專利名稱：：一種藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藻類高密度培養(yǎng)，具體說是一種藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，可用于培養(yǎng)藻類、生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品或提供水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料等。技術(shù)背景藻類可利用氣體中的二氧化碳進行光自養(yǎng)，富含蛋白質(zhì)、脂肪和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有繁殖快、環(huán)境適應(yīng)性強等優(yōu)點，常作為水產(chǎn)養(yǎng)殖用的餌料。同時，藻類遺傳及生化組成特殊性及代謝途徑的復(fù)雜性，決定其潛在的營養(yǎng)與藥學(xué)價值，人類可從中開發(fā)出大量結(jié)構(gòu)特異的高附加值的生物活性成分。亞心形扁藻規(guī)模化培養(yǎng)存在的主要問題是藻細胞生長緩慢，倍增時間長制約了亞心形扁藻在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。藻類規(guī)模化人工培養(yǎng)目前主要有開放式培養(yǎng)和封閉式光生物反應(yīng)器二類方式。開放式培養(yǎng)相對簡單、投資低；但該方式培養(yǎng)微藻的產(chǎn)率低，存在嚴重的生物污染，限制藻類培養(yǎng)和資源開發(fā)。復(fù)雜的封閉式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)藻類易于控制生物污染，產(chǎn)率相對高，但成本相對也高。因此，開發(fā)高密度培養(yǎng)基及構(gòu)建低廉高效的光生物反應(yīng)器裝置成為開發(fā)藻類資源的關(guān)鍵核心技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供的一種藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，本發(fā)明將優(yōu)化培養(yǎng)基與光生物反應(yīng)器聯(lián)用，可達到藻類高密度培養(yǎng)的目的，培養(yǎng)所需時間短，可大幅度地減少投資，達到藻類資源開發(fā)經(jīng)濟可行的。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為-一種藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，于光生物反應(yīng)器中添加高密度培養(yǎng)基，將微藻細胞接種于光生物反應(yīng)器中，接種密度為0.1xl06lxl()6cells/mL，平均光強為4000~6000lx，采用左右兩個方向采光，溫度控制在15~30°C，光暗時間比為10-24h:14-0h，每升培養(yǎng)基通氣量為0.05-1L/min;所述高密度培養(yǎng)基是由經(jīng)砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營養(yǎng)鹽制成，營養(yǎng)鹽的添加量為NaN0341360mg/L,NaH2P04'2H2012100mg/L，Tris0~1000mg/L,CH3COOH0~2ml，EDTA-Na20~60mg/L,H3B0325~50mg/L，F(xiàn)eCl3.6H2015mg/L,MnCl2.4H200~0.5mg/L，ZnCl20~0.05mg/L,CoCl2.6H20(M).05mg/L,CuS04.5H2000.05mg/L。通入的氣體為空氣或空氣與二氧化碳(包括大氣中的C02及工廠排放氣中的C02)的混合氣，二氧化碳與空氣的體積比例為0.05~10%;微藻包括來自淡水或海水的藻類，最好為綠藻或金藻。所述高密度培養(yǎng)基是由經(jīng)砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營養(yǎng)鹽制成，營養(yǎng)鹽的添加量最好為NaN03807mg/L，NaH2PCV2H2055mg/L，Tris830mg/L，CH3COOH0.6ml,EDTA-Na45mg/L,H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3'6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200，mg/L。所述光生物反應(yīng)器由氣源經(jīng)主管路與培養(yǎng)單元相連接構(gòu)成；其中培養(yǎng)單元為1個或1個以上的多個并聯(lián)；培養(yǎng)單元由透明材質(zhì)(透明材質(zhì)為玻璃管和塑料袋包括聚丙烯、聚氯乙烯或聚丙烯等)制成，培養(yǎng)單元的左右兩側(cè)均設(shè)置有光源(光源為太陽光和人工光源)；培養(yǎng)單元的底部設(shè)置有由多孔材料構(gòu)成的布氣器，布氣器下端設(shè)置有與外管路相通的進氣Ch所述氣源為相互并聯(lián)的氣瓶與壓縮泵，它們分別通過氣體控制閥和氣體流量計與主管路相連通。所述多孔材料可為玻璃泡、篩板、珊瑚礁或氣石等，最好為篩板。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點-本發(fā)明通過合理配置氮磷營養(yǎng)鹽濃度、碳源、光強、有效接收轉(zhuǎn)化光能、藻液的攪動程度，實現(xiàn)藻類短期內(nèi)快速增殖，縮短培養(yǎng)時間。