專利名稱：一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法及所使用的工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及一種通過生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法，還涉及該方法中所使用的工程菌。
背景技術(shù)：
近幾年，禽流感已被證明可以直接感染人類，來勢兇猛，病死率高。據(jù)統(tǒng)計，禽流感已經(jīng)感染100余人，其中一半以上病人死亡。截止2005年10月，柬埔寨、中國等十余個國家和地區(qū)先后出現(xiàn)了H5N1病毒的流行，至今仍在蔓延。目前，各國政府都在積極應(yīng)對禽流感可能在人類中出現(xiàn)的大面積爆發(fā)。流感病毒專家認為新一次流感大流行不可避免，可能為期不遠。2005年7月4日由世界衛(wèi)生組織主持的討論會上，科學家們指出，禽流感依然危險，要防范其在人類中發(fā)生大流行。
隨著禽流感形勢的日趨嚴峻，達菲作為預防和治療H5N1型禽流感的主要藥物受到各國的關(guān)注，僅美國政府就為此計劃儲備達菲約1億人份次。達菲的主要活性成分是奧塞米韋，而莽草酸(shikimic acid)是奧塞米韋的起始原料，目前莽草酸的生產(chǎn)主要通過化學萃取法從木蘭科植物八角茴香的種子中提取。由于各國都在盡可能多地儲備達菲這種抗禽流感藥物，導致莽草酸的供不應(yīng)求，由此帶來原材料八角茴香的短缺，因此化學法存在著原材料受限的嚴重弊端，尤其是在流感爆發(fā)及收成欠佳時。
此外，莽草酸還是許多生物堿、芳胺酸、吲哚衍生物和手性藥物合成的關(guān)鍵前體，其衍生藥物大部分尚處在實驗階段，比較受到關(guān)注的發(fā)展前途有二個一是抗菌抗腫瘤作用，1987年有報道中提到日本學者發(fā)現(xiàn)莽草酸的一種化合物對海拉細胞株(HeLacells)和埃希利腹水癌Ehrlichascitescarcinoma)有明顯的抑制作用，并能延長接種白血病細胞L1210的小鼠的存活時間，而且毒性相對較低，并指明抑制作用主要是因為此種莽草酸化合物與硫氫化物反應(yīng)；另一種化合物對須發(fā)癬菌有一定的對抗作用。并有報道(孫快麟等人)合成的莽草酸衍生物具有與二霉素類似的體外抑制白血病細胞L1210的作用(孫快麟，李潤蓀，雷興翰.若干莽草酸衍生物的合成和生物活性研究.藥學學報，1990，(1))。二是對心血管系統(tǒng)的作用，北京中醫(yī)藥大學的孫建寧等發(fā)現(xiàn)，莽草酸及其衍生物具有抗血栓形成和抑制血小板聚集的作用(孫文燕，孫建寧，劉振權(quán)，黃賤英，張文博.異亞丙基莽草酸抗大鼠腦缺血再灌注損傷的炎癥機制初探《中國藥學雜志》2005，40(9)678～680；孫文燕，孫建寧，劉振權(quán)，黃賤英，張文博.異亞丙基莽草酸對大腦中動脈缺血再灌注大鼠保護作用《北京中醫(yī)藥大學學報》2005，28(3)43～47；)。
隨著禽流感形勢的日益嚴峻，保證生產(chǎn)達菲所需原材料的充足是國際形勢的需要。莽草酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝復雜，且原料受自然因素影響較大，打破傳統(tǒng)的植物提取方式，采用環(huán)保、廉價、產(chǎn)量穩(wěn)定的生物工程菌生產(chǎn)莽草酸的方式是國際發(fā)展趨勢。莽草酸途徑，見圖1，是存在于微生物、真菌和植物中的重要的代謝途徑之一，但不存在于哺乳動物中。從葡萄糖到莽草酸合成中間有五個重要的酶，分別是3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮-7-磷酸合成酶(3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase，簡稱DAHP合成酶)、3-脫氫奎尼酸合成酶(3-dehydroquinate synthase)、3-脫氫奎尼酸脫水酶(3-dehydroquinatedehydratase)、莽草酸脫氫酶(shikimate dehydrogenase)和莽草酸激酶同工酶(shikimate kinase isozyme)。