專利名稱：從來源于生物的試樣采集dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及法醫(yī)學(xué)的DNA(脫氧核糖核酸)鑒定中或生物學(xué)的基因研究 中實施的從來源于生物的試樣采集DNA的方法。
背景技術(shù)：
為了使用活體組織鑒定親子 兄弟姐妹的血緣關(guān)系，或者根據(jù)如事 件 事故的死者的組織或陣亡者的陳年的遺骨等遺體組織確認(rèn)身份，或者 根據(jù)犯罪現(xiàn)場的毛發(fā)、體液或體液斑等遺留物收集確定犯人的證據(jù)而實施 法醫(yī)學(xué)的DNA鑒定。此外，為了進(jìn)行人和動植物的基因測序、基因工程、分 子生物學(xué)等生物學(xué)的基因研究而進(jìn)行DNA分析。
實施這樣的DNA鑒定等時，從來源于生物的試樣采集DNA，所述生物的試 樣例如有生存或非生存的人的牙齒、骨、指甲等硬組織，體毛、皮膚、肌肉、 內(nèi)臟、血管等軟組織，血液、淋巴液、唾液、精液、尿液等體液，體液斑或者 生存或非生存的動植物的組織。
目前，例如從牙齒或骨采集DNA的情況下，采用如下的方法通過依次用 次氯酸鈉水溶液、水、乙醇洗滌牙齒或骨，除去附著于表面的污染物質(zhì)或異物。 然后，干燥，粉碎后長時間用乙二胺四乙酸水溶液(EDTA)脫鈣。脫鈣后，用溶 解液和蛋白質(zhì)分解酶使試樣溶解，用苯酚、氯仿、異戊醇的混合物提取DNA， 從水層用乙醇使其沉淀，從而純化并采集DNA。
作為簡便的采集方法，日本專利特開2004-201525號公報中記載了向經(jīng)粉 碎的活體試樣添加DNA提取試劑后，通過乙醇沉淀而純化，回收DNA的方法。
Forensic Sciences 44(3) 264-272， 2003中記載了以下的例子美國 的2001年9月11日的世貿(mào)中心大樓的恐怖事件的遇難者的身份確認(rèn)中采用 的按照現(xiàn)有方法粉碎骨或牙齒后從劣化了的DNA對STR13基因座進(jìn)行DNA檢通常，如果粉碎試樣，則混入其它組織的DNA，如果用EDTA長時間脫鈣， 則DNA分解。此外，如果不進(jìn)行除蛋白質(zhì)處理或試樣陳化，則混入阻礙DNA 鑒定的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。另外，如果用乙醇使DNA沉淀，則損失珍貴的DNA。
發(fā)明的揭示
本發(fā)明是為了解決前述的課題而完成的，其目的在于提供從珍貴的來 源于生物的試樣在不混入雜質(zhì)的情況下簡便且高效地采集DNA的方法。 為了實現(xiàn)前述的目的而采用的DNA采集方法依次實施以下的步驟
(1) 實施將由硬組織構(gòu)成的來源于生物的試樣整塊地使用或者切斷或 粉碎后使用的片段化操作，
以及隨后向其添加EDTA的脫鈣操作的預(yù)處理步驟；
(2) 向(1)得到的試樣，加入溶解來源于生物的試樣中的DNA-蛋白質(zhì)的 復(fù)合體的增溶劑緩沖液和蛋白質(zhì)分解酶，溶解DNA-蛋白質(zhì)的復(fù)合體的溶解 步驟；
(3) 向(2)的復(fù)合體溶解液中，加入飽和三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽的 苯酚緩沖液或者含碘化鈉-異丙醇的水溶液來除去蛋白質(zhì)后，分取DNA提取 液的提取步驟；
(4) 將(3)的DNA提取液通過柱，純化DNA的純化步驟。 根據(jù)該方法，將來源于生物的試樣整塊地使用，或者使用以遠(yuǎn)大于粉
末的大小切斷或粉碎而得的片段。因此，該方法與將試樣完全粉末化的現(xiàn) 有方法相比，可以高效地僅采集所需的來源于生物的試樣的DNA，高精度地 檢測DNA。
DNA采集方法中，所述硬組織例如為牙齒或骨。
所述片段化操作理想的是，試樣為牙齒的情況下整塊地使用，或者試 樣為牙齒或骨的情況下，制成厚O. 1 0. 5cm的切片或至少粉碎成寬5mm左右 的顆粒來使用，獲得不含粉末的片段。
