專利名稱：：抗生鏈霉菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種菌種及其用途，尤其是涉及抗生鏈霉菌的誘變種及其用途。二
背景技術(shù)：
：目前，設(shè)施農(nóng)業(yè)包括大棚蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物常常由于溫室內(nèi)空氣不流通和較高的溫濕環(huán)境而易發(fā)生霉菌病害和根結(jié)線蟲病。這些病害在溫室、大棚得以孳生和蔓延，不僅成為大棚溫室經(jīng)濟(jì)作物的頭號殺手，而且還蔓延到露天田地的栽培作物。它們能獨(dú)自形成危害，還可與其它病原物一起造成復(fù)合侵染，加重土壤傳播性病害的發(fā)生，形成疫病。這些病害的發(fā)生一般造成作物減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)還可能使作物絕產(chǎn)。對于這些植物病害的防治，歷來以化學(xué)藥劑為主?；瘜W(xué)農(nóng)藥的長期使用，又使得這些病害生物產(chǎn)生抗藥性。為能達(dá)到抑病保產(chǎn)的目的，農(nóng)民在使用化學(xué)農(nóng)藥時(shí)加大了農(nóng)藥劑量，造成了農(nóng)藥殘留，不但使土壤板結(jié)，作物毒化，影響農(nóng)產(chǎn)品出口，而且直接危害著人體健康。微生物藥劑是由微生物本身或它的次生代謝產(chǎn)物制成的。它具有1).易被分解，對環(huán)境污染??；2).高效，針對性強(qiáng)，一般只對特定有害病菌和害蟲的特定器官發(fā)生作用，對人、畜和益鳥無害；3).由于易被分解，半衰期短，不易使目標(biāo)物產(chǎn)生抗藥性，產(chǎn)品生命周期相對較長；4).使用微生物技術(shù)及生物工程技術(shù)還可開發(fā)新品種、增加新劑型、提高效價(jià)，形成規(guī)?；a(chǎn)等。使用微生物藥劑防治植物病害，對非目標(biāo)生物無害，可使土壤中原有的有益生物群體得以生息，恢復(fù)害蟲天敵的殺蟲效力，其后期效果更好。有益于保護(hù)自然界生物多樣性和持續(xù)生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，不僅具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，而且還具有明顯的社會(huì)效益。因此是一項(xiàng)社會(huì)公益性事業(yè)。另外，具有抗真菌作用的抗生素藥物也可以用于臨床?，F(xiàn)有的抗生素藥劑使用時(shí)間長了以后也同樣需要新的換代產(chǎn)品來替代或交叉使用，以減輕病害生物抗藥性的產(chǎn)生。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗生鏈霉菌，由其生產(chǎn)的菌劑具有抗廣譜真菌的效果。能較好地防治農(nóng)作物真菌病害和根結(jié)線蟲的感染，不產(chǎn)生公害、無殘留。本菌劑對人的危害性非常低，做醫(yī)用藥和微生物農(nóng)藥都具有良好的性能和開發(fā)前景。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種抗生鏈霉菌，其特征在于命名為S頂001的抗生鏈霉菌是西安保藏變異禾中的亞禾中(6Yrepto/z7ce51朋"/u'c^ic〃5"sw/wpecj'esxz'，a/)，i亥菌禾中已在國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2005年4月14日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.1349。該菌的全細(xì)胞水解液含有L，L-DAP(二氨基庚二酸Diaminopimelicacid)，無特征性糖；細(xì)胞壁屬于I型；糖型C;主要抑菌物質(zhì)之一是多烯大環(huán)內(nèi)酯類，為廣譜型抗真菌類物質(zhì)。該菌種16SrDNA序列圖譜為1TGCAAGTCGAGGGGA，GTTGAGTAACAC61GTGGGCAATCICTGCGACAAGCCCTGG纖CGGCGTCT艦TACCGf掘T"121GACCGTCTGCATGG窗纖CCTCCGGCGGTGCAGGiVreAgcccgcggcc181TATCAGCTTGAGTGCCTCACCMCGCGACGacgggtagccggcctcagag241GGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGC;AGGc.虹agtggg301GAATATTGCACMTGGGOGAAAGCCTGATGCAGCGACGCC'GCCTGAGf/tcacggcctf361CGGGTTGTAAGCAGf歳GAAGCG艦CTGACGGTACCTCcagmgaagc421GCCGGCTAACTAOGTGCCACCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCMGCGTTGTCCGGAAT481TATTGGGCGTAMfiAGCTISTAGGCGCCTTGTCACGTCGGTTGTG繊GC541ACCCCGGGTCT6CAGTC認(rèn)ACGGCCAGGCTAGACTTCGGTAGG€GAGATcggaattcct601GGTGTAGCGGTC嵐TGCGCAGA窗CAGGAGGAACACCGGTGGCG薦CGGATCTCTG661GGCCGATACTAGCGAMGCGTGGGGAGCGAacaggattagataccctgg't721AGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCMCATTCCACGTTGTCCGTGCCGC781AGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCMGGCTMAACTCMAGGM841TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATCTGGCTTMTTCGACGCAACGCGAAGAAC901CTTACCAAGGCTTGACATACTCT'GGAG織GGCGCCCCCTTGTGGTCGCT961GTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCMCTCGTCTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA1021ACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCMiCAGGCCCTTGTGGTGC観)薩AGACCGCCGGGGTCAACTCGgggacmcgi('aagt〖:.w:a'rc麗:TO〖1141GTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGTXgctgcgatm:1201AGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCA6TTCGgatrxgctctgcmctc(;ac〖:cca'隨(；1261TCGGAGTCGCTAGTAATCGC織TC亂4TTGCTCCGGTG嫌a(:cnct(薦-TTTCT1321ACACACCGCCCGTCACGTCA(MM€T€GGTAACACCCGA(:CM(xaT『1381GTGGGAGGGAGCTGTC菌種培養(yǎng)及發(fā)酵條件為斜面培養(yǎng)基該菌種斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基或普通放線菌用培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度為26。C--45°C。液體發(fā)酵液體發(fā)酵用培養(yǎng)基經(jīng)正交試驗(yàn)選擇，確定搖床用發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分為:可溶性淀粉O.5—6%，葡萄糖O.5—6%，MgS040.05%，F(xiàn)e2S040.001%，K2HP0<0.05%，酵母膏0.5%，豆餅粉0.20/"%，魚粉0.20/0—4%;水100ml;ra控制在4一10。將培養(yǎng)基滅菌后，接入菌種，置搖床，26°C--45。C培養(yǎng)。固體培養(yǎng)；固體培養(yǎng)基可用各種農(nóng)副產(chǎn)品及其下腳料作培養(yǎng)基的主要成分。