它們在大腸桿菌中分別由aroF，aroB，aroD，aroE，aroK和aroL編碼，其中aroK和aroL都編碼莽草酸激酶同工酶，它將莽草酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate)(1.Dansette，P.and R.Azerad，The shikimate pathway.I. Preparation of 3-3H，4-3H and 2，4-3H2D-shikimic acid.Biochimie，1973.55(5)p.5 83-9；2.Dansette，P. and R.Azerad，The shikimate pathwayII. Stereospecificity of hydrogen transfercatalyzed by NADPH-dehydroshikimate reductase of E.coli.Biochimie，1974.56(5)p.751-5)。在莽草酸途徑中，莽草酸只是中間產(chǎn)物，因此，要利用莽草酸途徑合成莽草酸就必須破壞莽草酸激酶同工酶的作用，使莽草酸能在微生物體內(nèi)大量聚集。
目前，國外已有兩項通過大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(bacillus subtilis)生產(chǎn)莽草酸的專利。羅氏公司已經(jīng)率先和德國一家生物技術(shù)公司合作采用大腸桿菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化成莽草酸。羅氏公司透露他們生產(chǎn)達菲的主要原料莽草酸2/3從八角茴香中的提取，1/3利用生物工程技術(shù)從大腸桿菌中獲得。美國另一項專利是利用枯草桿菌生產(chǎn)莽草酸，這兩種方法異曲同工，轉(zhuǎn)化率也較為相似。目前國內(nèi)尚未見到利用生物工程技術(shù)合成莽草酸的報道。從葡萄糖到莽草酸的五步反應(yīng)中，其相關(guān)的催化酶并不能有效地催化各自底物轉(zhuǎn)化，從而使其降低了莽草酸的產(chǎn)量，同時，也影響了產(chǎn)物的純度。莽草酸途徑的限速酶為DHQ合成酶(aroB)，在美國的兩項專利中，都是利用帶有編碼限速酶的質(zhì)粒載體導入受體菌來提高莽草酸的碳流。然而，多拷貝質(zhì)粒載體上的基因可能會導致酶的表達超出最初改善限速酶影響的要求，造成細胞代謝上的負擔，從而降低細胞的生長速率和莽草酸的合成速率及產(chǎn)量。在以后的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)上勢必將帶來許多問題。另外，以往研究表明，整體調(diào)控基因shiA突變株可以比野生株在細胞內(nèi)多聚集20倍的糖原濃度(Yang H，Liu M Y，Romeo T.Coordinate genetic regulation of glycogen catabolism andbiosynthesis in Escherichia coli via the ShiA gene product.J Bacteriol，1996，1781012～1017)。因此，本發(fā)明敲除shiA基因?qū)⒂行У靥岣呒毦鷥?nèi)合成莽草酸的前體物，同時在大腸桿菌的染色體中增加限速酶的拷貝，從而大大提高莽草酸的轉(zhuǎn)化率。
通過生物技術(shù)合成莽草酸具有以下幾點優(yōu)勢(1)不受植物原材料生產(chǎn)周期及產(chǎn)量的限制八角茴香為木蘭植物八角茴香的果實，每年果期為秋季至翌年春季，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量有限，尤其是遇到流感爆發(fā)流行和果實欠收時；生物技術(shù)合成所需的原料是細菌、葡萄糖等，這些材料可隨時獲得，不受季節(jié)限制。(2)保護環(huán)境；(3)成本低廉相對從八角茴香萃取而言，通過生物技術(shù)合成莽草酸能降低生產(chǎn)成本約2/3。因此通過基因工程技術(shù)合成莽草酸是時勢所趨。
