專利名稱：通過(guò)特異的內(nèi)切蛋白酶對(duì)帶有堿性氨基酸c-末端的多肽進(jìn)行酰胺化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備C-末端酰胺化的二元肽或多元肽(di- or polybasic peptides)的方法，特別是用于制備那些具有人胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)生物學(xué)活性的肽、或其類似物或衍生物的方法。
背景技術(shù)：
與制藥相關(guān)的肽和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、生物醫(yī)學(xué)利用度和作用持續(xù)性很 大程度上依賴于其分子N-末端或C-末端的性質(zhì)。生物分子的半衰期明顯 受到帶有堿性氨基酸的C-末端延伸的影響。具體而言，如果在具有超過(guò)一 個(gè)堿性氨基酸的C-末端延伸上，在C-末端結(jié)尾的氨基酸是氨基酰胺，那 么能夠獲得良好的藥學(xué)活性。這種基于肽的活性物質(zhì)，如果該肽足夠小，可以按照改良的Merrifield 合成方案直接全部通過(guò)化學(xué)合成進(jìn)行制備。然而，當(dāng)這種肽的需要量很大 時(shí)，則顯現(xiàn)出該方法的局限性。因此，為了接下來(lái)在化學(xué)修^飾后適于用作 肽合成的反應(yīng)物，必須先行制備并且純化在合成中將要用到的氨基酸。在 除去合成結(jié)束時(shí)的保護(hù)性基團(tuán)后，然后可將目的肽或產(chǎn)物純化，并配制為 藥物。依賴于肽的組份，而且，通過(guò)在個(gè)別的偶聯(lián)步驟中錯(cuò)誤的偶聯(lián)，在 合成期間的鄰近效應(yīng)可導(dǎo)致有限的產(chǎn)量、外消旋作用或副產(chǎn)品的形成，因 此可能對(duì)總產(chǎn)量或者產(chǎn)品純度有不利影響。對(duì)于制備大量的所需產(chǎn)品，全 合成太復(fù)雜。因此，通過(guò)可替代的方法，特別是生物工程的方法進(jìn)行制備 是令人期待的。能夠使肽的C-末端酰胺化的酶是早已公知的。這些酶被命名(Eipper 等人，Mol. EndocrinoU987 Nov; 1 (11): 777)為肽酰甘氨酸a-酰胺化酶(PAM)。這種PAM酶的制備和純化是技術(shù)人員所熟悉的，并且已經(jīng)有詳 細(xì)的描述(M. Nogudi等人，Prot. Expr. Purif. 2003， 28: 293)。然而，與其 它的工業(yè)酶例如胰蛋白酶或羧肽酶的制備相比，該制備是昂貴的。當(dāng)該酶與要被酰胺化的前體蛋白在同一宿主細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，出現(xiàn)了 替代通過(guò)PAM"體外"酰胺化的方法。這是通過(guò)在宿主特異性的調(diào)控序列 的控制下將編碼PAM活性的基因序列引入宿主細(xì)胞來(lái)完成的。這個(gè)表達(dá) 序列可以是穩(wěn)定摻入各個(gè)染色體DNA序列之中，或者是存在于與目的蛋 白的表達(dá)質(zhì)粒平行的第二個(gè)質(zhì)粒上，或者是在同一個(gè)載體上整合作為第二 個(gè)表達(dá)盒，或被克隆至與編碼目的蛋白的基因序列同相的多順?lè)醋颖磉_(dá)通 路中，置于同一啟動(dòng)子序列的調(diào)控之下。然而，上述產(chǎn)量較低，所以只有 通過(guò)相當(dāng)大的發(fā)酵容量才能達(dá)到大量制備的目的。這導(dǎo)致純化復(fù)雜，更加 昂貴。此外，該酰胺化不是定量發(fā)生的，以至于必須將已酰胺化的所需蛋 白從未酰胺化的蛋白中分離出來(lái)。支持分泌性制備方法的決定(例如，Hong 等人，Appl Biochem Biotechnol. 2003;110， p.ll3-23)必須考慮到的事實(shí)是， 具有多元C末端的蛋白質(zhì)只有很少量的分泌或者根本不分泌。用于酰胺化的另外的方法是基于應(yīng)用蛋白特異性的自切割機(jī)制 (Cottingham等人，Nature Biotech. Vol. 19， 974-977， 2001)。然而，控制這 種反應(yīng)并不容易，并且可能發(fā)生轉(zhuǎn)硫酯化和因而形成不需要的產(chǎn)物。融合 蛋白可能相當(dāng)大的程度上對(duì)產(chǎn)量有不利的影響。上述酰胺化進(jìn)程從目的肽的C末端開(kāi)始，通過(guò)至少一個(gè)氨基酸甘氨酸 或可替代的內(nèi)蛋白肽延伸。然而，C末端為賴氨酸的肽，如果在序列中其 后它們不包含另外的賴氨酸或精氨酸，可以按多聚體結(jié)構(gòu)制備，該多聚體 隨后可通過(guò)胰蛋白酶或類胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)化為單體單元。以這種方式可獲 得高的產(chǎn)量。而在前述方法中這是不可能的。因此，已知的生物技術(shù)制備方法有不少缺點(diǎn)。制備在c末端具有超過(guò) 一個(gè)堿性氨基酸的賴氨酸或精氨酸的肽或蛋白質(zhì)，并且最后以合理的費(fèi)用 使其大量酰胺化，這個(gè)目標(biāo)尚未滿意地解決。如果能夠大量制備目的肽的前體，該肽被至少截短一個(gè)堿性氨基酸，并且隨后用賴氨酰胺或精氨酰胺以酶催化的半合成方式延長(zhǎng)該前體，那么 將出現(xiàn)另 一種替代的制備方法。Levin等(Biochemical Journal 63: 308-16;1956)描述了胰蛋白酶對(duì)賴氨酰胺和多種聚賴氨酰胺肽的作用。該作者的結(jié)果顯示賴氨酰胺衍生物在 胰蛋白酶的影響下不能轉(zhuǎn)化為高分子量的賴氨酰胺衍生物，因?yàn)檫^(guò)渡類型 的酰胺水解為游離酸比偶聯(lián)反應(yīng)更快。因此得出結(jié)論胰蛋白酶催化的半 合成的方法，其提供C端-連接的聚賴氨酰胺或聚精氨酰胺或聚-賴氨酸/ 精氨酸混合序列的肽的制備，是不成功的或者僅成功獲得低產(chǎn)量。發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種肽化學(xué)方法，其令人驚異地允許胰蛋白酶催化酰胺 化的堿性氨基酸、其類似物或衍生物以高產(chǎn)量(即> 30%)連接至C末端帶 有堿性氨基酸的肽。而且，令人驚奇的是，在本發(fā)明的方法中已經(jīng)可以觀察到，將保護(hù)性基 團(tuán)(參見(jiàn)Phraschke等人，Tetrahedron: Asymmetry 9，第1505-1518頁(yè)，1998) 例如，-Boc(叔丁氧羰基)、-Z(爺氧羰基)或-DDZ(二甲基苯基丙氧基羰基) 引入至酰胺化的堿性氨基酸(賴氨酰胺、精氨酰胺)并未導(dǎo)致連接反應(yīng)在效 率和選擇性方面有所改善。因此本發(fā)明的方法具有的優(yōu)點(diǎn)是其可能給予使用保護(hù)性基團(tuán)的掩蔽，因此避免通過(guò)除去保護(hù)性基團(tuán)和處理毒性試劑導(dǎo) 致的產(chǎn)量損失。這導(dǎo)致本方法相對(duì)于完全化學(xué)合成具有巨大的成本優(yōu)勢(shì)。 因此， 一方面本發(fā)明是用于制備C-末端酰胺化的二元肽或多元肽的方法，該肽的通式為(AA)n-Xm-NH2 (1)，其中(AA)n是由n個(gè)相同或不同類型的氨基酸構(gòu)成的肽，其中AA 是氨基酸或其類似物或衍生物；n 是3至2000之間的整數(shù)；并且X 是堿性氨基酸或其類似物或衍生物；m 是2至15之間的整數(shù)，其中通式II的化合物(AA)n-Xp (II) 與通式III的化合物在具有胰蛋白酶生物學(xué)活性的酶的存在下反應(yīng)，(X)q-NH2 (III)其中AA、 n和X定義如上，以及p和q是整數(shù)，以及p+q=m，并且在合適條件下，將產(chǎn)生的具有通式I的化合物進(jìn)行蛋白質(zhì)化學(xué)純 化；特別是當(dāng)其中m是2至10之間的整數(shù)，或者其中n是2至6之間的 整數(shù)時(shí)。