所述預(yù)處理步驟中，所述EDTA可以含有表面活性劑。 利用EDTA實施脫鈣的同時，利用該水溶液中所含的表面活性劑促進(jìn)脫 鈣，可使預(yù)處理步驟在短時間內(nèi)完成，僅充分且高效地采集DNA。所述表面活性劑較好是離子型表面活性劑。更好是所述離子型表面活性劑為十二垸基硫酸鈉(SDS)。 所述預(yù)處理步驟中，所述EDTA中的所述表面活性劑的濃度較好是O. l 0. 5重量％。所述預(yù)處理步驟中，更好是在所述EDTA中于20 60。C浸漬2小時 2天 來進(jìn)行所述脫鈣操作。所述預(yù)處理步驟中，特別好是在含有所述表面活性劑的所述EDTA中于 37 6(TC浸漬2小時 2天來進(jìn)行所述脫鈣操作。所述預(yù)處理步驟中，所述來源于生物的試樣可以是通過清潔操作清潔 了的試樣。所述預(yù)處理步驟中，所述清潔操作較好是將所述來源于生物的試樣依 次用中性洗劑水溶液、水、乙醇洗滌后干燥。所述溶解步驟中，較好是在所述復(fù)合體的溶解液中加入所述蛋白質(zhì)分 解酶，在37 65t:維持0. 5 6小時，調(diào)制所述DNA溶液。所述提取步驟中，較好是加入所述苯酚緩沖液后，將上清水層部分離， 容量大時通過超濾濃縮，分取所述DNA提取液。所述純化步驟中，所述柱較好是硅膜柱、硅珠填充柱或碘化鈉離心操作。如果采用本發(fā)明的麗A采集方法，則不會混入附著于來源于生物的試樣 的異物和阻礙DNA鑒定的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，而且不進(jìn)行DNA損失大的乙醇沉淀， 可以簡便、再現(xiàn)性好且高效地采集DNA。該方法不需要熟練技術(shù)，對于少量 至大量的范圍寬泛的試樣或者多份的試樣，也可以可靠地采集DNA。如果像前述的Forensic Sciences 44(3) 264-272， 2003那樣，按照現(xiàn) 有方法粉碎骨或牙齒后從劣化了的DNA對STR13基因座進(jìn)行檢測，則記載顯 示可檢測出所有的基因座的為27.2%。相對地，如果采用本發(fā)明，對于從陣亡者遺骨的牙齒采集的60年前的 DNA,獲得約70%的總基因座檢出率，若部分缺損，則可以獲得約80%以上 的檢出率。因此，本發(fā)明是顯著優(yōu)于粉碎骨或牙齒的現(xiàn)有方法的DNA采集方 法。而且，由于完全不使用粉末狀的來源于生物的試樣，因此不會混入粉末狀的來源于生物的試樣產(chǎn)生的分解物或雜質(zhì)，得到的DNA的純度高。劣化試樣的脫鈣中，如果使用含有表面活性劑的EDTA，則與僅采用EDTA的脫鈣相比，在操作時間進(jìn)一步縮短的同時，DNA的采集效率進(jìn)一步提高。 此外，由于可以從珍貴的微量的來源于生物的試樣獲得高品質(zhì)的DNA，因此DNA鑒定中不會發(fā)生誤認(rèn)。附圖的簡單說明

圖1為表示采用本發(fā)明的DNA采集方法的步驟的一例的圖。 實施發(fā)明的最佳方式以下，對本發(fā)明的DNA采集方法的實施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明的范 圍并不局限于這些實施例。參照表示實施的一例的圖l進(jìn)行說明。DNA經(jīng)過以下的步驟(1) (4)來 采集。(l)預(yù)處理步驟作為來源于生物的試樣，可以使用存活的人的牙齒或骨或者遺骨。對 來源于生物的試樣實施擦拭、洗滌等處理進(jìn)行清潔。具體來說，用在中性 洗劑的水溶液中浸漬了的刷子擦去附著于牙齒或骨的表面的污染物，用水 沖去中性洗劑。接著，用乙醇洗滌，通過吹風(fēng)機或自然對流使其風(fēng)干(圖 1(1.a))。接著，將來源于生物的試樣制成0.5cm左右大小的粒或切片使用，或者 在試樣為牙齒時整塊地使用。由此，與將試樣制成粉末的情況相比，可以 防止其它組織的DNA的混入。試樣為牙齒的情況下，將其牙根以O(shè). 1 0.2cm 左右的厚度切片后，從一顆牙齒獲得4 6塊約60 120mg的切片。另一方面， 試樣為骨的情況下，在包含骨髓的狀態(tài)下以O(shè). 15 0. 2cm的厚度切成0. 5cm 見方左右的大小，獲得約60 120mg的切片。作為來源于生物的試樣，都使 用1 4個切片即可，所以可以將殘余部分按原樣保存(圖l(l.b))。接著，在EDTA水溶液中于20 6(TC浸漬2小時 2天來進(jìn)行孵育，從而實施除去鈣成分的脫鈣。浸漬的溫度和時間較好是根據(jù)來源于生物的試樣的容量、形狀和新舊程度來適當(dāng)調(diào)整，更好是在37 60'C24小時以內(nèi)。EDTA 水溶液的濃度較好是0.2 0.5M，更好是以0.5M的濃度調(diào)至pH8.0(圖 1(1.c))。