/或750pg/ml潮霉素)上并在30。C溫育2-3天。選擇并培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落以如實(shí)施例3所述通過反相HPLC量化并鑒定鞘氨醇類堿。實(shí)施例2同時(shí)過表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉的酶Lafl。和Deslo的棉桃阿舒氏囊霉S"五S雙突變株的構(gòu)建質(zhì)粒pSSTH-LAFl-2被設(shè)計(jì)為用fe^M^抗性基因取代棉桃阿舒氏囊霉5Ti2基因，從而使棉桃阿舒氏囊霉5Ti2基因失活并同時(shí)過表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉D五W和Z^i^基因。如實(shí)施例1中所述獲得棉桃阿舒氏囊霉5Ti2、和丄JF7編碼序列以及棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子序列。由MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成如下寡核苷酸以從棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞擴(kuò)增的編碼序列AgDESl-DS-fw:ATGAACCAACGGGGTATAGCGAC(SEQIDNO:22中的核苷酸905-927)AgDESl-rv-SalI:TATATAGTCGACGAGTTTTGACTCCTTCTGTCTC(SEQIDNO:22中的核苷酸2246-2267;包含識(shí)別位點(diǎn))所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板并根據(jù)Innisetal.，(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(Finnzymes,cat.#F-531L)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)1372bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit(QIAGEN，cat.#28606)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子AgPENO-fW-Xbal:TATATATCTAGACTGTTCACAGCCTTCTGAGAC(SEQIDNO:"中的核苷酸l-";包含lal識(shí)別位點(diǎn))AgPENO-OEPCR-rv:GTCGCTATACCCCGTTGGTTCATTTTGAATTATTTGAGTTTCGGAGGTGTTAATC(SEQIDNO:25中的核苷酸436-467和SEQIDNO:22中的核苷酸905-927)所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix和棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)496bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。使用寡核苷酸AgPENO-fW-Xbal和AgDES1-rv-Sall以及1jil前述擴(kuò)增并純化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子和棉桃阿舒氏囊霉Z)￡S7編碼序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行交叉PCR，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)1846bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。之后用Sa/I(NewEnglandBiolabs，cat.#R0138S)和力al(NewEnglandBiolabs，cat.#R0145S)消化2小時(shí)，并與Sa/I和W。I切割的載體pUG6-AgSUR2::kanMX(參見實(shí)施例l)如生產(chǎn)商的方案所描述的進(jìn)行連接。使用2.5jul連接產(chǎn)物根據(jù)生產(chǎn)商的說明化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(InvitrogenOneShotTOPIO，cat.#C4040-03)。同樣得到質(zhì)粒pSSTH(7323bp)。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因和棉桃阿舒氏囊霉"^S7編碼序列的片段的DNA序列的真實(shí)性通過由Sequiserve(Vaterstetten,GERMANY)進(jìn)行的DNA測序進(jìn)行確認(rèn)。接下來合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增棉桃阿舒氏囊霉i^F7編碼序列AgLAGl-f\v:ATGTCGGGCCAAGTCAGGC(SEQIDNO:13中的核苷酸1-19)AgLAGl-PacI-rv:TATATATTAATTAACTGCATGCGCTGTCTGGCG(SEQIDNO:13中的核苷酸1291-1309;包含尸acl識(shí)別位點(diǎn))所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhuskmHighFidelityPCRMasterMix并使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)1118bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子P國ENO-PacI-fW:TATATATTAATTAACTGTTCACAGCCTTCTGAGAC(SEQIDNO:"中的核苷酸1_21;包含&d識(shí)別位點(diǎn))P-ENO-CO-LAGl-rv:CCTGACTTGGCCCGACATTTTGAATTATTTGAGTTTCGGAGGTGTTAATC(SEQIDNO:25中的核苷酸436-467和SEQIDNO:13中的核苷酸l-18)所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix并使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)475bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。使用寡核苷酸P-ENO-PacI-fW和AgLAGl-PacI-rv以及1pl前述擴(kuò)增并純化的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因的啟動(dòng)子和34棉桃阿舒氏囊霉丄^F7編碼序列的PCR產(chǎn)物進(jìn)行交叉PCR，其中使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)1593bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。之后用Pad(NewEnglandBiolabs,cat.#R0547S)消化2小時(shí)，并與Pad切割并去磷酸化(NewEnglandBiolabs,小牛腸堿性磷酸酶，cat.#M0290S)的載體pSSTH如前面所描述的進(jìn)行連接，產(chǎn)生圖5所示的質(zhì)粒pSSTH-LAFl-2(9117bp)。這個(gè)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化進(jìn)棉桃阿舒氏囊霉之后適于用^wMY取代棉桃阿舒氏囊霉6Ti么從而使其失活，并同時(shí)過表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉Z^W和Z^F7。所克隆的棉桃阿舒氏囊霉烯醇化酶編碼基因和棉桃阿舒氏囊霉Z^4F7編碼序列的真實(shí)性通過由S叫uiserve(Vaterstetten,GERMANY)進(jìn)行的DNA測序進(jìn)行確認(rèn)。質(zhì)粒pAG32-D8D被設(shè)計(jì)為破壞棉桃阿舒氏囊霉SZ)55"基因。編碼序列通過使用被功能性鑒定的乳酸克魯維酵母的A(8)-鞘脂去飽和酶(Takakuwaetal.,2002;EMBL編號(hào)AB085690)作為模板針對(duì)AshbyaGenomeDatabase(http:〃ashbya.genome.duke.edu/blast.html/)進(jìn)行BLASTP檢索得到，檢索結(jié)果是與棉桃阿舒氏囊霉基因AFL079W(GenBank編號(hào)存AAS53293，位于VI號(hào)染色體上290134-291750bp)顯著匹配，分值為616字節(jié)(bit)(氨基酸位置相同性和相似性分別是56%和69%)。合成如下寡核苷酸以擴(kuò)增SZ)五S編碼序列的一個(gè)內(nèi)部區(qū)域AgD8D畫HindlII-fW:NO:20中的核苷酸204-225;包含///"dll識(shí)別位點(diǎn))AgD8D-BamHI-rv:NO:20中的核苷酸1000-1021;包含BawM識(shí)別位點(diǎn))所述寡核苷酸用于進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中使用PhuskmHighFidelityPCRMasterMix并使用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895細(xì)胞作為模板。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)824bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit進(jìn)行純化。之后用BamHI(NewEnglandBiolabs,cat.#R0136S)35和///"cMI(NewEnglandBiolabs,cat.#R0104S)消化2小時(shí)，并與BawHI和切割的如前所述的載體pAG32(EUROSCARF,Oberursel，GERMANY)連接，產(chǎn)生圖6所示的質(zhì)粒pAG32-D8D(4960bp)。這個(gè)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化進(jìn)棉桃阿舒氏囊霉之后適于破壞棉桃阿舒氏囊霉SD^S基因。所克隆的內(nèi)部棉桃阿舒氏囊霉SD五S序列的真實(shí)性通過由Sequiserve(Vaterstetten，GERMANY)進(jìn)行的DNA測序進(jìn)行確認(rèn)。棉桃阿舒氏囊霉的轉(zhuǎn)化如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。質(zhì)粒pSSTH-LAFl-2用//pal(NewEnglandBiolabs,cat.#R0105S)線性化，質(zhì)粒pAG32-D8D用A^I(NewEnglandBiolabs,cat.#R0589S)線性化，并類似實(shí)施例1進(jìn)行純化。實(shí)施例3通過反相HPLC量化并鑒定棉桃阿舒氏囊霉菌株中的鞘氨醇類堿對(duì)于HPLC分析，生長于含有合適的抗生素的YEPD平板上的棉桃阿舒氏囊霉突變株的菌絲體如實(shí)施例1所述進(jìn)行均質(zhì)化，接種于具有隔板的100ml三角瓶中的20mlYEPD培養(yǎng)基(蛋白胨2%(w/v)、酵母提取物1%(w/v)和葡萄糖2%(w/v))中并在30°C以250rpm生長3天。在此時(shí)細(xì)胞處于穩(wěn)定期。將1ml菌絲體懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml反應(yīng)管中，13200rpm離心lmin并用移液管移出液體培養(yǎng)基。用IMHCI將樣品填充至1.5ml并在80。C溫育16h。將樣品短暫混勻并將500pl懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml反應(yīng)管中。加入1ml氯仿:甲醇(2:1)(v/v)并通過在混和型研磨儀(Retsch,Hahn，Germany)中在30Hz振蕩30min提取脂類。樣品在13200rpm離心5min并將500|il下層氯仿相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml反應(yīng)管中。通過在60°C真空離心(ChristVakuumzentrifbge,ChristAG,Osterode)20min使溶劑蒸發(fā)，將沉淀重懸于適當(dāng)體積的2-丙醇:H20(l:l)(v/v)中并在超聲水浴中在40°C溶解lOmin。為了確定菌絲體干重，從液體培養(yǎng)物中取出樣品并通過濾紙過濾，如實(shí)施例1所述。收集的菌絲體在110°C干燥過夜并稱重。鞘氨醇類堿濃度使用反相高壓液相色譜(RP-HPLC)確定。在C18植物鞘氨醇、C18二氫鞘氨醇和C18鞘氨醇的情況中，通過與可商購的參考物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)而進(jìn)行量化。在C18二氫鞘氨二烯醇(sphingadiene)的情況中，無可商購的參考物質(zhì)。因此，C18二氫鞘氨二烯醇(sphingadiene)的濃度使用C18鞘氨醇作為校準(zhǔn)物確定。RP-HPLC詳細(xì)情況:儀器Jasco;泵PU-2080，自動(dòng)進(jìn)樣器AS-2055,熒光檢測器FP-2020柱KromasiC18,250mmx4.6mmRP-HPLC條件流速2.00ml/min樣品體積10^上柱前衍生化2min，用等體積鄰苯二甲醛(o-phtaldialdehyde，OPA)注射體積10|il柱溫40°C塔板溫度環(huán)境溫度流動(dòng)相甲醇:水(92:8)(w/v)運(yùn)^T時(shí)間8min檢測方法熒光激發(fā)波長340nm發(fā)射波長455nm保留時(shí)間C18植物鞘氨醇4.00minC18二氫鞘氨二烯醇(sphingadiene)4.40minC18鞘氨醇5.50minC18二氫鞘氨醇7.00min這些分析的結(jié)果示于圖19。對(duì)比于棉桃阿舒氏囊霉野生型菌株僅產(chǎn)生可忽略的量的鞘氨醇，所有過表達(dá)i^;w并缺乏功能性sri2基因的菌株都產(chǎn)生0.5mg鞘氨醇每克細(xì)胞干重。另外單獨(dú)過表達(dá)LJF7或與插入失活組合過表達(dá)iL4F/使得不需要的副產(chǎn)物二氫鞘氮醇和二氫鞘氨二烯醇(sphingadienine)的形成急劇降低。實(shí)施例4從戶/c/z/ac//^r//F-60-1OANRRL1031中分離基因組DNA尸/c/z/a"/ern7F-60-1OANRRL1031在250ml三角瓶中的50mlYEPD培養(yǎng)基(蛋白胨2%(w/v)、酵母提取物1%(w/v)和葡萄糖2%(w/v》中在30°C以200rpm生長并在18h后在OD6oo為1.5時(shí)收集。用PUREGENEDNAD-6000A)根據(jù)生產(chǎn)商的說明分離染色體DNA。對(duì)分離的DNA用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定性檢測顯示了其高分子量(>16kbp)。實(shí)施例5i^/n'flcz'/^n'/i^G7基因的克隆和核苷酸序列的確定擴(kuò)增尸z'c/z^c//^rz7丄基因的內(nèi)部一部分首先，通過用棉桃阿舒氏囊霉Laglp(GenBankacc.#NP—982955)作為模板進(jìn)行TBLASTN檢索，從完全的和未完成的真核基因組的NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom—table.cgi)中提取酵母菌亞門物種中推斷的神經(jīng)酰胺合酶的氨基酸序列。這個(gè)蛋白質(zhì)與已鑒定的釀酒酵母Laclp和Laglp蛋白非常相似(氨基酸位置相同性分別是65%和69%)(Schorling"fl/.，2001;Guillasda/.,2003)，因此很可能具有祌經(jīng)酰胺合酶活性。所提取的序列(全部條目E-值〈2xl0"23)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)進(jìn)行排列對(duì)比。用于擴(kuò)增尸&A/"基因的內(nèi)部一部分的合適的寡核苷酸通過反翻譯Laglp序列內(nèi)部的氨基酸高度保守片段產(chǎn)生(考慮/^/^cz/ern7密碼子使用的高度偏性)。之后由MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成如下寡核苷酸LACl-deg-fw:TTYGTYGGTTTYTAYGCWATHTTYTTYACWTTYTTRMGWGAATT(SEQIDNO:l中的核苷酸1636-1679)LACl畫deg-rv:GGTTGWSWDATCCAACATTTRTATTGTTGWGT(SEQIDNO:l中的核苷酸2297-2266)這些寡核苷酸用于根據(jù)Innis"a/.,(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990，AcademicPress)進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，其中根據(jù)生產(chǎn)商的說明使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(Fi腿ymes,catJF-531L)。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)662bp片段。所述片段使用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen，cat.#28706)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。確定尸/c/7/ac^7"7UG7基因的內(nèi)部一部分的DNA序列用Sangerd(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,U.S.A.,74:5463-5467)開發(fā)的雙脫氧鏈終止法確定純化的PCR產(chǎn)物的DNA序列。