利用生物技術(shù)從大腸桿菌合成莽草酸具有重要的經(jīng)濟、社會效益，在全球面臨禽流感威脅的今天，其研究意義更顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
為了改善目前利用基因工程技術(shù)合成莽草酸的方法中莽草酸合成速率及產(chǎn)量低，純度低的缺陷，本發(fā)明公開了一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法。
本發(fā)明的制備方法包括如下步驟
1.利用基因工程技術(shù)構(gòu)建莽草酸代謝途徑限速酶的aroEaroFaroBkan多基因盒。構(gòu)建aroEaroFaroBkan多基因盒策略如圖2所示。包括如下步驟(1)PCR擴增基因aroF、aroB、aroE、shiA、kan，前三個基因中每個基因的5’端加入Ptac強啟動子；(2)分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-shiA，pET32a-aroF，pET32a-aroE，pET32a-aroB，pET32a-kan；(3)構(gòu)建aroEaroFaroBkan多基因盒將三個基因aroF、aroB、aroE通過酶切順序連接，并加入kan抗性基因。
Ptac強啟動子是DeBoer等構(gòu)建的來自trp啟動子和lac啟動子的一個雜合啟動子，由于其-35序列和Pribnow盒的一致性，故在控制大腸桿菌中外源基因的表達是高效的。據(jù)報道，其啟動效率比lacUV5啟動子高出11倍之多?；蚝兄械膋an抗性基因一方面是為了便于基因敲除和基因替換后菌株的篩選，另一方面也給了基因敲除和基因替換后的菌株一個選擇壓力，使其不易于發(fā)生回復突變。另外，kan基因可以利用能識別FRT位點的FLP重組酶系統(tǒng)而消除。
2.利用Red重組系統(tǒng)敲除細菌中的莽草酸激酶同工酶aroK和aroL。Red重組系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，可以直接利用含有同源臂的PCR線性片段，替換出同源臂內(nèi)的目的基因。Red是一種λ噬菌體主管同源重組的重組酶，由exo、beta和gam基因組成，Gam抑制宿主菌的RecBCD核酸外切酶，使外源線性DNA不至于立即被降解，Exo和Bet引導線性片段與同源區(qū)發(fā)生重組置換，而且效率較傳統(tǒng)的同源重組方法高幾十倍。aroK和aroL都編碼莽草酸激酶同工酶，它們的缺失將促使莽草酸在細胞內(nèi)的聚集。因此，通過構(gòu)建包含Red重組系統(tǒng)的質(zhì)粒來對大腸桿菌進行aroK和aroL基因的缺失突變，改造后的大腸桿菌備用。
3.敲除aroK和aroL缺失菌中的shiA基因，并敲入aroEaroFaroBkan多基因盒。采用脈沖電轉(zhuǎn)化多基因盒線性片段，利用Red重組系統(tǒng)敲入aroEaroFaroBkan多基因盒，同時敲除shiA基因，然后進行基因替換菌株的篩選。由于基因盒的插入，shiA基因被破壞的同時，保存了基因盒的完整性。本發(fā)明通過PCR鑒定基因敲除和基因替換菌株。
4.利用基因工程技術(shù)發(fā)酵該重組工程菌獲得莽草酸。通過搖瓶發(fā)酵莽草酸并進行轉(zhuǎn)化率的鑒定，探索最佳的發(fā)酵條件和轉(zhuǎn)化率。在本發(fā)明中，所用的工程菌為大腸桿菌、枯草桿菌等細菌，其中大腸桿菌為優(yōu)選。轉(zhuǎn)化率達到40％以上。
5.分離、純化莽草酸。本發(fā)明所使用的分離純化莽草酸方法為離子交換色譜法及重結(jié)晶法。
本發(fā)明還公開了在制備莽草酸方法中的重組工程菌，該工程菌敲除了aroK，aroL基因和shiA基因，包含aroEaroFaroBkan多基因盒。其中aroEaroFaroBkan多基因盒由強啟動子Ptac、莽草酸合成途徑的限速酶aroF、aroB、aroE及抗性基因kan組成。
本發(fā)明所公開的重組工程菌為大腸桿菌、枯草桿菌等細菌，優(yōu)選大腸桿菌。
莽草酸是一種單體化合物，分子式為C7H10O5，結(jié)構(gòu)式如圖1中所示，相對分子質(zhì)量為174.15，學名是3，4，5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-羧酸，為白色精細粉末，氣微，味辛酸，易溶于水，難溶于氯仿、苯和石油醚，熔點為185℃～187℃，旋光度為-180°。
