專利名稱：甲酸診斷/測定試劑盒及甲酸濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種甲酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定甲酸濃 度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境/工業(yè)檢驗測定技術領域。
技術背景甲酸(HCOOH)在室溫下有自然分解的特性，同時，測試過程中不可 避免地有一部分水分混入甲酸，甲酸是無色透明和發(fā)煙的液體.有濃烈的 刺激性酸味。 一般在工業(yè)及環(huán)境監(jiān)測中使用氣相色譜法；在醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)上使用酶法分析，酶法分析已被多個國際權威組織或機構采納如IFU (國 際果汁生產(chǎn)者協(xié)會)，AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生產(chǎn)者聯(lián)盟)，及MEBAK， OICC， VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標準檢測方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，監(jiān)測還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定甲 酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的甲酸診斷/測定試 劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀 上進行甲酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的 推廣應用。本發(fā)明甲酸濃度測定方法原理如下甲酸+高鐵細胞色素 甲酸脫氫酶二氧化碳+亞鐵細胞色素二氧化碳+乙酰輔酶八+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶八+輔酶這種方法應用甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase; EC 1.2.2.1; EC 1.2.2.3)偶聯(lián)丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase ; EC 1.2.1.51)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法/終點比色法。甲酸脫氫酶酶解甲酸反應產(chǎn)生二氧化碳，再 通過偶聯(lián)丙酮酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰) 氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸光度下降的程度/ 速度，可以測算甲酸的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明甲酸診斷/測定試劑盒 較為理想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L高鐵細胞色素 10 mmol/L乙酰輔酶A 15 mmol/L甲酸脫氫酶 10000 U/L丙酮酸脫氫酶 15000 U/L本發(fā)明的甲酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A、甲酸 脫氫酶、丙酮酸脫氫酶。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶。 還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A、甲酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、。丙酮酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶。還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A、甲酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定甲酸濃度的方法，其還原型輔 酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一本實施例的甲酸診斷/測定試劑為單試劑，包括:濯mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 15 mmol/L三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 高鐵細胞色素 乙酰輔酶A甲酸脫氫酶 10000 U/L丙酮酸脫氫酶 15000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37"C,反應時間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甲酸樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出甲酸的濃度 大小。 實施例二本實施例的甲酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括-試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L還原型輔酶 高鐵細胞色素乙酰輔酶A0.25 mmol/L 10 mmol/L 15 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑甲酸脫氫酶丙酮酸脫氫酶100 mmol/L 500 mmol/L10000U/L15000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37T:，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甲酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出甲酸的濃度大小。實施例三本實施例的甲酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶高鐵細胞色素100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L乙酰輔酶A 試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑15 mmol/L100 mmol/L500 mmol/L丙酮酸脫氫酶15000U/L試劑3(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑 甲酸脫氫酶100 mmol/L500 mmol/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定甲酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間 10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測甲酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向 為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出甲酸的濃度 大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉?？傊瑢嶒炞C明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的甲酸濃度測定方法，其方法原理如下甲酸+高鐵細胞色素甲酸脫氫酶二氧化碳+亞鐵細胞色素二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+ 輔酶A+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出甲酸的濃度大小測定結果。
2. —種甲酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶高鐵細胞色素乙酰輔酶A甲酸脫氫酶丙酮酸脫氫酶20-500 mmol/L-4000 mmol/L0.1-0.35 mmol/L50 mmol/L50 mmol/L-80000 U/L1000-1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權利要求2所述甲酸診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A、甲酸脫 氫酶、丙酮酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述甲酸診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A、甲酸脫 氫酶、丙酮酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原 型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 甲酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶組成。還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔 酶A、甲酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權利要求2所述甲酸診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A、甲酸脫 氫酶、丙酮酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原 型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶組成。還 原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A、甲酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶在 試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權利要求2所述甲酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 齊IJ 1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的甲酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定甲酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境/工業(yè)檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、高鐵細胞色素、乙酰輔酶A、甲酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出甲酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324519SQ20071002339
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司