(2) 溶解步驟向經(jīng)脫鈣的來源于生物的試樣加入增溶劑緩沖液，使DNA-蛋白質(zhì)的復(fù) 合體溶解。增溶劑緩沖液為含有0.5 2.5重量％的去污劑的緩沖液，可以 例舉例如100mM氯化鈉、10mM的Tris鹽酸鹽和2重量X作為去污劑的SDS的水 溶液。接著，在復(fù)合體的溶解液中加入蛋白質(zhì)分解酶液，在37 65'C維持 0.5 6小時的同時根據(jù)需要適當(dāng)進(jìn)行攪拌。對分解復(fù)合體中的蛋白質(zhì)的蛋 白質(zhì)分解酶液沒有特別限定，但特別好是蛋白酶K(圖l(2.a))。(3) 提取步驟向(2)的復(fù)合體溶解液中加入含有l(wèi)mM的EDTA的10mM的Tris鹽酸鹽的飽 和苯酚緩沖液(pH8. 0)，例如TE飽和苯酚(納卡萊泰思科株式會社(于力，^ 亍7夕株式會社)制，商品名)，除去蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物(圖l(3.a))。接著，將其離心分離，從其上清分離含有DNA的水層部。水層部在容量 大的情況下，可以通過超濾、例如使用Centricon 30(阿米空公司(Amicon Inc.)制；商品名)的離心法進(jìn)行濃縮。藉此，分取DNA提取液(圖l(3.b))。(4) 純化步驟將DNA提取液通過硅膜柱、例如QIAamp DNA血液迷你試劑盒(奇基株式 會社(株式會社年7^y)制，QIAamp為注冊商標(biāo))附帶的硅膜柱而進(jìn)行純化 后，獲得DNA(圖l(4.a))。另外，可以使用含有SDS的EDTA水溶液代替前述的(1)預(yù)處理步驟中使 用的EDTA水溶液。該情況下，較好是在含有SDS的EDTA水溶液于37 6(TC孵 育2小時 2天，從而實施用于除去鈣成分的脫鈣。孵育的溫度和時間較好 是根據(jù)來源于生物的試樣的容量、形狀和新舊程度來適當(dāng)調(diào)整，更好是24 小時以內(nèi)。EDTA水溶液的濃度較好是0.2 0. 5M，更好是以O(shè). 5M的濃度調(diào)至 pH8. 0。 SDS的濃度較好是O. 1 0. 5重量X(圖l(l.c))?？梢允褂霉柚樘畛渲?、例如使用磁性硅珠的MagExtractor(東洋紡織株 式會社(東洋紡績株式會社)制注冊商標(biāo))代替硅膜柱。雖然收率稍有下降， 但可以是苯酚-氯仿法。以下，對于實際從來源于生物的試樣采集DNA的例子進(jìn)行說明。(實施例l)用在中性洗劑的水溶液中浸漬了的刷子擦去附著于牙齒表面的污染 物，向牙齒澆無菌蒸餾水沖去中性洗劑，用乙醇沖洗牙齒，通過吹風(fēng)機使 其快速風(fēng)干。將牙齒置于邊長約3cm的立方體木片的臺座，在牙齒和臺座間的間隙滴 1 2滴aronalpha(東亞合成株式會社(東亜合成株式會社)制，注冊商標(biāo))， 將兩者固定。在透明的塑料袋中，通過牙科用的圓盤磨床將牙根部分切成 厚O. lcm以上的片，切出1 6片圓板狀的片段。持切片晃動除去粉末后，獲得不含粉末的切片。將該l 6片切片放入50mL的培養(yǎng)試管，加入30 50mL 0. 5M的EDTA(pH 8.0)水溶液(和光純藥工業(yè)株式會社(和光純薬工業(yè)株式會社)制；商品名)， 再加入SDS至O. 1重量％，在37 50。C孵育12小時，使其脫鈣。將牙齒移至2 mL的培養(yǎng)試管，用700iiL 0. 5M的EDTA(pH8.0)水溶液洗滌。將培養(yǎng)試管內(nèi) 的EDTA水溶液用移液管吸出。向培養(yǎng)試管的牙齒加入100 200uL作為增溶劑緩沖液的溶解液(10mM 的Tris鹽酸鹽、lOOmM的氯化鈉、2重量XSDS)和20 40 u L作為蛋白質(zhì)分解 酶液的20mg/mL的蛋白質(zhì)酶K溶液(和光純藥工業(yè)株式會社(和光純薬工業(yè)株 式會社)制；商品名)，在5(TC攪拌1 2小時進(jìn)行孵育，再加入20 30"L蛋 白質(zhì)酶K溶液，在50'C攪拌1 2小時進(jìn)行孵育。在培養(yǎng)試管中，牙齒的各切片分別在確認(rèn)一半以上可溶化后，加入與 其同量的TE飽和苯酚(納卡萊泰思科株式會社(于力，,亍只夕株式會社) 制，商品名)，緩緩地倒轉(zhuǎn)混合10 20次。