專利名稱：用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)、保存的液體培養(yǎng)基和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于梨形四膜蟲(7^ra/^m^7a pn/w7m'"的無菌純種培養(yǎng)的液體培 養(yǎng)基和方法，本發(fā)明還涉及一種用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基和方法。
背景技術(shù)：
梨形四膜蟲(r"m/^wew" ;^;/^m的屬于原生動(dòng)物門寡膜綱膜口目四膜科四膜蟲屬 的一種。該屬目前已知有10余種，世界性分布，主要產(chǎn)自淡水，也有的生活于咸水或 溫泉中。體長40 60微米，成倒卵形或梨形。口位于腹面前方正中，體表被以縱纖毛 帶，口后纖毛帶一般為2條。胞肛和2個(gè)伸縮泡孔均位于細(xì)胞后端。無性生殖為橫分 裂。有性生殖為接合生殖。合子核分裂分化產(chǎn)生新的大小核，兩細(xì)胞分開、分裂。
四膜蟲，作為一種外面覆蓋有類似頭發(fā)的纖毛的單細(xì)胞生物，雖然并非是最為耀 眼的真核生物，但它自身所具有的一系列生理特性卻使其在生化研究領(lǐng)域逐漸被公認(rèn) 為一種功能強(qiáng)大的模式生物。具體而言，四膜蟲在無菌培養(yǎng)基中生長繁殖迅速(2.5 小時(shí)/代)，耐受溫度范圍較寬；由于對(duì)一種嘌呤、 一種嘧啶以及一些氨基酸的絕對(duì)需 求，所以易于進(jìn)行放射性標(biāo)記；大量培養(yǎng)時(shí)，其生活周期中的有性生殖階段——接合， 易于誘導(dǎo)同步性；營養(yǎng)細(xì)胞大(30nmx5(Vm),可以進(jìn)行顯微注射以及光學(xué)顯微鏡分 析。此外，最新的研究發(fā)現(xiàn)，由于四膜蟲具有一個(gè)相對(duì)于大腸桿菌而言更為巨大的膜 系統(tǒng)，可以管理大腸桿菌所無法管理的蛋白，所以其在真核生物蛋白的過度表達(dá)這一 生物技術(shù)領(lǐng)域也表現(xiàn)出較為優(yōu)勢(shì)的應(yīng)用前景。
以上這些在結(jié)構(gòu)和行為方面所具有的優(yōu)勢(shì)特征，使得四膜蟲成為真核細(xì)胞基因工 程研究的理想材料。但現(xiàn)有技術(shù)在培養(yǎng)四膜蟲時(shí)，所采用的培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)條 件苛刻。例如，梨形四膜蟲的培養(yǎng)基通常包括葡萄糖、麥芽糖、胰蛋白胨、鉗合蛋白、 牛肉浸膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵多種營養(yǎng)成分，并需要使用 恒溫水浴搖床進(jìn)行搖瓶通氣振蕩培養(yǎng)，操作復(fù)雜。而四膜蟲的長期保存則需要在一80 'C超低溫冷凍條件下進(jìn)行，不僅操作復(fù)雜，而且在使用之前必需將其融化復(fù)壯，這一 過程往往導(dǎo)致四膜蟲大量死亡，存活的四膜蟲的細(xì)胞活性也大大降低，需要較長時(shí)間的恢復(fù)才能用于試驗(yàn)研究。因此如何簡便、快捷地獲得大量純種四膜蟲并將其在非凍 融狀態(tài)下長期保存而不受污染，常常成為影響相關(guān)試驗(yàn)研究進(jìn)度的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)在培養(yǎng)四膜蟲時(shí)所釆用的培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng) 條件苛刻的缺陷，從而提供一種成分簡單的用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，并 且提供一種使用這種培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，該方法可以簡便、快捷地獲得大量純種四膜 蟲。
本發(fā)明的另一目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)在長期保存四膜蟲時(shí)，需要超低溫冷凍，導(dǎo) 致操作復(fù)雜，且在使用前融化復(fù)壯時(shí)使得四膜蟲的存活率和細(xì)胞活性大大降低的缺陷， 從而提供一種用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基，并且提供一種使用這種培養(yǎng) 基的保存方法，該方法可以在非凍融狀態(tài)下長期保存四膜蟲且不受污染，也避免了由 此而導(dǎo)致的融化復(fù)壯操作，使得該方法操作簡便，保存的四膜蟲的死亡率降低，又同 時(shí)保存了活性。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明提供一種用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其為按照下述比例配制而
得將10.0 15.0g際蛋白胨(proteosepeptone)、 1,0 3.0g葡萄糖(glucose)和2.0 5.0g 酵母浸粉(yeast extract)溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0 7.5。
