專利名稱：用于擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因的多重pcr引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因的擴(kuò)增技術(shù)，屬于關(guān)于核苷 酸的測(cè)定或檢驗(yàn)方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
瘧疾在世界范圍內(nèi)流行形勢(shì)嚴(yán)峻，尤其是惡性瘧的危害更加突出，據(jù)世界 衛(wèi)生組織報(bào)告全球每年約有100萬(wàn)人死于惡性瘧，尚不包括間接引起的死亡。 我國(guó)云南和海南兩省存在惡性瘧流行，每年均有死亡病例報(bào)告。20世紀(jì)50年代 后，惡性瘧原蟲(chóng)開(kāi)始對(duì)抗瘧藥產(chǎn)生抗性，近年抗性形勢(shì)日趨嚴(yán)峻，由低度抗性 發(fā)展為高度抗性，由單一抗性發(fā)展為多重抗性，且抗性產(chǎn)生速度逐步加快。準(zhǔn) 確快速地監(jiān)測(cè)抗性株的分布和流行已成為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。新近研究表明抗瘧藥抗性的產(chǎn)生與惡性瘧原蟲(chóng)某些關(guān)鍵基因的單核苷酸多 態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)有關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因的SNP 可反映惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)相應(yīng)藥物的抗性情況，并在不同地區(qū)的多項(xiàng)研究中得到驗(yàn) 證。如惡性瘧原蟲(chóng)氯喹抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(尸/cW)的391T/A、 392 G/C、 399 G/T、 400 A/G、 402 T/A和404 A/C多態(tài)性(對(duì)應(yīng)72 76位氨基酸編碼序歹!j)與氯 喹抗性相關(guān)聯(lián)^"^fe"o" r" Ato>《g/" 77'箏爿wri冊(cè)'cra6 ^gewfa C/zemc^" W(^):27朋-"朋./ Tage/Wr W' /6ra/n'm Z' Mec/a"/爿，箏^fcto Trap, 97(X):，25.;爐r/c/2 S聘應(yīng)妙M StoW J諷寧7>6 / 她d 版禍，廁5， 川(7":W67-W70J;惡性瘧原蟲(chóng)多藥抗性基因(尸/mdr7)的256 A/T和257 A/T 多態(tài)性(對(duì)應(yīng)86位氨基酸編碼序列)與甲氟喹、氯喹等多種藥物的抗性有關(guān)"朋.；％取/ > iV,幾ra/2/m Z， Mecfam'爿，寧^cto Trap, 2006， 97"人/9-25.,' Dwra/w'wg/z ife/owr A Mo/ M/craWo/,6 5, 57^):574-S77. A惡性,原蟲(chóng)二氫 喋酸合成酶基因的1482T/G、 1483 C/T/G、 1486 G/C、 1794 A/G、 1918 C/G和2013 G/T/A多態(tài)性(對(duì)應(yīng)436、 437、 540、 581和613位氨基酸編碼序列) 與磺胺類藥物抗性有關(guān)；惡性瘧原蟲(chóng)二氫葉酸還原酶基因(iy^2/r)的148T/C、 152A/T、 153T/C、 175 T/C、 323 G/A/C和490 A/T多態(tài)性(對(duì)應(yīng)50、 51、 59、 108和164位氨基酸編碼序列)與乙胺嘧啶抗性有關(guān)宜湯#舉^房茅f A學(xué)與茅主j瘋?cè)咎?膨，2柳'777-徴,C : G6otos/20 GO， Fo/anV 04, 箏爿"a Trap, 206*5, P5口人7S3-W3,, iV&a， A Z)w7y JS &w (9,寧Trap Afed/"fHealth, 2005, 10(11) :1176-1179. 乂惡性瘧原蟲(chóng)三磷酸腺苷酶第6亞基基因 (PfATPase6)的2306 G/A多態(tài)性(對(duì)應(yīng)769位氨基酸編碼序列)與青蒿素類 藥物IC50升高有關(guān)^y"m6oM尺Legraw/ A7朋g M,寧2(W5， 366W"6957人957-P6A義在非洲和東南亞等惡性瘧嚴(yán)重流行地區(qū)，上述SNP已被 作為分子標(biāo)志用于現(xiàn)場(chǎng)惡性瘧原蟲(chóng)的藥物抗性評(píng)價(jià)f,J^^:湯#華^房寄主 ^學(xué)與茅主^i^^,志2005， "0.'"7-"a, Co"g; 即"g《'7Vq Sa"gc/za"g AT,她一/ M寧—她J //^ ^f/e錢(qián)，5, 7羊J: 77 7- 7".; S少咖必力D,顛/zCa^y 07,等Jw J 7h p Med //jyg, 206*5;7々2」.'77一7S/. ，' A^m6a B， Ja/an'扁檢測(cè)上述SNP首先需對(duì)相應(yīng)基因進(jìn)行擴(kuò)增，瘧疾患者血樣通常以濾紙干血 滴形式從現(xiàn)場(chǎng)帶回，所含瘧原蟲(chóng)DNA量較少，且混有人類DNA，傳統(tǒng)單輪PCR 的靈敏度和特異性均達(dá)不到要求。