專利名稱：純化l－門冬酰胺酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物蛋白酶藥品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種純化L-門冬酰胺酶方法。
背景技術(shù)：
L-門冬酰胺酶(也有如下別名左旋-門冬酰胺酶、Crasnitin、Colaspase、Asparaginase、ASP、L-ASP、Leunase)是一種抗腫瘤作用的酶抑制劑，能專一性地催化L-門冬酰胺酶水解生成門冬氨酸和氨，使腫瘤細胞缺乏門冬酰胺而影響蛋白質(zhì)的合成。對不能自身合成而必須依賴宿主提供門冬酰胺的某些腫瘤具有抑制作用。臨床上主要用于急性淋巴細胞性白血病，對急性粒細胞白血病和急性單核細胞白血病也有一定療效。
目前主要從大腸桿菌來制備L-門冬酰胺酶，其主要的生產(chǎn)工藝流程如下生產(chǎn)L-門冬酰胺酶的種子菌(如E.coli CPU)經(jīng)過培養(yǎng)和發(fā)酵后，收集菌體；菌體經(jīng)破壁、鹽析離心和過濾后得到過濾液；所述過濾液經(jīng)過濃縮脫鹽后，用酒精沉淀，取其沉淀物并溶解所述沉淀物，而制得DEAE離子交換層析的上樣液；所述上樣液經(jīng)過離子交換層析后，再經(jīng)過濃縮脫鹽、除菌和凍干步驟后得到L-門冬酰胺酶的凍干粉。
由于L-門冬酰胺酶是胞內(nèi)酶，通過溶菌酶破壁提取后，大量細菌內(nèi)毒素、核酸等雜質(zhì)同時也被釋放出來。在上述傳統(tǒng)工藝過程中，采用了DEAE離子交換柱層析進行純化，但由于目的蛋白和內(nèi)毒素對離子交換劑的結(jié)合能力很接近，很難通過層析達到有效分離，所以這給制備高純度注射酶制劑帶來了很大的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于在保證L-門冬酰胺酶生物活性的前提下，提供一種純化L-門冬酰胺酶的方法，該方法能有效截留提取過程中釋放出的細菌內(nèi)毒素，制備出符合注射要求的生物酶制劑。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種純化L-門冬酰胺酶的方法，生產(chǎn)L-門冬酰胺酶的菌株經(jīng)過常規(guī)處理并經(jīng)過離子交換層析后，進行疏水層析操作，得到疏水層析流出液，隨后對該流出液進行濃縮、除菌、干燥，制得L-門冬酰胺酶。
所述疏水層析操作包括如下步驟①向經(jīng)過離子交換柱層析的L-門冬酰胺酶洗脫液中加入鹽并攪拌，得疏水層析上樣液；②將步驟①所述的上樣液流經(jīng)被平衡液平衡好的疏水層析柱內(nèi)，并收集上樣流出液；③用洗滌液洗滌疏水層析住，并收集洗滌流出液；④將步驟②得到的上樣流出液和步驟③得到的洗滌流出液合并，得到疏水層析流出液。
步驟③中所述的洗滌直至洗滌流出液中L-門冬酰胺酶的滴點效價小于500U/ml時結(jié)束。
步驟②中所述的平衡液和步驟③中所述的洗滌液相同且均為鹽溶液。
所述鹽溶液的鹽濃度與步驟①中所述的上樣液的鹽濃度相同。所述鹽濃度的范圍為4％至8％。
所述鹽溶液中的溶質(zhì)與步驟①中所述的鹽相同。
所述的鹽為正鹽，優(yōu)選Na2SO4或K2SO4或(NH4)2SO4，最優(yōu)選所述的鹽為Na2SO4。
本發(fā)明的積極效果是(1)疏水層析操作簡便、有效，在一定程度提高L-門冬酰胺酶活性的同時，可有效吸附細菌內(nèi)毒素。(2)采用傳統(tǒng)的工藝流程，離子交換層析前和離子交換層析后，內(nèi)毒素的含量均大于0.25EU/U，而即經(jīng)過疏水層析后，內(nèi)毒素的含量小于0.25EU/U。
具體實施例方式
(實施例1)(1)將菌體懸浮于破壁液(含45％蔗糖、10mmolEDTA以及200mg/L溶菌酶)中，在30℃攪拌70min后攪拌下傾入大量水中，加入MnCl2沉淀菌體碎片和核酸，離心，取上清液即得酶提取液。酶提取液中加入硫酸銨至55％飽和度，離心除去沉淀，上清液中加入硫酸銨至90％飽和度，離心收集沉淀，沉淀物使溶解并透析脫鹽。脫鹽酶液中加入乙醇至33％(v/v)，離心除去沉淀的雜蛋白，上清液部分加乙醇至40％(v/v)，得沉淀A。沉淀A部分用50mmolLPBS(pH6.4)懸浮，離心后于上清液中加乙醇至45％(v/v)，得沉淀B。沉淀B用5mmolPBS(pH6.4)溶解，經(jīng)DEAE-纖維素層析，收集顯示酶活性組分，即得疏水層析用樣品。