然后，以13000rpm進(jìn)行離心分離 5分鐘，將上清水層部移至另一2mL培養(yǎng)試管。水層部的容量大的情況下， 通過使用Centricon 30(阿米空公司(Amicon Inc.)制；商品名)的超濾濃縮 至100 300uL，獲得DNA提取液。使用QIAamp DNA血液迷你試劑盒(奇基株式會社(株式會社年7歹乂) 制，QIAamp為注冊商標(biāo))，按照其操作步驟從DNA提取液純化DNA。另外，最 終的DNA的洗脫使用50uL QIAamp DNA血液迷你試劑盒(奇基株式會社(株式 會社年7^'y)制，QIAamp為注冊商標(biāo))附帶的AE緩沖液。對于得到的DNA， 進(jìn)行了PCR和電泳，未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)。(實施例2)用在中性洗劑的水溶液中浸漬了的刷子擦去附著于牙齒表面的污染 物，向牙齒澆無菌蒸餾水沖去中性洗劑，用乙醇沖洗牙齒，通過吹風(fēng)機使 其快速風(fēng)干。將整顆牙齒放入50mL的培養(yǎng)試管，加入30 50mL 0. 5M的EDTA(pH8. 0)水溶液(和光純藥工業(yè)株式會社(和光純薬工業(yè)株式會社)制；商品名)，再 加入SDS至O. 1重量％，在37 50。C孵育12小時，使其脫鈣。將牙齒移至2mL 的培養(yǎng)試管，用700uL 0.5M的EDTA(pH8.0)水溶液洗滌。將培養(yǎng)試管內(nèi)的E DTA水溶液用移液管吸出。向培養(yǎng)試管的牙齒加入100 200uL作為增溶劑緩沖液的溶解液(10mM 的Tris鹽酸鹽、lOOmM的氯化鈉、2重量XSDS)和20 40 u L作為蛋白質(zhì)分解 酶液的20mg/mL的蛋白質(zhì)酶K溶液(和光純藥工業(yè)株式會社(和光純薬工業(yè)株 式會社)制；商品名)，在5(TC攪拌1 2小時進(jìn)行孵育，再加入20 30txL蛋 白質(zhì)酶K溶液，在50'C攪拌1 2小時進(jìn)行孵育。在培養(yǎng)試管中，確認(rèn)溶液的顏色變成淺黃色且牙齒可溶化后，加入與 其同量的TE飽和苯酚(納卡萊泰思科株式會社(于力，^亍7夕株式會社) 制，商品名)，緩緩地倒轉(zhuǎn)混合10 20次。然后，以13000rpm進(jìn)行離心分離 5分鐘，將上清水層部移至另一2mL培養(yǎng)試管。水層部的容量大的情況下， 通過使用Centricon 30 (阿米空公司(Amicon Inc.)制；商品名)的超濾濃縮 至100 300pL,獲得DNA提取液。使用QIAamp DNA血液迷你試劑盒(奇基株式會社(株式會社年7歹乂) 制，QIAamp為注冊商標(biāo))，按照其操作步驟從DNA提取液純化DNA。另外，最 終的DNA的洗脫使用50uL QIAamp DNA血液迷你試劑盒(奇基株式會社(株式 會社年了歹V)制，QIAa卿為注冊商標(biāo))附帶的AE緩沖液。對于得到的DNA，進(jìn)行了PCR和電泳，未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)。 產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的DNA的采集方法可以在從由陣亡者遺骨、古代遺跡的遺骨、災(zāi) 害時的遺體、失蹤者的遺體等獲得的作為硬組織的牙齒或骨提取DNA時使 用。如果采用本發(fā)明則可以提取高品質(zhì)的DNA，所以可以在法醫(yī)學(xué)的DNA鑒 定或生物學(xué)的基因分析中獲得正確的數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.DNA采集方法，其特征在于，依次實施以下的步驟(1)實施將由硬組織構(gòu)成的來源于生物的試樣整塊地使用或者切斷或粉碎后使用的片段化操作，以及隨后向其添加含有乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液的脫鈣操作的預(yù)處理步驟；(2)向(1)得到的試樣，加入溶解來源于生物的試樣中的DNA-蛋白質(zhì)的復(fù)合體的增溶劑緩沖液和蛋白質(zhì)分解酶，調(diào)制DNA-蛋白質(zhì)的復(fù)合體的溶解液的溶解步驟；(3)向(2)的復(fù)合體溶解液中，加入飽和三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽的苯酚緩沖液或者含碘化鈉-異丙醇的水溶液來除去蛋白質(zhì)后，分取DNA提取液的提取步驟；(4)將(3)的DNA提取液通過柱，純化DNA的純化步驟。