使用用于PCR擴(kuò)增的引物作為測序引物。DNA測序由Sequiserve(Vaterstetten，Germany)進(jìn)行。得到的序列信息(662bp,相應(yīng)于SEQIDNO:l中的核苷酸1636-2297;圖7A)使用CloneManager7軟件(Scientific&EducationalSoftware)翻譯為蛋白質(zhì)，并將得到的氨基酸序列用作模板對(duì)NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行BLASTP檢索。所述檢索鑒別出了一個(gè)與釀酒酵母Laclp(—個(gè)神經(jīng)酰胺去飽和酶亞基)高度相似的乳酸克魯維酵母蛋白(NCBIacc.#XP一452132)，這是在所述數(shù)據(jù)庫中與所述新序列最為相似的蛋白質(zhì)，確認(rèn)了事實(shí)上擴(kuò)增了乃'c/^"/e^7丄^G7直系同源物的幾部分。擴(kuò)增完整P/c/n'ac^rn7Z^G7基因并確定其DNA序列為了確定完整尸/c/z^"/^777^L4G7基因(編碼序列、啟動(dòng)子區(qū)和3'-非翻譯區(qū))的DNA序列，之后進(jìn)行反向PCR。得自乃'c/7/flc^m'/F-60-10ANRRL1031的染色體DNA(300ng)(如實(shí)施例4中所述分離的)用(MBIFermentas,cat.弁ER0911)根據(jù)生產(chǎn)商的說明消化過夜，總體積為50(il。消化的DNA用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen，cat.#28106)根據(jù)生產(chǎn)商的說明迸行純化。洗脫出的DNA(50pl)用T4DNALigase(NewEnglandBiolabs,cat.#M0202L)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行過夜連接，總體積為200pl，39使用800U的T4DNALigase。連接的DNA用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。2.5|il洗脫液作為模板用于根據(jù)InnisWa/.,(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)進(jìn)行的反向PCR反應(yīng)。為此，應(yīng)用靶向尸/c/Wacz/e,T//L4G7基因已知部分的兩個(gè)寡核苷酸PcLACl-us-fW:中的核苷酸1732-1763)PcLACl-us-rv:CCAACAATTGGTGCAAGGGGAC(SEQIDNO:l中的核苷酸1721-1700)擴(kuò)增使用PhusiorTHighFidelityPCRMasterMix根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。用此方法可獲得2.2kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit(Qiagen，cat.#28006)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸PcLACl-us-fW、PcLAC1-us-rv、DB6PcLACl-us-rv2:TTAGACAGAAGCTCAACAGG(SEQIDNO:l中的核苷酸1032-1013)、DB6-PcLAClintfW:TTCAGCTGGTTATTTGTCTC(SEQIDNO:l中的核苷酸1240-1259)和DB6-PcLAClintrv:TAACCCAGAATCAAGGTC(SEQIDNO:l中的核苷酸94-77)作為測序引物。新獲得的序列信息包括SEQIDNO:l中的核苷酸1-1635。無法獲得所述DNA序列的下游新序列信息，因?yàn)?，Rpl位點(diǎn)位于緊鄰這一部分的下游(圖7A)。為了獲得尸/c/n'a"y^r"WG7基因編碼區(qū)的3'-末端及其3'-非翻譯區(qū)的DNA序列，需要進(jìn)行另一輪反向PCR。因此，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)方案，不同的是用///"dill(NewEnglandBiolabs,cat.#R0104S)消化尸/c&a";/^r"'染色體DNA和在反向PCR期間使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成)PcLACl扁ds陽fw:中的核苷酸2241-2272)PcLACl-ds-rv:CTGTTCTAAATTCTGTTAAAACTGACC(SEQIDNO:1中的核苷酸2239-2213)用此方法可獲得4.5kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸PcLACl-ds-fW;PcLACl-ds-rv;DB6-PcLAClds^v2:AAATCAGGTTTAACAATGGC(SEQIDNO:l中的核苷酸3152-3171)DB6-PcLACldsfW3:AGTTGATAAATGACGAATGG(SEQIDNO:l中的核苷酸4060-4079)和DB6-PcLACldsrv2:GAACGTACTCTTGTATCACCC(SEQIDNO:l中的核苷酸1343-1323)作為測序引物?？梢垣@得2655bp的新序列信息(SEQIDNO:l中的核苷酸2298-4952)，所述序列延伸至3，K^I位點(diǎn)下游的下一個(gè)歷"dIII限制位點(diǎn)(圖7B)。使用所描述的三步方法，可以分離總長為4952bp的尸Zc/n'flc^/r//基因座，并且可以確定其DNA序列(參見SEQIDNO:l和圖7)。如圖7C所示的PZc/z/aa/m77^4G7基因座編碼長度為429個(gè)氨基酸的尸z-c&acz/e/r//Laglp蛋白(SEQIDNO:2)。戶/c//a"/emYLaglp分別與從乳酸41克魯維酵母(GenBankacc.#XP—452132)和釀酒酵母(GenBankacc.#NC—001143)推斷的神經(jīng)酰胺合酶具有64%(80%)和62%(75%)的氨基酸位置相同性(相似性)。來自釀酒酵母的Laclp蛋白已經(jīng)被生化鑒定并示出顯示體內(nèi)神經(jīng)酰胺合酶活性(Schorlingetal.,MolecularBiologyoftheCell,12:3417-3427)。實(shí)施例6尸/cfegC//^77'"^F7基因的克隆和核苷酸序列的確定擴(kuò)增尸/c/w'flc/fgm7MJVS基因的內(nèi)部一部分由于用衍生自酵母菌亞門的Laflp蛋白的多序列排列對(duì)比的簡并寡核苷酸擴(kuò)增尸/c/z/a"/an7Z^P7基因(基因名稱的選擇類似于編碼釀酒酵母中兩個(gè)神經(jīng)酰胺酶合酶亞基的基因名稱^4C7和^4G/。它們?cè)醋栽谌科渌湍?包括尸/c/^cz/em'/)中也存在的Z^G7基因的重復(fù)(duplication)。其他酵母(包括Pi'c/Wac!/em7)中的第二個(gè)神經(jīng)酰胺酶合酶亞基是ZJC7和的旁系同源物，而不是直系同源物，明顯在釀酒酵母中不存在。因此，選擇命名為i^F7。)的內(nèi)部一部分失敗了，因此我們利用了這樣一個(gè)事實(shí)在多數(shù)酵母菌亞門物種中，編碼細(xì)胞周期蛋白C的SSVS基因位于i^^7基因的上游。首先，通過用棉桃阿舒氏囊霉Ssn8p(GenBankaccJAAS51713)作為模板進(jìn)行TBLASTN檢索，從完全的和未完成的真核基因組的NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)中提取酵母菌亞門物種的細(xì)胞周期蛋白C的氨基酸序列。所提取的序列(全部條目E-值〈xlO—,使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)進(jìn)行排列對(duì)比。用于擴(kuò)增尸z'c/n'ac^/r"557VS基因的內(nèi)部一部分的合適的寡核苷酸通過反翻譯Ssn8p序列內(nèi)部的氨基酸高度保守片段產(chǎn)生。之后由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸PcSSN8-deg-fW3:GAAGAATGTCCWCAACATATHMGW(SEQIDNO:3中的核苷酸1-24)PcSSN8-deg-rv2:YAAYAACTGYAAATCWGTDAT(SEQIDNO:3中的核苷酸42628-608)這些寡核苷酸用于根據(jù)Innis""/，，(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中根據(jù)生產(chǎn)商說明使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(Finnzymes,cat.#F-531L)。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)393bp片段。所述片段使用MinEluteGelExtractionKit(Qiagen,catJ28606)根據(jù)生產(chǎn)商說明進(jìn)行純化。確定尸/c/n'ac能m7基因的內(nèi)部一部分的DNA序列用Sangera/.(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,U.S.A.,74:5463-5467)幵發(fā)的雙脫氧鏈終止法確定純化的PCR產(chǎn)物的DNA序列。使用用于PCR擴(kuò)增的引物作為測序引物。DNA測序由S叫uiserve(Vaterstetten，Germany)進(jìn)行。得到的序列信息(339bp,相應(yīng)于SEQIDNO:3中的核苷酸1-339;圖8A)使用CloneManager7軟件(Scientific&EducationalSoftware)翻譯為蛋白質(zhì)，并將得到的氨基酸序列用作模板對(duì)NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行BLASTP檢索。所述檢索鑒別出了白假絲酵母Ssn8p(NCBIacc.#EAK97601)，這是在所述數(shù)據(jù)庫中與所述新序列最為相似的蛋白質(zhì)，確認(rèn)了事實(shí)上擴(kuò)增了i^/n'a"/em7S57VS直系同源物的幾部分。擴(kuò)增尸^n'ac/Zbrz7基因并確定其DNA序列為了確定尸/c/n'ac^rn7丄JF7基因(編碼序列、啟動(dòng)子區(qū)和3'-非翻譯區(qū))的DNA序列(在保守組織情況中應(yīng)當(dāng)位于5SM基因下游)，之后進(jìn)行反向PCR。得自i^c/z/aci/^r//F-60-10ANRRL1031的染色體DNA(300ng)(如實(shí)施例4中所述分離的)用i/aelll(NewEnglandBiolabs,cat.#R0108S)根據(jù)生產(chǎn)商的說明消化過夜，總體積為50pl。消化的DNA用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen,cat.#M106)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。洗脫出的DNA(50jil)用T4DNALigase(NewEnglandBiolabs，cat#M0202L)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行過夜連接，總體積為200^d，使用800U的T4DNALigase。連接的DNA用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。2.5pl洗脫液作為模板用于根據(jù)Innis"a/.，(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990，AcademicPress)進(jìn)行的反向PCR反應(yīng)。為此，應(yīng)用靶向ft'c/^c^m7S5M基因己知部分的兩個(gè)寡核苷酸-PcSSN8-ds陽fw:酸293-319)PcSSN8-ds-rv:核苷酸240-211)擴(kuò)增使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。用此方法可獲得1.8kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinEluteGelExtraktionKit(Qiagen,cat.#28606)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸PcSSN8-ds-^v和PcSSN8-ds-rv作為測序引物。新獲得的序列信息包括SEQIDNO:3中的核苷酸340-1800。無法完整擴(kuò)增丄AF7基因，因?yàn)?'7foein位點(diǎn)位于丄^7基因內(nèi)部(圖8A)。為了獲得A'c/u'ac^rn7W尸/基因編碼區(qū)的3'-末端及其3'-非翻譯區(qū)的DNA序列，需要進(jìn)行另一輪反向PCR。因此，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)方案，不同的是用Mp/2ll03I(MBIFermentas，cat.#ER0731)消化尸/c/w'acz/em7染色體DNA和在反向PCR期間使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成)PcLAGl-ds-fW:GTTGGATCTTGGTTATATTATCATTCATC(SEQIDNO:3中的核苷酸1738-1766)PcLAGl-ds-rv:的核苷酸1700-1670)用此方法可獲得2.5kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如實(shí)施所述確定，其中使用寡核苷酸PcLAgl-ds-fw、PcLAgl-ds-rv和DB6-PcLAGldsfw2:TTAAACCCAAATAAACCTGG(SEQIDNO:3中的核苷酸2620-2639)作為測序引物?？梢垣@得2396bp的新序列信息(SEQIDNO:3中的核苷酸1801-4195)，所述序列延伸至3'/Z^in位點(diǎn)下游的下一個(gè)M//d1031限制位點(diǎn)(圖8B)。使用所描述的三步方法，可以分離總長為4195bp的尸&/^"7br//LJF/基因座，并且可以確定其DNA序列(參見SEQIDNO:3和圖8)。如圖8C所示的a/en^i^f7基因座編碼長度為385個(gè)氨基酸的戶/c/zz'a"/em7Laflp蛋白(SEQIDNO:4)。尸z'c/n'ac^m'ZLaflp分別與從乳酸克魯維酵母(GenBankacc.#XP一452132)和棉桃阿舒氏囊霉(GenBankacc.#AAS51714)推斷的神經(jīng)酰胺合酶具有64%(80%)和65%(79%)的氨基酸位置相同性(相似性)。實(shí)施例7尸/c/z/ac能rn7漢C7基因的克隆和核苷酸序列的確定擴(kuò)增Pfc/n'acz'/^n7KYC/基因的內(nèi)部一部分首先，通過用棉桃阿舒氏囊霉基因(GenBankacc.#NP—986865)作為模板進(jìn)行TBLASTN檢索，從完全的和未完成的真核基因組的NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom—table.cgi)中提取酵母菌亞門物種的推斷的神經(jīng)酰胺酶的氨基酸序列。這個(gè)蛋白質(zhì)與已鑒定的釀酒酵母Ypclp和Ydclp神經(jīng)酰胺酶非常相似(氨基酸位置相同性分別是43%和44%)(Mao"o/.，2000a，b)，因此很可能具有神經(jīng)酰胺合酶活性。所提取的序列(全部條目E-值〈lxl()43)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)進(jìn)行排列對(duì)比。用于擴(kuò)增戶/c/^c^rr//JTC7(基因名稱的選擇類似于編碼釀酒酵母中兩個(gè)神經(jīng)酰胺酶的基因名稱ZPC/和FDC7，其中第二個(gè)字母表示相應(yīng)酶的優(yōu)選的底物植物神經(jīng)酰胺和二氫神經(jīng)酰胺。未知其他酵母物種(例如乃'c&""y^n'/)中的單一神經(jīng)酰胺酶的底物偏好性，因此，選擇命名為ZYC7。)基因的內(nèi)部一部分的合適的寡核苷酸通過反翻譯Yxclp序列內(nèi)部的氨基酸高度保守片段產(chǎn)生(考慮戶/c/2/a"/e/r//密碼子使用的高度偏性)。之后由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸ACER-deg-fw:酸995-1020)ACER-deg-rv-L2:苷酸1633-1607):7中的核苷:7中的核這些寡卞亥苷酸用于木艮據(jù)Innisefa/"(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中根據(jù)生產(chǎn)商說明使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(Finnzymes,cat.#F-531L)。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)639bp片段。所述片段使用QIAquickGdExtmktionKit(Qiagen,cat.#28706)根據(jù)生產(chǎn)商說明進(jìn)行純化。確定P/c/n'acz'/^n'z'FXC7基因的內(nèi)部一部分的DNA序列用Sangere/"/.(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,U.S.A.，74:5463-5467)開發(fā)的雙脫氧鏈終止法確定純化的PCR產(chǎn)物的DNA序列。使用用于PCR擴(kuò)增的引物作為測序引物。DNA測序由Sequiserve(Vaterstetten,Germany)進(jìn)行。得到的序列信息(639bp,相應(yīng)于SEQIDNO:7中的核苷酸995-1633;圖9A)使用CloneManager7軟件(Scientific&EducationalSoftware)翻譯為蛋白質(zhì)，并將得到的氨基酸序列用作模板對(duì)NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行BLASTP檢索。