優(yōu)選的，本發(fā)明提供的用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其為將12.0g際蛋 白胨(proteose peptone)、 2.0g葡萄糖(glucose)和3,5g酵母浸粉(yeast extract)溶于1000ml 無菌蒸餾水中，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.2。
本發(fā)明提供一種采用上述液體培養(yǎng)基對(duì)梨形四膜蟲進(jìn)行純種培養(yǎng)的方法，其包括 將純種梨形四膜蟲以1.0 2.0%(體積比)接種于如前所述的液體培養(yǎng)基中，補(bǔ)充10.0 20.0mg/L鏈霉素，保證至少占培養(yǎng)容器空間2/3的給氧空間，25 3(TC下恒溫靜置培 養(yǎng)72 96小時(shí)。
在上述培養(yǎng)方法中，優(yōu)選的接種比例為2.0%。
在上述培養(yǎng)方法中，優(yōu)選的鏈霉素的劑量為20.0mg/L。
在上述培養(yǎng)方法中，優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為30'C。本發(fā)明所提供的用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基和方法可以簡便、快捷地獲 得大量純種四膜蟲，為真核細(xì)胞基因工程等相關(guān)生物技術(shù)領(lǐng)域的研究提供理想的試驗(yàn) 材料。
本發(fā)明提供一種用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基，其為按照下述比例配 制而得將4.0 6.0g際蛋白胨(proteosepeptone)、 40.0 60.0g葡萄糖(glucose)和3.0 5.0g酵母浸粉(yeast extract)溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0 7.5 。
優(yōu)選的，本發(fā)明提供的用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基，其為將5.0g際 蛋白胨(proteose peptone)、 50.0g葡萄糖(glucose)和4.0g酵母浸粉(yeast extract)溶于 1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.2。
本發(fā)明提供一種采用上述用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基對(duì)梨形四膜蟲 進(jìn)行保存的方法，其包括將純種梨形四膜蟲以5.0 20.0% (體積比)接種于如前所 述的用于保存的液體培養(yǎng)基中，保證至少占培養(yǎng)容器空間2/3的給氧空間，15 25°C 下恒溫靜置保存，每一年轉(zhuǎn)種細(xì)胞一次。
在上述培養(yǎng)方法中，優(yōu)選的接種比例為10.0%。
在上述培養(yǎng)方法中，優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為20。C。
本發(fā)明所提供的用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基和方法可將梨形四膜蟲 保存0.5 1.0年，有效地解決了其在非凍融狀態(tài)下長期保存而不受污染的問題，且操 作簡便、高效快捷、成本低廉，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步說明。下述實(shí)施例中所用方法如無特 別說明均為常規(guī)方法，所有培養(yǎng)基中的溶劑均為水。
實(shí)施例l、制備一種用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基I
將12.0g際蛋白胨、2.0g葡萄糖和3.5g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào) 節(jié)溶液的pH值為7.2，得到本發(fā)明的用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基I。實(shí)施例2、制備一種用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基II
將10.0g目示蛋白月東、1.0g葡萄糖和2.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào) 節(jié)溶液的pH值為7.0，得到本發(fā)明的用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基II。
實(shí)施例3、制備一種用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基m
將15.0g際蛋白胨、3.0g葡萄糖和5.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào) 節(jié)溶液的pH值為7.5，得到本發(fā)明的用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基III。
實(shí)施例4、梨形四膜蟲的無菌擴(kuò)大純培養(yǎng)