另一方面本發(fā)明是上面描述的方法，其中n是10至1000之間、或15 至500之間、或20至400之間的整數(shù)。另一方面本發(fā)明是上面描述的方法，其中a) 表達(dá)融合肽，其包含通式II的一個(gè)或多個(gè)化合物作為融合肽的一部分。b) 該通式II的化合物是通過(guò)化學(xué)的或酶的切割從所述融合肽中釋放的；c) 從步驟b)得到的中間物是，在適當(dāng)?shù)慕?jīng)蛋白質(zhì)化學(xué)純化后，在具有胰蛋白酶生物學(xué)活性的酶存在下與通式III的化合物反應(yīng)；以及d)其中通式I的產(chǎn)物化合物適當(dāng)?shù)慕?jīng)蛋白質(zhì)化學(xué)純化和分離；其中特別 是通過(guò)面化氰、腸激酶、凝血因子X(jué)a、 Genenase、凝血酶或胰蛋白酶從 該融合蛋白中清除通式II的化合物；此外，更優(yōu)選表達(dá)該融合蛋白的表達(dá) 系統(tǒng)是選自包含大腸桿菌(E. coli)、肉糖葡萄球菌(S. carnosus)、沙門(mén)氏菌 (Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、粟 酒裂歹直酵母(Schizosaccharomyces pombe)和酉良酒酵母(S. cerevisiae)的纟且。 另夕卜，本發(fā)明是上面描述的方法，其中所述通式I的肽具有GLP-1或其衍生物或類似物的生物學(xué)活性。另一方面本發(fā)明是上面描述的方法，其中該通式I的化合物由通式IV 表征HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPS(X)m-NH2 (IV);特別是其能夠依次由以下序列表征HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH2 (SEQ ID No.l);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK NH2 (SEQ ID No. 2);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ ID No. 3);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2 (SEQ ID No. 4)或HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ ID No. 5)。另外本發(fā)明還涉及通式I的化合物，其由以下序列表征 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ ID No. 2);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ ID No. 3);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKRNH2 (SEQ ID No. 4)或HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ ID No. 5);以及它們的用途，特別是在緩釋制劑中的用途。另一方面，本發(fā)明包含一個(gè)或多個(gè)通式I的化合物的藥劑，其由以下 序列表征HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ ID No. 2);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKRNH2 (SEQ ID No. 3);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2 (SEQIDNo. 4)或HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ ID No. 5)。用于本發(fā)明目的的術(shù)語(yǔ)的含意是術(shù)語(yǔ)氨基酸的"類似物"是指天然產(chǎn)生的氨基酸，其在遺傳密碼中沒(méi)有 編碼但是適于摻入肽鏈。氨基酸的類似物的例子有鳥(niǎo)氨酸和瓜氨酸，另外 還有在側(cè)鏈中具有任何基本功能的所有其它的非天然產(chǎn)生的氨基酸，例如 2，4-二氨基丁酸；3-甲基鳥(niǎo)氨酸；4-甲基鳥(niǎo)氨酸；5-氨基亮氨酸；4-氨基亮 氨酸；3-氨基亮氨酸；5-氨基正亮氨酸；4-氨基正亮氨酸；3-氨基正亮氨酸； 4-氨基正纈氨酸；3-氨基正纈氨酸；6-甲基賴氨酸；5-甲基賴氨酸；4-甲基 賴氨酸；3-甲基賴氨酸。術(shù)語(yǔ)氨基酸的"衍生物"是指氨基酸或氨基酸類似物，其被一個(gè)或多個(gè) 化學(xué)集團(tuán)所取代。這樣的化學(xué)基團(tuán)的例子是在肽化學(xué)中慣用的保護(hù)性基團(tuán)， 例如-Boc (叔丁氧羰基)、-Z (節(jié)氧羰基)、-DDZ (二曱基苯基丙氧基羰基)、 畫(huà)Fmoc (N-a-(9-芴基甲氧基羰基)、畫(huà)2-溴誦Z、畫(huà)2-氯-Z、 -Tfa (三氟乙?；?、 煙酰、-4-硝基-Z、 -2-甲代吡咬基、-1\)8(4-甲苯磺酰)、-For(甲?；?、-生 物素基、-丹酰基、-Dnp(二硝基苯基)、-Mca(單氯乙酰)、-Mtt(N-曱基三苯 曱基)、-Nde(N-l-(4-硝基-l，3-茚二酮-2-亞基)乙基)、-l-亞氨乙基、-乙酰基、 -肉豆蔻酰、-棕櫚酰、N-石膽基(lithocholyl)個(gè)谷氨酰或-co-羧基十七烷酰。更多的這樣的基團(tuán)是C(0)-(CVC24)烷基基團(tuán)、c(o)-(c6-c24)烯基基 團(tuán)、C(0)-(C6-C24)烷二烯基(alkanedienyl)或C(0)-(C6-C24)烷三烯基 (alkanetrienyl)基團(tuán)，其中烷基、烯基、烷二烯基和烷三烯基基團(tuán)可存在于 支鏈或直鏈上。(d-C6)烷基是指有1、 2、 3、 4、 5或6個(gè)碳原子的烴基。(d-C6)烷基的實(shí)例是甲基、乙基、正丙基、異丙基、(l-甲基乙基)、正丁基、異丁基(2-甲基丙基)、仲丁基(l-甲基丙基)、叔丁基(l，l-二曱基乙基)、正戊基、異戊基、叔戊基、新戊基、己基。(CVC24)烷基相應(yīng)的指有6至24個(gè)碳原子的烴基。烷基可能是直鏈或支鏈的。優(yōu)選的(CVC24)烷基是脂 肪酸殘基，例如，己基、辛基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、 十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十 烷基、二十二烷基(dicosanyl)、 9，11-二甲基十三烷基、11-曱基十三烷基。這樣的基團(tuán)還是C(0)-苯基-(CVC8)雜芳基-苯基、C(O)-聯(lián)苯基或C(O)-萜苯基，其中苯基、聯(lián)苯基、萜苯基或雜芳基是未取代的或被選自(CVC,o) 烷基或O(d-C一烷基的組的一個(gè)或兩個(gè)基團(tuán)取代。在單取代的苯基中，取 代基可位于2位、3位或4位。雙取代的苯基可以在2，3位、2，4位、2,5 位、2，6位、3， 4位或3， 5位被取代。在三取代的苯基，取代基可位于2，3， 4位、2，3，5位、2，4，5位、2,4，6位、2， 3， 6位或3， 4， 5位。雜芳基是指 例如吠喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑 基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、吡淀基、吡嚷基、嘧咬基、喊溱基、 吲哚基、吲唑基、喹啉基、異喹啉基、酞嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基和肉 啉基。