經(jīng)檢索中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(CBM)、萬(wàn) 方數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)和PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，目 前文獻(xiàn)報(bào)道均采用巢式PCR方法對(duì)上述基因逐一進(jìn)行擴(kuò)增，具體方法以文獻(xiàn) Z)j./m&4 Z)oMmZw (9《CbWeyeJ《攀A^五"g/2朋7,3"^9.'257-2(53.禾。文獻(xiàn)47 ;"47-"M.為例簡(jiǎn)述如下。 1、戶/cr/巢式PCR擴(kuò)增方法 1)第一輪反應(yīng)上游引物5 ，-CCGTTAATAATAAATACACGCAG-3 ， 下游引物5,-CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC-3，反應(yīng)體系① 10xPCR緩沖液 5^1② 25 mmol/L MgCl2 5(il③ i00pmol/L上游引物 0.5^1④ 100(imol/L下游引物 0.5(il⑤ 10mmol/LdNTPs 1^1 H20 32.5^1⑦ 模板DNA 5pl⑧ 5 U/jil Taq DNA聚合酶 0.5|al 總體積 50|il 反應(yīng)條件94 °C 預(yù)變性 3 min2、尸/mt/r/巢式PCR擴(kuò)增方法 1)第一輪反應(yīng)上游引物5，-ATGGGTAAAGAGCAGAAAGA-3， 下游引物5，- AACGCAAGTAATACATAAAGTCA-3 ， 反應(yīng)體系① 10xPCR緩沖液 5^1② 25 mmol/L MgCl2 5 pi③ 100 (imol/L上游引物 0.5^1 100 ^mol/L下游引物 0.5^1 ⑤10mmolVLdNTPs@H2Q 32.5 (il30s 30s 1 min 3 min45循環(huán)2)第二輪反應(yīng)上游引物5，-TGTGCTCATGTGTTTAAACTT-3 ， 下游弓i物5 ，-CAAAACTATAGTTACCAATTTTG-3 ， 反應(yīng)體系① 10xPCR緩沖液 5^il② 25 mmol/L MgCl2 5^1③ 100 fimol/L上游引物 0.5|ul 100 |imol/L下游引物 0.5pi ⑤10 mmol/L dNTPs(DH20 35，⑦ 模板DNA 2^d⑧ 5 U/Vl Taq DNA聚合酶 0.5^1 總體積 50^1 反應(yīng)條件性 5 min 30s30s 30s — 3 min、30循環(huán)性火伸申c c c c49■6 o o5 6 6變性火申申預(yù)資*延跑5 2 8 5 59 9 4 6 6
3、 /y欲;w巢式PCR擴(kuò)增方法 1)第一輪反應(yīng)上游引物5，- GATTCTTTTTCAGATGGAGG-3， 下游引物5，- TTCCTCATGTAATTCATCTGA-3， 反應(yīng)體系6⑦ 模板DNA⑧ 5U/VlTaqDNA聚合酶 總體積反應(yīng)條件性5|Lil0.5 fil 50(il45循環(huán)mm2)第二輪反應(yīng)上游引5 ，-TGGTAACCTCAGTATCAAAGAA-3 ， 5 ，- ATAAACCTAAAAAGGAACTGG-3 ，下游引物 反應(yīng)體系① 10xPCR緩沖液② 25 mmoI/L MgCl2③ 100jimol/L上游引物④ 100 jimol/L下游引物⑤ 10mmol/LdNTPs H20⑦ 模板DNA⑧ 5 U/pl Taq DNA聚合l 總體積反應(yīng)條件性5(il 5(il35.5|^12)Lll50jil3 min 30 s 30 s 45 s卜20循環(huán)mm變性火伸伸c p c c c5 2 oo9 9 45 566變性火申申預(yù)變l延gp p c p c5 2 00 5 5ON 9 4 6 6 ① 10xPCR緩沖液 2.5^1② 20 mmol/L MgCl2 2.5^1③ 12.5pmol/L上游引物 0.5^1④ 12.5 jimol/L下游引物 0.5^1⑤ 10mmol/LdNTPs 0.6 jil H20 17々1⑦ 模板DNA l.O^d⑧ 5 U/pl Taq DNA聚合酶 0.2|il 總體積 25^1 反應(yīng)條件性 3 min1 min ，2 min卜40循環(huán) 1 min J 10 min2)第二輪反應(yīng)上游引物5，- AACCTAAACGTGCTGTTCAA -3， 下游引物5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA-3'反應(yīng)體系① 10xPCR緩沖液② 20 mmol/L MgCl2③ 12.5.pmol/L上游引物④ 12.5 prnol/L下游引物⑤ 10 mmol/L dNTPs ◎H20⑦ 模板DNA⑧ 5 U/fil Taq DNA聚合酶 總體積 反應(yīng)條件性1 min ，40循環(huán)2.5(il 2.5^il 0.5|il 0.5^1 O一 17.2|il l.O)il 0.2|il 25 (il變性火申申愛(ài)變、# Si Sc c c c c4 4 129 9 5 727變性火伸申,變1延延c c p p p4 4 12 29 9 5 7 7