2. 如權(quán)利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述硬組織為牙齒 或骨。
3. 如權(quán)利要求2所述的DNA采集方法，其特征在于，所述片段化操作是， 試樣為牙齒的情況下整塊地使用，或者試樣為牙齒或骨的情況下，制成厚 0. 1 0.5cm的切片或至少粉碎成寬5mm左右的顆粒來使用，獲得不含粉末的片段。
4. 如權(quán)利要求1所述的DNA釆集方法，其特征在于，所述預(yù)處理步驟中， 所述EDTA含有表面活性劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的DNA采集方法，其特征在于，所述表面活性劑是 離子型表面活性劑。
6. 如權(quán)利要求5所述的DNA采集方法，其特征在于，所述離子型表面活 性劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)。
7. 如權(quán)利要求4所述的DNA采集方法，其特征在于，所述EDTA中的所述 表面活性劑的濃度為O. 1 0. 5重量％。
8. 如權(quán)利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述預(yù)處理步驟中，在所述EDTA中于20 6(TC浸漬2小時 2天來進(jìn)行所述脫鈣操作。
9. 如權(quán)利要求4所述的DNA釆集方法，其特征在于，所述預(yù)處理步驟中， 在含有所述表面活性劑的所述EDTA中于37 6(TC浸漬2小時 2天來進(jìn)行所 述脫鈣操作。
10. 如權(quán)利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述預(yù)處理步驟 中，所述來源于生物的試樣是通過清潔操作清潔了的試樣。
11. 如權(quán)利要求10所述的DNA采集方法，其特征在于，所述清潔操作是 將所述來源于生物的試樣依次用中性洗劑水溶液、水、乙醇洗滌后，干燥。
12. 如權(quán)利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述溶解步驟中， 在所述復(fù)合體的溶解液中加入所述蛋白質(zhì)分解酶，在37 65'C維持0. 5 6 小時，調(diào)制所述DNA溶液。
13. 如權(quán)利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述提取步驟中， 加入所述苯酚緩沖液后，將上清水層部分離，分取所述DNA提取液。
14. 如權(quán)利要求1所述的DNA采集方法，其特征在于，所述純化步驟中， 所述柱是硅膜柱、硅珠填充柱或碘化鈉離心操作。
全文摘要
本發(fā)明提供從珍貴的來源于生物的試樣在不混入雜質(zhì)的情況下簡便且高效地采集DNA的方法。DNA采集方法依次實施以下的步驟(1)實施將由硬組織構(gòu)成的來源于生物的試樣整塊地使用或者切斷或粉碎后使用的片段化操作，以及隨后向其添加EDTA的脫鈣操作的預(yù)處理步驟；(2)向(1)得到的試樣，加入溶解來源于生物的試樣中的DNA-蛋白質(zhì)的復(fù)合體的增溶劑緩沖液和蛋白質(zhì)分解酶，調(diào)制DNA溶液的溶解步驟；(3)向(2)的復(fù)合體溶解液中，加入飽和三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽的苯酚緩沖液或者含碘化鈉-異丙醇的水溶液來除去蛋白質(zhì)后，分取DNA提取液的提取步驟；(4)將(3)的DNA提取液通過柱，純化DNA的純化步驟。
文檔編號C12N15/00GK101321864SQ20068004518
公開日2008年12月10日 申請日期2006年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月3日
發(fā)明者福島弘文, 長崎華奈子 申請人:國立大學(xué)法人信州大學(xué);日立軟件工程株式會社