取城市生活污水處理廠曝氣池中的活性污泥作為試驗(yàn)樣品，輕輕搖晃使其混合均 勻。取一無菌培養(yǎng)皿，將少量活性污泥樣品倒入其中，置于解剖鏡下觀察。待發(fā)現(xiàn)所 需梨形四膜蟲(7^ra/7少meMa ; n/om^)，用移液槍將其吸出后注入另一裝有專用擴(kuò)大純 培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中備用。
取上述得到的純種梨形四膜蟲(7^ra/^me朋pn/orm的接種于含實(shí)施例1制備的液 體培養(yǎng)基I的無菌三角瓶中，接種比例為2.0% (體積比)，補(bǔ)充20.0mg/L鏈霉素，保 證至少占培養(yǎng)容器空間2/3的給氧空間，3(TC下恒溫靜置培養(yǎng)96小時(shí)。將此擴(kuò)大純培 養(yǎng)后的樣品置顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，健康細(xì)胞數(shù)量達(dá)106cdl/ml。
實(shí)施例5、梨形四膜蟲的無菌擴(kuò)大純培養(yǎng)
將純種梨形四膜蟲接種于含實(shí)施例2制備的液體培養(yǎng)基II的無菌三角瓶中，接種 比例為1.0% (體積比)，補(bǔ)充10.0mg/L鏈霉素，保證至少占培養(yǎng)容器空間2/3的給氧 空間，25'C下恒溫靜置培養(yǎng)72小時(shí)。將此擴(kuò)大純培養(yǎng)后的樣品置顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)， 健康細(xì)胞數(shù)量達(dá)105cell/ml。
實(shí)施例6、梨形四膜蟲的無菌擴(kuò)大純培養(yǎng)
將純種梨形四膜蟲接種于含實(shí)施例3制備的液體培養(yǎng)基III的無菌三角瓶中，接種 比例為1.5% (體積比)，補(bǔ)充15.0mg/L鏈霉素，保證至少占培養(yǎng)容器空間2/3的給氧 空間，28'C下恒溫靜置培養(yǎng)84小時(shí)。將此擴(kuò)大純培養(yǎng)后的樣品置顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，實(shí)施例7、制備一種用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基IV
將5.0g際蛋白胨、50.0g葡萄糖和4.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào) 節(jié)溶液的pH值為7.2，得到本發(fā)明的用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基IV。
實(shí)施例8、制備一種用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基V
將4.0g際蛋白胨、40.0g葡萄糖和3.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào) 節(jié)溶液的pH值為7.0，得到本發(fā)明的用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基V。
實(shí)施例9、制備一種用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基VI
將6.0g際蛋白胨、60.0g葡萄糖和5.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào) 節(jié)溶液的pH值為7.5，得到本發(fā)明的用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基VI。
實(shí)施例10、梨形四膜蟲的無菌長期保存
將純種梨形四膜蟲以10.0% (體積比)接種于實(shí)施例7制備的用于保存的液體培 養(yǎng)基IV中，保證至少占培養(yǎng)容器空間2/3的給氧空間，2(TC下恒溫靜置保存90天后， 取培養(yǎng)物復(fù)壯72小時(shí)。將此復(fù)壯后的樣品置顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，健康細(xì)胞數(shù)量達(dá) 105cell/ml。
實(shí)施例11、梨形四膜蟲的無菌長期保存
將純種梨形四膜蟲以5.0% (體積比)接種于實(shí)施例8制備的用于保存的液體培養(yǎng) 基V中，保證至少占培養(yǎng)容器空間2/3的給氧空間，15'C下恒溫靜置保存90天后，取 培養(yǎng)物復(fù)壯72小時(shí)。將此復(fù)壯后的樣品置顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，健康細(xì)胞數(shù)量達(dá) 105cell/ml。
實(shí)施例12、梨形四膜蟲的無菌長期保存
將純種梨形四膜蟲以20.0% (體積比)接種于實(shí)施例9制備的用于保存的液體培 養(yǎng)基VI中，保證至少占培養(yǎng)容器空間2/3的給氧空間，25'C下恒溫靜置保存90天后， 取培養(yǎng)物復(fù)壯72小時(shí)。將此復(fù)壯后的樣品置顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，健康細(xì)胞數(shù)量達(dá) 105cell/ml。
