專(zhuān)利名稱(chēng)：D-氨基酸的生物催化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化合物的制備方法，涉及D-氨基酸的生物催化制備方法，主 要涉及D-色氨酸，D-苯丙氨酸，和D-酪氨酸的生物催化制備方法。
背景技術(shù)：
非蛋白氨基酸，如D型氨基酸和含不同取代基的氨基酸衍生物，是現(xiàn)代新 藥研發(fā)的重要工具和基礎(chǔ)原料。結(jié)構(gòu)多樣的非蛋白氨基酸在世界市場(chǎng)上一直價(jià) 格昂貴，供不應(yīng)求。非蛋白氨基酸等的制備能力也是一個(gè)國(guó)家新藥研發(fā)能力的 象征性指標(biāo)，與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)在該領(lǐng)域落后的差距較大。由于產(chǎn)品附加 值高，進(jìn)入市場(chǎng)容易，非蛋白氨基酸制造技術(shù)的發(fā)展競(jìng)爭(zhēng)激烈?，F(xiàn)行方法有化 學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。前者用不對(duì)稱(chēng)催化劑，價(jià)格昂貴且回收難，過(guò)程中尚 有保護(hù)去保護(hù)等步驟；后者有海因法，水解酶拆分法等，但每種方法都需要多 步反應(yīng)，工藝復(fù)雜，路線長(zhǎng)，排放物種類(lèi)多等弊端。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種D-氨基酸的生物催化制備方法，通過(guò)以下技術(shù)
方案實(shí)現(xiàn)
(1) 用酵母勻漿做催化劑
在5 0 0 m L搖瓶中，培養(yǎng)酵母菌Rhodotorula graminis (ATCC 20804)(牧 草紅酵母)，生長(zhǎng)2 4小時(shí)后，離心，傾出清液，冷凍，超聲破壁，制成勻漿， 置回?fù)u瓶中，每瓶中加入相同量消旋體D， L-氨基酸5 Omg;調(diào)pH7.3， 通空氣，透氣封口，放回在控溫?fù)u床中，圓周式搖動(dòng)，反應(yīng)時(shí)間4-4 0小時(shí)， 超濾、稀釋?zhuān)⑷際PLC進(jìn)行追蹤分析，用大賽路冠醚色譜柱分析，時(shí)間延 長(zhǎng)到l 2 0分鐘，確定獲得目的產(chǎn)物。本發(fā)明所用的酵母菌，通用編號(hào)為ATCC 20804，購(gòu)自美國(guó)。
(2) 活細(xì)胞做催化劑
本發(fā)明可在酵母菌Rhodotorula graminis (ATCC 20804)，生長(zhǎng)2 4小時(shí)后， 經(jīng)離心，傾出清液后直接用活細(xì)胞作為催化劑，用活細(xì)胞時(shí)，不需冷凍，超聲 破壁步驟，直接置回?fù)u瓶中，進(jìn)入下一步驟(同上)。
本發(fā)明用大賽路冠醚色譜柱分析，CrownpakCR(+),D-Try,tr=65min，產(chǎn)物 經(jīng)鑒定確認(rèn)為吲哚乙酸。
吲哚乙酸英文名Indole Acetic Acid，又名Au x i n，是植物中最主要 的生長(zhǎng)素。該物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和研究已經(jīng)有一個(gè)多世紀(jì)，而其作用機(jī)理新近才發(fā)現(xiàn)
(Nature 446, 640-644， 2007). 本發(fā)明方法表明經(jīng)過(guò)L 一 T r y的IAA代謝途 徑，這個(gè)代謝途徑廣泛存在于植物中，和一些植物依賴(lài)性微生物中，但從未見(jiàn) 過(guò)在該菌中存在的報(bào)道。
本發(fā)明的有益之處是(1)含多種酶的酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)勻槳(或活細(xì)胞)，在通空氣的條件下，能夠選擇性地氧化消旋體氨基 酸中L一型，留下未反應(yīng)的D—型。這一方法可用于D—型氨基酸的制備，也 可以用于D—氨基酸中L一摻雜物的清除。(2)本發(fā)明方法不經(jīng)衍生步驟，可 直接將消旋體中L-型氨基酸選擇性地轉(zhuǎn)化，留下未反應(yīng)的高純度的D-氨基酸。