術(shù)語(yǔ)"堿性氨基酸"是指賴氨酸、精氨酸或其衍生物或類似物，例如鳥(niǎo) 氨酸或瓜氨酸，優(yōu)選賴氨酸或精氨酸，特別是賴氨酸。在這方面，代替氨 曱酰基團(tuán)的賴氨酸、精氨酸可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)另外的反應(yīng)基團(tuán)，特別是 選自氨基酯、肽酯、酐和鹵化物中的基團(tuán)而衍生，并且被相應(yīng)地用于本發(fā) 明的方法中。術(shù)語(yǔ)"具有胰蛋白酶生物學(xué)活性的酶"是指除了公知的和來(lái)自 一般來(lái)源 (例如來(lái)源于大鼠、牛、豬、人、狗、小鼠)可商購(gòu)的胰蛋白酶，其同工酶、 衍生物或變異體之外，還包括具有高度相關(guān)的生物化學(xué)特性的酶，例如組 織蛋白酶、來(lái)自尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)和來(lái)自鏈霉菌(灰色鏈霉 菌(S. griseus)、剝落鏈霉菌(S. exfoliatus)、紅色鏈霉菌(S. erythraeus)、弗 氏鏈霉菌(S. fradiae)和微白黃鏈霉菌(S. albidoflavus))的胰蛋白酶、類胰蛋白酶、mastin、頂體蛋白酶、激肽釋放酶、絲氨酸蛋白酶(hepsin)、前列腺 蛋白酶I、賴氨酰內(nèi)肽酶(Lys-C)以及內(nèi)蛋白酶-Arg-C(梭菌蛋白酶)。十分明顯，對(duì)在這方面的技術(shù)人員而言，這個(gè)列表不是最終的，而且， 能夠特異地切割堿性氨基酸C-末端的另外的酶、同工酶、衍生物或變異體 在生物技術(shù)研究中被不斷地發(fā)現(xiàn)?；蛘?，可通過(guò)肽化學(xué)修飾或在DNA水 平的突變(突變蛋白質(zhì))改變酶的特異性。另外，通過(guò)合適地選擇反應(yīng)條件 可顯著改變酶的特異性和活性。在本發(fā)明的方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用微生物制備異源肽的能力。 為此，將期望的肽序列翻譯成相應(yīng)的DNA序列，偶聯(lián)至宿主特異性的啟 動(dòng)子序列。在這個(gè)情況下，可能依靠該表達(dá)策略表達(dá)目的肽，從而作為保 留在細(xì)胞內(nèi)的融合肽通過(guò)細(xì)胞直接或間接地形成。如果選擇應(yīng)用合適的融合肽的融合策略，那么對(duì)于熟練的技術(shù)人員而 言十分清楚的是，必須通過(guò)接頭將融合的配偶體分子連接到一起，并允許 以某種方式特異地分開(kāi)配偶體分子以便在處理后能夠得到期望的N-端的 目的肽。為達(dá)到本發(fā)明的目的，該目的肽是通式II的化合物。設(shè)計(jì)合適的 接頭可有很多的可能性，包括對(duì)于熟練的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)包括已知的和持續(xù) 擴(kuò)展的方法。例如，如果選擇的氨基酸是甲硫氨酸，可能用氰卣化物化學(xué) 切割。例如，如果選擇序列為DDDDK的五肽作為接頭，可用腸激酶切割。 例如，如果選擇序列為IEGR的四肽，可以用凝血因子X(jué)a產(chǎn)生切割。應(yīng)用適當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)，對(duì)N端為組氨^始的肽可用。6116肌86@作為處理酶。如果N端是以二肽Gly-Ser為特征，可以選擇四肽LVPR作為接頭，以便產(chǎn) 生凝血酶的切割位點(diǎn)。雖然，根據(jù)本發(fā)明為了肽的偶聯(lián)利用了具有胰蛋白 酶生物學(xué)活性的酶，在本發(fā)明的方法中，在這點(diǎn)上應(yīng)用這些酶原則上是可 行的。因此，只要是賴氨酸或精氨酸被插入融合部分和目的肽之間作為接 頭，最初可以在水性介質(zhì)中用胰蛋白酶除去融合肽的融合部分。然而，如果目的肽是適合輸出的，做為選擇，可將其以融合肽或其天 然形式分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。為達(dá)此目的，可能采用重組的宿主細(xì)胞，特 別是那些微生目的肽或包含該目的肽的相應(yīng)融合肽則有另外的選擇，即該目的肽為用于 本發(fā)明目的的通式II的化合物，其被直接分泌到周質(zhì)或培養(yǎng)基中。技術(shù)人員十分清楚，在這方面如果其C-末端由超過(guò)1個(gè)的堿性氨基酸組成，其輸出經(jīng)常受到限制。對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)用于此目的的宿主有機(jī)體和方法基本上可以從文獻(xiàn)中得到(參見(jiàn)，例如，Gellissen，Gerd(編輯)。重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)(Production of Recombinant Proteins), ISBN 3-527-31036-3)。很大程度上它們也能從 眾多的供應(yīng)商處商購(gòu)獲得?？赡芴岬降挠写硇缘墓居行掠⒏裉m生物實(shí) 驗(yàn)室，英杰(Invitrogen)和羅氏(Roche)。這些公司的目錄說(shuō)明書(shū)包括提供方 法學(xué)概述的參考文獻(xiàn)。對(duì)技術(shù)人員而言十分明顯，在這種連接中，使用的 微生物的范圍在持續(xù)地?cái)U(kuò)展，正如生物技術(shù)的方法的組成一樣。在本發(fā)明 的主題內(nèi)容中也包含在這方面更具體的實(shí)施方案。所提到的宿主/載體系統(tǒng) 有代表性的實(shí)例如下大腸桿菌、肉糖葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿 菌或假單胞菌(特別是螢光假單胞菌)型細(xì)菌，和乳酸克魯維酵母、巴斯德 畢赤酵母、粟酒裂殖酵母和釀酒酵母。然而，技術(shù)人員知道作為例子提到的這些系統(tǒng)可提供大量可能的變異， 例如從選擇合適的啟動(dòng)子或其它的核酸調(diào)控序列、宿主細(xì)胞和所用載體(例 如與DNA拷貝數(shù)相關(guān)，篩選方法的選擇等等)的遺傳特性而形成的變異。技術(shù)人員同樣知道每個(gè)目的肽由于其理化性質(zhì)，當(dāng)有意將其以分離的 形式提供時(shí)必須采用特異的純化方法。其基本上通過(guò)將已知的生化和生物 物理的分離方法適當(dāng)結(jié)合而獲得。同樣十分清楚，在這方面為了完成或優(yōu) 化所期待的基于新材料的成功純化(例如對(duì)于層析法)，正不斷地創(chuàng)造出新 的可能性。將前體肽與肽序列(例如其允許通過(guò)親和層析純化)結(jié)合，可能有利于 達(dá)到本發(fā)明的目的。至于本發(fā)明另外的研發(fā)，已經(jīng)通過(guò)實(shí)施例的途徑制備了如US 2004/0106547中公開(kāi)的胰高血糖素樣肽抑制劑的衍生物。衍生于胰高血糖 素樣肽抑制劑的這樣的肽，由于它們的降血糖效應(yīng)，可能在治療糖尿病或其它例如導(dǎo)致肥胖癥的代謝紊亂的醫(yī)藥研制中擔(dān)當(dāng)重要的角色。因此，為 了制藥的目的以適當(dāng)?shù)男问将@得這種肽是值得。國(guó)際專利申請(qǐng)書(shū)WO 02/066628描述了水蛭素衍生物，在其C-末端有 氨基酸Lys-Arg。通過(guò)C-末端精氨酸的酰胺化可以改變抗凝血效應(yīng)鐠。為 此目的，制備C-末端有賴氨酸的前體，并隨后根據(jù)本發(fā)明用精氨酰胺進(jìn)行 偶聯(lián)反應(yīng)，最終產(chǎn)生酰胺化的水蛭素衍生物。如在該申請(qǐng)書(shū)中所描述的可 以通過(guò)酵母分泌制備該前體。為此，例如，在EP-A 0 324 712中描述的亮 氨酸-水蛭素的基因序列，通過(guò)賴氨酸的密碼子延伸，并且通過(guò)繼續(xù)專利中 實(shí)施例所描述的步驟制備用賴氨酸延伸的水蛭素。