包括稻、谷、玉米、麥類、高梁、豆類的面粉及其加工下腳料等；麩皮、玉米蛋白粉、玉米面、稻殼、豆皮等；各種榨油后的餅粕，如豆餅、花生餅等；各種含蛋白質(zhì)和碳水化合物的動(dòng)物材料，如魚粉、蠶蛹粉、蛋白粉等都可以作為菌種培養(yǎng)基的組合物。按照蛋白質(zhì)碳水化合物=1一7:9—3的比例配制培養(yǎng)基物料，添加基料量50%—300%的水混合，拌勻即可。要注意的是基料中要添加合適比例的皮、殼類物質(zhì)，以利基料中空氣的存在和流通，一般為i一io%左右。將培養(yǎng)基滅菌后，接入菌種，置26'C--45t:培養(yǎng)。該菌種經(jīng)液體發(fā)酵72h—170h，由發(fā)酵原液制成的生物防霉劑水劑對包括稻瘟病蝕脈孢霉尸〃sar!'鵬ra5^'/7/^應(yīng)爿^ri/5W7、稻梨孢霉尸j.ric〃7a2"j'aozr幼eCsrars和立枯絲核菌yA/卵"o/w'aso/朋i'Zz7力/7在內(nèi)的多種真菌有抑制作用；對蘋果褐斑病、番茄葉霉病、日光溫室黃瓜黃霉病、灰霉病等多種植物真菌病有防治作用；使用帶有培養(yǎng)代謝成分的菌劑還有促植物生長作用。該菌由液體、固體發(fā)酵制成的菌劑及其提取物可用于防治大棚溫室根結(jié)線蟲病害。該菌劑及其生長代謝提取物可制成醫(yī)用、農(nóng)用用途的抗生制劑、促生長制劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下1)、本發(fā)明使用了菌種誘變技術(shù)。2)、本發(fā)明產(chǎn)生的生物防霉劑水劑的初期樣品(即發(fā)酵液)顯示出該菌劑是一個(gè)能抑制多種真菌和根結(jié)線蟲的菌劑。其抑制線蟲的能力可能來自于其對線蟲幫兇真菌的抑制，但不排除它對線蟲的直接作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵原液即有較高活性，經(jīng)適當(dāng)?shù)靥幚?、提取或濃縮、加入助劑后，其功能會(huì)更好。四圖1和圖2為原菌種SIM-fs孢子形態(tài)電鏡掃描圖(6000x、20000x);圖3和圖4為SIM001誘變菌種孢子形態(tài)電鏡掃描圖(3500x、30000x)。五具體實(shí)施例方式(一).菌種抗生鏈霉菌(6Yre/^o歷ycesa/^AioGciAs)實(shí)驗(yàn)編號為SIM-fs。于距離在130cm，吸收劑量為600Gy(xMrad)，的fi"Co-r射線照射下誘變，經(jīng)篩選獲得抗真菌活力提高較大的菌種，經(jīng)五代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，性能穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)編號為SIM001SIM001菌種描述特征如下測定方法形態(tài)特征參照《放線菌的分類和鑒定》一書中有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。于高氏合成一號瓊脂、ISP4瓊脂、甘油天門冬素瓊脂、GYM瓊脂和JCM42"咅養(yǎng)基瓊脂上，28'C插片培養(yǎng)14天后，取片，用常規(guī)方法觀察菌體的形態(tài)特征。培養(yǎng)特征在高氏合成一號瓊脂、ISP4瓊脂、甘油天門冬素瓊脂、GYM瓊脂和JCM42"培養(yǎng)基瓊脂上，28。C培養(yǎng)7—14天后觀察菌體的顏色及可溶色素。細(xì)胞壁化學(xué)組分分析按Hasegawa照薄板層析法(ThinLayerChromatogr鄰hy，TLC)對菌株進(jìn)行全細(xì)胞水解液的氨基酸和糖型分析。生理生化參照《放線菌的分類和鑒定》和《Bergey，sManualofSystematicBacteriology))Vol.4有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行生理生化鑒定。16SrDNA序列分析采用溶菌酶法改進(jìn)的Pitcher法(Pitcheretal.1989)從新鮮菌體提取基因DNA，用通用引物進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接用TaqDyeDeoxyTerminatorCycleSequencingKit測序，電泳及數(shù)據(jù)收集用AppliedBiosystemsDNAsequencer(model377)自動(dòng)進(jìn)行，將所測得16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬的序列進(jìn)行比較(北微所測)。9電鏡掃描在PDA培養(yǎng)基上，28。C培養(yǎng)3—7天，用水制成孢子懸液，1%磷鎢酸復(fù)染后，用HITACHIH-600電鏡觀察。測定結(jié)果形態(tài)特征革蘭氏染色陽性；ISP4瓊脂和GYM等瓊脂上生長14天后，基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，無橫隔，不斷裂；氣生菌絲生長良好，叢生，多分支，孢子絲直或柔曲。培養(yǎng)特征:氣生菌絲基內(nèi)菌絲可溶色素高氏合成一號瓊脂*灰黃褐黃無ISP4瓊脂灰黃黃褐無甘油天門冬素瓊脂淺褐淺褐無GYM瓊脂灰黃褐黃無JCM42^培養(yǎng)基瓊脂灰黃色橙黃無細(xì)胞型化學(xué)組分分析-菌株的全細(xì)胞水解液含有L，L-DAP(L，L-二氨基庚二酸Diaminopi鵬licacid)，無特征性糖；細(xì)胞壁屬于I型；糖型C。生理生化特征:特征結(jié)果特征結(jié)果淀粉水解+D-葡萄糖+木聚糖+D-果糖+45"C生長一蔗糖+NaN3(0.01%〕—L-鼠李糖一酚(0.1%)+D-甘露醇+Nacl3%+肌醇—5%+L-阿拉伯糖十7%+棉籽糖+吐溫20+半乳糖+40+山梨糖一60+菊糖一80+檸檬酸鹽+乙酸鹽+丙二酸鹽+丁二酸鹽一丙酸鹽16SrDNA序列分析誘變菌株SIMOOl16SrDNA序列圖譜:1TGCAAGTCGA6C雷OJGGCGGGGATTAGTGGCGAACGGG61GTGGGCAATCTCTGGGACAAGCCCTGG趣CGGGGTCTMTACCGG腿T121GACCGTCTGCatcctgt雄gctccggccgTGCAf認(rèn)GAGCCCfiCGGCC181窗CAGCTTGAGTGGCTCACCAAGGCGACGacgggtagccGGCCTG脇241GGCGACCGGCcacactm;aCT區(qū)ACACGGCCCAGACTCCTACf濕GGC縱ACT脇301GAATATTGCAAAGCCTGATCCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTT361CGGGTTGTAAGCAGGGMGAAGCr濕GTGACGGT紅TG421GCCGGCTAACTACCTCCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGCGCGCMCCGTTCTCCGGAAT481TATTGGGCGTAAAGAGCTCGMGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGMAGCCCGOKiCTTA541ACCCCGGGTCtgcagtcmta(xggcaggc羅GTTCGGTAGGGGAGAT601GGTGTAGCGG雄TATCAGG愿滅C薦GTGGCGAAGGCGGATCTCTG661GGCCGATACTTGGGGAGCGAACAGGATT恥AT紅CTGGT721AGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGC781AGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGCGAGTACGGCCGCMGGCm楊CTC扁GGM841TTGACGGGGGCCCGCACAAGTGTGGCTTAATTCGACGCMCGCGMGMC901CTTACCAAGGCTTGACATACTCTGG織CAGGCGCCCCCTTGTGCT謹(jǐn)961GTACAGGTGGTGCATGGCTGTOTCAGCTCGTGTCG甚AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA廳ACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGlTGCCAGCACGCCCm"T}TGCTC€C讓AGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACG了CAAGTCATCA麗ix'T'm1141GTCTTGGGCTGCACACGTGCTACMTGCCCGGT'ACAATGAGCTGCGATAC1201AGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTCC紙TTG.A(IC'CATGAAG1261TCGGAGTCGCTAGTAATCGC纖TC縱ATTCCTGCGCTGAATACGTTIX1321ACACACCGCCCGTCACGTCATMCACCCGAAG(慕冊1381GTGGGAGGGAGCTGTC誘變菌種SIMOOl16SrDNA序列分析與Genbank中相關(guān)序列Blast比較的結(jié)果表明菌株屬于鏈霉菌屬；與目前發(fā)表的相關(guān)菌株相比，本菌株的16SrDNA序列與分r印to/zz/ces^n^e^的序列相似性很高，達(dá)到99.9%的相似性。