專利名稱：麥芽糖測定試劑盒及麥芽糖的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種麥芽糖測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定麥芽糖濃 度的方法，屬于食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景麥芽糖分子為無色或白色晶體，還原性二糖，有醛基反應(yīng)，能發(fā)生銀鏡 反應(yīng)，也能與班氏試劑(用硫酸銅、碳酸鈉或苛性鈉、擰檬酸鈉等溶液配 制)共熱生成磚紅色氧化亞銅沉淀。能使溴水褪色，被氧化成麥芽糖酸。 用作食品、營養(yǎng)劑等。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量/連續(xù) 監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得 以測定麥芽糖濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的麥芽 糖測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生 化分析儀上進(jìn)行麥芽糖濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以 得到切實的推廣應(yīng)用。本發(fā)明麥芽糖濃度測定方法原理如下麥牙糖+磷酸根麥芽糖磷酸化酶葡萄糖+葡萄糖1-磷酸 葡萄糖+氧葡萄糖氧化酶葡糖酸內(nèi)酯+過氧化氫過氧化氫+輔酶 NAD(T)H氧化酶 還原型輔酶+氧 這種方法應(yīng)用麥芽糖磷酸化酶(Disaccharide phosphorylases; EC 2.4.1.8) (偶)聯(lián)葡萄糖氧化酶(glucose oxidase; EC 1.1.3.4)、 NAD(P)H氧化酶 (NADPH oxidase; EC 1.6.3.1)酶促反應(yīng)速率比色法/終點法。麥芽糖磷酸 化酶酶解麥芽糖反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖，再通過(偶)聯(lián)合葡萄糖氧化酶、NAD(P)H 氧化酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔 酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nrn處吸光度 上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測算 麥芽糖的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明麥芽糖測定試劑盒較 為理想
磷酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
麥芽糖磷酸化酶 10000 U/L
葡萄糖氧化酶 12000 U/L
NAD(P)H氧化酶 12000 U/L
本發(fā)明的麥芽糖測定試劑盒可以是單劑，包括
磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、 NAD(P)H氧化酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶。輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1或 試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 試劑3磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶。輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1、試 劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定麥芽糖濃度的方法，其輔酶可 以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實施例一
本實施例的麥芽糖測定試劑為單試劑，包括
磷酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
麥芽糖磷酸化酶 10000 U/L
葡萄糖氧化酶 12000 U/L
NAD(P)H氧化酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用
前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光
度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測麥芽糖樣品與試
劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0
分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析
儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出麥芽糖的濃
度大小。
實施例二
本實施例的麥芽糖測定試劑為雙試劑，包括 試劑1磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑輔酶100mmol/L50 mmol/L3 mmol/L試劑2磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑麥芽糖磷酸化酶 葡萄糖氧化酶 NAD(P)H氧化酶100 mmol/L50 mmol/L10000U/L12000U/L12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測麥芽糖樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出麥芽糖的濃度大小。實施例三本實施例的麥芽糖測定試劑為三試劑，包括 試劑1磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑100mmol/L 50 mmol/L輔酶
3 mmol/L
試劑2
磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑
葡萄糖氧化酶 NAD(P)H氧化酶
100 mmol/L 500 mmol/L
12000 U/L
12000U/L
試劑
磷酸緩沖液 穩(wěn)定劑
麥芽糖磷酸化酶
100mmol/L
500 mmol/L
10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定麥芽糖濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時 間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測麥芽糖樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出麥芽糖的濃 度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的麥芽糖的濃度測定方法，其方法原理如下麥牙糖+磷酸根 麥芽糖磷酸化酶 葡萄糖+葡萄糖1-磷酸葡萄糖+氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸內(nèi)酯+過氧化氫過氧化氫+輔酶 NAD(P)H氧化酶 還原型輔酶+氧將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出麥芽糖的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種麥芽糖測定試劑盒，主要成分包括磷酸緩沖液 20-穩(wěn)定劑—500 mmol/L—4000 mmol/L6 mmol/L麥芽糖磷酸化酶 葡萄糖氧化酶 NAD(P)H氧化酶1000--80000 U/L1000--80000 U/L1000--80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。反應(yīng)中，磷酸緩沖液提供磷酸 根底物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測定試劑盒，其特征在于 由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H 氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測定試劑盒，其特征在于由磷酸緩沖液、穩(wěn)定齊IJ、輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H 氧化酶組成雙劑試劑；試劑l，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、組成； 試劑2，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、 NAD(P)H氧化酶組成。輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H 氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測定試劑盒，其特征在于由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NAIXP)H 氧化酶組成多劑試劑；試劑l，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、組成； 試劑2，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成； 試劑3，由磷酸緩沖液、穩(wěn)定劑、麥芽糖磷酸化酶組成。輔酶、麥芽糖 磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1 、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麥芽糖測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的麥芽糖測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定麥芽糖濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括磷酸緩沖液、輔酶、麥芽糖磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、NAD(P)H氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出麥芽糖的濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101329259SQ20071002471
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司