作為替代，也可以依照 通過(guò)細(xì)菌的前體分泌途徑。例如，在專利申情書(shū)EP-A1 216 259中所描述 的技術(shù)可用于此目的。以下實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，而決不能將其解釋為關(guān)于本發(fā)明 的主題內(nèi)容的限制。實(shí)施例實(shí)施例1:大腸桿菌特異的編碼AVE (l-43)的DNA序列的合成 首先制備編碼肽AVE(l-43) (SEQ ID No.7)的基因序列SEQ ID No.6: SEQ ID No.6:TTTTTTAAGCTTGCACGGTGAAGGTACCTTCACCTCCGACCTGTC CAAACAGATGGAAGAAGAAGCTGTTCGTCTGTTCATCGAATGGC TGAAAAACGGTGGTCCGTCCTCCGGTGCTCCGCCTTCGAAAAAG AAGAAAAAGTGATAATAGCATGCACGTGCGGCCGCACCTGGTCG ACGAATTC AAA AAAASEQ ID No.7:通過(guò)PCR技術(shù)合成該基因序列。為此，通過(guò)DNA化學(xué)合成制備以下 條引物。應(yīng)用快速DNA合成系統(tǒng)(the Expedite DNA synthesissystem)(來(lái)自應(yīng)用生物系統(tǒng))進(jìn)行這一合成。a) 引物zp5u具有SEQIDNo.8序列5 '-ttttttaagcttgc acggtg aag -3'SEQ ID No. 8包含有義鏈("正義的")的1 - 23區(qū)。三聯(lián)體CAC編碼 組氨酸作為目的肽的第一個(gè)氨基酸。b) 引物zp3a具有SEQIDNo.9序列5畫(huà)CTTCCATCTGTTTGGACAGGTCGGAGGTGAAGGTACCTTC ACCGTGCAAG CTTAAAAAA-3SEQ ID No.9包含互補(bǔ)鏈("反義的")的1 - 59區(qū)。c) 引物zp3b具有SEQIDNo.lO序列5 -GGACGGACCACCGTTTTTCAGCCATTCGATGAACAGACGA ACAGCTTCTTCTTCCATCTGTTTGGAC AG—3SEQIDNo.10包括互補(bǔ)鏈("反義的")的40-108區(qū)。d) 引物zp3c具有SEQ ID No.ll序列:5 -CGTGCATGCTATTATCACTTTTTCTTCTTTTTCGAAGGCGG AGC ACCGG AGG ACGGACCACCGTTTTTC—3'SEQ ID No.ll包含互補(bǔ)鏈("反義的")的91-159區(qū)。 反義三聯(lián)體CTT編碼目的肽的最后一個(gè)氨基酸(AA")。e) 引物zp3d具有SEQ ID No.12序列5, TTttttGAATTCGTCGACCAGGTGCGGCCGCACGTGCATG CTATTATC ACTT—3SEQ ID No.12包含互補(bǔ)鏈("反義的")的余下區(qū)域。隨后應(yīng)用這些引物，在標(biāo)準(zhǔn)條件下于54。C進(jìn)行4輪PCR反應(yīng)。在反 應(yīng)1中，zp3a和zp5u每個(gè)引物使用100 ng。 PCR的循環(huán)數(shù)為5。在第二 輪反應(yīng)中，將1/40的反應(yīng)產(chǎn)物與zp5u和zp3b每個(gè)引物100 ng進(jìn)行10個(gè) 循環(huán)的反應(yīng)。在第三輪反應(yīng)中，1/40的反應(yīng)2的產(chǎn)物與zp5u和zp3c每個(gè) 引物100ng進(jìn)行另外10個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。最后，用1/40的反應(yīng)3的產(chǎn)物和 引物zp5u和zp3d在25個(gè)PCR循環(huán)中合成目的DNA片斷，其長(zhǎng)度用凝膠電泳驗(yàn)證。純化期望的DNA片斷并按照制造商(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室) 的說(shuō)明，與限制性酶EcoRl以及隨后與Hind3反應(yīng)。平行地，將質(zhì)粒pUC19 (新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)的DNA與酶EcoRl和 Hind3反應(yīng)。將切割的混合物片斷在1.2%的瓊脂糖凝膠上分開(kāi)，然后分離 pUC19的剩下的載體和從反應(yīng)4得到的目的產(chǎn)物。純化的片斷在T4連接 酶反應(yīng)中于16。C過(guò)夜，將其連接到一起。隨后，用連接的混合物轉(zhuǎn)化感受 態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(斯徹特公司(Stratagene)，大腸桿菌XL10 Gold菌林)并將 該轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪于包含25mg/l氨節(jié)青霉素的瓊脂板上。從單個(gè)克隆中分 離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)DNA序列分析確定其特性。以pSCHPUCZPl-43命名該目的片斷的質(zhì)粒DNA,并將其在大腸桿 菌K12細(xì)胞中作為制備表達(dá)載體的原料，用于合成通式I的化合物。實(shí)施例2:構(gòu)建AVE (l-43)的表達(dá)載體US 5496924，其內(nèi)容被清楚地包含于本申請(qǐng)中由此作為參考，提出原 子上可以制備裁剪的融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是能夠制備具有 小的平衡部分(ballast portion)的融合蛋白。按照申請(qǐng)中的實(shí)例使用該表達(dá) 系統(tǒng)。序列A-B區(qū)段通過(guò)腸激酶識(shí)別序列DDDDK與AVE(l-43)融合，產(chǎn) 生具有以下基因序列和氨基酸序列(SEQ ID No.13和No.l4)的融合蛋白SEQ ID No.13:5，畫(huà)GGAAACAGAATTCATGGCGCCGACCTCTTCTTCTACCAAAAAGCTCAACTGCAACTGGAACACCTGCTGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGGTATCAACAACTACAAAAACCCGAAACTGACGCGTATCGACGATGACGATAAACACGGTGAAGGTACCTTCACCTCCGACCTGTCCAAACAGATGGAAGAAGAAGCTGTTCGTCTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGTGGTCCGTCCTCCGGTGCTCCGCCTTCGAAAAAGAAGAAAAAGTGATAATAGCATGCACGTGCGGCCGCAAGCTTAAAAAA-3"ATG和AAG密碼子標(biāo)志著融合肽的第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸。SEQ ID No.14:MAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGIN NYKNPKLTRI DDDDKHGEGT FTSDLSKQME EEAVRLFIEW LKNGGPSSGA PPSKKKKK通過(guò)PCR技術(shù)制備編碼的基因序列。為此，合成以下引物1) 引物psw3—zpcolf (SEQ ID No.15):5 CGTATCGACGATGACGATAAACACGGTGAAGGTACCTTC-3 在這個(gè)例子中，該引物序列覆蓋了腸激酶識(shí)別位點(diǎn)和AVE^3-編碼序 列的起始。