原始菌株SIM-fs16SrDNA序列圖譜:1ggtcggcgtgcttac織tgCMgtcgaacgat,gaaccggtttcggccggggtattagtg61gcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggataagcccgggaaacmtgggtctaataccggatacgacactccgaggcatcUggggtgtgg纖gttccggcggt181gcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctacca鄉(xiāng)cgacga241cgggtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcc301tacgggaggcagcaigtggggMtattgcac股itgggcgaaagcctgatgcagcgacgccg361cgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacclxtttcagc鄉(xiāng)ga鄉(xiāng)agcg,gtga421cggtacctgcagaagaagcaccggct朋ctacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggg481tgcgagcgttgtccggaattattgggcgtaa卿gctcgt鄉(xiāng)cggtttgtCgCgtCgfit,541tgtgaaagcccggggcttaaccctgggtctgcagtcgatacgggcaggctagagUcggc601agggg卿ctggaattcctggtgt.agcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaecgg661tggcgaaggcgggtctctgggccga_tactgacgctg鄉(xiāng)agcgaaagcgtggggagcgaa721caggattagataccctggtagtccacgccgt認(rèn)cggtgggcactaggtgtgggcaacat781tccacgttgtccgtgccgcagctaacgcattaagtgccccgcctggggagwcggccgca841aggctaa犯ctcaaagg幼ttgacgggggcccgcacaagcgg(:ggagcatgtggcUaat901tcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacatcgg幼acggccag卿tgg961tcgcccccttgtggtcggtgt織ggtggtgcatggcigtcgtc紹ct.cgtgtcgtgaga1021tgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtgttge.cagc鄉(xiāng)xtcttcg1081gagggttggggactcacgggagactgccggggt,caactcgggga(.'ga('gt1141caagtcatcatgccccttatgtct.tgggctgcacac'gtgcUHC股itggCCggu"'a'ilg(:i1201gctgcgatgcegtgaggtggagcgaatctc艦咖gceggtc.tcagt":g1261tgcaactcgatcggagtcgcUigt組cgcaga!.cagcai:1321aatacgttcccgggccttgt3C3CHCCgCCcgt.cacgtc;i1381鄰ccggtggcctaaccccugtggg郷gfcig結(jié)果顯示原菌株SIM-fs16SrDNA序列分析表明該菌株屬于鏈霉菌屬。與非正式發(fā)表的鏈霉菌6Y化/to,ces早a^似2(海南熱帶作物生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提交GenBank號AY660018)的16SrDNA序列相似性達(dá)99.6%，而與目前正式發(fā)表的鏈霉菌的16SrDNA序列相似性均低于97%。與誘變后的變異株、灰色鏈霧菌5Yi^pto/zy^es^rj'sei/s禾口抗生鏈霧菌5"zLre/^9/zy^e61s/"c〃s的16SrDNA序列相似性分別為96.07%、96。05%和94.82%。原始菌株SIM-fs的16SrDNA序列分析測定中顯示它與抗生鏈霉菌"加/7tomyca朋勱/加'c^)相似性只有94.82%，低于95%。說明它在保藏過12'程中已經(jīng)發(fā)生變異。經(jīng)B"Co--r射線照射誘變后產(chǎn)生的誘變菌種SIM001的16SrDNA序列變得非常接近灰色鏈霉菌(6^^^湖/ces^ri5^M人符合度達(dá)99.9%。菌種比較16SrDNA在生物體內(nèi)很穩(wěn)定，常用于種的鑒定和比較。在誘變中能使其改變?nèi)绱酥螅f明其變異幅度的大小和易變異的程度。盡管它的16SrDNA序列接近灰色鏈霉菌，但是我們認(rèn)為它仍然有可能存在與灰色鏈霉菌5"&印^My"sgriset/s不完全相同的地方。根據(jù)文獻(xiàn)《鏈霉菌鑒定手冊》(中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組編著，1975)中記載灰色鏈霉菌5Yrepto^ces^r&eiAs分類歸屬于鏈霉菌第三類，即球孢Globisporus類群.該類群的主要特征之一是"孢子通常球形、橢圓型、有時(shí)柱形，孢子表面都是光滑的"。而抗生鏈霉菌(6^r印^/z77c"朋"Z)i'o""A^的分類歸屬于十二類群，金色Aureus類群，該類群特征之一是孢子表面多種多樣。為此，我們對原菌種SIM-fs孢子和誘變菌種S頂OOl的孢子進(jìn)行了電鏡掃描觀察。電鏡掃描結(jié)果原菌種SIM-fs孢子形態(tài)電鏡掃描圖(6000x、20000x):(見圖1和圖2)SIM001誘變菌種孢子形態(tài)電鏡掃描圖(3500x、30000x):(見圖3和圖4)圖片顯示該菌種孢子表面有刺突，不同于灰色鏈霉菌(5".griw^A應(yīng)屬抗生鏈霉菌M.""幼/加'c^人同時(shí)，圖片還顯示誘變菌株S頂001孢子表面的刺突較之原始菌種SIM-fs孢子表面的剌突稠密一些，但孢子卻沒有原始菌株的孢子圓。此外，與原始菌種比較，固體培養(yǎng)時(shí)的黑色素的產(chǎn)生有所改變。SIM001菌種在PDA營養(yǎng)瓊脂斜面固體培養(yǎng)時(shí)較SIM-fs菌種PDA營養(yǎng)瓊脂斜面固體培養(yǎng)時(shí)的表面顏色深，呈綠灰色；菌落背面幾乎無可溶性黑色素產(chǎn)生，而S頂-fs菌種有比較明顯的黑色素產(chǎn)生，所以我們將它命名為抗生鏈霉菌西安保藏變種的亞禾中(6Yre/to777ce51朋"力ic^ic〃s5Y/力邵ec/as"義i'朋入該菌禾中在"中國普通微生物菌種保藏管理中心"(CGMCC)進(jìn)行了鑒定，保藏編號是AS4.2006。我們又將該菌種進(jìn)行了專利保藏。專利保藏號CGMCCNo.1349。(二).菌種特性和作用該菌種產(chǎn)生多種抗生素，其菌體提取物和發(fā)酵原液紙層析均顯示能抑制多種真菌(由大棚植物病害株分離獲得的致病菌為目標(biāo)菌的測試模式中)的活性成分主要有兩種，一種在層析中偏非極性端，另一種在層析中偏極性端，均對細(xì)菌無抑制作用。由發(fā)酵液經(jīng)乙醇沉淀去蛋白濃縮后，用硅膠吸附，溶劑梯度洗脫，再經(jīng)柱層析分離獲得含活性成分的提取物。其中在層析中偏極性端的活性物質(zhì)呈兩性性質(zhì)，其官能團(tuán)反應(yīng)如下反應(yīng)名稱反應(yīng)特征可能的官能團(tuán)a-萘酚反應(yīng)兩夜面間出現(xiàn)紫環(huán)(+)糖類高錳酸鉀試驗(yàn)退色(+)不飽和鍵茚三酮反應(yīng)不變色(一)氨基酸或肽三氯化鐵反應(yīng)無變化(一)酚類肽鍵測定無反應(yīng)(一)肽鍵2，4二硝基苯肼黃至紅色(+)羰基所以據(jù)此推斷，該物質(zhì)含不飽和鍵，可能含有糖苷類，無氨基酸或肽鍵，無酚類活性，含有羰基。