專(zhuān)利名稱(chēng)：：肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法。
背景技術(shù)：
：堿性脂肪酶是一種新型洗滌劑用酶，主要用途是作為洗滌劑的新酶種。它的特性能分解衣物油污成甘油二脂、甘油單脂及脂肪酸等較易溶于水的物質(zhì)，從而顯著提高洗衣粉的洗滌效果，尤其是去除黃斑的效果。我們常用各種含酶洗衣粉，其中的酶制劑主要有堿性蛋白酶和堿性脂肪酶。堿性蛋白酶用于分解蛋白質(zhì)類(lèi)污物，如汗?jié)n、血漬等。堿性脂肪酶則主要作用于脂肪酸及其酯類(lèi)污物，也就是我們通常所指的油污類(lèi)。酶作為一種生物制劑，無(wú)毒并能完全生物降解，對(duì)環(huán)境的生態(tài)平衡起良性的作用。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的微生物脂肪酶產(chǎn)生菌己多達(dá)65個(gè)屬，其中細(xì)菌28個(gè)屬；絲狀真菌23個(gè)屬；酵母菌10個(gè)屬；放線(xiàn)菌4個(gè)屬。絲狀真菌在細(xì)胞外分泌酶，是一種優(yōu)異的脂肪酶產(chǎn)生菌種。但是國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有通過(guò)肉色曲霉菌種生產(chǎn)脂肪酶的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是一種肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法，其生產(chǎn)方法的步驟是(1).在種子培養(yǎng)基上制備肉色曲霉菌種；(2).肉色曲霉菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上制備發(fā)酵液，紙板過(guò)濾形成過(guò)濾酶液；(3).過(guò)濾酶液脫色，經(jīng)紙板精濾形成脫色過(guò)濾酶液；(4).脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮，即得到濃縮堿性脂肪酶。而且，所述的種子培養(yǎng)基為土豆斜面培養(yǎng)基，肉色曲霉菌種的制備方法是菌株肉色曲霉在土豆斜面培養(yǎng)基上2729。C溫度條件下培養(yǎng)7296小時(shí)；而且，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的構(gòu)成及其重量百分比分別為黃豆粉2;玉米粉l;糊精l;檸檬酸鈉O.1;N線(xiàn)0.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.20.5;蔗糖1;NH4N030.5;培養(yǎng)基的pH=8.0，培養(yǎng)溫度為2837°C，培養(yǎng)時(shí)間為9597h，酶活為10.2114.18U/ml。而且，所述的過(guò)濾酶液脫色采用中顆?；钚蕴?，加入量為0.51.0%，脫色時(shí)間為2030min。而且，所述的脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮采用醋酸纖維膜，操作溫度為1020°C，壓力為0.050.1Mpa。而且，所述的肉色曲霉菌種在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.3.3919。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明的菌株采用肉色曲霉"印er^77"scs273e"s人經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)及提取工藝獲得濃縮酶，并對(duì)該脂肪酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。用本發(fā)明菌株肉色曲霉生產(chǎn)脂肪酶的最適pH值為10.0，最適溫度為3(TC，pH和熱穩(wěn)定性好，可抗表面活性劑和漂白劑，能夠成為一種新型的應(yīng)用于常溫和低溫洗滌劑的酶制劑。圖l為本發(fā)明的PH值對(duì)酶活性影響的曲線(xiàn)圖；圖2為本發(fā)明溫度對(duì)酶活性影響的曲線(xiàn)圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明；下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所使用的肉色曲霉菌種是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏的一種肉色曲霉，保藏編號(hào)為CGMCCNo.3.3919。一種肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法，其生產(chǎn)方法的步驟是(1).在種子培養(yǎng)基上制備肉色曲霉菌種，以下提供三個(gè)實(shí)例a..種子培養(yǎng)基采用土豆斜面培養(yǎng)基PDA+2y。的蔗糖；培養(yǎng)條件28°C溫度下培養(yǎng)72小時(shí)。b.