所述檢索鑒別出了漢遜德巴利酵母Yxclp(NCBIaccJXP—457637)，這是在所述數(shù)據(jù)庫中與所述新序列最為相似的蛋白質(zhì)，確認(rèn)了事實(shí)上擴(kuò)增了/^/7&cz/ern71TC7直系同源物的幾部分。擴(kuò)增完整A'c/u'ac/&t//KYC7基因并確定其DNA序列為了確定完整Ac/^cz/err"ZXC7基因(編碼序列、啟動(dòng)子區(qū)和3'-非翻譯區(qū))的DNA序列，之后進(jìn)行反向PCR。得自i^c/n'a"/emYF-60-10ANRRL461031的染色體DNA(300ng)(如實(shí)施例4中所述分離的)用(MBIFermentas，catJER0221)根據(jù)生產(chǎn)商的說明消化過夜，總體積為50pl。消化的DNA用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen,cat.#28106)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。洗脫出的DNA(50jil)用T4DNALigase(NewEnglandBiolabs,catJM0202L)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行過夜連接，總體積為200pl，使用800U的T4DNALigase。連接的DNA用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。2.5nl洗脫液作為模板用于根據(jù)InnisW乂，(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)進(jìn)行的反向PCR反應(yīng)。為此，應(yīng)用靶向尸/c/^"y^r//K￥C7基因已知部分的兩個(gè)寡核苷酸YPCl-IPCR-l-fw:GCTGGATTTGCCATGTTTTCTGC(SEQIDNO:7中的核苷酸1082-1104)YPCl-IPCR-1-rv:酸1044-1020)擴(kuò)增使用PhusiorTHighFidelityPCRMasterMix根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。用此方法可獲得0.3kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit(Qiagen，cat.#28006)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸YPCl-IPCR-l-fW和YPCl-IPCR-1-rv作為測序引物。新獲得的序列信息包括SEQIDNO:7中的核苷酸795-994。無法獲得所述DNA序列的下游新序列信息，因?yàn)?'Dral位點(diǎn)位于緊鄰這一部分的下游(圖9A)。為了獲得尸/c/n'a"y^n7Z^C7基因編碼區(qū)的3'-末端及其3'-非翻譯區(qū)的DNA序列，需要進(jìn)行另一輪反向PCR。因此，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)方案，不同的是用Saw3AI(NewEnglandBiolabs，cat.弁R0169S)消化尸/c/z/a"/ew7染色體DNA和在反向PCR期間使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成)PcYPCl-IP-3-fW:47CATGGTTGGTGGCATDTNTTYACHGG(SEQIDNO:7中的核苷酸1607-1632)PcYPCl-IP-3-rv:CCAGAAAGGAAAATACCAATTCCTTTAATCATTG(SEQIDNO:7中的核苷酸1512-1479)用此方法可獲得0.4kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸PcYPCl-IP-3-fW和PcYPCl-IP-3-rv作為測序引物?？梢垣@得153bp的新序列信息(SEQIDNO:7中的核苷酸1634-1787)，所述序列延伸至3，Dml位點(diǎn)下游的下一個(gè)SmdJI限制位點(diǎn)(圖9B)。為了獲得P/c/2/a"/ew7iTC7上游區(qū)的進(jìn)一步的信息，需要進(jìn)行另一輪反向PCR。因此，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)方案，不同的是用^eMI(MBIFermentas，cat.#ER1261)消化尸/c/2/"染色體DNA和在反向PCR期間使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成)PcYXCl-ds-f\v:GGGGAAACAAGATGATTATGAATTG(SEQIDNO:7中的核苷酸1687-1711)PcYXCl-ds-rv:CTAAACCAGTTAAAACATGCCAC(SEQIDNO:7中的核苷酸1637-1615)用此方法可獲得1.6kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸PcYXCl-ds-fW和PcYXCl-ds-rv作為測序引物?？梢垣@得684bp的新序列信息(SEQIDNO:7中的核苷酸1788-2466)，所述序列延伸至3'^w3AI位點(diǎn)下游的下一個(gè)^eMI限制位點(diǎn)(圖9C)。為了獲得i^/"ac^b777ITC7上游區(qū)的進(jìn)一步的信息，需要進(jìn)行另一輪反向PCR。因此，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)方案，不同的是用JvrII(NewEnglandBiolabs，cat.#R0174S)消化乃'c/2/ac!;/br//染色體DNA和在反向PCR期間使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成)PcYXCl-ds-敏GGAGAGTTCACGTAGTTTAGGAG(SEQIDNO:7中的核苷酸2417-2439)PcYXCl-ds-rv2:苷酸2358-2331)用此方法可獲得大約5.5kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用PCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸PcYXCl-ds-fW2作為測序引物。可以獲得937bp的新序列信息(SEQIDNO:7中的核苷酸2467-3402)(圖9D)。為了獲得Ac/n'aci/ew"下游區(qū)的進(jìn)一步的信息，需要進(jìn)行另一輪反向PCR。因此，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)方案，不同的是用(MBIFermentas,cat弁ER1281)消化尸/c/w'aci/^r//染色體DNA和在反向PCR期間使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成)PcYXCl-us-fW:GGATAATCAGTTTACCATCAAAAG(SEQIDNO:7中的核苷酸831-854)PcYXCl-us畫rv:苷酸830-803)用此方法可獲得大約4.0kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述分為幾個(gè)部分確定，其中使用寡核苷酸PcYXCl-us-rv作為測序引物?？梢垣@得794bp的新序列信息(SEQIDNO:7中的核苷酸1-794)(圖9E)。使用所描述的六步方法，可以分離總長為3402bp的尸/c/z/fl";/br"基因座，并且可以確定其DNA序列(參見SEQIDNO:7和圖9)。如圖9F所示的巧c/2/a"/em'!'KTJ基因座編碼長度為284個(gè)氨基酸的戶/c/n'""y^T77Yxclp蛋白(SEQIDNO:8)。P/c/z/ac^m'/Yxclp分別與從漢遜德巴利酵母(GenBankacc.#XP一457637)和釀酒酵母(GenBankacc.#NP—015238)推斷的神經(jīng)酰胺酶具有61%(75%)和46%(66%)的氨基酸位置相同性(相似性)。來自釀酒酵母的Ydclp蛋白已經(jīng)被生化鑒定并示出顯示體內(nèi)神經(jīng)酰胺酶活性(Maoetal"TheJournalofBiologicalChemistry,275:31369-31378)。實(shí)施例8d&m7鞘脂A8去飽和酶基因的克隆和核苷酸序列的確定擴(kuò)增尸/cfe'ad,gm7鞘脂A8去飽和酶基因的內(nèi)部一部分首先，通過用棉桃阿舒氏囊霉鞘脂A8去飽和酶基因(GenBankacc.#AAS53293)作為模板進(jìn)行TBLASTN檢索，從完全的和未完成的真核基因組的NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom—table.cgi)中提取酵母菌亞門物種的推斷的鞘脂A8去飽和酶的氨基酸序列。這個(gè)蛋白質(zhì)與已鑒定的乳酸克魯維酵母鞘脂A8去飽和酶非常相似(氨基酸位置相同性分別是65%和59°/。XTakakuwae/fl/.,2002)，因此很可能具有鞘脂A8去飽和酶活性。所提取的序列(全部條目E-值<7x10—121)使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)進(jìn)行排列對(duì)比。用于擴(kuò)增尸/c/z/ac^m7鞘脂A8去飽和酶基因的內(nèi)部一部分的合適的寡核苷酸通過反翻譯鞘脂A8去飽和酶序列內(nèi)部的氨基酸高度保守片段產(chǎn)生(考慮尸/c/zffl"ybr//密碼子使用的高度偏性)。之后由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成如下寡核苷酸D8DES-fw:5，-GATGCWACHGATGAAATGMAYGCWTAYC-3，(SEQIDNO:5中的核苷酸2439-2466)D8DES-rv:5,-TTGRAATTGYAAACCACCRTGNAARAAATCYAACC畫3，(SEQIDNO:5中的核苷酸3839-3805)這些寡核苷酸用于豐艮據(jù)Innis"a/"(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990，AcademicPress)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中根據(jù)生產(chǎn)商說明50使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(Finnzymes,cat.#F-531L)。通過進(jìn)行此方法可以得到一個(gè)1401bp片段。所述片段使用QIAquickGelExtraktionKit(Qiagen，cat.#28706)根據(jù)生產(chǎn)商說明進(jìn)行純化。確定尸z'c/n'ac//br"SD^S基因的內(nèi)部一部分的DNA序列用Sangera/.(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,U.S.A.,74:5463-5467)開發(fā)的雙脫氧鏈終止法確定純化的PCR產(chǎn)物的DNA序列。使用用于PCR擴(kuò)增的引物作為測序引物。DNA測序由S叫uiserve(Vaterstetten，Germany)進(jìn)行。得到的序列信息(1401bp,相應(yīng)于SEQIDNO:5中的核苷酸2439-3839;圖IOA)使用CloneManager7軟件(Scientific&EducationalSoftware)翻譯為蛋白質(zhì)，并將得到的氨基酸序列用作模板對(duì)NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行BLASTP檢索。所述檢索鑒別出了乳酸克魯維酵母鞘脂A8去飽和酶(NCBIaccJXP—454832)，這是在所述數(shù)據(jù)庫中與所述新序列最為相似的蛋白質(zhì)，確認(rèn)了事實(shí)上擴(kuò)增了編碼鞘脂A8去飽和酶的尸/cWac^,"7直系同源物的幾部分。擴(kuò)增完整戶/c/n'ac//^T//鞘脂A8去飽和酶基因并確定其DNA序列為了確定完整尸/c/z/""/ern7鞘脂A8去飽和酶基因(編碼序列、啟動(dòng)子區(qū)和3'-非翻譯區(qū))的DNA序列，之后進(jìn)行反向PCR。得自尸/c/n'""y^r//F-60-10ANRRL1031的染色體DNA(300ng)(如實(shí)施例4中所述分離的)用/f;^CH4V(NewEnglandBiolabs,cat.#R0620S)根據(jù)生產(chǎn)商的說明消化過夜，總體積為50^。消化的DNA用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen,cat.#28106)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。洗脫出的DNA(50pl訴T4DNALigase(NewEnglandBiolabs，cat.弁M0202L)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行過夜連接，總體積為200pl，使用800U的T4DNALigase。連接的DNA用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。2.5pl洗脫液作為模板用于根據(jù)Innisa/.,(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990，AcademicPress)進(jìn)行的反向PCR反應(yīng)。為此，應(yīng)用靶向Pz'c/w'a"j^W/鞘脂△8去飽和酶基因已知部分的兩個(gè)寡核苷酸51D8DES-IPCR-l-fW中的核苷酸2553-2577)D8DES-IPCR-l-rv:中的核苷酸2552-2527)擴(kuò)增使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。用此方法可獲得0.6kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit(Qiagen,cat.#28006)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸D8DES-IPCR-l-fW和D8DES-IPCR-l-rv作為測序引物。新獲得的序列信息包括SEQIDNO:5中的核苷酸2142-2438。為了獲得編碼乃'c/^">m7鞘脂A8去飽和酶的基因的上游區(qū)進(jìn)一步的信息，需要進(jìn)行另一輪反向PCR。因此，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)方案，不同的是用Rpl(MBIFermentas，catJER0911)消化P/c/z/a">/t//染色體DNA和在反向PCR期間使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成)PcD8DIPCR-US-fw:GGGTCCTGTTGAAAAAAGCTAGG(SEQIDNO:5中的核苷酸2229-2251)PcD8DIPCR-US-rv:CCAACTGCTGGTTCACCAAAATAG(SEQIDNO:5中的核苷酸2211-2188)用此方法可獲得大約3.4kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸PcDSDIPCR-US-fW、PcD8DIPCR-US-rv、DB6-PcD8D-us-fw2:TTAAATGGTATTTCCTTAGTGC(SEQIDNO:5中的核苷酸3109-3130)和DB6畫PcD8D-us-rv2:GATTCATCTTCCATTATCATCTC(SEQIDNO:5中的核苷酸1343-1321)作為測序引物?？梢垣@得2141bp的新序列信息(SEQIDNO:5中的核苷酸1-2141)，所述序列延伸至3，F(xiàn)印I位點(diǎn)上游的下一個(gè)Rpl限制位點(diǎn)(圖IOB)。無法獲得所述DNA序列的下游新序列信息，因?yàn)?'R/7l位點(diǎn)位于緊鄰這一部分的下游(圖IOB)。為了獲得編碼/^/^c^m7鞘脂A8去飽和酶的基因編碼區(qū)的3'-末端及其3'-非翻譯區(qū)的DNA序列的進(jìn)一步信息，需要進(jìn)行另一輪反向PCR。因此，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)方案，不同的是用(MBIFermentas，catJER1281)消化P/c/nh"/^r//染色體DNA和在反向PCR期間使用如下寡核苷酸(由MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成)PcD8D-ds-fW:酸3769-3793)PcD8D畫ds-rv:CTTTCTGAAGTTCCTAAATCTG(SEQIDNO:5中的核苷酸3754-3733)用此方法可獲得大約1.8kbpPCR產(chǎn)物。所述片段使用MinElutePCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。這個(gè)片段的DNA序列如前述確定，其中使用寡核苷酸PcD8D-ds-^v和PcD8D-ds-rv作為測序引物?？梢垣@得1312bp的新序列信息(SEQIDNO:5中的核苷酸3840-5106)，所述序列延伸至3'Rpl位點(diǎn)下游的下一個(gè)限制位點(diǎn)(圖10C)。無法獲得所述DNA序列的下游新序列信息，因?yàn)?，K^I位點(diǎn)位于緊鄰這一部分的下游(圖10B)。使用所描述的四步方法，可以分離總長為5106bp的P/c/wh編碼鞘脂A8去飽和酶的基因座，并且可以確定其DNA序列(參見SEQIDNO:5和圖10)。如圖10D所示的尸fc/^"/em7基因座編碼長度為597個(gè)氨基酸的尸/c/z/a鞘脂A8去飽和酶Pc8Desp蛋白(SEQIDNO:6)。Pc8Desp尸&/7&"/e/r"鞘脂A8去飽和酶分別與從乳酸克魯維酵母(GenBankaccJXP一454832)和漢遜德巴利酵母(GenBankaccJXP一46161l)的鞘脂A8去飽和酶具有62%(74%)和57%(70%)的氨基酸位置相同性(相似性)。