(3)本發(fā)明方法無(wú)需傳統(tǒng)方法中常用的先保護(hù)、再去保護(hù)的步驟，路線簡(jiǎn)短， 效率高，可控制產(chǎn)物的對(duì)映體純度。(4)本發(fā)明方法也可用于其他類(lèi)D型非蛋 白氨基酸的制備。(5)本發(fā)明方法，制備過(guò)程不用金屬催化劑、有機(jī)溶劑及助 劑，反應(yīng)在中性條件進(jìn)行，除生物質(zhì)外，無(wú)化學(xué)排放，屬綠色環(huán)保生產(chǎn)過(guò)程。
(6)本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，步驟簡(jiǎn)單。


圖1為色氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時(shí)間下反應(yīng)混合物的色譜圖。 圖2為苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時(shí)間下反應(yīng)混合物的色譜圖。 圖3為酪氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時(shí)間下反應(yīng)混合物的色譜圖。 圖4為色氨酸和苯丙氨酸混合物轉(zhuǎn)化不同時(shí)間下反應(yīng)混合物的色譜圖。 圖5為色氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時(shí)間下反應(yīng)混合物的色譜圖。 圖6為苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時(shí)間下反應(yīng)混合物的色譜圖。 圖7色氨酸和苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化不同時(shí)間下反應(yīng)混合物的色譜圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例1 D-色氨酸和吲哚乙酸的制備
在5 0 0 mL搖瓶中(在2 8瓶中同時(shí)進(jìn)行)，培養(yǎng)酵母菌Rhodotorula graminis (ATCC 20804)(牧草紅酵母)，生長(zhǎng)2 4小時(shí)后，離心，傾出清液，冷 凍，超聲破壁，制成勻漿，置回?fù)u瓶中，每瓶中加入相同量消旋體D,L-色氨酸 5 0mg;調(diào)解pH7.3，通空氣，透氣封口，放回在控溫?fù)u床中，圓周式搖
動(dòng)，在反應(yīng)0小時(shí)，6小時(shí)和12小時(shí)階段性取出一毫升樣品進(jìn)行分析，追蹤 反應(yīng)進(jìn)程，超濾、稀釋?zhuān)⑷際PLC進(jìn)行追蹤分析，用大賽路冠醚色譜柱， Crownpak CR(+), D-Try, t產(chǎn)22min， L-Try， tr^30min.分析時(shí)間延長(zhǎng)到1 2 0分 鐘。結(jié)果參見(jiàn)圖l，顯示色氨酸生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中各物質(zhì)量的變化過(guò)程，其中圖A:轉(zhuǎn)化反應(yīng)開(kāi)始時(shí)t-0: L/D=l/1; B:轉(zhuǎn)化反應(yīng)6小時(shí)后t=6: L/D=l/3;C:轉(zhuǎn)化反應(yīng)12小時(shí)t-12: L=0 (L-消耗光只剩D)，產(chǎn)物吲哚乙酸隨時(shí)間增 加而增加。L-Try (tr=28-31min)逐漸消耗光，只剩下D-型(tr^22-24min)和 產(chǎn)物卩引哚乙酸(tr=60-65min)。同上，在2 8瓶中同時(shí)進(jìn)行，階段性取出一毫升樣品進(jìn)行分析，追蹤反應(yīng) 進(jìn)程，用大賽路冠醚色譜柱，Crownpak CR(+), D-Try， tr=20-23min, L-Try, tr=28-31min.分析時(shí)間延長(zhǎng)到9 0分鐘。L-Try消耗光時(shí)，停止反應(yīng)，用離子交 換樹(shù)脂分的產(chǎn)物，用核磁共振、質(zhì)譜分析、鑒定確認(rèn)為產(chǎn)物為吲哚乙酸。