專利名稱：：使用變異型乙酰乳酸合成酶基因的轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用在野生型乙酰乳酸合成酶的規(guī)定位置上導(dǎo)入變異的變異型乙酰乳酸合成酶的轉(zhuǎn)化方法及植物培育方法。
背景技術(shù)：
：已知乙酰乳酸合成酶(以下稱為"ALS")是酪氨酸、纈氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸生物合成途徑中的控速酶，是植物生長所必須的酶。眾所周知ALS廣泛存在于高等植物整體中，也在各種微生物例如酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、大腸軒菌(Escherichiacoli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)等中發(fā)現(xiàn)了上述酶的存在。已知大腸桿菌及鼠傷寒沙門氏菌中存在3種ALS的同工酶。上述各種同工酶是由承擔(dān)酶的催化活性的分子量大的催化亞單位和通過與支鏈氨基酸結(jié)合發(fā)揮反饋抑制劑功能的分子量小的控制亞單位形成的雜j氐聚4勿(Chipmanetal.,Biochim.Biophys.Acta.1385,401—419,1998[非專利文獻1])。催化亞單位分別位于IlvIH、IlvGM、IlvBN操縱子。另一方面，酵母菌中，ALS雖然為單一的酶，但與細菌一樣，由催化亞單位和控制亞單位形成(Pangetal.,Biochemistry,38,5222-5231,1999[非專利文獻2]),催化蛋白質(zhì)亞單位位于ILV2位點。也已知植物中的ALS與上述微生物相同，由催化亞單位和控制亞單位形成(Hersheyetal.，PlantMolecularBiology.40，795-806，1999)[非專利文獻3])。例如，作為雙子葉植物的煙草中，ALS的催化亞單位被SuRA及SuRB2個基因位點編碼(Leeetal.，EMBOJ.7，1241-1248，1988[非專利文獻4])，為玉米時，ALS的催化亞單位被alsl及als22個基因4立點編石馬(Burretal.，TrendsinGenetics7，55—61,1991[非專利文獻5];Lawrenceetal.,PlantMol.Biol.18,1185—1187,1992[非專利文獻6])。關(guān)于編碼催化亞單位的基因，為雙子葉植物時，不僅煙草，擬南芥(Arabidopsis)、油菜、棉、蒼耳(Xanthium)、反枝莧(Amaranthus)以及地膚(kochia)等均已完全確定了石咸基序歹'J(參見Chipmanetal.,Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998[非專利文獻l]及國際公開公報WO97/08327[專利文獻1])。單子葉植物中，玉米或水稻也完全確定了堿基序列。已知磺酰脲類除草劑、咪唑啉酮類除草劑、三唑嘧啶類除草劑以及嘧咬基羧基類除草劑(pyrimidinylcarboxyherbicide)(以下，稱為"PC類除草劑"。)等除草劑通過抑制該ALS來控制植物的生長(Ray，PlantPhysiol.75,827—831,1984[非專利文獻7];Shaneretal.，PlantPhysiol.76，545-546,1984[非專利文獻8];Subramanianetal.,PlantPhysiol.96,310-313,1991[非專利文獻9];Shimizuetal.，J.Pestic.Sci.19,59-67,1994[非專利文獻10])。作為對上述除草劑具有抗性的植物，在編碼ALS的基因中具有引起不分種類而存在的保守區(qū)域中的1個或2個氨基酸置換的1個或2個堿基置換的植物是已知的。例如可以舉出，編碼對磺酰脲類除草劑具有強抗性的ALS的基因(參見Kathleenetal.,EMBOJ.7,1241-1248，1988〔非專利文獻11〕；Mouradetal.，Planta,188,491—497,1992[非專利文獻12];Guttierietal.,WeedSci.43,175-178,1995[非專利文獻13];Bernasconietal.,J.Biol.Chem.270,17381-17385,1995[非專利文獻14]及特開昭63-71184號/>才艮[專利文獻2]),編碼對咪唑啉酮類除草劑具有強抗性的ALS的基因(參見Mouradetal.,Planta,188,491-497,1992[非專利文獻12];Leeetal.,FEBSLett.452,341-345，1999[非專利文獻15]及特開平5-227964號公報[專利文獻3]),編碼對PC除草劑具有強抗性的ALS的基因(參見WO02/44385Al[專利文獻4]及W003/083118A1[專利文獻5])或編碼對^黃酰脲類除草劑、咪唑啉酮類除草劑、PC除草劑具有抗性的ALS的基因(參見Kathleenetal.，EMBOJ.7,1241-1248,1988[非專利文獻11];Bernasconietal.