來自乳酸克魯維酵母的鞘脂A8去飽和酶8Desp蛋白已經(jīng)被生化鑒定并示出顯示體內(nèi)鞘脂A8-Delta(8)鞘脂去飽和酶活性(Takakuwada/.,CurrentMicrobiology,45:459-461)。實(shí)施例9同時(shí)過量產(chǎn)生戶/c/z/adfg,T//的酶Laglp、Laflp禾口Deslp的尸/c/n'oc//^n'i突變株的構(gòu)建為了構(gòu)建過表達(dá)乃'c/z/acz/ern7的酶Laglp、Laflp和Deslp的丁香霉素E抗性突變株，我們首先構(gòu)建了整合DEW表達(dá)載體。為此目的，用P/c/z/acz/ern'z'F-60-1OANRRL1031的染色體DNA(200ng)(如實(shí)施例4中所述分離的)作為模板根據(jù)Innis"fl/.(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)進(jìn)《亍PCR以擴(kuò)增c^rn73-磷酸甘油醛脫氫酶(7Di^)的啟動(dòng)子區(qū)。為此應(yīng)用如下寡核苷酸pGAP-Bgin-for:5'-TATATAAGATCTGTGGTACCTACATACAATTGACCC-3'(在5'-末端包含Sg/II識(shí)別序列)pGAP-NcoI-rev:5'-TATATACCATGGTTAATTAATTATTTGTTTGTTTG-3'(在5'陽末端包含AfeoI識(shí)別序列)。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。之后用Bg/II和臉o1(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物得到一個(gè)575bp片段，將此片段連接進(jìn)分別切割的pAG25(Goldstein"ThreenewdominantgenedisruptioncassettesforgenedisruptionSacc/wram少cascerev/由e，1999，Yeast)，生成具有融合至"加7的Pci/^r//的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(7D//3)的啟動(dòng)子區(qū)的載體pTH-GAP-natl(3892bp)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了將基因間間隔區(qū)作為整合位點(diǎn)插入進(jìn)載體中，將乃'c/n'a"/wn7核糖體RNA操縱子的5S-26SrDNA基因間間隔區(qū)(intergenicspacer,IS)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其中用P/c/n'a"/e〃力'F-60-10ANRRL1031的染色體DNA(200ng)作為模板并使用如下寡核苷酸pIS-Ndel國for:(在5'-末端包含AWeI識(shí)別序列)pIS-Ndel-rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG-3'(在5'-末端包含7V血I識(shí)別序列)所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。之后用M&I(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化載體pTH-GAP-natl和PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行連接，生成載體pTH-GAP-natl-IS2(4864bp)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法進(jìn)行。為了插入單一i^el識(shí)別位點(diǎn)以使載體pTH-GAP-natl-IS2線性化，將整合進(jìn)pTH-GAP-natl-IS2的尸/c/n'acz/en'/z'核糖體RNA操縱子的5S-26SrDNA基因間間隔區(qū)(IS)的兩個(gè)片段通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其中用載體pTH-GAP-natl-IS2作為模板。片段1用如下寡核苷酸擴(kuò)增pIS-Ndel-rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG-3'(在5'-末端包含TV^I識(shí)別序列)Pmel-rv:55TCAAATC-3'(在5'-末端包含與PmeI-fW-寡核苷酸互補(bǔ)的21bp序列和尸mel識(shí)別序列)片段2用如下寡核苷酸擴(kuò)增p-IS掘el陽for:(在5'-末端包含識(shí)別序列)Pmel-fw:5,TTAAACTTAGTGGATGGGAAACCCTGTAGAACTGGGACAAAC-3'戶萬述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得片段1和2的融合體，其中用兩個(gè)初級(jí)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)作為模板并使用寡核苷酸p-IS-Ndel-for:(在5'-末端包含AWeI識(shí)別序列)pIS-Ndel-rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG-3'(在5'-末端包含^^1識(shí)別序列)產(chǎn)生一個(gè)在兩端都具有7Wfel識(shí)別序列，并且在中間具有戶mel識(shí)別序列的978bp片段。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。用AWeI(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach，Germany的說明)切割PCR產(chǎn)物和載體pTH-GAP-natl-IS2。進(jìn)行連接以產(chǎn)生載體pTH-GAP-natl-IS2-Pmel(4879bp)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了引入/^/^cz/wn'/丙酮酸脫氫酶A亞基基因CPZM7)的啟動(dòng)子區(qū)控制下的~/^777D￡S7基因，用尸/c/7/acz/^r"F-60-1OANRRL1031的染色體DNA(200ng)作為模板PCR擴(kuò)增Z^W基因，其中使用如下寡核苷酸DESl-fw:CTTTATTATCAATGGCTACAATTACACATAGAAAAAACCCTTCACAAC-3'(在5'-末端包含與PDAl-rv寡核苷酸互補(bǔ)的50個(gè)堿基的序列)DESl-rv:5'-TATACTGCAGGCATATTGTCAATTCTATTGTACTTGAGTATTAATGATTA-3'(在5'-末端包含尸M識(shí)別序列)相應(yīng)地?cái)U(kuò)增Pz'c/nVicz/en^丙酮酸脫氫酶A亞基基因(Prt47)的啟動(dòng)子區(qū)，其中使用如下寡核苷酸PDAl-fV:5'-TATACTGCAGTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTCGCGACG-3'(在5'-末端包含尸WI識(shí)別序列)PDAl-rv:TGGAACTTCTA隱3'所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得DEW基因和Pn4/啟動(dòng)子區(qū)的融合體，其中使用包含Ac/n'aci/brz7Z)五S7基因和啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PDAl-fW:5'-TATACTGCAGTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTCGCGACG-3'(在5'-末端包含i^I識(shí)別序列)57DESl-rv:5'-TATACTGCAGGCATATTGTCAATTCTATTGTACTTGAGTATTAATGATTA-!3'(在5'-末端包含尸Wl識(shí)別序列)用此方法可獲得2.2kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶i^I(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach，Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)尸Wl切割的載體pTH-GAP-natl-IS2-Pmel以產(chǎn)生載體pTH/DB-002a.l。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了用放線菌酮賦予的抗性盒取代諾爾絲菌素(nourseothricin)抗性盒，用5*acl和&/I(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化載體pTH/DB隱002a.1。用QIAquickGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明凝膠純化不含有諾爾絲菌素抗性盒的5667bp載體骨架。為了產(chǎn)生放線菌酮賦予的抗性盒，通過PCR擴(kuò)增兩個(gè)片段，其中使用尸Zc/zz'a"7^tz7F-60-10ANRRL1031的基因組DNA作為模板片段1用如下寡核苷酸擴(kuò)增PcL41-SalI-fw:5'畫TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)PcL41-internal-rv:5'"AGCTTTTTTATGGAAAACTtGTTTGGTTTGACCACCGTAACCGG-3'(在5'-末端包含與PcL41-intemal-lW-寡核苷酸互補(bǔ)的49bp序列，插入一個(gè)點(diǎn)突變(C變?yōu)锳)以將L41p的aa56從脯氨酸取代為谷氨酰胺以賦予放線菌酮抗性)片段2用如下寡核苷酸擴(kuò)增58PcL41-intemal-fw:AAGCTAAAACTACCAAAAAAGTTGTTTTACG-3'PcL41-SacI-rv:5'-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3'(在5'-末端包含&/I識(shí)別序列)所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得所述兩個(gè)片段的融合體，兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物lOng)和寡核苷酸PcL41-SalI-fw:5'-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3'(在5'-末端包含SWI識(shí)別序列)PcL41-SacI-rv:5'-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)所得到的1.9kbp片段使用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶5WI和(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)載體？111/08-002&.1(見上述)的5667bp載體骨架以產(chǎn)生載體pDB007。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了引入戶勵(lì)&"/wn'z'3-磷酸甘油醛脫氫酶同工酶1(7D/i7)的啟動(dòng)子區(qū)控制下的Pz'c/n'acz/em'/^4F7基因，用Pi'c/z/ac!/en^'F-60-10ANRRL1031的染色體DNA(200ng)作為模板PCR擴(kuò)增ZJ^7基因，其中使用如下寡核苷酸PcLAGl教59CTTCAACAAATTCATCATC-3'(在5'-末端包含與PGAP-rv-寡核苷酸互補(bǔ)的29個(gè)堿基的序列)PcLAGl-rv:5'-CAGACAAGTTTAATATAGATACTTAAAC-3'相應(yīng)地?cái)U(kuò)增朽c/z/acybr//3-磷酸甘油醛脫氫酶同工酶1基因(7///)的啟動(dòng)子區(qū)，其中使用如下寡核苷酸PGAP-Sbfl:5'-末端包含幼/I識(shí)別序列)PGAP-rv:5'-CATTGTTAATTAATTATTTGTTTGTTTGTTTG-3'所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得i^^7基因和啟動(dòng)子區(qū)的融合體，其中使用包含P/c/zz'ac^w7丄v4^7基因和77)^7啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物lOng)和寡核苷酸PGAP-Sbfl:5'-TATATACCTGCAGGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3'(在5'-末端包含幼yi識(shí)別序列)PcLAGl-rv:5'-CAGACAAGTTTAATATAGATACTTAAAC-3'用此方法可獲得1.9kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)Sa/I(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的說明)消化、之后用DNAPolymeraseI(根據(jù)生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)進(jìn)行Klenow填充并用幼/I(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的說明)消化的載體pDB007，生成載體pPC-DESl-PcLAFl。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了引入尸/c/z/a">/777丙酮酸脫氫酶A亞基基因(尸DJ/)的啟動(dòng)子區(qū)控制下的尸/c/7/aci/^T//丄^G7基因，用尸/c/n'a"/e7T"F-60-1OANRRL1031的染色體DNA(200ng)作為模板PCR擴(kuò)增WG7基因，其中使用如下寡核苷酸PcLACl-f\v:ATGTCCACTTCCAGACCACAG-3'(在5'-末端包含與PPDA-rv-寡核苷酸互補(bǔ)的39個(gè)堿基的序列)PcLACl-BsiWI-rv:5'-TATACGTACGTGGTACATACGATATAATCCATGTAG畫3'(在5'-末端包含萬w'WI識(shí)別序列)相應(yīng)地?cái)U(kuò)增尸/c/^c^〃力'丙酮酸脫氫酶A亞基基因(尸A4/)的啟動(dòng)子區(qū)，其中使用如下寡核苷酸PPDA-BsiWI-fW-new:5'-TATACGTACGGACGCACCGGCCATTTTCAAAC-3'(在5'-末端包含&AVI識(shí)別序列)PPDA-rv:TTC-3'所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得WG/基因和戶D^啟動(dòng)子區(qū)的融合體，其中使用包含P/c/w'fl"/wr//Z^4G7基因和尸IM7啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PPDA-BsiWI-fw-new:5'-TATACGTACGGACGCACCGGCCATTTTCAAAC-3'(在5'-末端包含^AVI識(shí)別序列)PcLACl-BsiWI-rv:5'畫TATACGTACGTGGTACATACGATATAATCCATGTAG-3'(在5'-末端包含3WWI識(shí)別序列)用此方法可獲得2.2kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)切割的載體pPC-DESl-PcLAFl產(chǎn)生載體pPC-DESl-PcLAFl-PcLAGl(示于圖12)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。載體pPC-DES1-PcLAFl-PcLAGl用Pmel(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)線性化，之后用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。實(shí)施例10在丁香霉素E抗性尸/c/z/flc/Z^n7突變株中同時(shí)過量產(chǎn)生Ac/z/flczy^n7的酶Deslp和Laflp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、和小鼠堿性神經(jīng)酰胺酶的質(zhì)粒的構(gòu)建為了構(gòu)建過表達(dá)乃'c/z/a"/wW/的酶Deslp和Laflp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、和密碼子優(yōu)化形式的小鼠堿性神經(jīng)酰胺酶的丁香霉素E抗性突變株，首先設(shè)計(jì)了整合DEW表達(dá)載體。為此目的，用戶/c/n'a"/e〃"F-60-10ANRRL1031的染色體DNA200ng作為模板根據(jù)Innisefa/.(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)進(jìn)行PCR以擴(kuò)增Pcz/en^'3-磷酸甘油醛脫氫酶(7D/f7)(GenBank編號(hào)#AF053300)的啟動(dòng)子區(qū)。為此應(yīng)用如下寡核苷酸pGAP-BglII-for:5'-TATATAAGATCTGTGGTACCTACATACAATTGACCC-3'(在5'-末端包含^g/n識(shí)別序列)pGAP-NcoI-rev:5'-TATATACCATGGTTAATTAATTATTTGTTTGTTTG隱3'(在5'-末端包含7VcoI識(shí)別序列)。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。之后用&/11和羨01(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物得到一個(gè)575bp片段，將此片段連接進(jìn)分別切割的pAG25(Goldstein"a/.