專利名稱：一種用于婦科惡性腫瘤早期篩選的基因芯片及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及常見(jiàn)婦科惡性腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、子宮癌)的早期篩査方法, 具體地說(shuō)是常見(jiàn)婦科惡性腫瘤早期篩査與診斷的基因芯片及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤(包括肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌和宮頸癌等)是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見(jiàn)疾病。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年有490萬(wàn)新癌癥 患者，死亡者可達(dá)430萬(wàn)，每死亡10個(gè)人中就有一個(gè)死于癌癥。惡性腫瘤是人 類三大死因之一，僅次于心、腦血管疾病。對(duì)癌癥的防治除了在病因?qū)W上積極做好工作外，主要是"三早"措施，即 早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療。目前，對(duì)早期惡性腫瘤的治療往往可以取得 較好臨床效果，治愈率高，患者的生活質(zhì)量也因?yàn)槠涫中g(shù)范圍較小和化、放療 時(shí)間較短而大為提髙。同時(shí)，也有利于節(jié)省衛(wèi)生資源，減少醫(yī)療支出。因此， 癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療是降低死亡率及提高生存率的主要策略 之一。癌癥診斷主要是檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物，既惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的新陳代謝產(chǎn)物。腫瘤標(biāo)志物種類很多，目前發(fā)現(xiàn)的己有ioo多種。臨床上對(duì)于腫瘤的早期診斷主要采用腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，但由于其特異性較差，存在不易對(duì)腫瘤患者進(jìn)行 早期診斷，不能在全民中進(jìn)行普査等缺陷。開(kāi)發(fā)高特異性及高通量惡性腫瘤的 基因芯片及其檢測(cè)方法將有利于早期診斷、早期治療及全民普査，具有重大的 社會(huì)效益。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于常見(jiàn)婦科惡性腫瘤早期篩査診斷的特征基因 芯片的制備及其檢測(cè)方法，使常見(jiàn)婦科惡性腫瘤能夠盡早盡快篩選、確診和治療。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。用于常見(jiàn)婦科惡性腫瘤早期篩査診斷的寡核苷酸基因芯片制備的主要步驟是(1)經(jīng)大量研究得出在常見(jiàn)婦科惡性腫瘤患者的血液中癌癥基因表達(dá)功能明確且可檢測(cè)出的特征基因?yàn)槿橄侔㎜TA(NM—000595); VEGFA(M27281); ICAM1 (NM—000201); PRL(NM—000948); IGF1(NM—000618); BCL2(NM—000657); ERBB2(NM—004448); CXCL12(NM—000609); HMGA2(NM—003483); FAS(NM—000043); TNF(NM—000594); SYK(NMJ)03177); ACP5 (NM—001611); KLK2 (NM—005551); EGFR (NM—005228); IGFBP3(NM—000598);卵巢癌RASSF1 (NM_007182); CD44(X55150);子宮癌TNF (NM_000594); PRL (NM—000948); MDM2 (NM—002392); 薩P9 (NM—004994);IL-10 (NM_000572);(2) 根據(jù)基因序列號(hào)，利用數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI,確定上述特征基因的完整序列；(3) 找出與上述常見(jiàn)婦科惡性腫瘤特征基因互補(bǔ)的基因，制備出長(zhǎng)約 20-50個(gè)堿基序列的核酸分子的寡核苷酸片段；(4) 然后進(jìn)行DNA鏈的化學(xué)交聯(lián)，通常是官能團(tuán)修飾的寡核苷酸樣品轉(zhuǎn)移 到經(jīng)化學(xué)處理的活化載體上，使寡核苷酸末端與載體發(fā)生專一性共價(jià)偶聯(lián)。其中寡核苷酸的末端修飾及載體的表面處理為:載玻片先用3-巰丙基硅烷 衍生化、與5，端二硫鍵化合物修飾的寡核苷酸發(fā)生巰基置換反應(yīng)進(jìn)而交聯(lián)。