專利名稱：一種香菇7402菌種aflp快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測(cè)方法領(lǐng)域，具體涉及一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)香菇產(chǎn)量已從1983年的1.95萬(wàn)噸迅速發(fā)展到2005年的242萬(wàn)噸，占全球香菇總產(chǎn)量的70％以上，改寫了世界食用菌產(chǎn)量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產(chǎn)量差距，有專家預(yù)測(cè)，由于中國(guó)香菇產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在近10年內(nèi)其將成為世界產(chǎn)量最高的食用菌。中國(guó)香菇以其驚人的發(fā)展速度，優(yōu)質(zhì)的品質(zhì)及低廉的成本為世界菇業(yè)人士矚目，中國(guó)香菇已風(fēng)靡世界。
優(yōu)質(zhì)菌種在香菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產(chǎn)業(yè)中的重要地位。1999年我國(guó)簽署了《國(guó)際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國(guó)家的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，同時(shí)也要加強(qiáng)保護(hù)我們國(guó)家自己的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記制度來(lái)真正保護(hù)我國(guó)的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定基礎(chǔ)。尤其日本2004年4月1日開始實(shí)行《種苗法修正案》，對(duì)我國(guó)食用菌尤其是香菇的出口構(gòu)成了極大的威脅。就國(guó)內(nèi)而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現(xiàn)象，不僅給菇農(nóng)帶來(lái)了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國(guó)香菇的快速發(fā)展；而且，隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對(duì)香菇栽培菌株質(zhì)量的要求越來(lái)越高，需要發(fā)展更為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準(zhǔn)確無(wú)誤。
近年來(lái)，DNA指紋技術(shù)的迅速發(fā)展為在DNA分子水平上鑒定香菇菌種提供了嶄新的手段。其中AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphism)技術(shù)為新發(fā)展起來(lái)的被認(rèn)為是最有效的分子標(biāo)記方法。AFLP分析的基本原理是選擇性擴(kuò)增基因組DNA酶切片段。由于不同基因組DNA的酶切位點(diǎn)存在差異，因而產(chǎn)生了擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。用AFLP方法得到的指紋圖譜具有穩(wěn)定可靠且多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于菌種鑒定等方面的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地對(duì)香菇7402菌種進(jìn)行鑒定的AFLP快速檢測(cè)方法。
一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法，包括下列步驟(1)菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取采用PDY液體培養(yǎng)基(馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母提取物0.1％)，150rpm，25℃15天搖瓶培養(yǎng)菌絲。濾膜過(guò)濾收集菌絲，并用無(wú)菌水沖洗兩次，濾紙吸干后貼上標(biāo)簽放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> DNA提取采用CTAB法，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，用紫外分光光度儀BECKMAN DU 640測(cè)量DNA的濃度和相對(duì)純度，并調(diào)整所有樣品DNA濃度到100ng/ul。
(2)DNA雙酶切對(duì)樣品DNA進(jìn)行MseI和EcoRI的雙酶切。DNA樣品酶切體系包括(總體積20μl)ddH2O 14.8μl10×Buffer2.0μl10U/μl MseI 0.25μl10U/μl EcoRI 0.25μl100×BSA 0.2μl100ng/μl模板DNA 2.5μl37℃酶切3小時(shí)，65℃處理10min。
(3)DNA片段接頭的連接酶切完成的每個(gè)DNA樣品，加入5μL如下的反應(yīng)液，16℃連接過(guò)夜。
ddH2O 0.85μlBuffer2.5μl25uM MseI adapter 1.0μl5uM EcoRI adapter 0.5μl3U/μl T4-DNA連接酶 0.15μl(4)DNA酶切產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系(總體積20μl)ddH，O14μl10×PCR Buffer 2.0μl25mmol/L MgCl2 1.2μl10mmol/L dNTP 0.4μl50ng/L M000.6μl50ng/μL E00 0.6μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl
酶連產(chǎn)物 1μlM00和E00為專用引物，是根據(jù)Mse和EcoR I酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，序列分別為E00GAC TGC GTA CCA ATT CM00GAT GAG TCC TGA GTA APCR反應(yīng)條件72℃ 5min；94℃ 1min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，20cycles；72℃ 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。4℃保存?zhèn)溆谩?br> (5)AFLP的選擇性擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，作為選擇性擴(kuò)增的模板。PCR擴(kuò)增體系(總體積10μl)ddH2O 4.7μl10×PCR Buffer 1.0μl25mmol/L MgCl2 0.8μl10mmol/L dNTP 0.2μl50ng/L Mse11引物 0.3μl50ng/L EcoRI 14引物0.3μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋液 2.5μlMse11和EcoRI 14引物是在引物M00和E00基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，序列如下EcoRI 14GAC TGC GTA CCA ATT CATMse11GAT GAG TCC TGA GTA ACAPCR反應(yīng)條件94℃ 2min，95℃ 20s，66℃ 30s(每個(gè)循環(huán)降低1℃)30s，72℃ 2min，10cycles，；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，25cycles；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統(tǒng)觀察結(jié)果，用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)。