2) 引物psw3—zpcolrev (SEQ ID No. 16):5畫(huà)GTGTTTATCGTCATCGTCGATACGCGTCAGTTTCGG-3 在這個(gè)例子中，該序列相當(dāng)于從白介素2衍生的合成序列，如US5496924表中所示，其覆蓋34-38位氨基酸以及2/3的甲硫氨酸的密碼子。該引物序列的余下部分與《j物psw3—zpcolf重疊。3) pB引物fl (SEQ ID No. 17):5 -TGAGCGGATAACAATTTCACAC-3'該引物與存在于質(zhì)粒pK50(參見(jiàn)US 5496924中圖33)具有EcoRI切割 位點(diǎn)的上游雜交。4) 帶有Hind3切割位點(diǎn)的psw3—ave—l-43_rev (SEQ ID No.18):5 -TTTTTTAAGCTTGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCACTT 兩個(gè)PCR平行地進(jìn)行。 一個(gè)是用質(zhì)粒pK50的DNA與引物對(duì)pB引 物fl和psw3—zpcolrev于50。C進(jìn)行，以及另一個(gè)反應(yīng)是質(zhì)粒 pSCHPUCZPl畫(huà)43與引物對(duì)psw3—zpcolf和psw3—ave—1-43—rev于54。C進(jìn) 行。PCR產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳分級(jí)分離后被純化，并且各個(gè)等分試樣按l:l 的比例混合，然后在第三個(gè)PCR中與引物對(duì)pB引物fl和 psw3_ave—1-43—rev反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物與酶EcoRl和Hind3反應(yīng)，并應(yīng) 用于T4連接酶反應(yīng)中連接至經(jīng)這些酶平行處理打開(kāi)的質(zhì)粒pK50。用連接 混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21,并將其鋪板于包含25 mg/1氨節(jié)青霉素的選擇性瓊脂上。從一些克隆中重新分離質(zhì)粒DNA并用PCR和隨后的 DNA序列分析檢驗(yàn)。正確的質(zhì)粒以pBZP43命名。檢驗(yàn)大腸桿菌 BL21:pBZP43克隆對(duì)該融合蛋白的表達(dá)。這以類似于美國(guó)專利5496924 的實(shí)施例14的方式進(jìn)行。該表達(dá)產(chǎn)物用質(zhì)鐠和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 分析，其N-端用蛋白序列分析確定。挑選適用于更大量的原料發(fā)酵的克隆。實(shí)施例3:構(gòu)建AVE (l-39)的表達(dá)載體質(zhì)粒pBZP43作為模板用于與引物pB引物fl (實(shí)施例2)和 psw3—ave—39rev進(jìn)行的PCR反應(yīng)。按照該酶制造商提供的說(shuō)明，將該P(yáng)CR 產(chǎn)物與限制性酶EcoRI和Notl反應(yīng)，并在T4連接酶反應(yīng)中插入用 Ecorl/Notl打開(kāi)的質(zhì)粒pBZP43中。該產(chǎn)物為pBZP39質(zhì)粒，用其繼續(xù)在 實(shí)施例2中所述的步驟。psw3—ave—39rev (SEQ ID No. 19):5, TTttttGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCATTTCGAAGG CGGAGCACC-3'三聯(lián)體TTT編碼第39位的賴氨酸。 實(shí)施例4:構(gòu)建AVE (l-38-Arg)的表達(dá)載體質(zhì)粒pBZP43作為模板用于與引物pB引物fl (實(shí)施例2)和 psw3—ave38—argrev進(jìn)行的PCR反應(yīng)。按照該酶制造商提供的說(shuō)明，將該 PCR產(chǎn)物與限制性酶EcoRI和Notl反應(yīng)，并在T4連接酶反應(yīng)中插入用 Ecorl/Notl打開(kāi)的質(zhì)粒pBZP43中。該產(chǎn)物為pBZP38arg質(zhì)粒，用其繼續(xù) 在實(shí)施例2中所述的步驟。引物psw3—ave38—argrev (SEQ ID No. 20):5, TTttttGCGGCCGC ACGTGC ATGCTATTATCATACGCGAAG GCGGAGCACCG-3、三聯(lián)體AGG編碼第39位的精氨酸。實(shí)施例5:實(shí)施例2-4中構(gòu)建的菌林的發(fā)酵如德國(guó)專利申請(qǐng)DE 10 2004 058306.4，實(shí)施例3所描述的方法進(jìn)行發(fā) 酵，僅稍有不同。用不同的編碼目的肽衍生物(融合蛋白)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化 大腸桿菌BL21細(xì)胞，將其培養(yǎng)在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基中(見(jiàn)實(shí)施例 1)，在30。C或37°C以及pH 7.0的條件下于發(fā)酵罐中培養(yǎng)。用NH/溶液(26。/0 的水溶液)調(diào)節(jié)pH。通過(guò)保持培養(yǎng)發(fā)酵液中的溶解氧恒定在30%的控制策 略，確保培養(yǎng)物的通氣。對(duì)于無(wú)機(jī)鹽分批補(bǔ)料方法，將葡萄糖溶液(60%重 量/體積)按8 g/L/h至26 g/L/h補(bǔ)料。通過(guò)加入IPTG (終濃度為1-4 mM (f.c.)) 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。誘導(dǎo)時(shí)間為6-8小時(shí)。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。以如下方式進(jìn)行AVE前體融合蛋白在大腸桿菌BL21/pBZP43中的表達(dá)。從儲(chǔ)存于-80。C的大腸桿菌BL21細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)物中取出100 pL細(xì) 胞懸液，并在0.5L的預(yù)培養(yǎng)液中于37。C振搖孵育10-16小時(shí)。用適量的預(yù) 培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐中的主要培養(yǎng)物，接種密度是OD卿從0.01至0.05。預(yù)培養(yǎng)基5g/L細(xì)菌胰蛋白胨10 g/L酵母提取物5g/LNaCl主培養(yǎng)基基于葡萄糖作為碳源的限定無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)(Jeffrey H. Miller:分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1972))。在消耗掉最初存在于主培養(yǎng)基中的葡萄糖之后，補(bǔ)充葡萄糖溶液。通 過(guò)加入IPTG (1 mM終濃度)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，在誘導(dǎo)后觀察到融合蛋白的 表達(dá)量達(dá)到最大。例如，按照制造商提供的說(shuō)明應(yīng)用來(lái)自Novex (NuPage Novex 12%凝膠系統(tǒng)，英杰公司(InvitrogenTM))的十二烷基磺酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳分析系統(tǒng)，對(duì)發(fā)酵中各自在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)從發(fā)酵罐 取出的OD6咖m為0.02的細(xì)胞懸液進(jìn)行分析。