本發(fā)明通過構(gòu)建基因盒aroEaroFaroBkan，并在基因盒前、后分別加入強啟動子和抗性篩選基因，利用依賴于λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)敲除代謝調(diào)控基因shiA，并代替以基因盒aroEaroFaroBkan，增加了細胞內(nèi)的有效糖濃度，解除對PEP合成酶的負調(diào)控，從而使莽草酸合成途徑達到最優(yōu)化，另外，我們還要敲除莽草酸激酶同工酶aroK和aroL，使得大腸桿菌內(nèi)的莽草酸得以在細胞內(nèi)聚集。
在莽草酸代謝途徑中，碳貯存調(diào)控因子(carbon storage regulatorA，ShiA)的缺失可增加糖異生和糖原的合成，降低糖酵解。另外，ShiA也調(diào)控直接參與磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)代謝的3個酶的活性水平丙酮酸激酶(PykF)正調(diào)控，而PEP羧化酶(PckA)和PEP合成酶則被負調(diào)控。另外，一些非直接影響PEP的酶也被ShiA所調(diào)控，因而shiA基因的敲除可使細胞內(nèi)的PEP大大增加，為莽草酸的生物合成提供大量的前體物。
本發(fā)明使用依賴噬菌體的Red重組系統(tǒng)來敲除大腸桿菌中的碳貯存調(diào)控因子shiA，并代替以莽草酸途徑限速酶基因盒——強啟動子+aroFaroBaroE基因+篩選基因來優(yōu)化大腸桿菌莽草酸合成系統(tǒng)，操作方法簡單精確，從設(shè)計上明顯優(yōu)于美國兩個分別利用大腸桿菌和枯草桿菌生長莽草酸的研究。
本發(fā)明相對于國外兩項專利的創(chuàng)新點如下(1)通過敲除大腸桿菌的碳貯存調(diào)控因子，并代替以基因盒aroEaroFaroBkan，使莽草酸途徑達到最優(yōu)化；(2)使用了近幾年發(fā)展迅速的依賴于λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)，對大腸桿菌染色體DNA進行基因敲除、敲入和替換。該方法能有效利用線性DNA片段作為打靶分子，不需要限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，操作過程簡單、精確、快速、經(jīng)濟，大大縮短了構(gòu)建打靶載體的時間；
(3)基因盒替換的方法，避免了利用載體導入多拷貝限速酶基因方法的局限性，減輕了細菌代謝的負擔，提高了細菌的生長速率和莽草酸的合成速率及產(chǎn)量，同時提高了工程菌株的穩(wěn)定性，不存在質(zhì)粒丟失的情況。
大腸桿菌是現(xiàn)在生物實驗室常用工程菌。依賴λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)是新近發(fā)展起來的基因敲除方法。本發(fā)明在國內(nèi)首次成功地在大腸桿菌中高度表達莽草酸，以大腸桿菌為宿主菌，進行溫度誘導表達，轉(zhuǎn)化率在40％以上。
本發(fā)明通過構(gòu)建aroEaroFaroBkan多基因盒并替換掉整體調(diào)控基因shiA，提高了莽草酸合成限速酶在大腸桿菌內(nèi)的表達，有效地催化各自底物的轉(zhuǎn)化，盡可能地減少了染色體外的DNA，避免了細胞代謝上的負擔，同時shiA的缺失可增加糖異生和糖原的合成，降低糖酵解，可使細胞內(nèi)的PEP大大增加，為莽草酸的生物合成提供大量的前體物。莽草酸激酶同工酶aroK和aroL的缺失，促進了莽草酸在大腸桿菌胞質(zhì)內(nèi)的聚集。
本發(fā)明基于提高莽草酸生物合成產(chǎn)量和降低市場價格的目的，設(shè)計構(gòu)建了由莽草酸合成代謝限速酶組成的多基因盒，并替換掉整體調(diào)控基因shiA，同時缺失掉莽草酸激酶同工酶，使重組后的大腸桿菌能在體內(nèi)高效表達莽草酸，轉(zhuǎn)化率可達40-50％，為大規(guī)模制備莽草酸創(chuàng)造了條件。