，Threenewdominantgenedisruptioncassettesforgenedisruptionz'w(Sacc/wrawycescereWw'ore,1999，Yeast)產(chǎn)生具有融合至"W/的Pcz/wn7的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(7Di^)啟動(dòng)子區(qū)的載體pTH-GAP-natl(3892bp)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了將核糖體rDNA基因間間隔區(qū)作為整合位點(diǎn)插入進(jìn)所述載體中，將尸/c/n'a"/em7核糖體RNA操縱子的5S-26SrDNA基因間間隔區(qū)(IS)(GenBank編號(hào)#AF053301)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其中用尸/c&a"y^r"F-60-10ANRRL1031的染色體DNA(200ng)作為模板并使用如下寡核苷酸pIS-NdeI-for:5'-TATATACATATGCTAATCACAACAGAACATTCTCTAACG-3'(在5'-末端包含Mfel識(shí)別序列)pIS-Ndel陽rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG匿3'(在5'-末端包含Mfel識(shí)別序列)。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。63用iV&I(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)消化載體pTH-GAP-natl和PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行連接，產(chǎn)生載體pTH-GAP-natl-IS2(4864bp)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了插入單一尸,l識(shí)別序列以使載體pTH-GAP-natl-IS2線性化，將整合進(jìn)pTH-GAP-natl-IS2的P/c/w'a"/e/r"核糖體RNA操縱子(GenBank編號(hào)#AF053301)的5S-26SrDNA基因間間隔區(qū)(IS)的兩個(gè)片段通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其中用載體pTH-GAP-natl-IS2作為模板。片段1用如下寡核苷酸擴(kuò)增pIS-Ndel-rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG-3'依5'-末端包含iV^I識(shí)別序列)Pmel-rv:TCAAATC-3'(在5'-末端包含與PmeI-fW-寡核苷酸互補(bǔ)的21bp序列和PmeI識(shí)別序列)。片段2用如下寡核苷酸擴(kuò)增p-IS-Ndel-for:5'-TATATACATATGCTAATCACAACAGAACATTCTCTAACG-3'(在5'-末端包含M/el識(shí)別序列)Pmel-fw:5'-TGTTTAAACTTAGTGGATGGGAAACCCTGTAGAACTGGGACAAAC-3'。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得片段1和2的融合體，其中用兩個(gè)初級(jí)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物lOng)作為模板并使用寡核苷酸p-IS-Ndel-for:(在5'-末端包含iV&I識(shí)別序列)pIS-Ndel-rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)。產(chǎn)生一個(gè)在兩端都具有AWeI識(shí)別序列，并且在中間具有Pmel識(shí)別序列的978bp片段。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。用M/el(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)切割PCR產(chǎn)物和載體pTH-GAP-natl-IS2。進(jìn)行連接以產(chǎn)生載體pTH-GAP-natl-IS2-Pmel(4879bp)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了引入尸/c/n'flc^rn7丙酮酸脫氫酶A亞基基因(尸A47)的啟動(dòng)子區(qū)(SEQIDNO:27)控制下的P/c/z/acz/em7D五S7基因(SEQIDNO:26)，用尸/c/n'aczy^r"F-60-10ANRRL1031的染色體DNA(200ng)作為模板PCR擴(kuò)增D五57基因(SEQIDNO:26)，其中使用如下寡核苷酸DESl-fW:CTTTATTATCAATGGCTACAATTACACATAGAAAAAACCCTTCACAAC-3'(在5'-末端包含與PDAl-rv-寡核苷酸互補(bǔ)的50bp序列)DESl-rv:5'-TATACTGCAGGCATATTGTCAATTCTATTGTACTTGAGTATTAATGATTA-3'(在5'-末端包含戶M識(shí)別序列)。相應(yīng)地?cái)U(kuò)增尸/c/h'"c7/e/r//丙酮酸脫氫酶A亞基基因(尸ZX47)的啟動(dòng)子區(qū)(SEQIDNO:27)，其中使用如下寡核苷酸:PDAl-fW:5'-TATACTGCAGTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTCGCGACG-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)PDAl-rv:TGGAACTTCTA-3'o所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得Z^57基因和尸^47啟動(dòng)子區(qū)的融合體，其中使用包含P/c/z/ocz/e/r/z'Z)^S7基因和PA47啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PDA1務(wù)5'-TATACTGCAGTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTCGCGACG-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)DESl隱rv:ATTAATGATTA-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)。用此方法可獲得2.2kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶尸WI(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach，Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)尸Wl切割的載體pTH-GAP-natl-IS2-Pmel以產(chǎn)生載體pTH/DB-002a.l。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了用放線菌酮抗性盒取代諾爾絲菌素(nourseothricin)抗性盒，用和(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)消化載體pTH/DB-002a.1。用QIAquickGel66ExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明凝膠純化不含有諾爾絲菌素抗性盒的5667bp載體骨架。為了產(chǎn)生放線菌酮抗性盒，通過PCR擴(kuò)增尸/c/z^"ybT"￡4/基因(GenBank編號(hào)#AF053457)的兩個(gè)片段，其中使用尸fc/n'a"/ern7F-60-10ANRRL1031的基因組DNA作為模板片段1用如下寡核苷酸擴(kuò)增PcL41-Sa11-fw:5'-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3'(在5'-末端包含&/I識(shí)別序列)PcL41-internal-rv:CCGTAACCGG-3'(在5'-末端包含與PcL41-intemal-fSv-寡核苷酸互補(bǔ)的49bp序列，插入一個(gè)點(diǎn)突變(C變?yōu)锳)以將L41p的aa56從脯氨酸取代為谷氨酰胺以賦予放線菌酮抗性)。片段2用如下寡核苷酸擴(kuò)增:PcL41-internal-fw:AAGCTAAAACTACCAAAAAAGTTGTTTTACG-3'PcL41-SacI-rv:5'-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3'(在5'-末端包含^/I識(shí)別序列)。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得所述兩個(gè)片段的融合體，兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PcL41-SalI隱fW:5'-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3'(在5'-末端包含&/I識(shí)別序列)67PcL41-Sacl-rv:5'-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3'(在5'-末端包含&cl識(shí)別序列)。所得到的1.9kbp片段使用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶和^cl(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)載體pTH/DB-002a.1(見上述)的5667bp載體骨架以產(chǎn)生載體pDB007。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法進(jìn)行。為了引入尸/c/n'a3-磷酸甘油醛脫氫酶同工酶1(77)//7)的啟動(dòng)子區(qū)(GenBank編號(hào)#AF053300)控制下的棉桃阿舒氏囊霉基因(SEQIDN0:13)，用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895的染色體DNA(200ng)作為模板PCR擴(kuò)增^^7基因(SEQIDNO:13)，其中使用如下寡核苷酸AgLAGHAAGTCAGGCAG-3'(在5'-末端包含與PGAP-rv-寡核苷酸互補(bǔ)的32個(gè)堿基的序列)AgLAGl陽rv:5'-CATTACCGATCACCAGGTAGG-3'。相應(yīng)地?cái)U(kuò)增P/c/7/a3-磷酸甘油醛脫氫酶同工酶1基因(r/)i^)的啟動(dòng)子區(qū)(GenBank編號(hào)#AF053300)，其中使用如下寡核苷酸PGAP-Sbfl:5'-TATATACCTGCAGGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3'(在5'-末端包含S6yi識(shí)別序列)PGAP-rv:5'-CATTGTTAATTAATTATTTGTTTGTTTGTTTG畫3'。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得Z^F/基因和7D//7啟動(dòng)子區(qū)的融合體，其中使用包含棉桃阿舒氏囊霉L4F7基因和尸Zc/2/ac^廳"rD///啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PGAP-SbfI:5'-TATATACCTGCAGGTTACCCAGTGGTACCTACATAC隱3'(在5'-末端包含幼^1識(shí)別序列)AgLAGl-rv:5'-CATTACCGATCACCAGGTAGG匿3'。用此方法可獲得1.8kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶幼/1(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)化/I(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)消化、之后用DNAPolymeraseI的Klenow片段(根據(jù)生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)進(jìn)行Klenow填充并用幼"(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化的載體pDB007，生成載體pPC-DESl-AgLAFl。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法進(jìn)行。為了引入尸/c/h'""y^t77丙酮酸脫氫酶A亞基基因(尸ZM/)的啟動(dòng)子區(qū)(SEQIDNO:27)控制下的棉桃阿舒氏囊霉Z^C^基因(SEQIDNO:ll)，用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895的染色體DNA(200ng)作為模板PCR擴(kuò)增Z^G7(SEQIDNO:ll)基因，其中使用如下寡核苷酸AgLACl-fW:ATGGCTGAAAATTCGTTATTGAAGCCAC-3'(在5'-末端包含與PPDA-rv-寡核苷酸互補(bǔ)的42個(gè)堿基的序列)AgLACl-BsiWI-rv:5'-TATACGTACGGTGTAATGGCGGTGGAACAC-3'(在5'-末端包含Bw'WI識(shí)別序列)。相應(yīng)地?cái)U(kuò)增P/c/n'ac^br/!'丙酮酸脫氫酶A亞基基因(PZM7)的啟動(dòng)子區(qū)(SEQIDNO:27)，其中使用如下寡核苷酸PPDA-BsiWI-fw-new:5'-TATACGTACGGACGCACCGGCCATTTTCAAAC陽3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)PPDA-rv:TTC-3'。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得Z^G7基因和戶A4/啟動(dòng)子區(qū)的融合體，其中使用包含棉桃阿舒氏囊霉Z^4G7基因和P/c/z/aay^r"啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PPDA陽BsiWI-fw-new:5'-TATACGTACGGACGCACCGGCCATTTTCAAAC-3'(在5'畫末端包含識(shí)別序列)AgLACl-BsiWI誦rv:5'-TATACGTACGGTGTAATGGCGGTGGAACAC-3'(在5'-末端包含^/WI識(shí)別序列)。用此方法可獲得2.1kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶5w'WI(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商:NewEnglandBiolabs,Schwalbach，Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)切割的載體pPC-DESl-AgLAFl產(chǎn)生載體pPC-DESl-AgLAFl-AgLAGl(示于圖11)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。載體pPC-DESl-AgLAFl-AgLAGl用尸mel(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的說明)線性化，之后用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。另外，構(gòu)建了包含P/c/n'ac^rn7LAF1基因和為了在乃'c/n'ac!ybr"中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子優(yōu)化形式的小鼠堿性神經(jīng)酰胺酶的第二載體。為此目的，用100ngFirstChoicePCR-Ready小鼠腎cDNA(Ambion，Inc.,Austin,TX，U.S.A.)作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增堿性小鼠神經(jīng)酰胺酶的開放讀框(mC五7)(GenBank編號(hào)弁AF347023)。因此，應(yīng)用如下寡核苷酸mCER-fW:CGGGCACCAG-3'(在5'-末端包含與寡核苷酸PGAP-rv互補(bǔ)的32個(gè)堿基的序列)mCER-rv:TTGTCATTCTC-3'(在5'-末端包含與寡核苷酸TENO-f\v互補(bǔ)的29個(gè)堿基的序列)。相應(yīng)地?cái)U(kuò)增i^/nh"y^n73-磷酸甘油醛脫氫酶同工酶1基因(7P/7/)的啟動(dòng)子區(qū)(GenBank編號(hào)#AF053300),其中使用如下寡核苷酸PGAP-Sbfl:5'-TATATACCTGCAGGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)PGAP-rv:5'-CATTGTTAATTAATTATTTGTTTGTTTGTTTG-3'。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。71最后，通過進(jìn)行PCR獲得wC^基因和7D///啟動(dòng)子區(qū)的融合體，其中使用包含小家鼠(Mwsmwcw/M力C五/基因和/^/z^"/e/r"rD///啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PGAP-Sbfl:5'-TATATACCTGCAGGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3'(在5'-末端包含^^yi識(shí)別序列)mCER-rv:TTGTCATTCTC-3'(在5'-末端包含與寡核苷酸TENCMV互補(bǔ)的29個(gè)堿基的序列)。