實(shí)施例2 D-苯丙氨酸的制備在5 0 0 mL搖瓶中，培養(yǎng)酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)(牧 草紅酵母)，生長(zhǎng)2 4小時(shí)后，離心，傾出清液，冷凍，超聲破壁，制成勻漿， 均分后置回?fù)u瓶中，每瓶中加入相同量消旋體D， L-苯丙氨酸5 Omg;調(diào)p H7. 3，通空氣，放回在控溫?fù)u床中，圓周式搖動(dòng)，階段性取出一毫升樣品 進(jìn)行分析，追蹤反應(yīng)進(jìn)程，在反應(yīng)4 h， 6 h和4 0 h，超濾、稀釋?zhuān)⑷際 PLC進(jìn)行追蹤分析，用大賽路冠醚色譜柱，Crownpak CR(+)， D-Phe, tr=7.5min, L-Phe,tr=llmin.分析時(shí)間延長(zhǎng)到6 0分鐘。未發(fā)現(xiàn)其它可檢測(cè)的產(chǎn)物。用離子 交換樹(shù)脂分離，得到純的D-苯丙氨酸(D-Phe)。參見(jiàn)圖2，是苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中各物質(zhì)量的變化過(guò)程(為清晰起見(jiàn)， 每圖均為一個(gè)單獨(dú)的色譜圖)，說(shuō)明產(chǎn)物隨時(shí)間增加而增加。圖中.，A為反應(yīng) 開(kāi)始時(shí)L/D-l/l; B為反應(yīng)2小時(shí)L/D = 2/5; C為反應(yīng)4小時(shí)，L接近0 (L-消耗光只剩D)。 L-Phe (tr^l4.5min)。逐漸消耗光，只剩下D-型(tr=7-9min)。本研究發(fā)現(xiàn)酵母菌，可以將消旋體中的L-Phe轉(zhuǎn)化為未知產(chǎn)物，保留了對(duì) 映體純的D-Phe。成為一個(gè)在同時(shí)制備這消旋體L， D-Phe中或者含L-Phe的 混合物中，選擇性清除L-Phe保留純D-Phe的生物轉(zhuǎn)化方法。實(shí)施例3 D-酪氨酸的制備在5 0 OmL搖瓶中，培養(yǎng)酵母菌(牧草紅酵母)Rhodotorula graminis
(ATCC 20804)，生長(zhǎng)2 4小時(shí)后，離心，傾出清液，冷凍，超聲破壁，制成勻 漿，置回?fù)u瓶中，加入消旋體D， L-酪氨酸5 0mg;調(diào)pH7.3，通空氣， 放回在控溫?fù)u床中，圓周式搖動(dòng)，階段性取出一毫升樣品進(jìn)行分析，追蹤反應(yīng) 進(jìn)程，在反應(yīng)4 h ， 6 h和4 0 h ，超濾、稀釋?zhuān)⑷際 P L C進(jìn)行追蹤分析， 用大賽路冠醚色譜柱，Crownpak CR(+), D-Tyr， t產(chǎn)6min， L-Tyr, tr=9min.分析時(shí) 間延長(zhǎng)到6 0分鐘。用離子交換樹(shù)脂分離，得到純的D-酪氨酸(D-Tyr)。
參見(jiàn)圖3，是酪氨酸生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中各物質(zhì)量的變化過(guò)程。說(shuō)明產(chǎn)物隨時(shí) 間增加而增加。圖中A為反應(yīng)10分鐘，(t-10分鐘)L/D = 2/5; B為反應(yīng) 4小時(shí)(1=4小時(shí))，L接近O (L-消耗光只剩D)。 L-Tyr (tr^9min)逐漸消耗 光，只剩下D-型(tr=6min)。
本研究發(fā)現(xiàn)酵母菌，可以將消旋體中的L-Tyr轉(zhuǎn)化為未知產(chǎn)物，保留了對(duì) 映體純的D-Tyr。 成為一個(gè)在同時(shí)制備這消旋體L， D-Tyr中或者含L-Phe的 混合物中，選擇性清除L-Tyr保留純D-Tyr的生物轉(zhuǎn)化方法。
實(shí)施例4D -色氨酸和D -苯丙氨酸混合物的制備。
5 0 OmL搖瓶中，培養(yǎng)酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)，生長(zhǎng) 2 4小時(shí)后，離心，傾出清液，冷凍，超聲破壁，制成勻漿，均分后置回?fù)u瓶 中，每瓶中加入相同量消旋體D， L-色氨酸和D，L-苯丙氨酸(各5 Omg); 調(diào)pH7.3，通空氣，放回在控溫?fù)u床中，圓周式搖動(dòng)，階段性取出一毫升樣 品進(jìn)行分析，追蹤反應(yīng)進(jìn)程，在反應(yīng)4 h， 6 h和4 0 h，超濾、稀釋?zhuān)⑷?H P L C進(jìn)行追蹤分析，用大賽路冠醚色譜柱，Crownpak CR(+), D-Phe, tr=9min， L-Phe， tr^l3min， D-Try， t產(chǎn)20min， L-Try， ti=30min分析時(shí)間延長(zhǎng)到1 2 0分鐘。