紅外吸收檢測中顯示在1727nm處有吸收峰，表示其為一酯類化合物。在紫外吸收檢測中該物質(zhì)顯示在365、381、406處有吸收峰，在有吐溫80存在時(shí)其活性明顯減弱,這些均為多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的表現(xiàn)特征。由此我們斷定該物質(zhì)是多烯大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)，可能是七烯大環(huán)內(nèi)酯類。其PK值約在3—4。該活性成分物質(zhì)混合在發(fā)酵液中時(shí)，10(TC時(shí)15min不失活，但對光敏感。據(jù)有關(guān)資料記載，七烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不易被人腸道吸收。所以，作為內(nèi)服藥效果不好，可以作外用藥，開發(fā)為農(nóng)藥則對人畜安全。(三).菌種培養(yǎng)及發(fā)酵條件斜面培養(yǎng)基:該菌種斜面培養(yǎng)基為PDA或普通放線菌用培養(yǎng)基14液體發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)正交試驗(yàn)選擇搖床用發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉0.5—6%，葡萄糖0.5—6%，MgS040.05%，F(xiàn)e2S040.001%，K2HP040.05%，酵母膏0.5%，豆餅粉0.2%-~4%，魚粉0.2%—4%;水100ml;PH控制在4一10。將培養(yǎng)基滅菌后，接入菌種，置搖床，26°C—45"C培養(yǎng)。固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基可以使用農(nóng)副產(chǎn)品及其下腳料作基本原材料。植物類如稻、谷、玉米、麥類、高梁、豆類麩皮、玉米蛋白粉、玉米面、稻殼、豆皮等；各種榨取食用油后的餅粕，如豆餅、花生餅等；動(dòng)物類材料可以是各種含蛋白質(zhì)和碳水化合物的材料，如魚粉、蠶蛹粉、蛋白粉等，都可以作為菌種培養(yǎng)基的組合物。按照蛋白質(zhì)碳水化合物=1一7:9—3的比例配制培養(yǎng)基物料，添加培養(yǎng)基物料量的50%—300%的水混合，拌勻即可。要注意的是基料中要添加合適比例的皮、殼類物質(zhì)，以利于基料中空氣的存在和流通，一般為1%—10%左右。將培養(yǎng)基滅菌后，接入菌種，置26。C一45。C培養(yǎng)。(四).抑菌試驗(yàn)4.1.實(shí)驗(yàn)室抑菌譜測試試驗(yàn)4.1.1、試驗(yàn)?zāi)康拿鞔_S頂OOl菌產(chǎn)生的代謝物抑菌范圍，為安全合理使用及推廣提供理論和技術(shù)依據(jù)。4.1.2、材料與方法4.1.2.1.材料抑菌劑SIM001菌發(fā)酵原液離心得發(fā)酵液和菌泥，菌泥用丙酮提取，提取液濃縮去丙酮后與發(fā)酵液合并，用于抑菌能力的測定。供試菌其中稻瘟病蝕脈孢霉/^^3ri:朋rasi//et脂」z^i/s朋、稻梨孢毒尸j'i"icLLZarisorjzaeCarara禾口立枯絲核菌R力iz。cto/ia5"oZa/ivfj'j7/貝勾自北京微生物研究所，其余菌種均分離自陽光溫室染病經(jīng)濟(jì)作物的根、莖、葉明確病灶處。4.1.2.2.方法抑菌測試采用平皿濾紙圓片改良法。在無菌條件下，將供試菌均勻涂布在含有1%蛋白胨的PDA固體營養(yǎng)瓊脂表面，靜置2hr，使其充分附著。將O為lcm的濾紙圓片浸入發(fā)酵液中2min，用無菌鑷子夾出，于杯壁上盡量刮去多余的液體，然后置于涂布有供試菌的平皿表面，壓實(shí)，不要留有氣泡，以免測試不準(zhǔn)。將抑菌測試平皿倒置于26—45t:培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)，培養(yǎng)24hr—72hr，觀察濾紙圓片周圍形成的抑菌圈，測量抑菌圈的大小，記錄并比較之。4.1.3、結(jié)果表l，SIM001菌發(fā)酵液抑菌范圍測試<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>4.1.4、討論該菌劑的抑制真菌譜較廣，但是對細(xì)菌無效。實(shí)驗(yàn)室條件下能程度不同地抑制多種大棚蔬菜病害真菌，所以該菌劑應(yīng)為抗真菌的廣譜抑菌劑。若能適當(dāng)?shù)貪饪s，提高濃度或提取純的有效物質(zhì)來使用則效果會(huì)更好。4.2、大田實(shí)驗(yàn)4.2.1.例1、SIM001菌發(fā)酵液作為生物防霉劑水劑防治蘋果褐斑病藥效試驗(yàn)4.2.1.l.試驗(yàn)?zāi)康挠幸恍┮志镔|(zhì)在實(shí)驗(yàn)室的檢測中，表現(xiàn)非常好，但是一到田間，與植物結(jié)合后，卻變得無效或效果不明顯。而有一些抑菌物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)室的檢測中，表現(xiàn)平平，但是一到田間，與植物結(jié)合后，卻變得非常有效或效果非常明顯。這是多因素影響的結(jié)果。為明確SIM001菌發(fā)酵液田間抑菌能力，用其對蘋果褐斑病進(jìn)行防治效果實(shí)驗(yàn)，以檢測其與植物結(jié)合后的抗菌效果，為它安全合理使用及推廣提供技術(shù)、理論依據(jù)。4.2.1.2.供試作物蘋果，品種為紅富士。4.2.1.3.防治對象蘋果褐斑病[Marssoninamali(P.Henn)Ito];4.2.1.4.供試農(nóng)藥(1)、SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑SIM001菌液體培養(yǎng)72h—一144h，離心除去菌體，菌體用丙酮提取，提取液濃縮去丙酮后與發(fā)酵液合并用于生防測定。(2)50%撲海因可濕性粉劑(安萬特作物科學(xué)公司，市購)；(3)1%多氧清水劑(安徽績溪化工總廠，市購)。4.2.1.5.試驗(yàn)地概況本試驗(yàn)地安排在陜西省楊凌區(qū)大寨鄉(xiāng)東卡村3隊(duì)陳民生家3畝蘋果園，該園為9年生矮砧紅富士與短枝新紅星的混生園，株行距2X3m，本田塊土壤類型為壤土，肥力狀況好。本試驗(yàn)開始前10日未噴過其他殺菌劑，本試驗(yàn)開始時(shí)，田間零星可見蘋果褐斑病病葉。4.2.1.6.試驗(yàn)處理與實(shí)施實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)S頂001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑200倍和400倍；對照藥劑1750%撲海因可濕性粉劑1000倍，1%多氧清水劑300倍和400倍；另設(shè)清水對照，共計(jì)六個(gè)處理，每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)小區(qū)，每小區(qū)4株樹，各小區(qū)隨機(jī)排列。2003年7月19日噴藥，無風(fēng)，施藥器械為工農(nóng)一16型背負(fù)式手動(dòng)噴霧器，工作壓力為0.3—0.4Mpa，噴孔直徑1.3腿，藥液噴灑量為2kg/株，施藥三次，每次間隔7—10天。4.2.1.7.調(diào)查方法與結(jié)果計(jì)算每小區(qū)均選中間2株進(jìn)行調(diào)查，每株按東、西、南、北、中五個(gè)方位各固定一個(gè)當(dāng)年生枝條，調(diào)查其上的全部葉片，記錄總?cè)~數(shù)，病葉數(shù)和病斑數(shù)，每次施藥前后及最后一次藥后7天各調(diào)查一次，計(jì)算病情指數(shù)，病情增長率和防治效果。1).分級標(biāo)準(zhǔn)0級無病斑；1級病斑面積占整個(gè)面積的10%以下；3級病斑面積占整個(gè)面積的11%—25%;5級病斑面積占整個(gè)面積的26--40%以下；7級病斑面積占整個(gè)面積的41%—65%以下；9級病斑面積占整個(gè)面積的65%以下。2).防治效果計(jì)算公式各級病葉數(shù)x相對級值病情指數(shù)(％)=-xioo調(diào)査總?cè)~數(shù)x最高級數(shù)對照區(qū)病指增長率-處理區(qū)病指增長率防治效果(％)=-xioo對照區(qū)病指增長率4.2.1.8.結(jié)果與分析1).