用此方法可獲得1.4kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。為了將乃'c/^"/ern7的烯醇化酶基因CSV07)終止子區(qū)(SEQIDNO:28)與前述擴(kuò)增的構(gòu)建體融合，首先使用如下寡核苷酸擴(kuò)增fiV6^的終止子區(qū)TENO勘5'隱ATTTAGCTTCGGTGCTTTCCTATATAACG-3'TENO-fw-Sbfl:(在5'-末端包含幼yi識(shí)別序列》所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得rD/^/啟動(dòng)子區(qū)控制下的wC五W基因和￡iV(97終止子區(qū)的融合體，其中使用兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PGAP畫Sbfl:5'-TATATACCTGCAGGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3'(在5'-末端包含6*6/1識(shí)別序列)TENO畫fV-Sbfl:5'-TATATACCTGCAGGTTATAACGGTTGGGCAATGTTGAG-3'(在5'-末端包含S^/I識(shí)別序列)。用此方法可獲得1.8kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach，Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)幼yi切割的載體pDB007以生成載體pPC-DESl-mCER。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了用諾爾絲菌素抗性盒取代放線菌酮抗性盒，用和(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化載體pPC-DESl-mCER。用QIAquickGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明凝膠純化不含有放線菌酮抗性盒的7403bp載體骨架。為了產(chǎn)生諾爾絲菌素賦予的抗性盒，通過PCR擴(kuò)增三個(gè)片段。首先，擴(kuò)增為了在AW^"/e,T"'中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子優(yōu)化形式的賦予諾爾絲菌素抗性的"a"基因(SEQIDNO:29)，其中使用GeneartGmbH(Regensburg,Germany)提供的載體pPCR-Script-natl作為模板，使用寡核苷酸opt-natl-fw:ATAC-3'(在5'-末端包含與寡核苷酸PPDA-rv互補(bǔ)的23個(gè)堿基的序列)opt-natl-rv:5,TTTTATTGTCAGTACTGATTATTATGGACATGGCATTGAC-3'(在5'-末端包含與寡核苷酸T-TEF-fW互補(bǔ)的21個(gè)堿基的序列)。相應(yīng)地?cái)U(kuò)增/^/n'flcz/e/r//丙酮酸脫氫酶A亞基基因(戶ZI^)的啟動(dòng)子區(qū)(SEQIDNO:27)，其中使用如下寡核苷酸73PPDA-SalI扁fw:5'-TATGTCGACTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTC-3'(在5'-末端包含S"/I識(shí)別序列)PPDA-rv:TTC-3'。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR獲得密碼子優(yōu)化的"W7基因和戶A47啟動(dòng)子區(qū)的融合體，其中使用包含基因和尸/c/2/a^:/^n7戶A42啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PPDA-SalIL5'-TATGTCGACTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTC-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)opt-natl-rv:5'-TCTTTTTATTGTCAGTACTGATTATTATGGACA丁GGCATTGAC-3'(在5'-末端包含與寡核苷酸T-TEF-fW互補(bǔ)的21個(gè)堿基的序列)。用此方法可獲得1.3kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。為了將棉桃阿舒氏囊霉TEF終止子區(qū)與前述擴(kuò)增的構(gòu)建體融合，用棉桃阿舒氏囊霉ATCC19895的染色體DNA(200ng)作為模板PCR擴(kuò)增棉桃阿舒氏囊霉TEF終止子區(qū)(GenBank編號(hào)#A29820),其中使用如下寡核苷酸T-TEF-fW:5'-TCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTG-3'T-TEF-SacI-rv:5'-TGAGCTCTCGACACTGGATGGCGGCGTTAG-3'(在5'-末端包含&d識(shí)別序列)。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得乃'c/n'ac^m7尸A4/啟動(dòng)子控制下na7基因和棉桃阿舒氏囊霉r￡F終止子區(qū)的融合體，其中使用兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸PPDA-SalI-fW:5'-TATGTCGACTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTC-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)T-TEF-SacI-rv:5'-TGAGCTCTCGACACTGGATGGCGGCGTTAG-3'(在5'-末端包含&cl識(shí)別序列)。所得到的1.5kbp片段使用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。接下來用限制性核酸內(nèi)切酶和(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)載體pPC-DESl-mCER(見上述)的7403bp載體骨架以產(chǎn)生載體p-PC-DESl-mCER-natl。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了用為在"/wn7中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子優(yōu)化形式的基因(omC五及)取代mC五7基因，用Pad和(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)消化載體pPC-DESl-mCER-natl。用QIAquickGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明凝膠純化不含有wC￡i和基因的5514bp載體骨架。為了引入具有c7/m7'z'SVO/基因的終止子區(qū)的小家鼠omC￡i基因，用GeneartGmbH(Regensburg,Germany)提供的載體pUC-kana-mCER作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增owC五A基因(SEQIDNO:30)，其中使用如下寡核苷酸opt-mCER-PacI-fw:5'-GGTACCTTAATTAACAATGCATG-3'(在5'-末端包含Pad識(shí)別TTC-3'(在5'-末端包含與寡核苷酸TENO-^v互補(bǔ)的21個(gè)堿基的序相應(yīng)地?cái)U(kuò)增尸/c/n'acz/em7基因的終止子區(qū)(SEQIDNO:28)，其中使用如下寡核苷酸TENO-ftv:5'-ATTTAGCTTCGGTGCT丁TCCTATATAACG-3'T-ENO-BsiWI-rv:5'-TACGTACGTTATAACGGTTGGGCAATGTTG-3'(在5'-末端包含&AVI識(shí)別序列)。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得omC五i基因和SVO終止子區(qū)的融合體，其中使用包含密碼子優(yōu)化形式的小家鼠C￡A基因和戶/c/2,"c喬m7￡M>7終止子區(qū)的兩個(gè)PCR產(chǎn)物(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸opt-mCER-PacI-^v:5'-GGTACCTTAATTAACAATGCATG-3'(在5'-末端包含識(shí)別序列)T-ENO-BsiWI-rv:5'-TACGTACGTTATAACGGTTGGGCAATGTTG-3'(在5'-末端包含&fM識(shí)別序列)。用此方法可獲得1.2kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。之后用限制性核酸內(nèi)切酶Pad和(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)載體pPC-DESl-mCER-natl(見上述)的5514bp載體骨架以產(chǎn)生載體p-mCER-natl。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了構(gòu)建過表達(dá)o/wCEi和尸z'c/n'a"/wn77D//7啟動(dòng)子(GenBank編號(hào)#AF053300)和(SEQIDNO:28)終止子區(qū)控制下的第二基因的載體，首先擴(kuò)增啟動(dòng)子，其中用尸/c/n'a"/emYF-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板并使用寡核苷酸GAPDH-SpeI-fW:5'陽TATATAACTAGTTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3'(在5'-末端包含S/^I識(shí)別序列)GAPDH-CO-rv:5'-CCCGGGATTTAAATGGCGCGCCGTTAATTAATTATTTGTTTGTTTGTTTG-3'(在5'-末端包含與寡核苷酸ENO-CO-fW-互補(bǔ)的22個(gè)堿基的序列)。相應(yīng)地?cái)U(kuò)增Pfc/n'fl"/em7^V(97基因的終止子區(qū)，其中使用如下寡核苷酸ENO-CO教TCCTA畫3'ENO-SpeI-rv:5'-TATATACCGCGGTTATAACGGTTGGGCAATGTTG-3'(在5'-末端包含5^I識(shí)別序列)。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。最后，通過進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得兩個(gè)片段的融合體，其中使用兩個(gè)PCR產(chǎn)物77(每個(gè)產(chǎn)物10ng)和寡核苷酸GAPDH-SpeI勘5'-TATATAACTAGTTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3'依5'-末端包含5^el識(shí)別序列)ENO-Spel-rv:5'-TATATACCGCGGTTATAACGGTTGGGCAATGTTG-3'(在5'-末端包含S;^I識(shí)別序列)。在此可獲得0.9kbpPCR產(chǎn)物。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。之后用限制性核酸內(nèi)切酶^el(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)切割的進(jìn)載體p-mCER-natl以產(chǎn)生載體p-mCER-natl-X-B，其中cz/ernY7D7//啟動(dòng)子與"af7表達(dá)盒方向相反。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。為了最終將尸/c/z/acz/em'的丄^F7基因(SEQIDNO:3)插入進(jìn)攜帶omC^i的載體p-mCER-natl-X-B，擴(kuò)增丄/4/^7基因(SEQIDNO:3)，其中用AcWaci/^r"F-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板并使用寡核苷酸PcLAFl-HpaI-fw:5'陽TATATAGTTAACATGATTTCAACTTCAACAAATTC-3'依5'陽末端包含識(shí)別序列)PcLAFl-XmaI-rv:5'-TATATACCCGGGCTAATCATCATCTTCATCATC-3'(在5'-末端包含XmaI識(shí)別序列)。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。之后用限制性核酸內(nèi)切酶/Z;^I和^mal(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連78接進(jìn)用AcI(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany的說明)切割、之后用DNAPolymeraseI的Klenow片段(根據(jù)生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)進(jìn)行Klenow填充并用力加I(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化的載體p-mCER-nat1-X-B，生成載體p-mCER-natl-PcLAFl(示于圖12)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法進(jìn)行。載體p-mCER-natl-PcLAFl用尸mel(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)線性化，之后用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化，之后轉(zhuǎn)化進(jìn)丁香霉素E抗性P油'a"，"7突變株。實(shí)施例ll.用于在丁香霉素E抗性i^'c/nV突變株中同時(shí)過量產(chǎn)生尸/c/n'ad/"em7的酶Deslp和Laglp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、和小鼠堿性神經(jīng)酰胺酶的質(zhì)粒的構(gòu)建為了過表達(dá)A'c/n'aci/^r/z'的Deslp和棉桃阿舒氏囊霉的Laflp和Laglp，使用載體pPC-DESl-AgLAFl-AgLAGl(參見實(shí)施例11)。另外，構(gòu)建用于過表達(dá)P/c/2^cz/ern7的owC五i基因和Laglp的載體。為此目的，將乃c/z/acz/ern7的丄JG7基因(SEQIDNO:l)插入進(jìn)攜帶omC五i的載體p-mCER-natl-X-B(參見實(shí)施例ll)內(nèi)。首先，用戶/c/^cz/em7F-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板擴(kuò)增丄JG7(SEQIDNO:l)基因，使用寡核苷酸PcLAGl陽EcoRV-fW:5'-TATATAGATATCATGTCCACTTCCAGACCACAG-3'(在5'畫末端包含￡coRV識(shí)別序列)PcLAGl-XmaI-rv:5'畫TATATACCCGGGTTATTCACTCTTTTTTTCTTG-3'(在5'匿末端包含^md識(shí)別序列)。所述片段用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化。之后用限制性核酸內(nèi)切酶五coRV和Zmal(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach，Germany的說明)消化PCR產(chǎn)物并連接進(jìn)用Acl(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)切割、之后用DNAPolymeraseI的Klenow片段(根據(jù)生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)進(jìn)行Klenow填充并用Zmal(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化的載體p-mCER-natl-X-B，生成載體p-mCER-natl-PcLAGl(示于圖13)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。載體p-mCER-natl-PcLAGl用(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)線性化，之后用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化，之后轉(zhuǎn)化進(jìn)丁香霉素E抗性"/em7突變株。實(shí)施例12用于在丁香霉素E抗性Ac/^cz'/^n7突變株中同時(shí)過量產(chǎn)生乃'c/n'ac^m'z'的酶Deslp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、密碼子優(yōu)化形式的小鼠堿性神經(jīng)酰胺酶、和密碼子優(yōu)化形式的顆石藻類病毒神經(jīng)酰胺合酶的質(zhì)粒的構(gòu)建為了過表達(dá)P/c/w'fl"ybr"'的Deslp和棉桃阿舒氏囊霉的Laflp和Laglp，使用載體pPC-DESl-AgLAFl-AgLAGl(參見實(shí)施例10)。另外，構(gòu)建用于過表達(dá)omC五i基因和編碼顆石藻類病毒神經(jīng)酰胺合酶的為了在乃'c/z^c^rn7中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子優(yōu)化的基因(oCvZ^G7)的載體。