種子培養(yǎng)基采用土豆斜面培養(yǎng)基PDA+29&的蔗糖；培養(yǎng)條件28'C溫度下培養(yǎng)84小時(shí)。c.種子培養(yǎng)基采用土豆斜面培養(yǎng)基PDA+2W的蔗糖；培養(yǎng)條件28°C溫度下培養(yǎng)96小時(shí)。(2).肉色曲霉菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上制備發(fā)酵液，經(jīng)紙板過(guò)濾形成過(guò)濾酶液，以下提供三個(gè)實(shí)例a.發(fā)酵培養(yǎng)基(％):黃豆粉2;玉米粉1;糊精1;檸檬酸鈉0.1;NaN030.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.5(mL);蔗糖1;NH4N030.5;pH8.0。接種與培養(yǎng)條件孢子懸浮液的濃度為6.2X106，接種量10e/ml，培養(yǎng)37°C，培養(yǎng)時(shí)間為96h，測(cè)得的酶活為10.21U/ml。4b.發(fā)酵培養(yǎng)基(％):黃豆粉2;玉米粉l;糊精l;擰檬酸鈉0.1;NaN030.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.5(mL);蔗糖1;NH4N030.5;pH8.0。接種與培養(yǎng)條件孢子懸浮液的濃度為6.2X106，接種量10e/ml，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時(shí)間為96h，測(cè)得的酶活為12.68U/ml。C.發(fā)酵培養(yǎng)基(％):黃豆粉2;玉米粉1;糊精1;檸檬酸鈉0.1;NaNO30.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.5(mL);蔗糖1;NH4N030.5;pH8.0。接種與培養(yǎng)條件孢子懸浮液的濃度為6.2X106，接種量10e/ml，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間為96h，測(cè)得的酶活為14.18U/ml。(3).過(guò)濾酶液脫色，紙板精濾形成脫色過(guò)濾酶液，以下提供三個(gè)實(shí)例a.過(guò)濾酶液經(jīng)紙板精濾后加入中顆?；钚蕴窟M(jìn)行脫色處理，加入量為0.5%，脫色30min，觀察脫色過(guò)濾酶液外觀，測(cè)定酶活力。b.過(guò)濾酶液經(jīng)紙板精濾后加入中顆粒活性炭進(jìn)行脫色處理，加入量為0.5%，脫色20min，觀察脫色過(guò)濾酶液外觀，測(cè)定酶活力。c.過(guò)濾酶液經(jīng)紙板精濾后加入中顆粒活性炭進(jìn)行脫色處理，加入量為1.0%，脫色30min，觀察脫色過(guò)濾酶液外觀，測(cè)定酶活力。結(jié)論采用P/。中顆粒活性炭進(jìn)行脫色處理30min后，脫色過(guò)濾液顏色由深褐色變?yōu)榻瘘S色，脫色效果最為明顯，，酶活收率為92.4%，達(dá)到了所需的最佳脫色效果。(4).脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮，即得到濃縮堿性脂肪酶，以下提供四個(gè)實(shí)例:a.將脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度20'C，操作壓力0.05MP，超濾2小時(shí)后，測(cè)定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數(shù)。b.將脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度2(TC，操作壓力O.10MP,超濾2小時(shí)后，測(cè)定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數(shù)。c.將脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度1(TC，操作壓力0.05MP，超濾2小時(shí)后，測(cè)定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數(shù)。d.將脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮，采用醋酸纖維膜，超濾溫度1(TC，操作壓力O.1MP，超濾2小時(shí)后，測(cè)定濃縮酶液酶活力以及濃縮倍數(shù)。結(jié)論采用醋酸纖維的超濾膜進(jìn)行堿性脂肪酶的超濾，超濾溫度IO'C，操作壓力為0.05MP時(shí)，單位時(shí)間酶的濃縮倍數(shù)最高，且酶活回收率最大為96.1%，達(dá)到了所需的最佳濃縮效果?？傉摫緦?shí)驗(yàn)活性炭脫色后用醋酸纖維膜超濾，有效提高脂酶液澄清度，提高液體酶商品性狀。每個(gè)濃縮工藝階段酶的回收率都維持在較高的水平，脫色精濾和超濾濃縮工藝酶的回收率分別達(dá)到92.4%和96.1%，最終整個(gè)工藝流程的總回收率為88.80%(見(jiàn)表1)。表1提取流程中酶活力檢測(cè)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，以進(jìn)一步論證本發(fā)明的先進(jìn)性。