，J.Biol.Chem.270，17381-17385,1995[非專利文獻14];Hattorietal.,Mol.Gen.Genet.246，419-425,1995[非專利文獻16];Alisonetal.,PlantPhysiol.lll,1353，1996[非專利文獻17];Rajasekarauetal.,PlantSci.119,115-124,1996[非專利文獻18]、特開昭63-71184號公報[專利文獻2]、特開平4-311392號公報[專利文獻6]、Bernasconietal.，USPatent5633437,1997[專利文獻7]、WO02/44385Al[專利文獻4]及WO03/083118Al[專利文獻5])。另外，人們嘗試了使具有對磺酰脲類除草劑顯示特異抗性的ALS的個體與具有對咪唑啉酮類除草劑顯示特異抗性的ALS的個體雜交，制作對兩者顯示抗性的植物(Mouradetal.,Mol.Gen.Genet，243，178-184,1994[非專利文獻19])。并且，也人為地將編碼ALS的基因轉(zhuǎn)化為除草劑抗性基因(參見Ottetal.，J.Mol.Bio1.263,359-368,1996[非專利文獻20]、特開昭63-71184號7>凈艮[專利文獻2]、特開平5-227964號公報[專利文獻3]、特表平ll-504213號7>凈艮[專利文獻8])，明確了缺失l個氨基酸對磺酰脲類除草劑和咪唑啉酮類除草劑兩者均顯示抗性(參見特開平5-227964號公報[專利文獻3])。如上所述地潛心研究了對除草劑具有抗性的ALS及編碼ALS的基因，但至今尚無以PC類除草劑抗性為指標，僅對PC類除草劑具有特異的抗性的變異ALS基因的報告。如果能得到對特定的除草劑具有特異的抗性的變異ALS基因，則可以在各種用途中使用該變異ALS基因，但至今沒有關(guān)于在對PC類除草劑的特異性方面有用的變異ALS基因的報告。Chipmanetal.,Biochim.Biophys.Acta.1385,401非專利文獻l-419，1998非專利文獻2非專利文獻3806,1999非專利文獻4非專利文獻5非專利文獻6Pangetal.，Biochemistry,38，5222-5231,1999Hersheyetal.,PlantMolecularBiology.40，795-Leeetal.，EMBOJ.7,1241-1248,1988Burretal.,TrendsinGenetics7，55—61,1991Lawrenceetal.,PlantMol.Biol.18,1185—1187,1992非專利文獻7Ray,PlantPhysiol.75,827-831，1984非專利文獻8Shaneretal.，PlantPhysio1.76,545-546，1984Subramanianetal.,PlantPhysiol.96，310—313,非專利文獻91991非專利文獻IO非專利文獻ll非專利文獻12非專利文獻13非專利文獻1417385,1995非專利文獻15非專利文獻16非專利文獻17非專利文獻18非專利文獻191994非專利文獻20專利文獻l專利文獻2專利文獻3專利文獻4專利文獻5專利文獻6專利文獻7專利文獻8Shimizuetal.,J.Pestic.ScU9，59-67，1994Kathleenetal.，EMBOJ.7,1241-1248,1988Mouradetal.,Planta，188,491-497,1992Guttierietal.，WeedSci.43,175-178,1995Bernasconietal.，J.Biol.Chem,270,17381-Leeetal.，F(xiàn)EBSLett.452,341-345,1999Hattorietal.,Mol.Gen.Genet.246,419-425，1995Alisonetal.,PlantPhysiol.l11，1353，1996Rajasekarauetal.,PlantSci.l19,115-124,1996Mouradetal.,Mol.Gen.Genet，243,178-184,Ottetal.，J.Mol.Biol.263,359-368,1996國際公開公報W097/08327號特開昭63-71184號/>才艮特開平5-227964號公報國際公開公報W002/44385號國際公開公報W003/083118號特開平4-311392號公報Bernasconietal.，美國專利號USP5,633，437號特表平11-504213號公報