本發(fā)明的光生物反應(yīng)器能充分利用轉(zhuǎn)化光能，有效保障體系內(nèi)部的藻液營養(yǎng)分布均勻一致，避免光反應(yīng)器內(nèi)存在的死角問題，氣體交換(補償二氧化碳)充分，降低了細胞貼壁生長，極大提高微藻培養(yǎng)效率。本發(fā)明適于微藻高密度規(guī)模生產(chǎn)，為微藻資源綜合開發(fā)利用提供經(jīng)濟效益。圖1為本發(fā)明光生物反應(yīng)器正面觀示意圖；圖2為本發(fā)明光生物反應(yīng)器側(cè)面觀示意圖；注l.氣瓶；2.壓縮泵；3.氣體控制闊；4.氣體流量計；5.光生物反應(yīng)器;6.光源；7為布氣器；(箭頭表示氣流方向)圖3為不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式扁藻細胞的生長動力學(xué)圖譜。具體實施方式下面通過具體實施例對本發(fā)明的方法與結(jié)果進行說明，本發(fā)明細胞培養(yǎng)參照申請人已申報的專利(申請?zhí)?3110981.0，發(fā)明名稱一種海洋綠藻兩步法生物光解水制氫方法)進行，其他試劑均為商業(yè)化的試劑。所述光生物反應(yīng)器由氣源經(jīng)主管路與培養(yǎng)單元5相連接構(gòu)成；所述培養(yǎng)單元5為多個并聯(lián)；培養(yǎng)單元5由透明材質(zhì)制成，培養(yǎng)單元的左右兩側(cè)均設(shè)置有光源6;培養(yǎng)單元5的底部設(shè)置有由篩板制成的布氣器7，布氣器下端設(shè)置有與外管路相通的進氣口；所述氣源為相互并聯(lián)的氣瓶1與壓縮泵2，它們分別通過氣體控制閥3和氣體流量計4與主管路相連通。實施例1亞心形扁藻由遼寧省大連水產(chǎn)研究所提供，并經(jīng)過本實驗室平板純化。用經(jīng)砂濾的天然海水ll(TC高壓蒸汽滅菌15min，冷卻后添加不同營養(yǎng)鹽，配制康維方培養(yǎng)基(NaN03100mg/L，NaH2P04'H2020mg/L，EDTA—Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3-6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L)。從瓊脂平板挑取的單細胞藻落，經(jīng)逐級放大培養(yǎng)，獲得種子細胞。細胞接種密度為0.6xl06cells/mL，平均光強為5000lx，采用左右兩個方向采光，溫度控制在25'C，光暗時間比為14h:10h。依照均勻?qū)嶒炘O(shè)計要求將氮、磷、Tris-HAc按不同比例配制成10培養(yǎng)基，其中氮摩爾濃度為0.0516mM，磷摩爾濃度為0.01lmM，Tris-HAc濃度從1.6540mM(以Tris計，Tris:HAc=10mM:lml)，各培養(yǎng)基中微量元素含量均同康維方培養(yǎng)基。對培養(yǎng)10天的結(jié)果進行藻細胞計數(shù)，并取200ml勻勻的藻A菱離心、精'洗、烘干、稱重。結(jié)J艮如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由上表可知7~10號培養(yǎng)基培養(yǎng)效果均明顯優(yōu)于其它培養(yǎng)基，即氮源濃度在4~16mM范圍內(nèi)能有效促進扁藻細胞快速增殖，其獲得藻細胞數(shù)量均為在康維方培養(yǎng)條件下的1.98倍以上，最高達2.3倍。利用10種培養(yǎng)基獲得扁藻細胞干重對其培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，在不計微量元素的情況下，由Matlab統(tǒng)計軟件計算得到優(yōu)化培養(yǎng)基為N03—-N9.50mM，P043—_P0.34mM，Tris-HAc6.7mM。實施例2亞心形扁藻由遼寧省大連水產(chǎn)研究所提供，并經(jīng)過本實驗室平板純化。5用經(jīng)砂濾的天然海水ll(TC高壓蒸汽滅菌15min，冷卻后添加營養(yǎng)鹽，配制康維方培養(yǎng)基(NaN03100mg/L，NaH2P04'H2020mg/L，EDTA—Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3.6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L)和優(yōu)化培養(yǎng)基(NaN03807mg/L,NaH2P04.2H2055mg/L,Tris830mg/L,CH3COOH0.6ml，EDTA-Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3.6H201.3mg/L,MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04'5H200.02mg/L,(NH4)6M07024.4H200.009mg/L))。。從瓊脂平板挑取的單細胞藻落，經(jīng)逐級放大培養(yǎng)，獲得種子細胞。細胞接種密度為0.6xl06CellS/mL，將藻液分為兩組，一組進行康維方培養(yǎng)基搖瓶靜置培養(yǎng)，每天定時搖46次，另一組放入12個培養(yǎng)單元裝置，透明材料為玻璃管，底部通氣裝置多孔材料為篩板，均勻設(shè)計得到的優(yōu)化培養(yǎng)基，通入空氣培養(yǎng)，流速為200ml/min，平均光強為5000lx，采用左右兩個方向采光，溫度控制在25t:，光暗時間比為14h:10h。