試驗(yàn)結(jié)果如附表1所示?？梢钥闯觯琒頂OOl菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑對蘋果褐斑病具有較好的預(yù)防和治療效果。第一次藥后7天，由于田間病情較輕，其防效相對高，各處理均達(dá)到100%。隨著時(shí)間延續(xù)和病情的發(fā)展，各處理防效開始出現(xiàn)一定程度的差異，第二次用藥后7天，供試藥劑SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑200倍和400倍的防效分別為84.89%禾口75.97%。連續(xù)噴三次藥后，各處理的防效較前有一定程度的提高，其200倍和400倍的防效分別為85.89%和77.05%。對照藥劑1%多氧清水劑300倍和400倍對蘋果褐斑病亦有較好的防治效果，且在同等劑量用量下，其效果與S頂001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑相當(dāng)。2).經(jīng)過對第二次藥后7天的防治效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(附表2，A)，結(jié)果表明，各處理間的差異達(dá)極顯著水平。進(jìn)一步地進(jìn)行差異顯著性比較，除SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑400倍和1%多氧清水劑400倍以及1%多氧清水劑300倍和撲海因WP1000倍無顯著差異外，其它處理間均有顯著或極顯著的差異。3).田間觀察表明，供試藥劑在試驗(yàn)計(jì)量下對蘋果是安全的。藥劑使用后，果樹葉片油綠肥厚，似有增肥效果。4.2.1.9.結(jié)論本試驗(yàn)結(jié)果表明，SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑為防治蘋果褐斑病的一種有效藥劑。建議進(jìn)行大面積示范推廣，推薦劑量為輕度發(fā)生時(shí)，使用400倍液；中等程度發(fā)生時(shí)，可適當(dāng)提高使用劑量。建議在病害初發(fā)生時(shí)開始使用，一般應(yīng)連噴三次，每次間隔7—10天。附表2生物防霉劑水劑防治蘋果斑病效果調(diào)査表附表3各小區(qū)防效及反正弦轉(zhuǎn)換值附表4變量分析表19附表2生物防霉劑水防治蘋果褐斑病效果處理防前病指第一次藥后7天第二次藥后7天第三次藥后7天病指防效(%)病指防效(%)病指防效(%)生物防霉劑水劑200倍0.000.001000.8984.281.3485.89生物防霉劑水劑400倍0.000.001001.3675.972.1877.051%多氧清水齊!1300倍0.000.001001.2278.451.6382.841%多氧清水劑400倍0.000.001001.3176.862.0678.3250%撲海因可濕性粉劑1000倍0.000.001001.2178.621.7581.58清水對照0.000.09—5.66—9.50一附表3各小區(qū)防效及反正弦轉(zhuǎn)換值(第三次藥后7天)處理防治效果(°/。)反正弦轉(zhuǎn)換值12341234■E生物防霉劑水劑200倍86.6785.8385.7885.2568.6167.8667.8667.45271.78生物防霉劑水劑400倍78.4077.1475.9676.9762.3161.4160.6761.34245.731%多氧清水劑300倍83.4683.3380.3682.9766.0365.8863.7265.65261.281%多氧清水劑400倍79.7776.6778.8977.7463.2961.1462.6561.82248.950%撲海因可濕性粉劑畫倍82.8878,9380.5982.7865.5762.6563.8765.50257.59合計(jì)—_一—325.81318.94318.77321.761285.28附表4變量分析表變異來源自由度平方和均方F值FO,05FO.01處理間4107.4326.8641.973,265.41重復(fù)間36.512.173.393.49誤差127.620.64總變異19121.564.2.3.例2、SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑防治番茄葉霉病效果試驗(yàn)番茄葉霉病[ClodosporiumfulvuraCooke]是番茄栽培中的常發(fā)性病害之一，通?？稍斐蓽p產(chǎn)10%-15%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%以上，經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前生產(chǎn)上一般以化學(xué)藥劑防治為主控制危害。SIM001防霉劑是一種新型微20生物制劑，具有無毒無公害綠色制劑特點(diǎn)。為了明確其殺茵防病效果，開展了該制劑防治番茄葉霉病的田間藥效試驗(yàn)?，F(xiàn)將結(jié)果簡報(bào)如下4.2.2.1.材料與方法試驗(yàn)在陜西省科學(xué)院渭南科技示范基地蔬菜地進(jìn)行。供試藥劑為SIM001菌液體培養(yǎng)96h—一120h，離心除去菌體產(chǎn)生的發(fā)酵原液作為生物防霉劑水劑;對照藥劑為75%百菌清可濕性粉劑(青島東大藥業(yè)有限公司生產(chǎn))；供試番茄品種為L402番茄，2002年2月14-15日定植。試驗(yàn)設(shè)SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑100、200、300倍液，75%百菌清600倍液及清水對照(CK)5個(gè)處理，重復(fù)3次，隨機(jī)排列，小區(qū)面積16m2共15個(gè)小區(qū)。于番茄葉霉病發(fā)生初期開始第一次用藥，以后每隔7天1次，共噴3次。采用工農(nóng)16型背負(fù)式噴霧器常規(guī)噴霧，以葉背葉面均勻周到，不滴藥液為宜，小區(qū)用藥液量均為75kg.667m—2。防效調(diào)查每小區(qū)對角線5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)2株共10林。分別于每次施藥前和第3次施藥后7天調(diào)査每株上中下3個(gè)葉片，根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)分別記錄葉片發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。同時(shí)，每次施藥后連續(xù)觀察番茄植株的葉片、果實(shí)、花器等是否產(chǎn)生藥害。分級標(biāo)準(zhǔn)0級，葉片無病斑；1級，葉片上有1-2個(gè)病斑；2級，葉片上有3-7個(gè)病斑；3級，葉片上有8-10個(gè)病斑，病斑交接明顯；4級，葉片上有10個(gè)以上病斑，且病斑相連，葉片萎焉。計(jì)算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>對照病情指數(shù)增加值-處理病情指數(shù)增加值防治效果％=__X100%對照病情指數(shù)增加值4.2.2.2.結(jié)果與分析田間試驗(yàn)結(jié)果表明，SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑對番茄葉霉病具有較好的防治作用(表5)。第2次藥后7天調(diào)査，防霉劑100、200倍液防效為75.2%和74.9%。表5SIM001防霉劑防治番茄葉霉病效果防前第1次藥后7天第2次藥后7天第3次藥后7天藥劑與處理病指病指防效(％)病指防效o)病指防效(％)防霉劑100倍液14.718.842.6b19.675.2a23.378.9a防霉劑200倍液13.819,041.5b19.074.9a23.376.8a防霉劑300倍液15.120.934.3c22,960.4c30,462.6c百菌清600倍液14.418.060.7a20.768.4b25.572.8b清水對照(CK)13.922.8—33.9一54.8—*表中病指為3次重復(fù)平均值，顯著性測驗(yàn)采用"DMRT"法，字母相同者為5%水平差異不顯著第3次藥后7天防效分別78.9%和76.8%，效果均優(yōu)于對照藥劑756%百茵清600倍液。且SIMOOl菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑lOO、200倍液防效差異不顯著。