(2)疏水層析操作①向經(jīng)過DEAE離子交換層析的L-門冬酰胺酶洗脫液中加入Na2SO4，并使L-門冬酰胺酶洗脫液中Na2SO4的濃度為6％，得到疏水層析上柱液；②將上柱液流入經(jīng)濃度為6％的Na2SO4溶液平衡好的疏水層析柱，并收集上樣流出液；③用濃度為6％的Na2SO4溶液洗滌疏水層析柱，直至洗滌流出液中L-門冬酰胺酶的滴點效價小于500U/ml時結(jié)束；④將步驟②得到的上樣流出液和步驟③得到的洗滌流出液合并，得到疏水層析流出液。
(3)疏水層析操作后的處理將疏水層析操作步驟④所得的疏水層析流出液濃縮脫鹽、除菌、冷凍干燥、制得L-門冬酰胺酶干粉。
(實施例2)本實施例其余與實施例1相同，不同之處在于疏水層析操作中所采用的Na2SO4的濃度均為4％。
(實施例3)本實施例其余與實施例1相同，不同之處在于疏水層析操作中所采用的鹽為濃度為8％的K2SO4，。
(實施例4)本實施例其余與實施例1相同，不同之處在于疏水層析操作中所采用的鹽為濃度為5％的(NH4)2SO4。
經(jīng)檢測，本發(fā)明的實施例1至實施例4中所制備的L-門冬酰胺酶干粉中內(nèi)毒素的含量均小于0.25EU/U。
顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于生產(chǎn)L-門冬酰胺酶的菌株經(jīng)過常規(guī)處理并經(jīng)過離子交換層析后，進行疏水層析操作，得到疏水層析流出液，隨后對該流出液進行濃縮、除菌、干燥，制得L-門冬酰胺酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于所述疏水層析操作包括如下步驟①向經(jīng)過離子交換柱層析的L-門冬酰胺酶洗脫液中加入鹽并攪拌，得疏水層析上樣液；②將步驟①所述的上樣液流經(jīng)被平衡液平衡好的疏水層析柱內(nèi)，并收集上樣流出液；③用洗滌液洗滌疏水層析住，并收集洗滌流出液；④將步驟②得到的上樣流出液和步驟③得到的洗滌流出液合并，得到疏水層析流出液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于步驟③中所述的洗滌直至洗滌流出液中L-門冬酰胺酶的滴點效價小于500U/ml時結(jié)束。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于步驟②中所述的平衡液和步驟③中所述的洗滌液相同且均為鹽溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于所述鹽溶液的鹽濃度與步驟①中所述的上樣液的鹽濃度相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于所述鹽濃度的范圍為4％至8％。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6之一所述的純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于所述鹽溶液中的溶質(zhì)與步驟①中所述的鹽相同。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于所述的鹽為正鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于所述的鹽為Na2SO4、K2SO4或(NH4)2SO4。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的純化L-門冬酰胺酶的方法，其特征在于所述的鹽為Na2SO4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純化L－門冬酰胺酶的方法，生產(chǎn)L－門冬酰胺酶的菌株經(jīng)過常規(guī)處理并經(jīng)過離子交換層析后，進行疏水層析操作，疏水層析操作包括如下步驟①向經(jīng)過離子交換柱層析的L－門冬酰胺酶洗脫液中加入鹽并攪拌，得疏水層析上樣液；②將步驟①所述的上樣液流經(jīng)被平衡液平衡好的疏水層析柱內(nèi)，并收集上樣流出液；③用洗滌液洗滌疏水層析住，并收集洗滌流出液；④將步驟②得到的上樣流出液和步驟③得到的洗滌流出液合并，得到疏水層析流出液；隨后對該流出液進行濃縮、除菌、干燥，制得L－門冬酰胺酶。本發(fā)明的方法在一定程度提高L－門冬酰胺酶活性的同時，可有效吸附細菌內(nèi)毒素，經(jīng)過疏水層析后，內(nèi)毒素的含量小于0.25EU/U。
文檔編號C12N9/82GK101063118SQ20071002122
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日
發(fā)明者鄭濤, 張寒春 申請人:常州千紅生化制藥有限公司