4、pfdhfr巢式PCR擴(kuò)增方法1)第一輪反應(yīng)上游引物5，- TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 ， 下游引物5 ，- CTAGTATATACATCGCTAACA-3 ， 反應(yīng)體系① 10xPCR緩沖液 2.5^11② 20 mmol/L MgCl2 2.5|il③ 12.5 |imol/L上游引物 0.5)il④ 12.5 pmol/L下游引物 0.5)^1⑤ 10mmol/LdNTPs 0.6^1 H20 17，⑦ 模板DNA 1.0^1⑧ 5 U/W Taq DNA聚合酶 0.2pl 總體積 25pl 反應(yīng)條件94 °C 預(yù)變性 3 min94 °C 變性 1 min ，2)第二輪反應(yīng)上游引物5，隱TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3' 下游引物5'- CTGGAAAAAATACATCACATTCATATG-3，反應(yīng)體系52 °C 72 °C 72 °C退火 延伸 延伸① 10xPCR緩沖液② 20 mmol/L MgCl:2， 2.5|il 0.5(il 0.5^1 0.6^1 17， 1.0|il 0.2[il 25 [il③ 12.5 (imol/L上游引物④ 12.5 (imol/L下游引物 10 mmol/L dNTPs ◎H20⑦ 模板DNA⑧ 5 U/pl Taq DNA聚合酶 總體積反應(yīng)條件<formula>formula see original document page 9</formula>5、 PfATPase6的PCR擴(kuò)增方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。巢式PCR方法的原理和技術(shù)均已成熟，在惡性瘧原蟲(chóng)抗性相關(guān)基因研究中 廣泛應(yīng)用，但完成上述5個(gè)藥物抗性相關(guān)基因的擴(kuò)增至少需要進(jìn)行10次PCR 反應(yīng)，約5個(gè)工作日方能完成，消耗較多人力，操作步驟復(fù)雜，所需費(fèi)用高， 且時(shí)效性較差，制約了惡性瘧原蟲(chóng)抗性相關(guān)分子標(biāo)志在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中的廣泛應(yīng)用。 尋找一個(gè)高效、便捷的手段來(lái)擴(kuò)增這些基因顯得十分必要。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因傳統(tǒng)擴(kuò)增方法操作繁瑣、耗時(shí)耗 力的不足，提供一種高效、便捷的惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因多重PCR擴(kuò)增 引物及方法，實(shí)現(xiàn)一次反應(yīng)完成5個(gè)主要抗性相關(guān)基因(分別反映惡性瘧原蟲(chóng) 對(duì)氯喹、甲氟喹、乙胺嘧啶、磺胺類和青蒿素類等藥物的抗性情況)的擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋21個(gè)抗性相關(guān)SNP，為后繼的SNP分析，如DNA測(cè)序、RFLP、 PCR-ELISA和SNP芯片等檢測(cè)方法提供重要技術(shù)支撐，從而顯著提高惡性瘧原 蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)SNP的檢測(cè)效率，為惡性瘧原蟲(chóng)抗性分子標(biāo)志監(jiān)測(cè)的廣泛開(kāi)展 奠定技術(shù)基礎(chǔ)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)原理在PCR反應(yīng)管中，加入適當(dāng)緩沖液，微量模 板DNA， 4種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)溶液，DNA聚合酶(如TaqDNA聚合 酶)，和一對(duì)特異性引物，將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下(如94X:) 變性，雙鏈解為單鏈；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下(如5(TC)與 模板DNA互補(bǔ)結(jié)合，形成部分雙鏈；溶液溫度再升至中溫(如72"C)，在DNA 聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，以結(jié)合在單鏈模板DNA上的引物為起點(diǎn)， 按模板DNA堿基的配對(duì)要求，合成互補(bǔ)鏈。如此反復(fù)按順序改變反應(yīng)溫度，即 高溫變性，低溫退火和中溫延伸，這樣一個(gè)循環(huán)使特定區(qū)段的DNA數(shù)量增加1倍。 一般經(jīng)過(guò)2(K40次循環(huán)擴(kuò)增，最終使模板DNA數(shù)量增加數(shù)百萬(wàn)倍，可在短 時(shí)間內(nèi)生成大量特定DNA分子。多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一 PCR 反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng) 原理與一般PCR相同。