但S頂001防霉劑防治番茄葉霉病的速效性較差，第1次用藥后7天防效僅為40%左右，低于對照藥劑75%百茵清(防效60.7%)，這說明SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑藥效作用較慢，需連續(xù)使用2次以上。同時(shí)，試驗(yàn)表明噴施防霉劑后對番茄植株安全，葉片、果實(shí)、花器均無藥害出現(xiàn)出現(xiàn)，證明防霉劑在番茄上使用十分安全。4.2.2.3.結(jié)論化學(xué)農(nóng)藥對蔬菜的使用污染己嚴(yán)重威脅著人們的生活質(zhì)量和我國加入WTo后蔬菜的市場競爭力，尋求防治病蟲效果良好又無毒無公害的防治新制劑使綠22色食品蔬菜生產(chǎn)的關(guān)鍵所在。本試驗(yàn)結(jié)果初步表明，SIM001防霉劑對番茄葉霉病具有較好的防治效果，連續(xù)使用2次以上，防效可達(dá)70%以上，且對作物十分安全，無明顯藥害發(fā)生。4.2.3.例3、SIM001菌產(chǎn)生的微生物農(nóng)藥一一防霉劑防治日光溫室黃瓜黃霉病、灰霉病的效果試驗(yàn)黃瓜霜霉病[Pseudoperonosporacubensis]和灰霉病[Botrytiscinerea]是保護(hù)地黃瓜栽培中兩大主要病害，通常造成減產(chǎn)20%50%，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致絕產(chǎn)。因棚室溫濕條件極利于發(fā)病，目前生產(chǎn)上一般以化學(xué)藥劑防治為主。但由于化學(xué)農(nóng)藥防治不僅造成環(huán)境污染，而且引起病害抗藥性增長，因此，篩選開發(fā)新的高效低毒防治藥劑，減輕病原菌的抗藥性的產(chǎn)生，是目前蔬菜病害防治研究的主攻目標(biāo)之一。微生物農(nóng)藥一SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑是應(yīng)用微生物發(fā)酵技術(shù)研制開發(fā)的一種新型微生物農(nóng)藥，具有無毒無公害綠色制劑特點(diǎn)。為了明確防霉劑對黃瓜霜霉病、灰霉病的防治效果，評價(jià)了制劑的保產(chǎn)性及安全性，以期為制劑配方的完善和生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。我們于2003年3—7月開展了本項(xiàng)試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下4.2.3.1.材料與方法4.2.3.1.1處理設(shè)計(jì)防治黃瓜霜霉病設(shè)SIM001菌產(chǎn)生的水劑微生物農(nóng)藥一防霉劑(菌劑發(fā)酵原液)IOO、200、00倍液；72%克露WP(美國杜邦公司)；600倍液及空白對照(清水)共5個(gè)處理。防治黃瓜灰霉病設(shè)SIM001菌產(chǎn)生的水劑100、200、300倍液；50%速克靈(日本住友公司)600倍液及空白對照共5個(gè)處理。4.2.3.1.2試驗(yàn)方法4.2.3.1.2.1室內(nèi)試驗(yàn)室內(nèi)試驗(yàn)在陜西省科學(xué)院渭南科技示范基地綜合實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，分別于田間黃瓜霜霉病發(fā)生初期、黃瓜灰霉病發(fā)生高峰期采集新鮮病葉(霜霉病)或花器萎焉的幼瓜(灰霉病)。霜霉病每處理5個(gè)病葉，按處理在己配制好的藥液中浸漬，置于直徑40cm高20cm的塑料盆中，并用蘸水棉球保濕，上蓋塑料薄膜；分別于試驗(yàn)前及用藥后3.5天按分級標(biāo)準(zhǔn)逐葉記載病情發(fā)生情況，計(jì)算分析各處理防治效果；灰霉病每處理10個(gè)幼瓜，用病瓜逐一進(jìn)行常規(guī)接菌后靜置12小時(shí)，再按處理在己配制好的藥液中浸漬瓜條，同樣置于直徑40cm高20cm的塑料盆中，并用蘸水棉球保濕，上蓋塑料薄膜，藥后3—5天統(tǒng)計(jì)各處理的病瓜率，計(jì)算分析各處理防治效果。4.2.3.1.2.2大田試驗(yàn)試驗(yàn)在陜西省科學(xué)院渭南科技示范基地溫室黃瓜棚進(jìn)行。黃瓜品種為津春3號，2002年9月28日播種育苗，11月57日定植大田。試驗(yàn)設(shè)兩組，1組為黃瓜霜霉病防治試驗(yàn)，小區(qū)面積16m2共15個(gè)處理小區(qū)，各處理3次重復(fù)。于黃瓜發(fā)病初期開始第一次噴藥，以后每隔5d噴一次，共噴3次。采用工農(nóng)一16型背負(fù)式噴霧器常規(guī)噴霧，以葉背葉面均勻周到，不滴藥液為宜，小區(qū)噴藥液量均為1125kg.hnf2。另1組為黃瓜灰霉病防治試驗(yàn)，試驗(yàn)方法同第1組。4.2.3.1.3效果調(diào)査分別于每次噴藥前和第3次噴藥后5d調(diào)查病情發(fā)展程度，調(diào)查時(shí)，灰霉病每小區(qū)隨機(jī)調(diào)查20個(gè)瓜條，統(tǒng)計(jì)病瓜率并計(jì)算分析防治效果霜霉病每小區(qū)隨機(jī)取10株，每株自下而上調(diào)查全部葉片數(shù)，采用5級分級標(biāo)準(zhǔn)(以葉片為單位〉記載，計(jì)算各處理病情指數(shù)和防治效果。每次采瓜時(shí)按小區(qū)單收稱重，折合成hm2產(chǎn)量，比較各處理保產(chǎn)效果。試驗(yàn)期間注意觀察記載黃瓜生長發(fā)育、黃瓜長勢及是否有藥害現(xiàn)象等。4.2.3.1.4病害分級標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計(jì)公式霜霉病分級標(biāo)準(zhǔn)0級葉片無發(fā)?。籌級病斑占葉面積1/5以下；II級病斑占葉面積1/51/3以下；III級病斑占葉面積1/31/2以下；IV級病斑占葉面積1/2以上。統(tǒng)計(jì)計(jì)算方法E(病級葉片數(shù)x代表級值)病情指數(shù)％=---xioo調(diào)查總?cè)~片數(shù)x發(fā)病最高代表級值對照病指增加值(病果率)一處理病指增加值(病果率)防治效果％=-xioo對照病指增加值(病果率)4.2.3.2.結(jié)果分析4.2.3.2.1.對黃瓜霜霉病防治效果室內(nèi)測定結(jié)果表明，與清水對照相比，試驗(yàn)各處理對黃瓜霜霉病均有一定的防治效果，并以防霉劑100、200倍液及72%克露600倍液效果較好達(dá)75%以上，可有效控制病害蔓延發(fā)展，且防效差異不顯著。田間試驗(yàn)結(jié)果見表6，由表6可以看出，在黃瓜生長期，隨著S頂001菌產(chǎn)生的微生物農(nóng)藥一防霉劑使用濃度的增大，對黃瓜霜霉病防治效果也隨之提高，噴施300、200、100倍液防效依次為62.7%、79.1%和78.3%，與室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致。而防霉劑100、200倍液防效差異不顯著，且與化學(xué)藥劑72%克露WP600倍液防效(78.3%)相當(dāng)。同時(shí)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用防霉劑3個(gè)濃度處理區(qū)黃瓜植株發(fā)育正常，葉色濃綠，葉片平整，瓜條商品性好，無藥害現(xiàn)象發(fā)生，證明使用防霉劑對作物安全無害。表6.不同處理對黃瓜霜霉病防效比較與保產(chǎn)效果藥劑與處理防前防后防治效果折合產(chǎn)量保產(chǎn)率病情指數(shù)病情指數(shù)％(kg/hm2)(%)防霉劑100倍液11.717.179.1a6302023.7a防霉劑200倍液12.518.278.3a6285023.3a防霉劑300倍液12.]21.862.7b5792013.7b720/?？寺禬P600倍11.817.478.3a6289023.4a25清水對照(CK)12.238.2—50960—※數(shù)據(jù)為三次重復(fù)平均值，￥/著性測驗(yàn)采用"DMRT"法，表中相同字母表示5%水平無顯著差異。下同。產(chǎn)量測定結(jié)果證明SIM001菌產(chǎn)生的微生物農(nóng)藥一防霉劑100、200倍液噴霧保產(chǎn)效果較好，分別為23.7%和23.3%，與殺菌劑72%杜邦克露600倍液(23.4%)基本相當(dāng)，多重比較結(jié)果，產(chǎn)量差異不顯著。而SIM001防霉劑300倍液保產(chǎn)效果差異明顯。綜上分析，可以得出SIM001菌產(chǎn)生的微生物農(nóng)藥——防霉劑200倍液田間噴霧對黃瓜霜霉病有良好的防治效果。4.2.3.2.2.