從圖3可以看出，培養(yǎng)到第15天，采用搖瓶靜置培養(yǎng)的方式，細胞密度達2X10^dls/mL，而采用光生物反應(yīng)器優(yōu)化培養(yǎng)基通空氣培養(yǎng)，細胞密度達8X10^ells/mL。利用光生物反應(yīng)器，光自屏蔽現(xiàn)象得以改善，光能利用率提高，氣體交換通暢，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本。權(quán)利要求1.一種藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于于光生物反應(yīng)器中添加高密度培養(yǎng)基，將微藻細胞接種于光生物反應(yīng)器中，接種密度為0.1×106～1×106cells/mL，平均光強為4000～6000lx，采用左右兩個方向采光，溫度控制在15～30℃，光暗時間比為10-24h∶14-0h，每升培養(yǎng)基通氣量為0.05～1L/min；所述高密度培養(yǎng)基是由經(jīng)砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營養(yǎng)鹽制成，營養(yǎng)鹽的添加量為NaNO34～1360mg/L，NaH2PO4·2H2O12～100mg/L，Tris0～1000mg/L，CH3COOH0～2ml，EDTA-Na20～60mg/L，H3BO325～50mg/L，F(xiàn)eCl3·6H2O1～5mg/L，MnCl2·4H2O0～0.5mg/L，ZnCl20～0.05mg/L，CoCl2·6H2O0～0.05mg/L，CuSO4·5H2O0～0.05mg/L。2.按照權(quán)利要求1所述藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述通入的氣體為空氣或空氣與二氧化碳的混合氣，二氧化碳與空氣的體積比例為0.05~10%。3.按照權(quán)利要求1所述藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述微藻為綠藻或金藻。4.按照權(quán)利要求1所述藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述高密度培養(yǎng)基是由經(jīng)砂濾的天然海水滅菌冷卻后添加不同營養(yǎng)鹽制成，營養(yǎng)鹽的添加量為NaN03807mg/L，NaH2P(V2H20:55mg/L,Tris830mg/L,CH3COOH0.6ml,EDTA-Na45mg/L,H3B0333.6mg/L，F(xiàn)eCl3.6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L,ZnCl20.021mg/L,CoCl2-6H200.02mg/L,CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L。5.按照權(quán)利要求1所述藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述光生物反應(yīng)器由氣源經(jīng)主管路與培養(yǎng)單元(5)相連接構(gòu)成；其中培養(yǎng)單元(5)可為1個或1個以上的多個并聯(lián)；培養(yǎng)單元(5)由透明材質(zhì)制成，培養(yǎng)單元的左右兩側(cè)均設(shè)置有光源(6);培養(yǎng)單元(5)的底部設(shè)置有由多孔材料構(gòu)成的布氣器(7)，布氣器下端設(shè)置有與外管路相通的進氣口；所述氣源為相互并聯(lián)的氣瓶(1)與壓縮泵(2)，它們分別通過氣體控制閥(3)和氣體流量計(4)與主管路相連通。6.按照權(quán)利要求5所述藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述多孔材料為玻璃泡、篩板、珊瑚礁或氣石。7.按照權(quán)利要求5所述藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，其特征在于所述多孔材料為篩板。全文摘要本發(fā)明涉及藻類高密度培養(yǎng)，具體說是一種藻類細胞快速高密度培養(yǎng)方法，于光生物反應(yīng)器中添加高密度培養(yǎng)基，將微藻細胞接種于光生物反應(yīng)器中，采用左右兩個方向采光。本發(fā)明通過合理配置氮磷營養(yǎng)鹽濃度、碳源、光強、有效接收轉(zhuǎn)化光能、藻液的攪動程度，實現(xiàn)藻類短期內(nèi)快速增殖，縮短培養(yǎng)時間。本發(fā)明的光生物反應(yīng)器能充分利用轉(zhuǎn)化光能，有效保障體系內(nèi)部的藻液營養(yǎng)分布均勻一致，避免光反應(yīng)器內(nèi)存在的死角問題，氣體交換充分，降低了細胞貼壁生長，極大提高微藻培養(yǎng)效率。本發(fā)明適于微藻高密度規(guī)模生產(chǎn)，為微藻資源綜合開發(fā)利用提供經(jīng)濟效益。文檔編號C12N1/12GK101265449SQ20071001059公開日2008年9月17日申請日期2007年3月14日優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日發(fā)明者遠劉,衛(wèi)張,虞星炬,禎郭,金美芳,陸洪斌,陳兆安申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所