為此目的，將顆石藻類病毒的oCVWG7基因(SEQIDNO:31)插入進(jìn)攜帶omC五i的載體p-mCER-natl-X-B(參見實(shí)施例ll)內(nèi)。首先，用限制性核酸內(nèi)切酶和(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商:NewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)將oCv丄JG7基因(SEQIDNO:31)從GeneartGmbH(Regensburg,Germany)提供的載體pGA4-CVLAGl中切割出來，并連接進(jìn)用SM^I和Zmal(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)切害U的載體p-mCER-natl-X-B內(nèi)，生成載體p-mCER-natl-oCvLAGl(示于圖14)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。載體P-mCER-natl-oCvLAGl用尸md[(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)線性化，之后用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化，之后轉(zhuǎn)化進(jìn)丁香霉素E抗性P!'c/n'fl"/aT//突變株。實(shí)施例13用于在丁香霉素E抗性尸/c/z^c/fem'z'突變株中同時(shí)過量產(chǎn)生Ac/z/。cz'/^n'/的酶Deslp、棉桃阿舒氏囊霉的酶Laflp和Laglp、密碼子優(yōu)化形式的小鼠堿性神經(jīng)酰胺酶、和密碼子優(yōu)化形式的小鼠神經(jīng)酰胺合酶的質(zhì)粒的構(gòu)建為了過表達(dá)戶/cWa￡#em'z'的Deslp和棉桃阿舒氏囊霉的Laflp和Laglp，使用載體pPC-DESl-AgLAFl-AgLAGl(參見實(shí)施例10)。另外，構(gòu)建用于過表達(dá)omC五i基因和密碼子優(yōu)化的小鼠神經(jīng)酰胺合酶(omZ^SX5)的載體。為此目的，將小鼠的o附丄ASS5基因(SEQIDNO:32)插入進(jìn)攜帶owC￡7的載體p-mCER-natl-X-B(參見實(shí)施例ll)內(nèi)。首先，用限制性核酸內(nèi)切酶H戶I和(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)將om丄ASS5基因(SEQIDNO:32)從GeneartGmbH(Regensburg,Germany)提供的載體pUK-kana-omLASS5中切割出來，并連接進(jìn)用Acl(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)切割、之后用DNAPolymeraseI的Klenow片段(根據(jù)生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)進(jìn)行Klenow填充并用Xmd(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商:NewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany的說明)消化的載體p-mCER-natl-X-B內(nèi)，生成載體p-mCER-natl-omLASS5(示于圖15)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序進(jìn)行確定。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。載體p-mCER-natl-omLASS5用尸mel(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商N(yùn)ewEnglandBiolabs,Schwalbach，Germany的說明)線性化，之后用QIAquickPCRPurificationKit根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行純化，之后轉(zhuǎn)化進(jìn)丁香霉素E抗性尸/c/W""/e/7^'突變株。實(shí)施例14丁香霉素E抗性乃'c/n'fld&rn'/突變株的轉(zhuǎn)化丁香霉素E抗性乃'c/^"/wn'/突變株的轉(zhuǎn)化如最近所描述的進(jìn)行(Baeda/.,Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast尸z'c/n,acz)fem7.2003.ApplEnvironMicrobiol.;美國專利6,638,735)。將丁香霉素E抗性尸/c似acz/ern7菌株(來自WO2006/048458的SYR2l-2C，圖4)在YPD培養(yǎng)基中生長至600nm光密度為1至1.5。離心收集細(xì)胞并重懸于O.l培養(yǎng)體積的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中，在使用前向所述磷酸鹽緩沖液中加入25mM二硫蘇糖醇。在37。C溫育15min后，將細(xì)胞用一培養(yǎng)體積的冰冷穩(wěn)定液[270mM蔗糖，10mMTris-HCl(pH7.5),1mMMgCl2]漂洗兩次并重懸于0.01培養(yǎng)體積的穩(wěn)定液中。5pl線性化的載體pPC-DESl-AgLAFl-AgLAGl、p-mCER-natl-PcLAFl、p-mCER畫natl-PcLAGl、p-mCER-natl-oCvLAGl或p-mCER-natl-omLASS5(含有1.6嗎DNA)與50^細(xì)胞混和并在冰上溫育10min。之后將轉(zhuǎn)化混和物轉(zhuǎn)移至2mm電穿孔杯中。電穿孔用GenePulserXcell(Bio-RadLaboratories,Miinchen,Germany)在500V、50pF和700Q根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。在電穿孔之后，細(xì)胞重懸于500nl穩(wěn)定液中并轉(zhuǎn)移至含有2mlYPD培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中。細(xì)胞在30。C以每分鐘250轉(zhuǎn)過夜再生后，將再生培養(yǎng)物的小份鋪板于含有0.5嗎放線菌酮/毫升(pPC-DESl-AgLAFl-AgLAGl)或0.5(ig放線菌酮/毫升和50Hg/ml諾爾絲菌素(菌株已經(jīng)含有pPC-DESl-AgLAFl-AgLAGl并已經(jīng)用p-mCER-natl-PcLAFl、p-mCER-natl畫PcLAGl、p-mCER-natl-oCvLAGl或p-mCER國natl畫omLASS5轉(zhuǎn)化)的YPD平板上。在30。C溫育七天后，出現(xiàn)幾十個(gè)菌落。實(shí)施例1582由過表達(dá)鞘氨醇類堿生物合成基因的丁香霉素E抗性Pt'c/n'fla'/^n'f突變株搖瓶生產(chǎn)乙?；拾贝紴榱藴y試由過表達(dá)上述基因CPcD^S7、JgZJF7、^g^4G/單獨(dú)或與owC五A組合，另外，與Pc^4FA戶c丄」G7、oCvZ^4G7或om丄ASS5組合)的丁香霉素E抗性突變株增加生產(chǎn)乙?；拾贝?，培養(yǎng)相應(yīng)菌株用于搖瓶生產(chǎn)乙酰化鞘氨醇(關(guān)于相應(yīng)質(zhì)粒參見表3)。為此目的，在5mlYPD培養(yǎng)基中(試管內(nèi))接種所述菌株作為預(yù)培養(yǎng)物，在30°C以每分鐘250轉(zhuǎn)培養(yǎng)3天。接下來，用所述預(yù)培養(yǎng)物的1%接種20mlTAPS-Medium(在具有隔板的100mlErlenmeyer燒瓶中)并在30°C以每分鐘25Q轉(zhuǎn)生長4天。表l.TAPS培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表2.微量元素和維生素母液的組成微量元素溶液A(g/L)(NH4)2Fe(S04)20.027gZnS04.7H200.005gCuS04.5H200.0075gMnS04.lH200扁6gH3B030.0006gNaMoO"H200細(xì)6gKI0細(xì)5g維生素溶液溶液B煙酸0.003gD-泛酸鈣0.003g硫胺素(維生素Bl)0.003g對(duì)氨基苯甲酸0.002g吡哆醇(維生素B6)0細(xì)3gd-生物素O細(xì)Olg實(shí)施例16在培養(yǎng)液中量化乙酰化鞘氨醇類堿為了提取脂類，向15mlfalcon管中1ml未分級(jí)分離的發(fā)酵液中加入4ml丙酮，在室溫以每分鐘250轉(zhuǎn)水平振蕩10分鐘。之后將混和物在5.300g離心10分鐘，，并在JascoHPLC系統(tǒng)(LC-2000系列)上分析上清液。應(yīng)用如下條件流動(dòng)相丙酮/水90:10(v/v)，含有0.05%(v/v)三氟乙酸(TFA)流速1.0ml/min運(yùn)《亍時(shí)間llmin注射體積100|al柱Kromasil100CI8(250x4.6mm，顆粒大小5|am)柱溫30°C塔板溫度環(huán)境溫度UV檢測波長200nm84乙?；膲A通過與己確定的參考物質(zhì)(DSM，Delft)對(duì)比保留時(shí)間和UV譜進(jìn)行鑒定，相應(yīng)地通過對(duì)比樣品和參考物質(zhì)的峰面積進(jìn)行量化。由過表達(dá)上述基因的丁香霉素E抗性"/wn7突變株搖瓶生產(chǎn)乙酰化鞘氨醇總結(jié)于表3。濃度單位為mg每克生物量干重。表3.遺傳工程化的尸/c/n'ac^m7菌株的三乙?；拾贝碱悏A的量。濃度單位為mg每克生物量千重。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>實(shí)施例17在丁香霉素E抗性Pk/;/flc//^n7突變株中失活編碼鞘脂A8去飽和酶的基因并同時(shí)過量產(chǎn)生/Vc/^'ac//~ern7的酶Deslp、密碼子優(yōu)化形式的小鼠堿性神經(jīng)酰胺酶、和密碼子優(yōu)化形式的顆石藻類病毒神經(jīng)酰胺合酶尸/c/z/ac!/em7具有編碼與乳酸克魯維酵母鞘脂A8去飽和酶具有高度相似性的酶的基因(參見實(shí)施例8)，所述酶已知在鞘氨醇類堿的C-8和C-9之間弓I入一個(gè)雙鍵(Takakuwa"a/.,CurrentMicrobiology,45:459-61)。因此，這個(gè)酶的活性可能不利作用于鞘氨醇的產(chǎn)生，因?yàn)樵诙淝拾贝贾?無論其是游離鞘氨醇類堿或作為二氫神經(jīng)酰胺的一個(gè)組分)引入這樣一個(gè)雙鍵會(huì)導(dǎo)致與形成鞘氨醇的共同前體的競爭。為了將上述鞘脂生物合成基因的過表達(dá)與編碼P/cr/^cz/e/r"鞘脂A8去飽和酶的基因的失活組合在一起，首先，用得自載體pDB006的在aa第56位含有一個(gè)點(diǎn)突變的的P/c/z/acz/^r//基因取代載體p-mCER-natl-oCvLAGl中的"a〃基因(參見實(shí)施例12)，所述點(diǎn)突變使得"y^T//在存在抗生素放線菌酮的條件下生長。為此目的，用限制性核酸內(nèi)切酶&d和消化載體pTH-GAP-natl-IS2-Pmel(參見實(shí)施例10)，并用QIAGENQIAquickGelExtractionKit凝膠純化3448bp片段。為了得到尸c丄4/基因(GenBank編號(hào)#AF053457)并引入所希望的點(diǎn)突變，通過PCR擴(kuò)增兩個(gè)片段，其中用尸/c/z^"/ew"F-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板。片段1使用如下寡核苷酸擴(kuò)增PcL41陽SalI-fW:5'-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3'(在5'-末端包含Sa/I識(shí)別序列)PcL4l-internal-rv:5'-GTTTTAGCTTTTTTATGGAAAACTtGTTTGGTTTGACCACCGTAACCGG畫3'產(chǎn)生1222bp片段，其中包含與寡核苷酸PcL41-internal-fW互補(bǔ)的49bp序列，并插入一個(gè)從C變?yōu)锳的點(diǎn)突變，將aa56從脯氨酸取代為谷氨酰胺。片段2用如下寡核苷酸擴(kuò)增PcL41-intemal-fw:5'-CCGGTTACGGTGGTCAAACCAAACaAGTTTTCCATAAAAAAGCTAAAACTACCAAAAAAGTTGTTTTACG-3'PcL41-SacI畫rv:5'-TATAGAGCTCaattCCAATGTTTTGATCTGTC-3'(在5'-末端包含^cl識(shí)別序列)產(chǎn)生753bp片段，其中包含與寡核苷酸PcL41-intemal-rv互補(bǔ)的49bp序歹U，并插入一個(gè)點(diǎn)突變(從C變?yōu)锳)，將aa56從脯氨酸取代為谷氨酰胺。所述兩個(gè)片段用QIAGENMinEluteGdExtractionKit凝膠純化。用每一個(gè)片段(2W)作為模板，以及寡核苷酸PcL41-SalI-^v和PcL41-SacI-rv(見上述)進(jìn)行交叉PCR。由此產(chǎn)生一個(gè)1906bp片段，在其末端具有5WI-和Sad-限制位點(diǎn)。之后用Sa/I和&cl消化所述片段，用QIAGENMinElutePCRPurificationKit純化，并連接進(jìn)pTH-GAP-natl-IS2-Pmel的3448bp骨架。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化、以及確認(rèn)所希望的質(zhì)粒的存在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法進(jìn)行。所獲得的質(zhì)粒命名為pDB006。用限制性核酸內(nèi)切酶尸WI和(根據(jù)所述限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)商:NewEnglandBiolabs，Schwalbach,Germany的說明)消化質(zhì)粒p-mCER-natl-oCvLAGl，并用QIAGENQIAquickGelExtractionKit凝膠純化6997bp片段。插入體尸ci:W通過用尸Wl和&cI消化pDB006獲得，類似地凝膠純化1918bp片段，并接下來連接進(jìn)所述載體。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化、以及確認(rèn)所希望的質(zhì)粒的存在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法進(jìn)行。在此確認(rèn)過程中，顯然用于克隆步驟的5bd限制位點(diǎn)在所產(chǎn)生的命名為p-mCER-LP-PcvL41-oCvLAGl的質(zhì)粒中不再存在。因此，對(duì)完整插入體和相鄰區(qū)域進(jìn)行測序以確認(rèn)真實(shí)性?？梢源_認(rèn)，可能由于5bcl的星活性，載體p-mCER-natl-oCvLAGl在屬于oCvUO基因的烯醇化酶終止子區(qū)的識(shí)別序列GAGCTC未被切割，而是在序列GAGCTT被切割。因此，^cl識(shí)別位點(diǎn)在連接后不再存在，并且所述終止子被截短至211bp而不是332bp。這個(gè)事實(shí)被認(rèn)為是不相關(guān)的，并且所述載體被用于下一歩引入P/c/z/a"ybr///)￡57基因(SEQIDNO:26)。其通過PCR擴(kuò)增，使用如下寡核苷酸PcDESl隱Pst南5'-TATATACTGCAGTTACCCAGTGGTACCTACATAC-3'(在5'-末端包含P"I識(shí)別序列)PcDESl-PstI-rv(5'-TATATACTGCAGTTATAACGGTTGGGCAATG-3'(在5'-末端包含尸WI識(shí)別序列)并使用Ac/n'ac^em'/F-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板。所得到的1983bp片段如上所述進(jìn)行凝膠純化、用限制性核酸內(nèi)切酶i^I消化。并用QIAGENQIAquickPCRPurificationKit進(jìn)行PCR純化。載體p-mCER-LP-PcvL41-oCvLAGl進(jìn)行類似切割和純化。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化、以及確認(rèn)所希望的質(zhì)粒的存在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。通過進(jìn)行本方法獲得的質(zhì)粒命名為pTH-LP-l。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序確定。編碼尸/c/z/acz/em7鞘脂A8去飽和酶的基因(SEQIDNO:5)的一個(gè)內(nèi)部區(qū)域通過PCR擴(kuò)增，其中用P!'c/u'acz/ctt"F-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板，并使用如下寡核苷酸PcD8D-PshAI-fW:5'-TATATAGACAAAAGTCCAGTTCCAAAGTGCTC-3'(在5'-末端包含尸M識(shí)別序列)PcD8D-BsiWI-rv:5'-TATATACGTACGAAAATTGCACTAAGGAAATAC-3'(在5'-末端包含BsiWI識(shí)別序列)855bp片段用QIAGENMinEluteGelExtractionKit凝膠純化，并且接下來用限制性核酸內(nèi)切酶尸AAI和J5WWI根據(jù)生產(chǎn)商(NewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany)的說明進(jìn)行消化。之后用QIAGENMinElutePCRPurificationKit進(jìn)行純化，類似地消化載體pTH-LP-l，并用QIAGENQIAquickGelExtractionKit凝膠純化9662bp片段。