對黃瓜灰霉病防治效果(表7)試驗(yàn)結(jié)果表明，無論是室內(nèi)還是田間測定，SIM001菌產(chǎn)生的微生物農(nóng)藥——防霉劑各處理濃度對黃瓜灰霉病均有一定的防治效果，室內(nèi)測定防效僅為23.6%—43.3%，大田試驗(yàn)結(jié)果防治效果在16.7%—37.2%之間，但明顯低于對照化學(xué)藥劑50%速克靈600倍液(防治效果73.1%—88.2%)。說明SIM001菌產(chǎn)生的微生物農(nóng)藥一防霉劑若要將其作為黃瓜灰霉病防治藥劑，還需在配方上進(jìn)一步改進(jìn)或完善，以提高其防治應(yīng)用效果。表7.不同處理對黃瓜灰霉病防治效果比較室內(nèi)實(shí)驗(yàn)大田實(shí)驗(yàn)藥劑與處^"藥前病瓜率一^"^~防治效果藥前病瓜率~藥后15d防治效果(%)病瓜率(％)病瓜率(％)防霉劑100倍濃033,341.3b8.310.737.2b防霉劑200倍液033.341.3b10.016.535.5b防霉劑300倍液043.323.6c8.316.616.7c50%速克靈600倍06.788.2a11.714.473.1a清水對照(CK)056.7—8.318.3一4.2.3.3.結(jié)論與建議4.2.3.3.1.室內(nèi)及田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明，SIM001菌產(chǎn)生的微生物農(nóng)26藥防霉劑葉面噴霧可有效防治黃瓜霜霉病發(fā)生危害，具有防效好、安全無害的特點(diǎn)，適合用于己對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的黃瓜霜霉病的防治。大田使用濃度以防霉劑200倍液為宜，間隔時(shí)間5—7天，并應(yīng)連續(xù)噴施2—3次，則可有效控制黃瓜霜霉病的發(fā)生危害。4.2.3.3.2.本試驗(yàn)結(jié)果說明，SIM001菌產(chǎn)生的水劑微生物農(nóng)藥防霉劑對黃瓜灰霉病防治效果不理想。建議在配方上進(jìn)一步改進(jìn)或完善，拓寬防治譜，提高防治效果。4.2.4.例4、微生物農(nóng)藥一SIM01菌劑防治大棚溫室番茄根結(jié)線蟲病的效果試驗(yàn)蔬菜根結(jié)線蟲(為南方根結(jié)線蟲#e7oiob^77ei/co卵i'm;是一種世界性分布的威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要病原物，是近年來一種重要作物根部病害，是世界各國的對外檢疫對象。根結(jié)線蟲病也是國內(nèi)外最為嚴(yán)重的植物病害之一，這種病害在溫室、大棚和露地等栽培的作物上都有發(fā)生，一般造成作物減產(chǎn)20%—30%，嚴(yán)重的達(dá)50%以上，已成為當(dāng)前蔬菜生產(chǎn)的一大障礙。對于根結(jié)線蟲的防治，歷來以化學(xué)藥劑為主。由于化學(xué)藥物殘留易造成土壤板結(jié)、作物毒化，通過食物鏈再給人類帶來危害，因此，通過不產(chǎn)生公害、無殘留的生物防治來控制根結(jié)線蟲的技術(shù)越來越受到人們重視。從微生物中尋找對根結(jié)線蟲有抑殺作用的藥劑成為近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn)。我們用SIM001菌劑對番茄根結(jié)線蟲進(jìn)行了防治效果及安全性評價(jià)。以期為該制劑應(yīng)用范圍提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下-4.2.4.1.材料與方法4.2.4.1.l.供試作物大棚溫室番茄(西安市長安區(qū))。4.2.4.1.2.供試對照藥劑:4.2.4.1.2.1.3%米樂爾顆粒劑(廣州農(nóng)藥廠生產(chǎn)，市售)4.2.4.1.2.2.SIM01菌劑供試菌劑的制備27供試菌種SIM01菌劑分成液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種。a.用液體培養(yǎng)液34"C搖床振蕩培養(yǎng)4天，原發(fā)酵液含活菌菌液備用；b.用固體培養(yǎng)基34t:培養(yǎng)6天，為固體活菌菌劑直接備用。4.2.4.1.3.試驗(yàn)處理在長安區(qū)溫室蔬菜病地上，劃分12個(gè)長方形小區(qū)，每小區(qū)面積為4m2(4X1)，每小區(qū)2行20株。實(shí)驗(yàn)共設(shè)防霉菌劑-a、防霉菌劑-b、3%米樂爾和清水空白對照四個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。液體菌劑按每小區(qū)1000ml灌根蓋土；固體菌劑則在番茄苗根部周圍挖穴，以每株50g的使用量拌土填入后蓋土；對照藥米樂爾施用量按45kg/ha換算，拌土根施后蓋土；對照用清水拌土同法進(jìn)行處理。各植株均勻?yàn)⑺３譂駶櫋?.2.4.1.4.試驗(yàn)調(diào)查;藥效調(diào)查于施藥處理后30天、處理后100天在各試驗(yàn)小區(qū)采樣，每點(diǎn)采5株，把番茄苗挖出后放清水中輕輕沖掉泥土，稱重后只留根系進(jìn)行檢查。觀察番茄根部結(jié)節(jié)數(shù)，以其結(jié)節(jié)數(shù)的多少作為防效計(jì)算基數(shù)。同時(shí)測植株高度。計(jì)算防治效率和植株的增高率。用DMTR法檢驗(yàn)各處理間的差異是否顯著。4.2.4.1.5.計(jì)算公式2(病株數(shù)X相應(yīng)病級)病情指數(shù)(%)=-X100調(diào)査總株數(shù)X4對照區(qū)病情指數(shù)一防治區(qū)病情指數(shù)相對防效(%)二--X100對照區(qū)病情指數(shù)Pt2株高-Pt,株高增高率(％):-X100Pt,株高(注Pt,為處理30天，Pt2為處理后100天)O級:整個(gè)根系無根結(jié)1級整個(gè)根系的1%-20%有根結(jié)2級整個(gè)根系的21%-40%有根結(jié)3級整個(gè)根系的41%-60%有根結(jié)4級:整個(gè)根系的61%以上有根結(jié)4.2.4.2.結(jié)果與分析(表8)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌劑在田間對番茄根結(jié)線蟲有一定的防治效果。其中，SIM001—b菌劑的處理效果最好。處理后30天的防效為73.37%，與對照藥3%米樂爾的防效87.75%差異顯著，以對照藥3%米樂爾的防效為優(yōu)良；處理后100天則SIM001菌劑的防效有所上升，達(dá)88.74%，與對照藥米樂爾的防效73.08%差異顯著，此時(shí)，以SIM001—b菌劑的處理效果好，S頂001—a處理的效果次之。從發(fā)病程度看S頂001—b處理的田間發(fā)病最輕，其根結(jié)指數(shù)21.03%，與對照藥米樂爾和SIM001-a菌劑的處理有顯著差異。從植株生長情況看，以SIM001-b菌劑的處理效果最好，處理后100天番茄苗增高率達(dá)92.03%，與空白對照增高率55.10%差異非常顯著。其次是S頂001-a菌劑的處理，增高率達(dá)87.12%。結(jié)果表明SIM001菌劑對番茄生長有一定的促進(jìn)作用。表8SIM001菌劑防治番茄根結(jié)線蟲田間試驗(yàn)結(jié)果處理30天相對防效(%)100天相對防效(%)病情指數(shù)(%)增高率(%)SIM01菌劑-a71.04bB肌71aA28.1IbB87.12abASIM01菌劑-b73.37bB88.74aA21.03cG92.03aA米樂爾3%87.75aA74.11aA38.36bcBC76.86abACK91,62aA55.10bA注小寫字母為0.05顯著水平，大寫字母為0.01顯著水平。4.2.4.3.討論4.2.4.3.1.SIM001菌劑菌在田間土攘中對番茄根結(jié)線蟲病有較高的抑制作用。294.2.4.3.2.SIM001菌劑在處理后100天的防效比30天的防效略有上升，而對照藥米樂爾處理后100天的防效比30天的防效有所下降。表明化學(xué)藥品藥效隨著時(shí)間推移會(huì)有所下降，但是SIM001活菌劑菌在田間的防效卻隨著該活菌的定植而效果持久，后效作用明顯。4.2.4.3.3.試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，SIM001菌劑對番茄苗生長有一定的促進(jìn)作用，這一結(jié)果可能與施到土壤里的菌劑成分有關(guān)。