實(shí)施例6:在實(shí)施例5中制備的融合蛋白的純化用1000 ml Tris緩沖液(50 mM Tris/HCl， pH 7.4)重懸1000 g生物量的 重組大腸桿菌菌抹。通過(guò)兩次高壓勻漿(Rannie高壓勻漿器，1000巴)破碎 細(xì)胞。通過(guò)加入Benzonase(核酸酶)(1000 U/L)和氯化鎂(10 mM)消化基因 組DNA1.5小時(shí)。膨脹床層析法純化融合蛋白。為此，用緩沖液(50 mM Tris/HCl， pH 7.4)將細(xì)胞勻漿稀釋至10升，并直接上樣至預(yù)先用緩沖液 (50 mM Tris/HCl pH7.4)平衡的層析柱(流線SPXL， GE衛(wèi)生保健)。加樣后 接下來(lái)是用平衡緩沖液(6倍柱體積)沖洗的步驟，接著用7%的高鹽緩沖液 (50 mM Tris/HCl pH 7.4; 1 M NaCl)完成另外的沖洗步驟。用10倍柱體積 的20%的高鹽緩沖液進(jìn)行洗脫。用808凝膠電泳(!^1^386@ Novex 12%凝 膠系統(tǒng)，英杰公司)和高效液相色譜對(duì)洗脫收集液進(jìn)行檢測(cè)。融合蛋白收集 液在透析過(guò)濾至腸激酶緩沖液(50 mM Tris/HCl pH 7.4; 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2)后被用于蛋白酶切割反應(yīng)。按照制造商提供的說(shuō)明在腸激酶緩 沖液(20 mM Tris/HCl， 50 mM NaCl， 2 mM CaCl2 pH 7.4)中用腸激酶(英杰 公司)切割融合蛋白。實(shí)施例7:從腸激酶切割反應(yīng)中分離切割產(chǎn)物按照德國(guó)專利申情書(shū)DE102004058306.4中實(shí)施例6的方法進(jìn)行切割 產(chǎn)物的分離。用腸激酶切割融合蛋白后，接著通過(guò)離子交換層析(Source 30S(填料)，安瑪西亞生物科學(xué)(Amersham Biosciences))將切割產(chǎn)物彼此分 離。用H20稀釋將離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)到大約7mS/cm。在將蛋白溶液上樣至預(yù) 先平衡的層析柱(20 mM Tris/HCl， pH 7.4;用NaCl調(diào)節(jié)電導(dǎo)率至約7 mS/cm)后，用15%的緩沖液8 (20 mM Tris/HCl， pH 7.4; 500 mM NaCl) 沖洗掉未結(jié)合的物質(zhì)。通過(guò)應(yīng)用超過(guò)10倍柱體積的梯度達(dá)到100%的緩沖 液B進(jìn)行AVE肽前體的洗脫。用SDS凝膠電泳法、高效液相色語(yǔ)法和質(zhì) 鐠法對(duì)含有AVE前體的部分進(jìn)行鑒定。將相應(yīng)的部分混合、脫鹽，并在除 去有機(jī)溶劑后冷凍干燥。實(shí)施例8: AVE (l-39)與H-Lys(Boc)-NH2偶聯(lián)的肽稱取0.2 mg的AVE (1-39)(分子量4218; 0.047nmol;終濃度lg/L)放入 1.5mL聚丙烯反應(yīng)器中。加入11 pL的pH5.6的0.1M吡咬-乙酸鹽緩沖液、 60 的129 g/L的溶于pH5.6的0.1 M吡，定-乙酸鹽緩沖液的 H-Lys(Boc)-NH2.HCl溶液(含有7.75 mg的H-Lys(Boc)-NH2.HCl = 27.5 pmol = 585 mol的H-Lys(Boc)-NH2.HCl/每摩爾AVE (l-39))和119 |iiL的 DMF。該澄清的溶液于12。C平衡。加入10nL的2g/L胰蛋白酶溶液至水 中(包含0.02 mg的胰蛋白酶=0.002 g胰蛋白酶/每克AVE (l-39))使反應(yīng)起 始。該反應(yīng)溶液在12。C孵育，同時(shí)按每分鐘1000轉(zhuǎn)振搖。有規(guī)則地取出 用于過(guò)程控制的樣本，并通過(guò)加入9倍體積的含17°/。水、17%乙腈和64% 三氟乙酸的溶液稀釋以終止反應(yīng)。該反應(yīng)進(jìn)程后進(jìn)行液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS) 分析。在達(dá)到最大產(chǎn)量后，通過(guò)加入三氟乙酸將該反應(yīng)物酸化至pH值低 于2.5并用層析法純化。實(shí)施例9: AVE (l-43)與H-Lys-NH2偶聯(lián)的肽稱取3.85 mg的AVE (1-43)(分子量4731; 0.814 pmol;終濃度20 g/L) 放入1.5 mL聚丙烯反應(yīng)器中。加入41 nL的620 g/L的溶于pH5.8的0.1 M 乙酸鈉緩沖液的H-Lys-NH2.2HC1溶液(含有25.6 mg的H-Lys-NH2.2HC1 =117.5 pmol = 144 mol的H-Lys-NH2.2HCl/每摩爾AVE (1-43))、 116 pL DMF和32 ^LpH5.8的0.1 M乙酸鈉緩沖液。該澄清的溶液于12。C平衡。 加入2.9 pL的20 g/L胰蛋白酶溶液至水中(含有0.06 mg的胰蛋白酶- 0.015 g的胰蛋白酶/每克AVE (l-43))使反應(yīng)起始。該反應(yīng)溶液在12。C孵育，同 時(shí)按每分鐘900轉(zhuǎn)振搖。有規(guī)則地取出用于過(guò)程控制的樣本，并用9倍體 積的含17%水、17%乙腈和64%三氟乙酸的溶液稀釋以終止反應(yīng)。該反應(yīng) 進(jìn)程接下來(lái)是液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析。在達(dá)到最大產(chǎn)量后，通過(guò)加入三氟 乙酸將該反應(yīng)物酸化至pH值低于2.5并用層析法純化。實(shí)施例10: AVE (l-39)與H-Lys-NH2偶聯(lián)的肽稱取0.2 mg的AVE (1-39)(分子量4218; 0.047pmol;終濃度lg/L)放入 1.5 mL聚丙烯反應(yīng)器中。加入11 |LiL的pH5.6的0.1 M吡咬-乙酸鹽緩沖 液、60 pL 100g/L的溶于pH5.6 0.1 M吡咬-乙酸鹽緩沖液的 H-Lys-NH2.2HC1溶液(包含6.0 mg的H-Lys-NH2.2HC1 = 27.5 pmol = 585 mol的H-Lys-NH2.2HCl/每摩爾AVE (l-39))和119|tiL的DMF。該澄清 的溶液于12。C平衡。加入IO^iL的2g/L胰蛋白酶溶液至水中(包含0.02 mg 胰蛋白酶=0.002 g胰蛋白酶/每克AVE(l-39))使反應(yīng)開(kāi)始。該反應(yīng)溶液在 12。C孵育，同時(shí)按每分鐘1000轉(zhuǎn)振搖。有規(guī)則地取出用于過(guò)程控制的樣本， 并用9倍體積的含17%水、17%乙腈和64%三氟乙酸的溶液稀釋以終止反 應(yīng)。該反應(yīng)進(jìn)程接下來(lái)是液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析。在達(dá)到最大產(chǎn)量后，通 過(guò)加入三氟乙酸將該反應(yīng)物酸化至pH值低于2.5并用層析法純化。實(shí)施例11: AVE(l-39)與H-Arg-NH2偶聯(lián)的肽稱取0.2 mg的AVE (1-39)(分子量4218; 0.047pmol;終濃度lg/L)放入 1.5mL聚丙烯反應(yīng)器中。加入11 iliL的pH5.6的0.1 M吡P定-乙酸鹽緩沖液、 60 pL的113 g/L的溶于pH5.6 0.1 M吡啶-乙酸鹽緩沖液的H-Arg -NH2.2HC1溶液(包含6.77 mg的H-Arg-NH2.2HC1 = 27.5 jimol = 585 mol 的H-Arg-NH2.2HCl/每摩爾AVE (l-39))和119|iiL的DMF。