例1:以對(duì)-棕櫚酸硝基苯酯為底物，用領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的方法檢測(cè)PH值對(duì)制得的肉色曲霉?jié)饪s酶活性的影響，表明酶作用的PH值范圍為6.0—-12.0，最佳pH值為10.0，對(duì)堿性環(huán)境有極強(qiáng)的耐受性。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖l。例2:以對(duì)-棕櫚酸硝基苯酯為底物，用領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的方法檢測(cè)溫度對(duì)制得的肉色曲霉?jié)饪s酶活性的影響，表明所產(chǎn)酶作用的溫度范圍為10°C--70°C，最佳溫度為30°C。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。例3以對(duì)-棕櫚酸硝基苯酯為底物，檢測(cè)肉色曲霉?jié)饪s酶與表面活性劑(TritonX—lOO、Tween-80、Tween-20)、漂白劑(過(guò)硼酸鈉、過(guò)氧化氫)按濃度1%于30°C、pH10.0下保溫1個(gè)小時(shí)后脂肪酶活性的變化。結(jié)果顯示該脂肪酶活力除了與TritonX—lOO共存時(shí)大幅度提高，其他均變化不大。該酶具有良好的抗表面活性劑與氧化劑特性。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。表2清潔劑對(duì)酶活的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1.一種肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于其生產(chǎn)方法的步驟是(1).在種子培養(yǎng)基上制備肉色曲霉菌種；(2).肉色曲霉菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上制備發(fā)酵液，紙板過(guò)濾形成過(guò)濾酶液；(3).過(guò)濾酶液脫色，經(jīng)紙板精濾形成脫色過(guò)濾酶液；(4).脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮，即得到濃縮堿性脂肪酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基為土豆斜面培養(yǎng)基，肉色曲霉菌種的制備方法是菌株肉色曲霉在土豆斜面培養(yǎng)基上2729。C溫度條件下培養(yǎng)7296小時(shí)；3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的構(gòu)成及其重量百分比分別為黃豆粉2;玉米粉l;糊精l;檸檬酸鈉O.1;NaN030.5;K2HP040.5;FeS040.006;大豆油0.20.5;蔗糖1;NH4N030.5;培養(yǎng)基的pH二8.O,培養(yǎng)溫度為2837°C，培養(yǎng)時(shí)間為9597h，酶活為10.2114.18U/ml。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的過(guò)濾酶液脫色采用中顆?；钚蕴浚尤肓繛?.51.0%，脫色時(shí)間為2030min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮采用醋酸纖維膜，操作溫度為1020。C，壓力為0.050.1Mpa。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法，其特征在于所述的肉色曲霉菌種在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏編號(hào)為CGMCCNo.3.3919。全文摘要本發(fā)明涉及一種肉色曲霉生產(chǎn)濃縮堿性脂肪酶的方法，其制備方法的步驟是(1).在種子培養(yǎng)基上制備肉色曲霉菌種；(2).肉色曲霉菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基上制備發(fā)酵液，紙板過(guò)濾形成過(guò)濾酶液；(3).過(guò)濾酶液脫色，紙板精濾形成脫色過(guò)濾酶液；(4).脫色過(guò)濾酶液進(jìn)行超濾濃縮，即得到濃縮堿性脂肪酶。用本發(fā)明菌株肉色曲霉生產(chǎn)脂肪酶的最適pH值為10.0，最適溫度為30℃，pH和熱穩(wěn)定性好，可抗表面活性劑和漂白劑，能夠成為一種新型的應(yīng)用于常溫和低溫洗滌劑的酶制劑。文檔編號(hào)C12N9/20GK101210235SQ20071006020公開(kāi)日2008年7月2日申請(qǐng)日期2007年12月25日優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日發(fā)明者劉瑞娟,薇戚,王建玲,王春霞,王海寬,趙婷婷,路福平申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)