即菌劑中帶有其培養(yǎng)物和代謝物成分，這些物質(zhì)可能給植物帶來新的營養(yǎng)或生長因子，起到肥效作用，而使植株健壯，增高加快。4.2.4.3.4.生防菌與線蟲、作物和土壤各因子之間的相互作用關(guān)系以及如何創(chuàng)造更合適的條件才能更有利于菌種定植，縮短起始期的時(shí)間等等還有待進(jìn)一步研究。但是實(shí)驗(yàn)表明用非化學(xué)性的微生物防治則不失為生物防治中最有前途的方法之一。五、毒力測試陜西省疾病預(yù)防控制中心對SIM001菌產(chǎn)生的生物防霉劑水劑毒性檢測報(bào)告樣品編號農(nóng)N(2003)第0017號樣品名稱生物農(nóng)藥(抗霉劑)樣品來源送檢樣品性狀棕色液體檢驗(yàn)依據(jù)GB15670-1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》檢驗(yàn)項(xiàng)目大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)檢驗(yàn)類別皿樣品數(shù)量1000ml收樣閂期2003年09月19日檢驗(yàn)完成Fl期2003年11月10日5.1.受試物SIM001菌劑由發(fā)酵液組成生物農(nóng)藥(抗霉劑)。取受試物30g加蒸溜水至50ml，充分混勻。5.2.試驗(yàn)動(dòng)物由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SN大白鼠20只，雌、雄各半，體重180-220g，一級動(dòng)物(醫(yī)動(dòng)字第08-005號)。飼料、墊料來源同上。5.3.動(dòng)物室環(huán)境溫度21-24°C，相對濕度45%-55%。動(dòng)物房合格證號醫(yī)動(dòng)字第08-32號。5.4.試驗(yàn)方法取禁食16h的試鼠20只，將受試物按6000mg/kg.bw的劑量(灌胃容量1.0ml/100g.bw)，一次灌胃給予，連續(xù)觀察14d，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。5.5.試驗(yàn)結(jié)果:觀察期內(nèi)未見試鼠出現(xiàn)任何中毒癥狀，體重?zé)o異常變化。.故雌、雄大白鼠急性經(jīng)口毒性LD50)6000mg/kg。5.6.結(jié)果評價(jià)按GB15670-1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》中評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，生物農(nóng)藥(抗霉劑)大鼠經(jīng)口急性毒性屬低毒級。權(quán)利要求1、一種抗生鏈霉菌，其特征在于命名為SIM001的抗生鏈霉菌是西安保藏變異種的亞種(Streptomycesantibioticussubspeciesxi’an)；由60Co-r射線誘變，經(jīng)篩選獲得；該菌種已在國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位進(jìn)行了專利保藏，保藏日期為2005年4月14日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.1349。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生鏈霉菌，其特征在于:該菌種的16SrDNA序列圖譜為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生鏈霉菌，其特征在于該菌的全細(xì)胞水解液含有L，L-DAP(二氨基庚二酸Diaminopimelicacid)，無特征性糖；細(xì)胞壁屬于I型；糖型C;其在生長代謝過程中能產(chǎn)生抗廣譜真菌的抗菌活性成分，這些抗菌活性成分主要為兩種物質(zhì)，其中之一是多烯大環(huán)內(nèi)酯類。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生鏈霉菌，其特征在于菌種培養(yǎng)及發(fā)酵條件為斜面培養(yǎng)基該菌種斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基或普通放線菌用培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為26。C一45°C;液體發(fā)酵液體發(fā)酵用培養(yǎng)基經(jīng)正交試驗(yàn)選擇，確定搖床用發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分為可溶性淀粉0.5--6%，葡萄糖0.5--6%，MgS040.05%，F(xiàn)e2S040.001%K2HP040.05%，酵母膏0.5%，豆餅粉0.2%—4%，魚粉0.2%--4%;水100ml;PH控制在4—10;將培養(yǎng)基滅菌后，接入菌種，置搖床，26°C--45。C培養(yǎng)。固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基可用各種農(nóng)副產(chǎn)品及其下腳料作培養(yǎng)基的主要成分。包括稻、谷、玉米、麥類、高梁、豆類的面粉及其加工下腳料等；麩皮、玉米蛋白粉、玉米面、稻殼、豆皮等；各種榨油后的餅粕，如豆餅、花生餅等；各種含蛋白質(zhì)和碳水化合物的動(dòng)物材料，如魚粉、蠶蛹粉、蛋白粉等均可以作為菌種培養(yǎng)基的組合物；按照蛋白質(zhì)碳水化合物=1一7:9—3的比例配制培養(yǎng)基物料，添加基料量50%—300%的水混合，拌勻即可；基料中添加合適比例的皮、殼類物質(zhì)，為1一10%;將培養(yǎng)基滅菌后，接入菌種，置26"—45"培養(yǎng)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生鏈霉菌，其特征在于該菌種經(jīng)液體發(fā)酵72h—170h，由發(fā)酵原液制成該菌劑一生物防霉劑水劑對包括稻瘟病蝕脈孢霉尸〃su'膽ra57'//ez^/z爿z^j'/75W、禾舀梨孢霉尸j'"'c〃7srj'aory幼eCarars和立枯絲核菌to/7J'SW7s/7iA7i力/7在內(nèi)的多種真菌有抑制作用；對蘋果褐斑病、番茄葉霉病、日光溫室黃瓜黃霉病、灰霉病等多種植物真菌病有防治作用；使用帶有培養(yǎng)代謝成分的菌劑還有促植物生長作用。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生鏈霉菌，其特征在于該菌劑其由液體、固體發(fā)酵制成的菌劑可用于防治植物根結(jié)線蟲病害。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生鏈霉菌，其特征在于該菌種包括原始菌種發(fā)酵制成的液體、固體菌劑、提取物，用于防治植物根結(jié)線蟲病害、真菌病害。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗生鏈霉菌，其特征在于該菌種發(fā)酵物、其提取物可制成醫(yī)用、農(nóng)用用途的抗生制劑、促生長制劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種抗生鏈霉菌，其發(fā)酵產(chǎn)物可抑制廣譜真菌、原蟲，大田實(shí)驗(yàn)?zāi)芊乐巫魑镎婢『透Y(jié)線蟲。效果好，不產(chǎn)生公害、無殘留。本菌制劑對人的危害性非常低，做醫(yī)用和農(nóng)用都具有良好的性能和開發(fā)前景。本發(fā)明命名為SIM001的抗生鏈霉菌是西安保藏變異種的亞種(Streptomycesantibioticussubspeciesxi’an)，該菌種已在國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局指定的保藏單位進(jìn)行了專利保藏，保藏日期為2005年4月14日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.1349。該菌的全細(xì)胞水解液含有L，L-DAP(二氨基庚二酸Diaminopimelicacid)，無特征性糖；細(xì)胞壁屬于I型；糖型C；主要抑菌物質(zhì)之一是多烯大環(huán)內(nèi)酯類，為廣譜型抗真菌類物質(zhì)。文檔編號C12N1/20GK101463332SQ200710199250公開日2009年6月24日申請日期2007年12月17日優(yōu)先權(quán)日2007年12月17日發(fā)明者呂之堯,郭崇華申請人:郭崇華被以下專利引用(1),