(交 聯(lián)密度為3X105寡核苷酸/nm2，芯片密度可達(dá)20000點(diǎn)/cm2 );(5) 然后沖洗未反應(yīng)的寡核苷酸探針后，制備出表達(dá)有常見(jiàn)婦科惡性腫瘤 特征基因的寡核苷酸基因芯片。常見(jiàn)婦科惡性腫瘤早期篩查診斷的檢測(cè)方法，其主要步驟是(1) 提取出待測(cè)病人血液中的樣品基因；(2) 將樣品基因與表達(dá)有常見(jiàn)婦科惡性腫瘤特征基因的寡核苷酸基因芯片 上的寡核苷酸基因序列進(jìn)行雜交；(3) 將芯片雜交結(jié)果進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，將芯片置入芯片掃描儀中,通過(guò)掃描 可得到顯色結(jié)果，分別為表達(dá)量增加為紅色，表達(dá)量降低為綠色，表達(dá)量不 變?yōu)辄S色；根據(jù)檢測(cè)雜交信號(hào)的顯色情況，可判斷特征基因表達(dá)的上下調(diào)(即 數(shù)量的增減)情況；(4)判讀結(jié)果，通常患有常見(jiàn)婦科惡性腫瘤的相關(guān)特征基因表達(dá)的上下調(diào) 情況如下乳腺癌表達(dá)上調(diào)的特征基因LTA(NM—000595); VEGFA(M27281); PRL(NM—000948); IGF1(NM—000618); BCL2(NM—000657); CXCL12(NM—000609); ERBB2(NM—004448); HMGA2(NM_003483); TNF(NM—000594); SYK(NM—003177); ACP5(NM_001611);KLK2(NM—005551); EGFR(NM—005228); IGFBP3(NM—000598); 表達(dá)下調(diào)的特征基因ICAM1 (NM—000201); FAS (NM—000043); 卵巢癌表達(dá)上調(diào)的特征基因CD44(X55150);表達(dá)下調(diào)的特征基因RASSF1(NM—007182); 子宮癌表達(dá)上調(diào)的特征基因TNF(NM—000594) ;PRL(NM_000948); MDM2(NM—002392); MMP9(NM—004994); IL-10(NM—000572);將實(shí)際測(cè)得值與上列對(duì)照值比較，若出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的特征基因上調(diào)了，或 表達(dá)下調(diào)的特征基因下調(diào)了，則可判斷出該病人患有乳腺癌，或卵巢癌，或子宮 癌.反之，如果特征基因都未上調(diào)或下調(diào)，則不患有癌癥。本發(fā)明從基因水平對(duì)常見(jiàn)婦科惡性腫瘤進(jìn)行篩査及診斷，為惡性腫瘤的早 期發(fā)現(xiàn)和早期診斷開(kāi)辟了新的方法，其創(chuàng)新特征為(1)該基因芯片功能明確， 可以表明樣本基因是否正常表達(dá)；(2)基因存在于血液中，采樣簡(jiǎn)便，易于普 篩；(3)將常見(jiàn)婦科惡性腫瘤的特征基因制成寡核苷酸基因芯片，能夠使臨床 檢測(cè)條件保持一致性。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。 實(shí)施例一采集若干癌癥患者的血液樣本，按照前述要求，通過(guò)基因公司制備成寡核 苷酸基因芯片。 實(shí)施例二取病人甲的血液5ml并提取血液基因樣本，將樣本基因與該寡核苷酸基因芯 片雜交，檢測(cè)所得雜交結(jié)果顯示甲血液中VEGFA(M27281)、 IGF1 (NM—000618)、 LTA(NM—000595)表達(dá)上調(diào)，即說(shuō)明病人甲很可能患有乳腺癌。實(shí)施例三取病人乙的血液5ml并提取血液基因樣本，將樣本基因與該寡核苷酸基因芯 片雜交，檢測(cè)所得雜交結(jié)果顯示乙血液中RASSF1(NM—007182)表達(dá)下調(diào)、 CD44 (X55150)表達(dá)上調(diào)，即說(shuō)明病人乙很可能患有卵巢癌。實(shí)施例四取病人丙的血液5ml并提取血液基因樣本，將樣本基因與該寡核苷酸基因芯 片雜交,檢測(cè)所得雜交結(jié)果顯示:丙血液中TNF (NM—000594) 、 MDM2 (NM一002392)、 醒P9(NMJ)04994)表達(dá)上調(diào)，即說(shuō)明病人丙很可能患有子宮癌。
權(quán)利要求