(6)遺傳分析儀檢測(cè)選擇性擴(kuò)增的AFLP產(chǎn)物在CEQTM 8000遺傳分析儀器進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)孔加入0.5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，30μl上樣緩沖液和0.3μl標(biāo)準(zhǔn)分子量，上機(jī)檢測(cè)。
對(duì)114(為生產(chǎn)用種)個(gè)收集自全國(guó)各地的香菇生產(chǎn)用菌種及少數(shù)野生種共164個(gè)菌株實(shí)驗(yàn)，只有香菇7402菌株能擴(kuò)增檢測(cè)出分子量為214bp的特殊DNA條帶(圖1)，樣品在不同時(shí)間和不同泳道檢測(cè)重復(fù)性在0.5bp(圖2)該檢測(cè)方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。該檢測(cè)所需時(shí)間只需要4-5天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間，出菇試驗(yàn)則需要至少3個(gè)月的時(shí)間；該方法采用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增條帶的分離結(jié)合熒光信號(hào)檢測(cè)該方法與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，具有準(zhǔn)確性、重復(fù)性好的特點(diǎn)。


圖1AFLP檢測(cè)圖譜1箭頭標(biāo)注的為214bp的特殊條帶。
圖2 AFLP檢測(cè)圖譜2箭頭標(biāo)注的為214bp的特殊條帶，樣品在不同時(shí)間和不同泳道檢測(cè)重復(fù)性在0.5bp。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例1菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取采用PDY液體培養(yǎng)基(馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母提取物0.1％)，150rpm，25℃15天搖瓶培養(yǎng)香菇7402菌株菌絲。濾膜過(guò)濾收集菌絲，并用無(wú)菌水沖洗兩次，濾紙吸干后貼上標(biāo)簽放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> DNA提取采用CTAB法，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，用紫外分光光度儀BECKMAN DU 640測(cè)量DNA的濃度和相對(duì)純度，并調(diào)整所有樣品DNA濃度到100ng/ul。
DNA雙酶切對(duì)樣品DNA進(jìn)行MseI和EcoRI的雙酶切。DNA樣品酶切體系包括(總體積20μl)ddH2O 14.8μl10×Buffer2.0μl10U/μl MseI 0.25μl10U/μl EcoRI 0.25μl100×BSA 0.2μl100ng/μl模板DNA 2.5μl37℃酶切3小時(shí)，65℃處理10min。
DNA片段接頭的連接酶切完成的每個(gè)DNA樣品，加入5μL如下的反應(yīng)液，16℃連接過(guò)夜。
ddH2O 0.85μlBuffer2.5μl25uM MseI adapter 1.0μl5uM EcoRI adapter 0.5μl3U/μl T4-DNA連接酶 0.15μlDNA酶切產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系(總體積20μl)ddH，O14μl10×PCR Buffer2.0μl25mmol/L MgCl21.2μl10mmol/L dNTP 0.4μl50ng/μL M00 0.6μl50ng/μL E00 0.6μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl酶連產(chǎn)物 1μlM00和E00為專用引物，是根據(jù)Mse和EcoRI酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，序列分別為E00GAC TGC GTA CCA ATT CM00GAT GAG TCC TGA GTA APCR反應(yīng)條件72℃ 5min；94℃ 1min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，20cycles；72℃ 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。4℃保存?zhèn)溆谩?br> AFLP的選擇性擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，作為選擇性擴(kuò)增的模板。PCR擴(kuò)增體系(總體積10μl)ddH2O 4.7μl10×PCR Buffer 1.0μl25mmol/L MgCl2 0.8μl10mmol/L dNTP 0.2μl
50ng/μL Mse11引物 0.3μl50ng/μL EcoRI 14引物 0.3μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋液 2.5μlMse11和EcoRI 14引物是在引物M00和E00基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，序列如下EcoRI 14GAC TGC GTA CCA ATT CATMse11GAT GAG TCC TGA GTA ACAPCR反應(yīng)條件94℃ 2min，95℃ 20s，66℃ 30s(每個(gè)循環(huán)降低1℃)30s，72℃ 2min，10cycles，；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，25cycles；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統(tǒng)觀察結(jié)果，用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)。