該澄清的溶液 于12。C平衡。加入10 pL的2 g/L胰蛋白酶溶液至水中(包含0.02 mg胰蛋 白酶=0.002 g胰蛋白酶/每克AVE (l-39))使反應(yīng)開(kāi)始。該反應(yīng)溶液在12°C 孵育，同時(shí)按每分鐘1000轉(zhuǎn)振搖。有規(guī)則地取出用于過(guò)程控制的樣本，并 用9倍體積的含17%水、17%乙腈和64%三氟乙酸的溶液稀釋以終止反應(yīng)。 該反應(yīng)進(jìn)程接下來(lái)是液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析。在達(dá)到最大產(chǎn)量后，通過(guò)加 入三氟乙酸將該反應(yīng)物酸化至pH值低于2.5并用層析法純化。實(shí)施例12: AVE (l-43)與H-Arg-NH2偶聯(lián)的肽稱取0.25 mg的AVE (1-43)(分子量4731; 0.047 pmol;終濃度1.1 g/L) 放入1.5 mL聚丙烯反應(yīng)器中。加入11 |iiL的pH5.6的0.1M吡淀-乙酸鹽緩沖液、60 pL的113g/L溶于pH5.6， 0.1 M吡啶-乙酸鹽緩沖液的H-Arg -NH2.2HC1溶液(包含6.77 mg的H-Arg-NH2.2HC1 = 27.5 pmol = 585 mol 的H- Arg -NH2.2HClA^f爾AVE (l-43))和119^L DMF。該澄清的溶液于 12。C平衡。加入10i^L的2g/L胰蛋白酶溶液至水中(包含0.02 mg胰蛋白 酶=0.002 g胰蛋白酶/每克AVE (l-43))使反應(yīng)開(kāi)始。該反應(yīng)溶液在12。C保 溫，同時(shí)按每分鐘1000轉(zhuǎn)振搖。有規(guī)則地取出用于過(guò)程控制的樣本，并用 9倍體積的含17%水、17%乙腈和64。/。三氟乙酸的溶液稀釋以終止反應(yīng)。 該反應(yīng)進(jìn)程接下來(lái)是液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析。在達(dá)到最大產(chǎn)量后，通過(guò)加 入三氟乙酸將該反應(yīng)物酸化至pH值低于2.5并用層析法純化。實(shí)施例13: AVE (l-38)-Arg與H-Lys-NH2偶聯(lián)的肽 稱取0.2 mg的AVE (l-38)-Arg (分子量4246; 0.047pmol;終濃度lg/L) 放入1.5mL聚丙烯反應(yīng)器中。加入11 的pH5.6的0.1M吡啶-乙酸鹽緩 沖液、60 pL 100 g/L的溶于pH5.6， 0.1 M吡咬-乙酸鹽緩沖液的 H-Lys-NH2.2HC1溶液(包含6.0mg的H-Lys-NH2.2HC1 = 27.5 pmol = 585 mol的H-Lys畫(huà)NH2.2HCl/每摩爾AVE (l-38)-Arg)和119 |nLDMF。該澄 清的溶液于12。C平衡。加入10 |LiL的2 g/L胰蛋白酶溶液至水中(包含0.02 mg胰蛋白酶=0.002 g胰蛋白酶/每克AVE (l-38)-Arg)使反應(yīng)開(kāi)始。該反 應(yīng)溶液在12。C孵育，同時(shí)按每分鐘1000轉(zhuǎn)振搖。有身見(jiàn)則地取出用于過(guò)程 控制的樣本，并用9倍體積的含17。/。水、17%乙腈和64%三氟乙酸的溶液 稀釋以終止反應(yīng)。該反應(yīng)進(jìn)程接下來(lái)是液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析。在達(dá)到最 大產(chǎn)量后，通過(guò)加入三氟乙酸將該反應(yīng)物酸化至pH值低于2.5并用層析 法純化。實(shí)施例14: AVE(l-43)與H-Lys(Boc)-NH2偶聯(lián)的肽 稱取20 mg的AVE (1-43)(分子量4731; 1.058pmol;終濃度20g/L)放入 2mL聚丙烯反應(yīng)器中。加入370 的482 g/L溶于pH5.5的0.1 M檸檬酸 鈉緩沖液的 H-Lys(Boc)-NH2.HCl 溶液(包含 155 mg 的H-Lys(Boc)-NH2.HCl = 550 pmol = 130 mol的H-Lys(Boc)國(guó)NH2.HCl/每摩爾 AVE (l-43))和600 inLDMF。該澄清的溶液于12。C平衡。加入30 |iiL的3.3 g/L胰蛋白酶溶液至水中(包含0.1 mg的胰蛋白酶=5 mg胰蛋白酶/每克 AVE (l-"))使反應(yīng)起始。該反應(yīng)溶液在U。C孵育，同時(shí)按每分鐘1000轉(zhuǎn) 振搖。有規(guī)則地取出用于過(guò)程控制的樣本，并用9倍體積的含17%水、17% 乙腈和64。/。三氟乙酸的溶液稀釋以終止反應(yīng)。該反應(yīng)進(jìn)程接下來(lái)是液-質(zhì) 聯(lián)用(LC-MS)分析。在達(dá)到最大產(chǎn)量后，通過(guò)加入三氟乙酸至終濃度 50%(體積/體積)使該反應(yīng)物酸化。這樣處理以終止反應(yīng)，并同時(shí)定量清除 Boc保護(hù)基團(tuán)。用層析法對(duì)該反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化。實(shí)施例15:酰胺化的AVE衍生物的純化偶聯(lián)反應(yīng)得到的反應(yīng)混合物，隨后使用高效吸附層析色鐠樹(shù)脂CG300 XT 20 (Amberchrom CG300 XT 20)作為支持物質(zhì)通過(guò)反相(RP)層析分離， 接著用Source 30S作為支持通過(guò)離子交換步驟從適當(dāng)?shù)南疵摬糠种蟹蛛x酰 胺化的目的肽。在高效吸附層析色鐠柱(Amberchrom column)上脫鹽之后， 獲得用于藥劑配制的產(chǎn)品。通過(guò)基質(zhì)輔助的激光解吸電離質(zhì)譜 (MALDI-MS)和核磁共振(NMR)分析對(duì)該產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。實(shí)施例16: Leu-水蛭素Lys-Arg-NH2的制備專利申請(qǐng)EP-A 1 216 259的實(shí)施例1描述了允許Leu-水蛭素分泌至細(xì) 菌上清液的表達(dá)質(zhì)粒的制備。在標(biāo)準(zhǔn)PCR中利用該質(zhì)粒的DNA作為模板。 用于該反應(yīng)的正向引物是在實(shí)施例中所述的smompaf2序列。所用的反向 引物是寡核苷酸hirjys66—rev (SEQ ID NO.:21)，其具有以下序列 5 -TTTTTTAAGC TTCTATTATT TCTGAAGGTA TTCCTCAGGG-3Hind3其中帶下劃線的密碼子編碼賴氨酸。從22位至40位(末端)的序列與申請(qǐng) EP-A 1 216 259的表1所描述序列的178—195的序列片段互補(bǔ)。如該實(shí)施例中所述進(jìn)行PCR，產(chǎn)物用限制性酶EcoRl和Hind3消化并插入相應(yīng)打開(kāi)的載體pJF118。在鑒定后，按照專利申請(qǐng)EP-A1 216 259 的實(shí)施例11的方法，將DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12，并表達(dá)中間產(chǎn)物和純化。 然后，對(duì)應(yīng)于本申請(qǐng)書(shū)的實(shí)施例13，用相應(yīng)摩爾濃度與精氨酰胺反應(yīng)生成 Leu-水蛭素,-6sLys-Arg-NH2。如果直接在作為中間宿主菌的MC1061菌株 中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物也在周質(zhì)空間中存在。這使得必需使用已知的方法 進(jìn)行細(xì)胞破碎，作為分離中間產(chǎn)物的額外準(zhǔn)備步驟。實(shí)施例17:基于AVE衍生物的肽偶聯(lián)反應(yīng)的分析接著通過(guò)反相-高壓液相法(RP-HPLC)在購(gòu)自沃特世(Waters)的 Symmetry 300 150 x 4.6 mm、 5 |nm柱上分析才艮據(jù)實(shí)施例8-14的偶聯(lián)反應(yīng)。 0.1% (體積/體積)曱酸(洗脫劑A)和含0.1。/。甲酸的乙腈(洗脫劑B)作為洗脫 劑。用于洗脫的條件是用15分鐘以上的時(shí)間在柱溫為60。C以及流速為1 mL/min使用洗脫劑B從20%至50。/。的線性梯度進(jìn)行洗脫。在215 nm下 進(jìn)行檢測(cè)。 一般注射5 jtL的1:25稀釋的反應(yīng)樣品。在保留時(shí)間介于7至 10分鐘之間時(shí)檢測(cè)脫保護(hù)的AVE衍生物。
