專利名稱：腦突觸體的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腦突觸體的分離方法。
背景技術(shù)：
腦突觸體是通過細(xì)胞分離技術(shù)得到的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)末梢的膨大部 分。體內(nèi)神經(jīng)原與神經(jīng)原的連接與信號傳遞是通過神經(jīng)末梢的突觸實(shí)現(xiàn)的， 突觸末梢含有神經(jīng)遞質(zhì)。當(dāng)神經(jīng)沖動到達(dá)神經(jīng)末梢，突觸體釋放神經(jīng)遞質(zhì)作 用于次一級神經(jīng)原，使之產(chǎn)生效應(yīng)。不同的神經(jīng)末梢含有不同的神經(jīng)遞質(zhì)， 單胺類、谷氨酸、甘氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)釋放后是通過突觸前膜再攝取后使其作 用消失的。因此腦突觸體是生理和藥理工作者研究的重要部位之一，可用于 與這些神經(jīng)遞質(zhì)的攝取活動相關(guān)的研究，例如可用于這些神經(jīng)遞質(zhì)的抑制劑
和興奮劑的藥理研究。其中，腦突觸體用于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，如5-羥色胺 (5-HT)、去甲腎上腺素(NA)和多巴胺(DA)攝取作用的研究，并作為 作用于單胺類遞質(zhì)再攝取環(huán)節(jié)的抗精神病藥的篩選模型，是國際公認(rèn)的、先 進(jìn)的研究方法。
本發(fā)明人曾在文獻(xiàn)報道的方法上，對腦突觸體分離方法進(jìn)行了研究和改 進(jìn)(董文心，李建其，倪湘蓮，黃成均.腦突觸體攝取5-羥色胺研究方法的 建立及應(yīng)用.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志.2001. 31 (3): 118-120)，其主要步驟為1) 將大鼠斷頭后迅速取出大腦，在低溫條件(4"C的生理鹽水)下去除軟腦膜 及血管組織，取大腦皮層2ml于0.32M(30ml)的蔗糖溶液中勻漿后，以1500g 平衡離心(4°C) 10min，目的是去除大的細(xì)胞碎片；2)取上清液于17000g 再次平衡離心(4°C) 30min，目的是收集此液體中的所有組織，進(jìn)行下面的梯度離心，以分離腦突觸體；3)隨后將沉淀懸浮后置于0.32M、0.8M和1.2M 的蔗糖梯度離心管中以38000g的離心力進(jìn)行梯度離心60min，用穿刺針小 心收集位于0.8M和1.2M界面之間的懸浮液，此懸浮液即含有腦突觸體；4) 對收集的腦突觸體懸液再次進(jìn)行離心以20000g的速度(4°C) 30min，所得 沉淀物即精制的腦突觸體。該方法所制備的突觸體懸液中的蛋白含量穩(wěn)定在 5.6~6.8g/L(6.18±0.36g/L， n=14)，其組間變異為5.8%，在選定300nmol 'I/V 管的3H-單胺作為底物濃度時，突觸體的含量在120-220yg蛋白滑之間， 突觸體攝取單胺的效力無差異，不需每次進(jìn)行蛋白測定，大大簡化了實(shí)驗(yàn)程 序；而且可以同時進(jìn)行對5-HT、 NA和DA的再攝取研究。采用該方法對一 些已知單胺再攝取抑制劑的代表藥進(jìn)行研究，測得的IC50值與文獻(xiàn)報道非常 吻合，而且還篩選出了具有很強(qiáng)的雙重再攝取抑制(5-HT、 NA)作用的新 藥(CNZL02111934.1、 US 10/516,205)。然而此方法操作步驟還較煩瑣，特 別是用穿刺針小心收集位于0.8M和1.2M界面之間的懸浮液的步驟操作難度 較大，若操作不當(dāng)，則會造成突觸體含量的變化；而且分離時間也較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種較上述現(xiàn)有方法步驟簡化、時間縮 短而突觸體懸液中的蛋白含量無明顯變化的、改進(jìn)的腦突觸體的分離方法。
本發(fā)明人通過諸多試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，將現(xiàn)有方法步驟重新組合，通過控制離 心速度和時間，將含有腦突觸體的離體腦組織(大腦皮層)首先置于0.32M 和1.2M的蔗糖溶液中進(jìn)行離心，首先去除在1.2M的蔗糖溶液中可沉淀的大 的細(xì)胞碎片與沉渣；接著將含有腦突觸體的0.32M的蔗糖溶液置于0.8M的 蔗糖溶液中再次離心，將原來位于0.8M和1.2M界面的突觸體懸浮液直接離 心沉淀于管底，取沉淀物即為精制的腦突觸體。