連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化、以及確認(rèn)所希望的質(zhì)粒的存在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。通過進(jìn)行本方法獲得的質(zhì)粒命名為pTH-deltaD8D(示于圖17)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序確定。實(shí)施例18在丁香霉素E抗性尸/c/z^菌株中失活編碼堿性神經(jīng)酰胺酶的基因并同時(shí)過量產(chǎn)生尸/c/n'flc//^r//的酶Deslp、密碼子優(yōu)化形式的小鼠堿性神經(jīng)酰胺酶、和密碼子優(yōu)化形式的顆石藻類病毒神經(jīng)酰胺合酶尸/c/^c^廳/Z具有編碼與釀酒酵母堿性神經(jīng)酰胺酶具有高度相似性的酶的基因(參見實(shí)施例7)，所述酶已知優(yōu)先水解含有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇而不是鞘氨醇作為鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺(Maoetal.，TheJournalofBiologicalChemistry,275:31369-31378)。因此，這個(gè)酶的活性可能不利于鞘氨醇的產(chǎn)生，因?yàn)楹卸淝拾贝甲鳛榍拾贝碱悏A的神經(jīng)酰胺是形成鞘氨醇的前體。為了將上述鞘脂生物合成基因的過表達(dá)與巧c/n'ac^rn'/內(nèi)源堿性神經(jīng)酰胺酶基因rXC7的失活組合在一起，用編碼P/c/^c^rn7神經(jīng)酰胺酶的基因的一個(gè)內(nèi)部區(qū)域(SEQIDNO:8)取代質(zhì)粒pTH-deltaD8D上的基因間間隔區(qū)(IS)區(qū)域(參見實(shí)施例17和圖17)。首先，通過PCR擴(kuò)增編碼尸/c/z/acz/em7神經(jīng)酰胺酶的基因(SEQIDNO:8)的兩個(gè)內(nèi)部的、部分重疊的片段，其中使用Ac/n'acz/ern'fF-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板，并分別使用寡核苷酸對(duì)OTKD284/OTKD285和OTKD286/OTKD287:OTKD284:CC-3'(下劃線/^/zAI識(shí)別序列)OTKD285:5'-TAAATCTCAATTCACACTGGTGCTAAATTATTTTTAAATGCAGA-3'(下劃線力el識(shí)別序列)OTKD286:5'-TAAAAATAATTTAGCACCAGTGTGAATTGAGATTTATATTGATAAGTT-3'(下劃線:J/el識(shí)別序列)OTKD287:5'-TATATACGTACGCAATATTATAGAAATACCAATTGT-3'(下劃線:5w，識(shí)別序列)兩個(gè)部分重疊的片段(分別是239和236bp)用QIAGENQIAquickGelExtractionKit進(jìn)行凝膠純化。用每一個(gè)片段(2pl)作為模板，以及寡核苷酸OTKD284和OTKD287(見上述)進(jìn)行交叉PCR。獲得在其末端具有單一A/^I和5w7fl位點(diǎn)，以及一個(gè)中間^/el位點(diǎn)的439bpDNA片段。所述片段用/V"I和5w'附根據(jù)生產(chǎn)商(NewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany)的說明進(jìn)行消化。之后用QIAGENPCRPurificationKit純化。類似地消化載體pTH-LP-1，并使用QIAGENQIAquickGelExtractionKit凝膠純化9662bp片段。兩個(gè)片段的連接、化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化、以及89確認(rèn)所希望的質(zhì)粒的存在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。通過進(jìn)行本方法獲得的質(zhì)粒命名為pSo-5(示于圖18)。插入體的方向和真實(shí)性通過DNA測序確定。實(shí)施例19由過表達(dá)鞘氨醇類堿生物合成基因的丁香霉素E抗性戶/c/7^d/^r//突變株搖瓶生產(chǎn)乙?；拾贝碱悏A，以及在培養(yǎng)液中量化乙?；拾贝碱悏A如在實(shí)施例14中所描述的，在pSo-5用j/el消化之后，用實(shí)施例17和18的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化丁香霉素E抗性尸/c/h'""/w,77菌株。如在實(shí)施例15中所描述的，由丁香霉素E抗性尸,c/z/""/wn7突變株搖瓶生產(chǎn)乙?；拾贝碱悏A，根據(jù)實(shí)施例16用RP-HPLC檢測并量化乙?；拾贝碱悏A。結(jié)果示于表4。引人注目的是，當(dāng)使用編碼尸^n'ac^/r"鞘脂A8去飽和酶的基因的片段替代rDNA基因間間隔區(qū)(pTH-LP-l)作為靶序列(pTH-deltaD8D)，從而導(dǎo)致基于質(zhì)粒pTH-deltaD8D同源整合進(jìn)染色體而引起的尸/c/n'flcz/e777失活時(shí)，三乙?；拾贝?TriASo)的量顯著增加。另外，當(dāng)使用編碼尸/c^^"j^rHXYC7堿性神經(jīng)酰胺酶的基因的片段替代rDNA基因間間隔區(qū)(pTH-LP-l)作為耙序列(pSo-5)，從而導(dǎo)致基于質(zhì)粒pSo-5同源整合進(jìn)染色體而引起的尸/c/k'""j^7v77XC7失活時(shí)，三乙酰化鞘氨醇(TriASo)的總量和TriASo/TriASa比例都顯著提高。表4.遺傳工程化的尸/c/z/aa/em7菌株中質(zhì)粒整合位點(diǎn)對(duì)三乙?；拾贝碱悏A水平的影響。濃度單位為mg每克生物量干重。質(zhì)粒整合位點(diǎn)TriASoTriASa總量比例TriASo/TriASapTH-LP-l基因間間隔區(qū)(IS)21.6659.4781.130.36pTH-deltaD8D33.4569.90103.350.48pSo陽528.4752.7681.230.5390權(quán)利要求1.一種微生物菌株，所述微生物菌株產(chǎn)生，以每克CDW計(jì)，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇類堿或其鹽或酯，其中R是X-(CH2)m-Y-(CH2)n-CH3，其中a.X是CH2或CHOH，并且b.m在0和4之間，優(yōu)選地m是1，并且c.Y是CH2-CH2，CH＝CH或CH＝CCH3，并且d.n在4和14之間，優(yōu)選地n是8或10。2.獲得權(quán)利要求1的微生物菌株的方法，所述方法通過如下步驟進(jìn)行a.提高編碼具有神經(jīng)酰胺合酶活性的酶和/或具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表達(dá)，所述具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有式I所示的鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺，和/或b.降低編碼具有鞘脂A8去飽和酶活性的酶和/或具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表達(dá)，所述具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇作為鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺，和c.分離具有權(quán)利要求1限定的生產(chǎn)力的菌株。3.權(quán)利要求2的方法，進(jìn)一步包括提高編碼具有二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶活性的酶的多核苷酸的表達(dá)。4.權(quán)利要求2或3的方法，包括用一或多種權(quán)利要求2或3限定的編碼所述酶的多核苷酸進(jìn)行DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。5.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的方法，其中所述具有神經(jīng)酰胺合酶活性的酶選自a.具有SEQIDNO:2禾B/或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的多肽，b.具有與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列有至少45%序列相同性禾口/或與SEQIDNO:4所示的氨基酸序列有至少45%序列相同性的氨基酸序列的多肽，c.具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的多肽，d.具有與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列有至少45%序列相同性的氨基酸序列的多肽，e.具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的多肽，和f.具有與SEQIDNO:IO所示的氨基酸序列有至少45%序列相同性的氨基酸序列的多肽。6.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的方法，其中所述酶具有神經(jīng)酰胺酶活性，所述神經(jīng)酰胺酶能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有式I所示的鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺，所述酶選自d.具有SEQIDNO:15所示的氨基酸序列的多肽，和e.具有與SEQIDNO:15所示的氨基酸序列有至少70%序列相同性的氨基酸序列的多肽。7.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的方法，其中所述具有鞘脂A8去飽和酶活性的酶選自f.具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽，和g.具有與SEQIDNO:6所示的氨基酸序列有至少30%序列相同性的氨基酸序列的多肽。8.權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的方法，其中所述酶具有神經(jīng)酰胺酶活性，所述神經(jīng)酰胺酶能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇作為鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺，所述酶選自h.具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的多肽，和i.具有與SEQIDNO:8所示的氨基酸序列有至少25%序列相同性的氨基酸序列的多肽。9.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述具有二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶活性的酶選自j.具有SEQIDNO:17所示的氨基酸序列的多肽，禾口k.具有與SEQIDNO:17所示的氨基酸序列有至少30%序列相同性的氨基酸序列的多肽。10.權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼具有鞘脂A8去飽和酶活性的酶或編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶的多核苷酸得自真菌或酵母，優(yōu)選地得自釀酒酵母(Sacc/2araw少c^cewWw'ae)、乳酸克魯維酵母(iT/w_yveraw_ycay/acto)、多形漢遜酵母(Z/arae"w/apo/>wc>rp/70)、巴其萬德畢赤氏酉孝母(尸/c/n'aptwton'力、尸/c/zz'aci/^r//、角軍月旨耳卩氏酵母(K/rovWa/z》o(y"ca)、白假絲酵母(C朋^^a仏/cfl"力、產(chǎn)朊假絲酵母(Ow^^wWfe)或棉桃阿舒氏囊霉04A&agaw_^//)，更優(yōu)選地得自酵母戶/c/n'aC7/e,T"、棉桃阿舒氏囊霉或解脂耶氏酵母，所述神經(jīng)酰胺酶能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇作為鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺。11.權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼具有神經(jīng)酰胺合酶活性的酶或編碼具有二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶活性的酶的多核苷酸得自病毒、真菌、植物或動(dòng)物，更優(yōu)選地得自藻類病毒、酵母或哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選地得自顆石藻類病毒屬(Cbcco/"/zov/n^)、糖酵母屬(&cc/707WM少ce"、裂殖酵母屬(5t/H'zcw7cc/7arawycas)、德巴利酵母屬(De6aA70myce力、克魯維酵母屬(A:/w"erawyce力、畢赤氏酵母屬CP/c/7/G)、耶羅威亞酵母屬(l^raw/a)、假絲酵母屬(Ca"&Wa)、阿舒氏囊霉屬(^s;^ya)、小鼠、大鼠或人類。12.權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶的多核苷酸得自動(dòng)物，優(yōu)選地得自哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地得自小鼠、大鼠或人類，所述神經(jīng)酰胺酶能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有式I所示的鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺。13.用于生產(chǎn)式I所示的鞘氨醇類堿或其鹽或酯的方法，包括在有益于產(chǎn)生所述鞘氨醇類堿的條件下對(duì)權(quán)利要求1的微生物菌株進(jìn)行發(fā)酵，和從發(fā)酵液中收集所述鞘氨醇類堿。14.顯示神經(jīng)酰胺合酶活性的多肽，其選自由具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽、具有與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%序列相同性的氨基酸序列的多肽、具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的多肽和具有與SEQIDNO:4所示的氨基酸序列有至少55%、優(yōu)選地至少60%、更優(yōu)選地至少70°/。、更優(yōu)選地至少80%、最優(yōu)選地至少90%序列相同性的氨基酸序列的多肽組成的一組。15.顯示鞘脂A8去飽和酶活性的多肽，其選自由具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的多肽和具有與SEQIDNO:6所示的氨基酸序列有至少65%、優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少80%、最優(yōu)選地至少90%序列相同性的氨基酸序列的多肽組成的一組。16.顯示神經(jīng)酰胺酶活性的多肽，所述神經(jīng)酰胺酶優(yōu)先或甚至特異性地水解具有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇作為鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺，所述多肽選自由具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的多肽和具有與SEQIDNO:8所示的氨基酸序列有至少60%、優(yōu)選地至少70%、更優(yōu)選地至少80%、最優(yōu)選地至少90%序列相同性的氨基酸序列的多肽組成的一組。全文摘要本發(fā)明提供遺傳工程化的微生物菌株，特別是遺傳工程化的酵母菌株，所述微生物菌株產(chǎn)生，以每克CDW計(jì)，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇類堿或其鹽或酯。本發(fā)明提供獲得遺傳工程化的微生物菌株的方法，所述菌株產(chǎn)生，以每克CDW計(jì)，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇類堿或其鹽或酯。所述方法包括步驟a)提高編碼具有神經(jīng)酰胺合酶活性的酶和/或具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表達(dá)，所述具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有式I所示的鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺，和/或b)降低編碼具有鞘脂Δ8去飽和酶活性的酶和/或具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表達(dá)，所述具有神經(jīng)酰胺酶活性的酶能夠優(yōu)先或甚至特異性地水解含有植物鞘氨醇或二氫鞘氨醇作為鞘氨醇類堿的神經(jīng)酰胺，和分離具有所要求的生產(chǎn)力的菌株。文檔編號(hào)C12N15/55GK101490260SQ200780026080公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2007年5月11日優(yōu)先權(quán)日2006年5月11日發(fā)明者D·博爾格爾,M·A·范登貝爾赫,S·舍費(fèi)爾,T·許勒申請(qǐng)人:科茲莫弗姆有限公司