本發(fā)明為我國首次利用重組大腸桿菌高度表達莽草酸，為以莽草酸為原料的藥物例如達菲等的生產(chǎn)成本提供了可能的經(jīng)濟環(huán)保途徑，中國作為世界人口最多的國家，在應(yīng)對禽流感爆發(fā)時需要達菲儲備數(shù)量巨大，因此達菲生產(chǎn)原材料-莽草酸的生產(chǎn)迫在眉睫。本發(fā)明具有巨大的市場和經(jīng)濟價值，并會極大地提高我國對防治禽流感及其他流感的應(yīng)對能力。


圖1為莽草酸代謝途徑。A是DAHP合成酶；B是3-脫氫奎尼酸合成酶(3-dehydroquinate synthase)；C是3-脫氫奎尼酸脫水酶(3-dehydroquinatedehydratase，)D是莽草酸脫氫酶(shikimate dehydrogenase)；E是莽草酸激酶同工酶(shikimate kinase isozyme)。
圖2為aroEaroFaroBkan多基因盒的構(gòu)建示意圖。其中pUC-pUC19載體及目的基因；pET-pET32a載體及目的基因；kan抗性篩選基因；XXba I；NNspV；MMsc I；Kkpn I；BaBamH I；BgBglII圖3鑒定aroL::CMr陽性轉(zhuǎn)化子。
圖4鑒定aroK::CMr陽性轉(zhuǎn)化子圖5為aroF，aroB，aroE的PCR擴增。其中MDL2000 marke；1，2aroE；3，4aroB；5，6aroF圖6為Kan的PCR擴增。其中MDL2000 marke；1，2kan圖7為shiA的PCR擴增。其中MDL2000 marke；1，2shiA圖8為PCR鑒定pUC-aroEaroFaroBkan，其中MDL2000 marker；1，5，9aroB；2，6，10Kan；3，7，11aroF；4，8，12aroE具體實施方式
實施例一莽草酸表達菌株的構(gòu)建材料與方法(1)菌株與質(zhì)粒。E.coli DH5α購自Takara公司。質(zhì)粒pKD46(oriR101repA101ts ParaB-gam-bet-exo Amp)是溫度敏感型，在阿拉伯糖誘導后表達同源重組需要的三個γ噬菌體重組酶Gam，Bet和Exo。質(zhì)粒pKD3為兩邊含有FRT位點的氯霉素抗性基因，質(zhì)粒pCP20也是溫度敏感型，熱誘導后表達FLP重組酶，能識別FRT位點并促進重組的發(fā)生(1.Datsenko KA，Wanner BL. One step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K 12 usingPCR products.Proc Natl Acad Sci USA，2000，976640～6645；2.Red重組技術(shù)研究進展，中國生物工程雜志，2006，26(1)81～86)，以上三種質(zhì)粒由王恒梁博士惠贈。pUC19購自Takara公司，pET32a購自Novagen公司。
(2)培養(yǎng)基LB1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl。
LBS含瓊脂為1.5％的LB固體培養(yǎng)基。
M9培養(yǎng)基20％5×M9鹽溶液，0.4％葡萄糖，另含Vit PP 4 ug/ml，Vit B1 4ug/ml；檢測芳香族氨基酸基因缺陷用M9加對氨基苯甲酸(PABA)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)各40ug/ml；固體平板加1.5％瓊脂。
5×M9鹽溶液(1L)Na2HPO4·12H2O 75g，KH2PO415g，NaCl 2.5g，NH4Cl 5.0g，去離子水定容至1L，調(diào)節(jié)PH值至7.4，高壓滅菌20min備用。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖2％，硫酸胺2％，檸檬酸鈉0.05％，反丁烯二酸0.05％，硫酸鎂0.08％，磷酸二氫鉀/磷酸氫二鉀0.34mg/0.16mg，碳酸鈣0.04％，0.5％酵母提取物；100倍微量元素5ml，pH7.2。100倍微量元素含CoCl20.1mg/L，ZnSO41mg/L，CaCl25mg/L，VB110mg/L，尼克酸鹽酸10mg/L，MnCl22mg/L.