因此，本發(fā)明的技術(shù)方案為 一種腦突觸體的分離方法，其包括下列步① 將離體大腦皮層組織于0.32M的蔗糖溶液中勻漿后，直接置于1.2M 的蔗糖溶液中以至少20000g平衡離心20-60分鐘后，用吸管吸去下層的 1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置于0.8M的蔗糖溶液中以至少30000g平衡離 心20 60分鐘后，取沉淀物即為精制的腦突觸體。
其中，離心速度越快，相同時間內(nèi)沉淀更充分；換言之，為達(dá)到同樣的 離心效果，所需時間可縮短。當(dāng)然，考慮到常用的離心設(shè)備及能耗，本發(fā)明 步驟①中的離心速度一般優(yōu)選在20000 40000g范圍，而步驟②中的離心速 度優(yōu)選在30000 40000g范圍。
更佳地，步驟①中的離心速度為20000g，離心時間為30分鐘。 步驟②中的離心速度為30000g，離心時間為30分鐘。 同常規(guī)，本發(fā)明的兩個離心步驟在低溫(4'C)條件下進(jìn)行；而0.32M 的蔗糖溶液用量只要能使離體大腦皮層組織勻漿完全即可，通常與離體大腦 皮層組織的體積比至少為10:1，較佳地為15 20:1; 1.2M或0.8M的蔗糖溶
液的用量只要能與0.32M的蔗糖溶液清楚分界，并能接納其中沉淀物即可， 通常其與離體大腦皮層組織的體積比至少為5:1。
根據(jù)本發(fā)明，所說的腦突觸體通常來源于試驗(yàn)動物，故本發(fā)明以常用的 試驗(yàn)大鼠為例來說明。
本發(fā)明分離方法的步驟，特別是離心步驟由4步改為2步，簡化了操作 程序；離心時間由130min可以縮短為60min左右，縮短了跨度一整天的腦 突觸體攝取單胺實(shí)驗(yàn)的整個實(shí)驗(yàn)進(jìn)程；省略了操作難度較大、對突觸體含量 影響較大的用穿刺針小心收集位于0.8M和1.2M界面的懸浮液的步驟;所制 備的突觸體的蛋白含量非常穩(wěn)定，較現(xiàn)有方法無明顯降低，穩(wěn)定在4.5 5g/L， 符合在選定300nM/管的3H-單胺作為底物濃度時，突觸體的含量在120-220 Ug蛋白/管之間的標(biāo)準(zhǔn)，提供了足量的突觸小體(突觸體)以供再攝取所需 (如表l所示)。表l在定量的SH-5-HT底物濃度下，每管所需突觸小體的作用量
0=4, x±s)
蛋白含量(突觸體)3H-5-HT計數(shù)(cpm)
120ug/管300畫1.L-1/管678.5 ±4.95
220U e/管300應(yīng)ol.L-1 /管695.5 ±86.9

圖1為氟西汀對腦突觸體攝取SH-5-HT抑制作用的量效關(guān)系圖(r^4， x ±s)。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。
首先根據(jù)常規(guī)方法，將Wistar或SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物責(zé)任有 限公司)斷頭后迅速取出大腦，在低溫條件(4"的生理鹽水)下去除軟腦 膜及血管組織，取大腦皮層進(jìn)行下列實(shí)施例的試驗(yàn)。
其中，突觸體懸液(懸浮于lml人工腦脊液中)中突觸體的含量以每升 溶液中所含的蛋白量來定量，采用上海申索試劑有限公司的總蛋白試劑盒 (雙縮脲比色法)來進(jìn)行蛋白測定。離心機(jī)為(德國Sigma公司，3K30型 高速冷凍離心機(jī))。
實(shí)施例1
① 將離體大腦皮層組織2ml于20ml、 0.32M的蔗糖溶液中勻漿后，直接 置于10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以20000g平衡離心30分鐘后，用吸管吸去 下層的1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置于10ml、 0.8M的蔗糖溶液中以30000g平衡 離心30分鐘后，取沉淀物即為精制的腦突觸體。
突觸體懸液中突觸體的含量為4.8g蛋白/L。 實(shí)施例2① 將離體大腦皮層組織2ml于20ml、 0.32M的蔗糖溶液中勻漿后，直接 置于10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以40000g平衡離心20分鐘后，用吸管吸去 下層的1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置于10ml、 0.8M的蔗糖溶液中以30000g平衡 離心60分鐘后，取沉淀物即為精制的腦突觸體。