權(quán)利要求
1. 用于制備通式I的C-末端酰胺化的二元肽或多元肽的方法，所述通式I為(AA)n-Xm-NH2(I)，其中(AA)n是由n個(gè)相同或不同類型的氨基酸組成的肽，其中AA是氨基酸或其類似物或衍生物；n是3至2000之間的整數(shù)；并且X是堿性氨基酸或其類似物或衍生物；m是2至15之間的整數(shù)，其中通式II的化合物(AA)n-Xp(II)與通式III的化合物在具有胰蛋白酶生物學(xué)活性的酶的存在下反應(yīng)(X)q-NH2(III)其中AA、n和X被定義如上，以及p和q是整數(shù)，以及p+q＝m，并且在合適條件下，對(duì)產(chǎn)生的通式I的化合物進(jìn)行蛋白質(zhì)化學(xué)純化。
2. 如在權(quán)利要求l中所要求的方法，其中m是2至10之間的整數(shù)。
3. 如在權(quán)利要求2中所要求的方法，其中m是2至6之間的整數(shù)。
4. 如在權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所要求的方法，其中n是10至1000之間的整數(shù)。
5. 如在權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所要求的方法，其中n是15至500 之間的整數(shù)。
6. 如在權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所要求的方法，其中n是20至400 之間的整數(shù)。
7. 如在權(quán)利要求l-6中任意一項(xiàng)所要求的方法，其中a) 表達(dá)融合肽，其包含一個(gè)或多個(gè)通式II的化合物作為融合肽的部分；b) 通過(guò)化學(xué)的或酶的切割從所述融合肽釋放通式II的化合物；c) 從步驟b得到的中間產(chǎn)物，在適當(dāng)條件下經(jīng)蛋白質(zhì)化學(xué)純化后，在 具有胰蛋白酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)存在下，與通式III的化合物反應(yīng)；并 且d) 在適當(dāng)條件下，對(duì)產(chǎn)生的通式I的化合物進(jìn)行蛋白質(zhì)化學(xué)純化和分離。
8. 如在權(quán)利要求7中所要求的方法，其中通過(guò)氰卣化物、腸激酶、凝 血因子X(jué)a、 Genenase、凝血酶或胰蛋白酶從該融合蛋白中清除通式II的 化合物。
9. 如在權(quán)利要求7中所要求的方法，其中在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白， 所述表達(dá)系統(tǒng)選自包含大腸桿菌、肉糖葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿 菌、螢光假單胞菌、乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、啤酒裂殖酵母和 釀酒酵母的組。
10. 如在權(quán)利要求1-2的一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求中所要求的制備通式I 的C末端酰胺化的二元肽或多元肽的方法，其中所述通式I的肽具有 GLP-1或其衍生物或類似物的生物學(xué)活性。
11. 如在權(quán)利要求1-10的任一項(xiàng)所要求的方法，其中通式I的化合物 由通式IV表4正HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPS(X)m-NH2 (IV)。
12. 如在權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)所要求的方法，其中通式I的化合物 由以下序列表征HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH2 (SEQ ID No.l);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2(SEQ ID No. 2);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ ID No. 3);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2 (SEQ ID No. 4)或HGEGTFTSDL SK(JMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ ID No. 5)。
13. 通式I的化合物，其由以下序列表征HGEGTFTSDL SK(JMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ ID No. 2);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ ID No. 3);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKRNH2 (SEQ ID No. 4)或HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ ID No. 5)。
14. 在權(quán)利要求12中指定的化合物作為藥物，特別是緩釋制劑的用途。
15. 包含一種或多種通式I的化合物的藥物，所述化合物由以下序列 表征HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ ID No. 2);HGEGTFTSDL SK,EEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ ID No. 3);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2 (SEQ ID No. 4)或HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRKNH2 (SEQ ID No. 5)。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生C-末端酰胺化的二元肽或多元肽的方法，其由使兩個(gè)肽在具有胰蛋白酶生物學(xué)活性的酶的存在下反應(yīng)；和，如果需要，通過(guò)蛋白質(zhì)化學(xué)純化可由此獲得的通式(I)的化合物組成。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101268097SQ200680034026
公開(kāi)日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2006年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月27日
發(fā)明者C·薩拉尼亞德, F·措赫爾, L·蘭德里克-布爾泰因, P·哈伯曼, S·里佐姆 申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬(wàn)特德國(guó)有限公司