(3)酶和試劑。dNTP，Taq DNA多聚酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I，BamH I，Kpn I，Bgl II，Nsp V，Not I，Msc I和Xba I，T4 DNA連接酶，DNA marker和DNA Ligation Kit購自Takara公司；DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit I購自Roche公司。小量質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天為時代公司。L-阿拉伯糖、氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素購自Sigma公司。
(4)引物設(shè)計由Primer Premier 5.0分析軟件完成，引物由上海生工公司合成。
(5)質(zhì)粒DNA制備，DNA序列分析，DNA轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選，限制性內(nèi)切酶水解、電轉(zhuǎn)化等常規(guī)方法均參照分子克隆實驗指導v3。
(6)用Red重組系統(tǒng)快速敲除E.coli DH5α的aroL基因和aroK基因，獲得aroK-/aroL-菌株。
(7)如圖2所示構(gòu)建多基因盒，然后用限制性內(nèi)切酶把基因盒從載體上切下，從而制備好線性化的多基因盒替換片段；利用Red重組系統(tǒng)將多基因盒片段敲入aroK-/aroL-菌株的基因組中，并替換掉shiA基因；(8)利用菌株抗性的變化及菌液PCR進行基因破壞和基因替換菌株的篩選。
(9)工程菌發(fā)酵。挑單個工程菌接種于3ml LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培育過夜，用生理鹽水洗滌1次，用發(fā)酵培養(yǎng)基洗滌1次，按3～5％接種于10ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，30℃搖床培育過夜至OD600為0.5～0.6時，將溫度升高至37℃，再培養(yǎng)48h，讓莽草酸充分表達累積。
(10)莽草酸純化。采用離子交換色譜法對表達的莽草酸進行分離，然后進一步通過重結(jié)晶法純化莽草酸。
實施的具體步驟分別敘述如下1.用Red重組系統(tǒng)快速敲除E.coli DH5α的aroL基因和aroK基因，獲得aroK-/aroL-菌株。
1.1 PCR引物的設(shè)計用于同源重組引物設(shè)計的原則是5’端的基因同源區(qū)和3’端的氯霉素抗性基因同源區(qū)組成，用于擴增氯霉素抗性基因。鑒定引物分別從目的基因的上下游設(shè)計。
1)L基因的同源重組引物分別為L1見序列表中序列1；L2見序列表中序列2；2)K基因的同源重組引物分別為P1見序列表中序列3；P2見序列表中序列4；1.2 Red重組系統(tǒng)的誘導和感受態(tài)細胞的制備將轉(zhuǎn)化有pKD46的DH5α菌株接種，30℃培養(yǎng)過夜；次日150接種至100ml LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素濃度為50mg/ml)，30℃培養(yǎng)至A600≈0.25時，加入L-阿拉伯糖至30mmol/L，誘導1h(A600不能超過0.6)，使pKD46上的Exo、Bet和Gam三個蛋白充分表達。冰上預冷10分鐘，4000rpm/min，4℃離心10min，棄培養(yǎng)基；用預冷10％甘油離心洗滌3次，濃縮成100倍成1ml的感受態(tài)細胞，每管100ul。
1.3電轉(zhuǎn)化將同源臂引物擴增的氯霉素抗性基因片段約200ng加入感受態(tài)細胞，混勻，轉(zhuǎn)入0.2cm電擊杯中，用Bio-Rad電擊儀作電轉(zhuǎn)化。電擊條件200Ω，25uF，電擊電壓2.3kV，電擊時間為4-5ms，電擊后迅速加入1ml的LB，150rpm/min，37℃培養(yǎng)1h，之后涂于氯霉素平板(氯霉素濃度為34ug/ml)；12h后用PCR法鑒定長出的氯霉素抗性克隆(如圖3)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進一步證實aroL同源區(qū)序列已被氯霉素抗性基因替換。
1.4 FLP位點專一性重組將pCP20轉(zhuǎn)入氯霉素抗性克隆，30℃培養(yǎng)8h，后提高到42℃過夜，熱誘導FLP重組酶表達，質(zhì)粒也逐漸丟失。用接種環(huán)蘸菌液在無抗生素培養(yǎng)基上劃板，挑長出的單克隆點到氯霉素抗性平板上，未生長的為氯霉素抗性基因已被Flp重組酶刪除。用鑒定引物作PCR對氯霉素抗性消失的克隆進行鑒定。
1.5同理繼續(xù)使用Red重組系統(tǒng)敲除aroK基因。
PCR法鑒定長出的氯霉素抗性克隆(如圖4)。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進一步證實aroK同源區(qū)序列已被氯霉素抗性基因替換，最后使用FLP位點專一性重組消除氯霉素抗性基因。
1.6營養(yǎng)缺陷型表型鑒定挑取陽性菌種的單克隆接種于2ml LB(Kan 50ug/ml)中，37℃振搖培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，用0.9％的生理鹽水細菌一次，離心棄上清，所得菌體重懸生理鹽水中，然后分別接種于M9(另含Vit PP 4ug/ml，VitB 1 4ug/ml)培養(yǎng)基和M9加對氨基苯甲酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸各40ug/ml的培養(yǎng)基固體平板中，以野生型菌株為對照，37℃培養(yǎng)36hr，觀察生長情況。結(jié)果顯示突變體在M9培養(yǎng)基中不能生長，只要在M9培養(yǎng)基中添加了芳香氨基酸和PABA才能生長，但與野生型DH5α菌株相比，突變體生長較為遲緩。提示突變體aroK和aroL基因功能的缺失。