權(quán)利要求
1、一種用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其為按照下述比例配制而得將10.0～15.0g眎蛋白胨、1.0～3.0g葡萄糖和2.0～5.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0～7.5。
2、 如權(quán)利要求1所述的用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其特征在于其為 將12.0g際蛋白胨、2.0g葡萄糖和3.5g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào)節(jié)溶 液的pH值為7.2。
3、 一種對(duì)梨形四膜蟲進(jìn)行純種培養(yǎng)的方法，其包括將純種梨形四膜蟲以1.0 2.0%體積比接種于權(quán)利要求1所述的液體培養(yǎng)基中，補(bǔ)充10.0 20.0mg/L鏈霉素，保 證至少占培養(yǎng)容器空間2/3的給氧空間，25 3(TC下恒溫靜置培養(yǎng)72 96小時(shí)。
4、 如權(quán)利要求3所述的對(duì)梨形四膜蟲進(jìn)行純種培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 接種比例為2.0%。
5、 如權(quán)利要求3所述的對(duì)梨形四膜蟲進(jìn)行純種培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 鏈霉素的劑量為20.0mg/L。
6、 如權(quán)利要求3所述的對(duì)梨形四膜蟲進(jìn)行純種培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的 培養(yǎng)溫度為30°C 。
7、 一種用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基，其為按照下述比例配制而得 將4.0 6.0g際蛋白胨、40.0 60.0g葡萄糖和3.0 5.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸 餾水中，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0 7.5。
8、 如權(quán)利要求7所述的用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基，其特征在于 其為將5.0g際蛋白胨、50.0g葡萄糖和4.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào) 節(jié)溶液的pH值為7.2。
9、 一種對(duì)梨形四膜蟲進(jìn)行保存的方法，其包括將純種梨形四膜蟲以5.0 20.0% 體積比接種于權(quán)利要求7所述的用于保存的液體培養(yǎng)基中，保證至少占培養(yǎng)容器空間 2/3的給氧空間，15 25X:下恒溫靜置保存，每一年轉(zhuǎn)種細(xì)胞一次。
10、 如權(quán)利要求9所述的對(duì)梨形四膜蟲進(jìn)行保存的方法，其特征在于所述的接 種比例為10.0%。
11、 如權(quán)利要求9所述的對(duì)梨形四膜蟲進(jìn)行保存的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)溫度為2(TC。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于梨形四膜蟲的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，其為將10.0～15.0g眎蛋白胨、1.0～3.0g葡萄糖和2.0～5.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào)節(jié)pH為7.0～7.5而得。本發(fā)明將純種梨形四膜蟲以1.0～2.0％接種于該液體培養(yǎng)基中，補(bǔ)充10.0～20.0mg/L鏈霉素，保證給氧空間，25～30℃下恒溫靜置培養(yǎng)，可以簡便、快捷地獲得大量純種四膜蟲。本發(fā)明還涉及一種用于梨形四膜蟲的長期保存的液體培養(yǎng)基，其為將4.0～6.0g眎蛋白胨、40.0～60.0g葡萄糖和3.0～5.0g酵母浸粉溶于1000ml無菌蒸餾水中，并調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.5。本發(fā)明將純種梨形四膜蟲以5.0～20.0％接種于該液體培養(yǎng)基中，保證給氧空間，15～25℃下恒溫靜置保存，可將梨形四膜蟲保存0.5～1.0年，有效地解決了其在非凍融狀態(tài)下長期保存而不受污染的問題。
文檔編號(hào)C12N1/10GK101407764SQ20071017583
公開日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2007年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者娟 劉, 敏 楊 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心