突觸體懸液中突觸體的含量為4.9g蛋白/L。 實(shí)施例3
① 將離體大腦皮層組織2ml于30ml、 0.32M的蔗糖溶液中勻漿后，直接 置于10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以20000g平衡離心60分鐘后，用吸管吸去 下層的1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置于10ml、0.8M的蔗糖溶液中以40000g平衡 離心20分鐘后，取沉淀物即為精制的腦突觸體。
突觸體懸液中突觸體的含量為4.6g蛋白/L。 實(shí)施例4
① 將離體大腦皮層組織2ml于20ml、 0.32M的蔗糖溶液中勻漿后，直接 置于10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以30000g平衡離心40分鐘后，用吸管吸去 下層的1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置于10ml、 0.8M的蔗糖溶液中以40000g平衡 離心40分鐘后，取沉淀物即為精制的腦突觸體。
突觸體懸液中突觸體的含量為5.0g蛋白/L。 應(yīng)用實(shí)施例1
采用本發(fā)明方法制備腦突觸體，并進(jìn)行氟西汀對腦突觸體攝取5-HT抑 制試驗(yàn)(試驗(yàn)步驟參照現(xiàn)有技術(shù)如CNZL02111934.1)。試管中先加入l.Oml Tris-Krebs緩沖液，隨后加入20 " 1突觸小體懸液(實(shí)施例1的腦突觸體用 人工腦脊液懸浮)，繼之加入O.lmM的氟西汀10tU，混合均勻，37'C水浴 中溫浴5min。再加入10"1底物(3H-5-HT)，混勻，37°(:溫浴5min。將試管迅速放入4"C冰水中終止反應(yīng)，真空抽濾，并洗滌2次。取下濾膜，60-70
'c烘干，將濾膜放入閃爍瓶內(nèi)，加入甲苯閃爍液，于e-液閃計數(shù)器計數(shù)。
突觸體的凈攝取量37。C的cpm值(主動再攝取)減去0。C的cpm值(非特 異性聚集)，其量效關(guān)系圖如圖1所示。
測得的5-HT再攝取抑制劑的代表藥氟西汀的ICs。值為0.04 ix mol，U1/ 管，與文獻(xiàn)報道非常吻合(0.049umoH/1)。
權(quán)利要求
1、一種腦突觸體的分離方法，其包括下列步驟①將離體大腦皮層組織于0.32M的蔗糖溶液中勻漿后，直接置于1.2M的蔗糖溶液中以至少20000g平衡離心20～60分鐘后，用吸管吸去下層的1.2M的蔗糖溶液；②將步驟①得到的上清液置于0.8M的蔗糖溶液中以至少30000g平衡離心20～60分鐘后，取沉淀物即為精制的腦突觸體。
2、 如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于步驟①中的離心速度為 20000~40000g，步驟②中的離心速度為30000~40000g。
3、 如權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于步驟①中的離心速度為 20000g，離心時間為30分鐘。
4、 如權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于步驟②中的離心速度為 30000g，離心時間為30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腦突觸體的分離方法，其包括下列步驟①將含有腦突觸體的腦組織于0.32M的蔗糖溶液中勻漿后，直接置于1.2M的蔗糖溶液中以至少20000g平衡離心20～60分鐘后，用吸管吸去下層的1.2M的蔗糖溶液；②將步驟①得到的上清液置于0.8M的蔗糖溶液中以至少30000g平衡離心20～60分鐘后，取沉淀物即為精制的腦突觸體。本發(fā)明分離方法較現(xiàn)有技術(shù)簡化了操作步驟、縮短了分離時間，而且所分離的腦突觸體的蛋白含量非常穩(wěn)定，在用于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的攝取試驗(yàn)時，具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、效率高和操作簡單的特點(diǎn)。
文檔編號C12N5/06GK101294145SQ20071003987
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月24日
發(fā)明者倪湘蓮, 董文心, 顧豐華 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院