多重PCR的特點(diǎn)有①高效性，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi) 同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因片段；②系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于一組相關(guān)基因的擴(kuò) 增；(D經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多個(gè)基因在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增，節(jié)省時(shí)間、試劑，節(jié) 約經(jīng)費(fèi)開(kāi)支。Hot start Taq DNA聚合酶的氨基酸殘基上結(jié)合了熱依賴的封閉基團(tuán)，常溫下 沒(méi)有活性，避免了非特異性引物退火和引物二聚體。只有經(jīng)94'C加熱變性超過(guò) 4分鐘才能激活。相對(duì)普通Taq DNA聚合酶，其擴(kuò)增的特異性、靈敏度和產(chǎn)量 均有所提高。本發(fā)明根據(jù)多重PCR擴(kuò)增原理，采用Hot start Taq DNA聚合酶，依據(jù)戶/cr/、 尸>7&7、 P^%w、 /y函/r和/y^77^we6等5個(gè)惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因序列， 運(yùn)用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，參考文獻(xiàn)r earce/^7-/3WJ 2對(duì)引物，摸索和優(yōu)化多重PCR引物組合、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件， 設(shè)置遞增延伸溫度，建立了 5個(gè)惡性瘧原蟲(chóng)抗性相關(guān)基因的單管多重PCR擴(kuò)增本發(fā)明所述的惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因是指包括/yc/Y、尸/"^W、尸/J/2戸、和P/47Pa^(5在內(nèi)的惡性瘧原蟲(chóng)基因。 一種用于擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因靶序列的引物集，其包括至少 一對(duì)選自下組的引物或引物變體(a) 引物P1F: 5，-GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAAT-3， 引物P1R: 5,-ATATTGGTAGGTGGAATAGATTCT扁3，；(b) 引物P2F: 5，-TGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA-3， 弓I物P2R: 5 ，-TCGTACCAATTCCTGAACTCACTT扁3';(c) 引物P5F: 5'-AAAATAAATACCACATCAACACAT-3， 引物P5R: 5'-TCAATAATACCTAATCCACCTAAA-3，；其中所述的引物變體是指在相應(yīng)引物上從3'末端，從5'末端或者從3，和5'末端 有1-3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的引物。如上所述的引物集，其還包括至少一對(duì)選自下組的引物或引物變體(d) 引物P3F: 5，-GATTCTTTTTCAGATGGAGG-3，弓1物P3R: 5 ，-TTCCTCATGTAATTCATCTGA陽(yáng)3 ，；(e) 引物P4F: 5，-TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3，引物P4R: 5 ，-CTGGAAAAAATACATCACATTCATATG-3';方法。其中所述的引物變體是指在相應(yīng)引物上從3'末端，從5'末端或者從3'和5'末端 有1-3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的引物。一種擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因的方法，其用包括上述(a)或(b)或(c) 中任一引物對(duì)進(jìn)行惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因PCR反應(yīng)。一種擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因的方法，采用上述引物集對(duì)惡性瘧 原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。如上所述的方法，其包括將引物混合液與100-500 ng模板DNA混合；其中 引物混合液中每條引物含量在0.02-0.1 pmol之間。如上所述的方法，其中多重PCR的反應(yīng)條件是94°C預(yù)變性13-17 min， 進(jìn)入循環(huán)94°C變性35-45 s， 50°C退火1.5-2.5 min，由50。C按0.1°C/s遞增 至70陽(yáng)74。C，共35-45個(gè)循環(huán)，然后70-74。C延伸3min。本發(fā)明進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性15 min，進(jìn)入循 環(huán)94°C變性40 s、 50°C退火2min、由50。C按O.rC/秒遞增至72°C ，共40 循環(huán)，然后72。C延伸3min。