本研究發(fā)現(xiàn)酵母菌，可以將消旋體L， D-Phe和消旋體L， D-Try兩個(gè)消旋 體混合物中L型轉(zhuǎn)化掉，只保留了對(duì)映體兩個(gè)純的D-Phe和D-Try的混合物。 成為一個(gè)L-選擇性清除法。
結(jié)果參見(jiàn)圖4， A:轉(zhuǎn)化反應(yīng)開(kāi)始時(shí)t=0:苯丙氨酸L/D =1/1;色氨酸 L/D=l/1; B: t-40時(shí)，L型苯丙及L-色氨酸大部分消耗光，只剩D-苯丙氨酸 及D-色氨酸。
實(shí)施例5 D-色氨酸和吲哚乙酸的制備
本實(shí)施例是用活細(xì)胞為催化劑，在5 0 OmL搖瓶中(在2 8瓶中同時(shí)進(jìn) 行)，培養(yǎng)酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)(牧草紅酵母)，生長(zhǎng)2 4 小時(shí)后，離心，傾出清液，置回?fù)u瓶中，其余過(guò)程同實(shí)施例l。圖5-圖7結(jié)果參見(jiàn)圖5，顯示色氨酸生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中各物質(zhì)量的變化過(guò)程，其中A: 轉(zhuǎn)化反應(yīng)開(kāi)始時(shí)"=0時(shí))混合物的色譜圖，反應(yīng)開(kāi)始時(shí)L/D=l/1; B:轉(zhuǎn)化 反應(yīng)21小時(shí)L=0 (L-消耗光只剩D)，說(shuō)明產(chǎn)物隨時(shí)間增加而增加。L-Try (tr=28-31min)逐漸消耗光，只剩下D-型(tr=22-24min)和產(chǎn)物卩引哚乙酸(此 圖中未顯示t產(chǎn)60-65min )。實(shí)施例6 D-苯丙氨酸的制備(本實(shí)施例是用活細(xì)胞為催化劑) 同實(shí)施例2，細(xì)胞洗滌后直接放回?fù)u瓶，加底物消旋體D， L-苯丙氨酸， 其余過(guò)程同實(shí)施例2。結(jié)果參見(jiàn)圖6，苯丙氨酸生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中各物質(zhì)量的變化過(guò)程(為清晰起 見(jiàn)，每圖均為一個(gè)單獨(dú)的色譜圖)，說(shuō)明產(chǎn)物隨時(shí)間增加而增加。圖中A反 應(yīng)2小時(shí)L/D = 2/5; B反應(yīng)5小時(shí)，L接近0 (L-消耗光只剩D)。 L-Phe (tr=14.5min)逐漸消耗光，只剩下D-型(tr=7-9min)實(shí)施例7 D-色氨酸和D-苯丙氨酸混合物的制備(本實(shí)施例是用活細(xì)胞 為催化劑)同實(shí)施例4，細(xì)胞經(jīng)洗滌后，置回?fù)u瓶，加底物消旋體D， L-色氨酸和 D,L-苯丙氨酸，其余過(guò)程同實(shí)施例4。結(jié)果參見(jiàn)圖7， A為轉(zhuǎn)化反應(yīng)剛開(kāi)始時(shí)(t=10分鐘)；B為轉(zhuǎn)化反應(yīng)6小時(shí) (1=640時(shí))，反應(yīng)21小時(shí)時(shí)，L型苯丙及L-色氨酸大部分消耗光，只剩D-苯 丙氨酸及D-色氨酸。活細(xì)胞試驗(yàn)中，反應(yīng)速度較勻漿為快。本方法中，整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程和產(chǎn)物的分離過(guò)程中不用有機(jī)試劑，是一個(gè)綠色 環(huán)保的過(guò)程。本發(fā)明選用的酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)，是經(jīng)篩 選后選擇的最佳菌株。本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有L-Try IAA代謝途徑的酵母菌，它可以將消旋體中的 L-Try轉(zhuǎn)化為IAA，保留D-Try。 D-Try和IAA性能差異很大，易于分離，因 而成為一個(gè)同時(shí)制備這兩個(gè)化合物的生物轉(zhuǎn)化方法。本方法已成功用于D-色氨 酸，D-苯丙氨酸以及D-酪氨酸的制備，但方法不限于本實(shí)施例所列氨基酸。 本發(fā)明方法已用于消旋體色氨酸及苯丙氨酸混合物中L-型對(duì)應(yīng)體&清除，但方