1、一種用于婦科惡性腫瘤早期篩查的寡核苷酸基因芯片的制備，其特征在于制備步驟為1)列出在常見(jiàn)婦科惡性腫瘤患者的血液中癌癥基因表達(dá)功能明確且可檢測(cè)出的特征基因?yàn)槿橄侔㎜TA(NM_000595)；VEGFA(M27281)；ICAM1(NM_000201)；PRL(NM_000948)；IGF1(NM_000618)；BCL2(NM_000657)；ERBB2(NM_004448)；CXCL12(NM_000609)；HMGA2(NM_003483)；FAS(NM_000043)；TNF(NM_000594)；SYK(NM_003177)；ACP5(NM_001611)；KLK2(NM_005551)；EGFR(NM_005228)；IGFBP3(NM_000598)；卵巢癌RASSF1(NM_007182)；CD44(X55150)；子宮癌TNF(NM_000594)；PRL(NM_000948)；MDM2(NM_002392)；MMP9(NM_004994)；IL-10(NM_000572)；(2)根據(jù)基因序列號(hào)，利用數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI，確定上述特征基因的完整序列；(3)找出與上述常見(jiàn)婦科惡性腫瘤特征基因互補(bǔ)的基因，制備出長(zhǎng)約20-50個(gè)堿基序列的核酸分子的寡核苷酸片段；(4)然后進(jìn)行DNA鏈的化學(xué)交聯(lián)，通常是官能團(tuán)修飾的寡核苷酸樣品轉(zhuǎn)移到經(jīng)化學(xué)處理的活化載體上，使寡核苷酸末端與載體發(fā)生專一性共價(jià)偶聯(lián)；(5)然后沖洗未反應(yīng)的寡核苷酸探針后，制備出表達(dá)有常見(jiàn)婦科惡性腫瘤特征基因的寡核苷酸基因芯片。
2、 一種用于婦科惡性腫瘤早期篩査的檢測(cè)方法，其特征在于其主要步驟是(1) 提取出待測(cè)病人血液中的樣品基因；(2) 將樣品基因與表達(dá)有常見(jiàn)婦科惡性腫瘤特征基因的寡核苷酸基因芯片 上的寡核苷酸基因序列進(jìn)行雜交；(3) 將芯片雜交結(jié)果進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，將芯片置入芯片掃描儀中，通過(guò)掃描 可得到顯色結(jié)果，分別為表達(dá)量增加為紅色，表達(dá)量降低為綠色，表達(dá)量不 變?yōu)辄S色；根據(jù)檢測(cè)雜交信號(hào)的顯色情況，可判斷特征基因表達(dá)的上下調(diào)(即 數(shù)量的增減)情況；(4)判讀結(jié)果，通?；加谐Ｒ?jiàn)婦科惡性腫瘤的相關(guān)特征基因表達(dá)的上下調(diào) 情況如下乳腺癌表達(dá)上調(diào)的特征基因LTA (NM—000595); VEGFA (M27281);PRL(NM—000948); IGF1(NM_000618); BCL2(NM_000657); CXCL12(NM一000609); ERBB2(NM—004448); HMGA2(NM_003483); TNF(既000594); SYK(NM—003177); ACP5(NM_001611); KLK2(NM—005551); EGFR(NM—005228); IGFBP3(NM一000598); 表達(dá)下調(diào)的特征基因ICAM1 (NM—000201); FAS (NM—000043); 卵巢癌表達(dá)上調(diào)的特征基因CD44(X55150);表達(dá)下調(diào)的特征基因RASSF1 (NM—007182); 子宮癌表達(dá)上調(diào)的特征基因TNF(NM_000594) ;PRL(NM_000948); MDM2(NM—002392); MMP9(NM—004994); IL-10(NM—000572);將實(shí)際測(cè)得值與上列對(duì)照值比較，若出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的特征基因上調(diào)了，或 表達(dá)下調(diào)的特征基因下調(diào)了，則可判斷出該病人患有乳腺癌，或卵巢癌，或子宮 癌.反之，如果特征基因都未上調(diào)或下調(diào)，則不患有癌癥。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種常見(jiàn)婦科惡性腫瘤早期篩查與診斷的寡核苷酸基基因芯片制備及其檢測(cè)方法。它是以常見(jiàn)婦科惡性腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、子宮癌)的相關(guān)基因?yàn)轵?yàn)證，通過(guò)寡核苷酸基因芯片的制備以及芯片雜交及檢測(cè)，最后確定患者是否患有該惡性腫瘤的一種方法。本發(fā)明提供了一種基于基因芯片的常見(jiàn)婦科惡性腫瘤早期篩查診斷的檢測(cè)方法，將常見(jiàn)婦科惡性腫瘤的特征基因制成寡核苷酸基因芯片，能夠使臨床檢測(cè)條件保持一致性。能夠盡早、盡快篩選、確診常見(jiàn)惡性腫瘤。該技術(shù)方法采樣簡(jiǎn)便，一致性好，易于全民普篩；應(yīng)用得當(dāng)，可使癌癥死亡率降低約1/3。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101230390SQ20071016865
公開(kāi)日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2007年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日
發(fā)明者張曉雷, 朱文婷, 王恒松, 譚秋萍, 勇 陳, 韓鳳梅 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)