2.構(gòu)建多基因盒aroEaroFaroBkan2.1 PCR擴增目的基因aroF、aroB、aroE、shiA、kan；
以E.coli DH5α全DNA為模板，用相應(yīng)的寡聚核苷酸引物擴增目的基因；相應(yīng)的5’端寡核苷酸引物包含Ptac全序列。PCR擴增結(jié)果如圖3，4，5所示。
PCR引物設(shè)計見序列表中序列5-17；2.2多基因盒的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，用相應(yīng)的酶進行雙酶切，直接插入到pUC19或pET32a載體中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-shiA，pET32a-aroF，pET32a-aroB，pET32a-aroE，pET32a-kan。然后pET32a-aroB和pET32a-kan分別用Xba I和Msc I雙酶切，前者回收線性化pET32a-aroB，后者回收基因kan，然后進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取克隆進行酶切鑒定；接著，pET32a-aroBkan和aroF用Nsp V和KpnI雙酶切，前者回收線性化的pET32a-aroBkan，后者回收基因aroF，然后進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取克隆進行酶切鑒定；進一步，pET32a-aroFaroBkan和pET32a-aroE用BamH I和Kpn I雙酶切，前者回收線性化pET32a-aroFaroBkan，后者回收基因aroE，然后進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得pET32a-aroEaroFaroBkan，挑取克隆通過PCR鑒定，如圖6；測序結(jié)果顯示連接序列正確。
2.3 pUC19-shiAaroEaroFaroBkanshiA的構(gòu)建利用shiA基因內(nèi)部的BglII酶切位點把pUC19-shiA切開，同時用Bgl II和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒pET32a-aroEaroFaroBkan，回收基因盒aroEaroFaroBkan，利用BglII和BamH I是同尾酶的特點，進行連接和轉(zhuǎn)化，然后進行PCR鑒定。測序結(jié)果顯示連接結(jié)果正確。
3.進一步利用Red重組系統(tǒng)進行shiA基因敲除和基因替換基因盒插入shiA的中間，因此基因盒兩端各有大約140bp的序列與宿主菌的基因組染色體同源。用shiA兩端的酶切位點把shiA連同基因盒一起酶切下，實現(xiàn)DNA片段的線性化。然后按照與步驟1的Red重組技術(shù)從aroK-/aroL-菌株中敲除shiA基因，敲入基因盒shiAaroEaroFaroBkanshiA，從而獲得莽草酸工程菌Escherichia coli DH5α△SE。
4.莽草酸工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)挑單個莽草酸工程菌Escherichia coli DH5α△SE接種于3ml LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培育過夜，用生理鹽水洗滌1次，用發(fā)酵培養(yǎng)基洗滌1次，按3～5％接種于10ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，30℃搖床培育過夜至OD600為0.5～0.6時，將溫度升高至37℃，再培養(yǎng)48h，讓莽草酸充分表達累積。離心，上清用離子交換色譜法分離，進一步通過重結(jié)晶純化。結(jié)果如表1所示?？梢钥吹教窍臎]有明顯差異，而莽草酸酸產(chǎn)量提高了3.07倍。
表1搖瓶發(fā)酵的莽草酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率

序列表<110>汪莉<120>一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法及所使用的工程菌<130>
<160>17<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>70<212>DNA<213>
<400>1atgacacaac ctctttttct gatcgggcct cggggctgtg gtaaaacaac agcgattgtg60taggctggag 70<210>2<211>76<212>DNA<213>
<400>2tcaacaattg atcgtctgtg ccagggcgct gcgaatttca gaaatcacct taattaacgg60ctgacatggg aattag76<210>3<211>70<212>DNA<213>
<400>3atggcagaga aacgcaatat ctttctggtt gggcctatgg gtgccggaaa agcgattgtg60taggctggag 70<210>4<211>76<212>DNA<213>
<400>4ttagttgctt tccagcatgt gaataatctg gtttgcaacc actttagcgc taattaacgg60ctgacatggg aattag76
<210>5<211>106<212>DNA<213>
<400>5cgggatcctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa60caatttcaca caggaaacag tattcatgga tgttaccgca aaatac 106<210>6<211>37<212>DNA<213>
<400>6ataagaatgc ggccgcttag gcaccgaacc ccatgac37<210>7<211>45<212>DNA<213>
<400>7cggggtacct gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgc 45<210>8<211>108<212>DNA<213>