遺傳分析儀檢測(cè)選擇性擴(kuò)增的AFLP產(chǎn)物在CEQTM 8000遺傳分析儀器進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)孔加入0.5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，30μl上樣緩沖液和0.3μl標(biāo)準(zhǔn)分子量，上機(jī)檢測(cè)。可擴(kuò)增檢測(cè)出分子量為214bp的特殊DNA條帶。
權(quán)利要求
1.一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取(2)DNA雙酶切對(duì)樣品DNA進(jìn)行MseI和EcoRI的雙酶切；(3)DNA片斷接頭的連接接頭使用MseI adapter與EcoRI adapter；(4)DNA酶切產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增的專用引物，是根據(jù)MseI和EcoRI酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，序列分別為E00GAC TGC GTA CCA ATT CM00GAT GAG TCC TGA GTA A(5)AFLP的選擇性擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，作為選擇性擴(kuò)增的模板。選擇性擴(kuò)增的引物Mse1 11和EcoRI14是在引物M00和E00基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的序列如下EcoRI 14GAC TGC GTA CCA ATT CATMse1 11GAT GAG TCC TGA GTA ACA(6)遺傳分析儀檢測(cè)選擇性擴(kuò)增的AFLP產(chǎn)物在遺傳分析儀器進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1)所述的菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取包括下列步驟采用PDY液體培養(yǎng)基(馬鈴薯20％，葡萄糖2％，酵母提取物0.1％)，150rpm，25℃15天搖瓶培養(yǎng)菌絲；濾膜過(guò)濾收集菌絲，并用無(wú)菌水沖洗兩次，濾紙吸干后貼上標(biāo)簽放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，DNA提取采用CTAB法，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，用紫外分光光度儀BECKMAN DU 640測(cè)量DNA的濃度和相對(duì)純度，并調(diào)整所有樣品DNA濃度到100ng/ul。
3.如權(quán)利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)所述的DNA雙酶切條件為DNA樣品酶切體系包括(總體積20μl)ddH2O14.8μl10×Buffer 2.0μl10U/μl MseI 0.25μl10U/μl EcoRI0.25μl100×BSA 0.2μl100ng/μl模板DNA 2.5μl37℃酶切3小時(shí)，65℃處理10min。
4.如權(quán)利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)所述的DNA片斷接頭的連接為酶切完成的每個(gè)DNA樣品，加入5μL如下的反應(yīng)液，16℃連接過(guò)夜ddH2O0.85μlBuffer2.5μl25uM MseI adapter 1.0μl5uM EcoRI adapter 0.5μl3U/μl T4-DNA連接酶 0.15μl。
5.如權(quán)利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(4)所述的DNA酶切產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為(總體積20μl)ddH2O14μl10×PCR Buffer2.0μl25mmol/L MgCl21.2μl10mmol/L dNTP 0.4μl50ng/μL M000.6μl50ng/μL E000.6μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl酶連產(chǎn)物 1μlPCR反應(yīng)條件72℃5min；94℃1min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，20cycles；72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。4℃保存?zhèn)溆谩?br> 6.如權(quán)利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(5)所述的AFLP的選擇性擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系(總體積10μl)ddH2O4.7μl10×PCR Buffer1.0μl25mmol/L MgCl20.8μl10mmol/L dNTP 0.2μl50ng/μL MseI 17引物 0.3μl50ng/μL EcoRI 11引物 0.3μl5U/μL Taq DNA酶 0.2μl預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋液 2.5μlPCR反應(yīng)條件94℃2min，95℃20s，66℃30s(每個(gè)循環(huán)降低1℃)30s，72℃2min，10cycles，；94℃30s，56℃30s，72℃2min，25cycles；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，用VDS攝影系統(tǒng)觀察結(jié)果，用于毛細(xì)管電泳檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(6)所述的遺傳分析儀為CEQTM8000遺傳分析儀。
8.如權(quán)利要求1所述的一種香菇7402菌種AFLP快速檢測(cè)方法，其特征在于香菇7402菌種能擴(kuò)增檢測(cè)出分子量為214bp的特殊DNA條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開一種能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地對(duì)香菇7402菌種進(jìn)行鑒定的AFLP快速檢測(cè)方法。方法包括步驟菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提?。籇NA的MseI和EcoRI雙酶切；DNA片斷使用MseI adapter與EcoRI adapter進(jìn)行連接；DNA酶切產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增；AFLP的選擇性擴(kuò)增；遺傳分析儀檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101042370SQ200710040320
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者陳明杰, 譚琦, 尚曉冬, 宋春艷, 卓英, 潘迎捷 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所