法不限于這兩種氨基酸的混合，應(yīng)該適于更多不同種類(lèi)的氨基酸及其可能構(gòu)成 的各種可能混合物中L-型對(duì)映體的清除。
權(quán)利要求
1.一種D-氨基酸的生物催化制備方法，其特征是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在500mL搖瓶中，培養(yǎng)牧草紅酵母菌，生長(zhǎng)24小時(shí)后，離心，傾出清液，冷凍，超聲破壁，制成勻漿，置回?fù)u瓶中，每瓶中加入相同量消旋體D，L-氨基酸50mg；調(diào)pH7.3，通空氣，透氣封口，放回在控溫?fù)u床中，圓周式搖動(dòng)，反應(yīng)時(shí)間4-40小時(shí)，超濾、稀釋?zhuān)⑷際PLC進(jìn)行追蹤分析，用大賽路冠醚色譜柱分析，時(shí)間延長(zhǎng)到120分鐘，確定獲得目的產(chǎn)物，本發(fā)明所用的酵母菌，通用編號(hào)為ATCC 20804，購(gòu)自美國(guó)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-氨基酸的生物催化制備方法，其特征是通過(guò) 以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)牧草紅酵母菌，生長(zhǎng)2 4小時(shí)后，經(jīng)離心，傾出清液， 直接將活細(xì)胞置回?fù)u瓶中，進(jìn)入下一步驟。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-氨基酸的生物催化制備方法，其特征是方 法中底物選用D,L-色氨酸，獲得目的產(chǎn)物為D-色氨酸和產(chǎn)物H引哚乙酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的D-氨基酸的生物催化制備方法，其特征是方 法中底物選用D,L-苯丙氨酸，獲得目的產(chǎn)物為D-苯丙氨酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-氨基酸的生物催化制備方法，其特征是方 法中底物選用D，L-酪氨酸，獲得目的產(chǎn)物為D-酪氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種D-氨基酸的生物催化制備方法，將酵母菌(ATCC 20804)培養(yǎng)后離心，傾出清液，冷凍，超聲破壁，制成勻漿，在通空氣的條件下，選擇性地氧化消旋體氨基酸中L-型，留下目的產(chǎn)物D-型氨基酸。本發(fā)明也可接用活細(xì)胞作為催化劑，用活細(xì)胞時(shí)，不需冷凍，超聲破壁。本發(fā)明方法可用于D-型氨基酸的制備，也可以用于D-氨基酸中L-摻雜物的清除，還可用于其他類(lèi)D型非蛋白氨基酸的制備。本發(fā)明方法無(wú)需采用傳統(tǒng)方法中常用的先保護(hù)、再去保護(hù)的步驟，制備過(guò)程不用金屬催化劑、有機(jī)溶劑及助劑，除生物質(zhì)外，無(wú)化學(xué)排放，屬綠色環(huán)保生產(chǎn)過(guò)程。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，制備路線簡(jiǎn)短，步驟簡(jiǎn)單，效率高。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101117640SQ200710070108
公開(kāi)日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2007年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日
發(fā)明者張子張, 張曄斌 申請(qǐng)人:浙江大學(xué);杭州慧根藥業(yè)有限公司