擴(kuò)增產(chǎn)物-20°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系包括10xPCR緩沖液(含1.5-2.5 mmol/LMg2+) 5.0 |il， 10 mmol/L dNTPs 1.0-1.5 pl，引物混合物液(組成2.5-4.0 pi 12.5 ,ol/LPlF、2.5-4.0 |il 12.5 |imol/L P1R、 1.5-2.5 pi 12.5 ,ol/L P2F、 1.5-2.5 jil 12.5 )imol/LP2R、 1.5-2.5 fil 12.5拜ol/L P3F、 1.5-2,5 |il 12.5 |imol/L P3R、 1.5-2.5 |il 12.5 jimol/LP4F、 1.5-2.5 (il 12.5 |_imol/LP4R、 1.5-2.5 ^il 12.5 |amol/LP5F、 1.5-2.5 |il 12.5 (imol/L P5R) 0.8-1.2 (il，模板DNA 2.0-3.0 「d， 5 U/jil Hot start Taq DNA 聚合酶0.3-0.5 |il，加滅菌雙蒸水至50.0]al。本發(fā)明進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系優(yōu)選條件包括10xPCR緩沖液(含 2.0mmol/LMg2+) 5.0^1， 10 mmol/L dNTPs 1.2 fil，引物混合物液(組成3.2 mJ 12.5 jimol/L PIF、 3.2 |il 12.5 jimol/L PIR、 2.0 pi 12.5 |imol/L P2F、 2.0 pi 12.5 pmol/LP2R、 2.0 (il 12.5 |_imol/LP3F、 2.0 (il 12.5 pmol/L P3R、 2.0 fil 12.5 |imol/L P4F、 2,0 (il 12,5 (imol/LP4R、 2.0 (il 12.5 jimol/LP5F、 2.0 ^ 12.5 |imol/LP5R) 1.0|il，模板DNA2.5)al， 5 U/(il Hot start Taq DNA聚合酶0.4^1，加滅菌雙蒸水 至50.0 (il。如上所述引物集在惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因擴(kuò)增方面的應(yīng)用。 傳統(tǒng)巢式PCR擴(kuò)增方法每擴(kuò)增一個(gè)惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因需進(jìn)行兩 次PCR反應(yīng)，若欲擴(kuò)增目前明確的5個(gè)主要抗性相關(guān)基因，則需10次PCR反 應(yīng)，約5個(gè)工作日方能完成，本發(fā)明單管一次反應(yīng)即可完成5基因擴(kuò)增，只需5 小時(shí)。本發(fā)明所需耗材和試劑用量顯著少于傳統(tǒng)巢式PCR擴(kuò)增方法，節(jié)省費(fèi)用。傳統(tǒng)巢式PCR擴(kuò)增5基因需完成10次PCR操作，本發(fā)明工作量與一次普通PCR相當(dāng)，操作步驟少，快捷方便，減少各種操作失誤發(fā)生的可能，可提高
實(shí)驗(yàn)成功幾率。本發(fā)明單管一次反應(yīng)完成5個(gè)主要抗性相關(guān)基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋21個(gè) 已知藥物抗性相關(guān)SNP位點(diǎn)，尤其適用于PCR-ELISA和SNP芯片等高通量基 因型分析方法。傳統(tǒng)方法耗時(shí)耗力，限制了抗性分子標(biāo)志在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，本發(fā)明將 促進(jìn)惡性瘧原蟲(chóng)抗性分子標(biāo)志在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中的廣泛應(yīng)用。


圖1為實(shí)施例中本發(fā)明多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
根據(jù)尸/cW、 7ym士八iyW戸、/y^/^和/^7Po^6 5個(gè)惡性瘧原蟲(chóng)基因的保 守序列及21個(gè)藥物抗性相關(guān)SNP位點(diǎn)的位置，設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物，由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。5個(gè)基因預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為戶/cW: 315 bp;尸/m晶514 bp; ，— 770 bp;尸 594 bp; ，7P置6": 437 bp。上游弓l物(P1F): 5'-GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAAT-3' 下游引物(P1R): 5'-ATATTGGTAGGTGGAATAGATTCT-3，上游引物(P2F): 5'-TGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA-3， 下游引物(P2R): 5'-TCGTACCAATTCCTGAACTCACTT-3，上游引物(P3F): 5'-GATTCTTTTTCAGATGGAGG陽(yáng)3， 下游引物(P3R): 5，-TTCCTCATGTAATTCATCTGA-3， 尸澤上游引物(P4F): 5'-TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3， 下游引物(P4R): 