<400>8ggaattcggt acctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg60gataacaatt tcacacagga aacagtattc atgcaaaaag acgcgctg108<210>9<211>37<212>DNA<213>
<400>9ataagaatgc ggccgcttaa gccacgcgag ccgtcag37<210>10<211>45<212>DNA
<213>
<400>10cggttcgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgc45<210>11<211>107<212>DNA<213>
<400>11ggaattcgaa tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat60aacaatttca cacaggaaac agtattcatg gagaggattg tcgttac 107<210>12<211>36<212>DNA<213>
<400>12ataagaatgc ggccgcttac gctgattgac aatcgg 36<210>13<211>44<212>DNA<213>
<400>13cgtggccatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgc44<210>14<211>31<212>DNA<213>
<400>14cgtggccatc atgaacaata aaactgtctg c 31<210>15<211>35<212>DNA<213>
<400>15gctctagatc tcaggtggca cttttcgggg aaatg 35<210>16
<211>27<212>DNA<213>
<400>16cgggatccat gctgattctg actcgtc 27<210>17<211>29<212>DNA<213>
<400>17cgggatccga acgggagtaa agcgaaaag 29
權(quán)利要求
1.一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法，主要包括以下步驟(1)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建莽草酸代謝途徑限速酶的aroEaroFaroBkan多基因盒；(2)利用Red重組系統(tǒng)敲除細菌中的莽草酸激酶同工酶aroK和aroL；(3)敲除細菌中的shiA基因，并敲入aroEaroFaroBkan多基因盒；(4)利用基因工程技術(shù)發(fā)酵該重組工程菌獲得莽草酸；(5)分離、純化莽草酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中aroEaroFaroBkan多基因盒的構(gòu)建方法包括如下步驟(1)PCR擴增基因aroF、aroB、aroE、shiA、kan，前三個基因中每個基因的5’端加入Ptac強啟動子；(2)分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-shiA，pET32a-aroF，pET32a-aroB，pET32a-aroE，pET32a-kan；(3)構(gòu)建aroEaroFaroBkan多基因盒將三個基因aroF、aroB、aroE通過酶切順序連接，并加入kan抗性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中細菌為大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中利用Red重組系統(tǒng)敲除aroK和aroL，構(gòu)建aroK-/aroL-的工程菌株，步驟如下(1)用于同源重組的引物5’端為aroK基因兩側(cè)的同源臂，3’端為用于擴增氯霉素抗性基因的引物，同理設(shè)計aroL氯霉素抗性基因引物；PCR擴增帶FRT位點的氯霉素抗性基因；(2)將以上的線性片段轉(zhuǎn)入表達Red重組酶的菌株中；(3)選擇氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體；(4)FLP重組酶消除氯霉素抗性基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中敲入aroEaroFaroBkan多基因盒采用脈沖電轉(zhuǎn)化多基因盒線性片段方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中分離純化莽草酸采用離子交換色譜法及重結(jié)晶法。
7.權(quán)利要求1所述方法中的重組工程菌，其特征在于該工程菌敲除了aroK和aroL基因，包含由強啟動子Ptac、莽草酸合成途徑的限速酶aroF、aroB、aroE及抗性基因kan組成的aroEaroFaroBkan多基因盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述重組工程菌，其特征在于該工程菌為大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述重組工程菌，其特征在于該工程菌為大腸桿菌DH5α。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法，還公開了該方法中所用的重組大腸桿菌。本發(fā)明的方法包括構(gòu)建包含莽草酸代謝途徑限速酶多基因盒的載體；將多基因盒替代shiA基因；利用Red重組系統(tǒng)敲除細菌中的莽草酸激酶同工酶；發(fā)酵重組工程菌獲得莽草酸及莽草酸純化等步驟。通過本發(fā)明的方法，可以提高莽草酸的表達產(chǎn)量，降低生產(chǎn)莽草酸成本，為生產(chǎn)防治流感藥物達菲提供原料，具有重要的經(jīng)濟、社會價值。
文檔編號C12N1/21GK101085998SQ200710110469
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月7日 公開號200710110469.0
發(fā)明者汪莉 申請人:汪莉