5'-CTGGAAAAAATACATCACATTCATATG-3，上游引物(P5F): 5'-AAAATAAATACCACATCAACACAT-3， 下游引物(P5R): 5'-TCAATAATACCTAATCCACCTAAA-3，(二)多重PCR 1、 模板DNA的制備(1)現(xiàn)場(chǎng)收集5份惡性瘧原蟲(chóng)濾紙血樣，1份間日瘧原蟲(chóng)濾紙血樣(作為 陰性對(duì)照)；(2)將瘧原蟲(chóng)濾紙千血滴剪石卒，.5 ml EP管；(3) 加200W IO(TC預(yù)熱的5% (w/v) chelex-100，振蕩20s;(4) IO(TC水浴10min，振蕩20s;(5) 10 000rpm離心5 min，吸取上清150(11， -20"保存?zhèn)溆?2、 多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(1 ) 10xPCR緩沖液(含2.0 mmolZL Mg2+)(2) 10mmol/LdNTPs(3) 引物混合物液(4) 模板DNA(5) 5 U/V1 Hot start Taq DNA聚合酶(6) H20總體積5.0 pi 1.2 |il 1.0 (J 2.5 (il 0.4 ^ 39.9 pi 50 (il3.2 (i 12.5 ,1/LP1R、 2.0注引物混合液的組成3.2^1 12.5 |imol/LPlF-1^1 12.5 )imol/LP2F、 2.0 [il 12.5 |imol/LP2R、 2.0 pi 12.5 |imol/LP3F、 2.0 |il 12.5 ^mol/LP3R、 2,0 pi 12.5 |imol/LP4F、 2.0 (il 12.5 )imol/L P4R、 2,0 pi 12.5 |imol/L P5F、 2.0 (il 12.5 |imol/LP5R。擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性15min94 °C變性40 s 〕50°C退火2 min ^ 40循環(huán)由50。C按0.rC/s遞增至72。C j72°C延伸3 min-20°C保存所用PCR儀型號(hào)為PTC-200,購(gòu)自MJ Research公司(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5pl，加1 ^溴酚藍(lán)上樣緩沖液，混勻，點(diǎn)樣于20g/L瓊 脂糖凝膠(含0.5嗎/ml溴化乙錠)，以100 bp DNA分子量Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分 子參照，在5 V/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度下于1倍的TAE電泳緩沖液中電泳50分鐘，凝 膠成像系統(tǒng)(MULTI GENIUS Bio Imaging System, Syngene)紫外線下觀察結(jié)果 并拍照(見(jiàn)圖l)。圖1中M: 100 bp DNA分子量Marker, 1-5:現(xiàn)場(chǎng)惡性瘧原 蟲(chóng)DNA多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6:現(xiàn)場(chǎng)間日瘧原蟲(chóng)DNA多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，7: 空白對(duì)照多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(四) PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定利用DNA回收試劑盒(大連寶生物工程有限公司)從瓊脂糖凝膠中回收 PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行DNA序列測(cè)定。DNA序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服 務(wù)有限公司完成。(五) 總結(jié)本實(shí)驗(yàn)利用5對(duì)特異引物，采用優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，成 功地?cái)U(kuò)增出惡性瘧原蟲(chóng)5個(gè)主要藥物抗性相關(guān)基因靶序列，PCR產(chǎn)物大小分別 為尸/cW: 315 bp;尸/m^7: 514 bp; P/^2/^: 770 bp;尸/^z/r: 594 bp; P/^7Po^6: 437bp。經(jīng)序列比對(duì)，現(xiàn)場(chǎng)惡性瘧原蟲(chóng)標(biāo)本的5基因靶序列除多態(tài)性位點(diǎn)外均與 惡性瘧原蟲(chóng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株3D7株一致。陰性對(duì)照和空白對(duì)照未見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用 本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改， 并把在此說(shuō)明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此， 本發(fā)明不限于這里的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，對(duì)于本發(fā)明 做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因靶序列的引物集，其特征在于包括至少一對(duì)選自下組的引物或引物變體(a)引物P1F5’-GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAAT-3’ 引物P1R5’-ATATTGGTAGGTGGAATAGATTCT-3’；(b)引物P2F5’-TGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA-3’ 引物P2R5’-TCGTACCAATTCCTGAACTCACTT-3’；(c)引物P5F5’-AAAATAAATACCACATCAACACAT-3’ 引物P5R5’-TCAATAATACCTAATCCACCTAAA-3’；其中所述的引物變體是指在相應(yīng)引物上從3’末端，從5’末端或者從3’和5’末端有1-3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的引物。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物集，其特征在于還包括至少一對(duì)選自下組的引物或 引物變體.-(d) 引物P3F: 5'-GATTCTTTTTCAGATGGAGG-3'弓I物P3R: 5'-TTCCTCATGTAATTCATCTGA-3'; (e)引物P4F: 5'-TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3，弓(物P4R: 5，-CTGGAAAAAATACATCACATTCATATG-3'; 其中所述的引物變體是指在相應(yīng)引物上從3'末端，從5，末端或者從3，和5， 末端有1-3個(gè)附加核苷酸加入或缺失的引物。
3. —種擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因的方法，其特征在于用包括權(quán)利要求 1所述引物集中任一引物對(duì)進(jìn)行惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因PCR反應(yīng)。
4. 一種擴(kuò)增惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因的方法，其特征在于采用權(quán)利要求1 或2中所述引物集對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于將引物混合液與100-500 ng模板DNA 混合；其中引物混合液中每條引物含量在0.02-0.1 pmol之間。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述多重PCR的條件是94°C預(yù)變 性13-17 min，進(jìn)入循環(huán)94°C變性35-45 s， 50°C退火1.5-2.5 min，由 5(TC按0.rC/s遞增至70-74 。C，共35-45個(gè)循環(huán)，然后70-74 °C延伸3 min。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述多重PCR條件是:94t:預(yù)變性15 min，進(jìn)入循環(huán)94°C變性40 s， 50°C退火2min，由50。C按0.1°C/s遞增 至72-C，共40個(gè)循環(huán)，然后72"C延伸3min。
8. 權(quán)利要求1、 2中任一項(xiàng)所述引物集在惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因擴(kuò)增方 面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)基因多重PCR擴(kuò)增方法，以惡性瘧原蟲(chóng)基因組DNA為模板，采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的多重PCR引物集，進(jìn)行一次單管PCR反應(yīng)，擴(kuò)增特定的5個(gè)基因(惡性瘧原蟲(chóng)氯喹抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Pfcrt、惡性瘧原蟲(chóng)多藥抗性基因Pfmdr1、惡性瘧原蟲(chóng)二氫喋酸合成酶基因Pfdhps、惡性瘧原蟲(chóng)二氫葉酸還原酶基因Pfdhfr和惡性瘧原蟲(chóng)三磷酸腺苷酶第6亞基基因PfATPase6)靶序列，擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋21個(gè)目前已知惡性瘧原蟲(chóng)藥物抗性相關(guān)SNP位點(diǎn)。本發(fā)明操作步驟少，快捷方便，節(jié)約費(fèi)用；尤其適用于高通量基因型分析，將有力促進(jìn)惡性瘧原蟲(chóng)抗性相關(guān)SNP在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中的廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101161822SQ20071004300
公開(kāi)日2008年4月16日 申請(qǐng)日期2007年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者張國(guó)慶, 湯林華 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所