發(fā)明內(nèi)容鑒于上述實際情況，本發(fā)明的目的在于提供可以使用對PC類除草劑的特異性優(yōu)異的變異ALS基因，有效地選擇轉(zhuǎn)化細胞的方法。為了達到上述目的，本發(fā)明人進行了深入的研究，結(jié)果明確了具有特定變異的ALS對PC類除草劑顯示極高的抗性，并且發(fā)現(xiàn)可以使用編碼具有該變異的ALS的基因作為選擇標記物，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明包含以下內(nèi)容。(1)一種轉(zhuǎn)化方法，所述方法包括以下步驟使用含有目標基因和編碼變異型乙酰乳酸合成酶的基因的重組載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞的步驟，上述變異型乙酰乳酸合成酶是相當(dāng)于來自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸變異為丙氨酸的變異型乙酰乳酸合成酶；和在嘧啶基羧基類除草劑的存在下培養(yǎng)上述步驟中所得的轉(zhuǎn)化細胞的步驟，其特征在于，使用編碼上述變異型乙酰乳酸合成酶的基因作為選擇標記物。(2)如(1)所述的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，編碼上述變異型乙酰乳酸合成酶的基因為編碼以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因。(a)由序列號2中記載的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)。(b)由序列號2中記載的氨基酸序列的第95位的丙氨酸之外的至少l個以上氨基酸被置換、缺失或加成的氨基酸序列形成，且對嘧啶基羧基類除草劑具有抗性，具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。(3)如(1)所述的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，上述宿主細胞是植物細胞。(4)一種植物培育方法，所述方法包括以下步驟使用含有目標基因和編碼變異型乙酰乳酸合成酶的基因的重組載體，轉(zhuǎn)化植物細胞的步驟，上述變異型乙酰乳酸合成酶是相當(dāng)于來自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸變異為丙氨酸的變異型乙酰乳酸合成酶；和在嘧啶基羧基類除草劑的存在下培養(yǎng)上述步驟中所得的轉(zhuǎn)化植物的步驟，其特征在于，使用編碼上述變異型乙酰乳酸合成酶的基因作為選擇標記物。(5)如(4)所述的植物培育方法，其特征在于，編碼上述變異型乙酰乳酸合成酶的基因為編碼以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因。(a)由序列號2中記載的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)。(b)由序列號2中記載的氨基酸序列的第95位的丙氨酸之外的至少l個以上氨基酸被置換、缺失或加成的氨基酸序列形成，且對嘧啶基羧基類除草劑具有抗性，具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。本i兌明書包含作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申i青2005-136186號說明書及/或附圖中所記載的內(nèi)容。圖1表示比較來自水稻的變異型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列和來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列得到的結(jié)果。圖2-1表示比較來自水稻的變異型ALS基因的堿基序列和編碼來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)的基因的堿基序列得到的結(jié)果。圖2-2表示比較來自水稻的變異型ALS基因的堿基序列和編碼來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)的基因的堿基序列得到的結(jié)果。圖2-3表示比較來自水稻的變異型ALS基因的堿基序列和編碼來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)的基因的堿基序列得到的結(jié)果。圖3是表示觀察來自含有雙草醚鈉(bispyribac-sodium)的生根培養(yǎng)基中的G95A-1系統(tǒng)及G95A-2系統(tǒng)的克隆個體中的生根情況得到的結(jié)果的照片。圖4是說明G95A變異型ALS表達載體的制作方法的模式圖。圖5是表示以對野生型ALS的抑制達到50%的濃度為基準的G95A變異型ALS的藥物抗性比(RS比)的特性圖。具體實施方式下面詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶蛋白質(zhì)(以下稱為"變異型ALS蛋白質(zhì)")可以通過使野生型ALS蛋白質(zhì)中的規(guī)定部位變異而得到。在來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)中，從N末端的曱硫氨酸開始數(shù)的第95位氨基酸是甘氨酸。本發(fā)明的變異型ALS蛋白質(zhì)中，該第95位甘氨酸被置換為丙氨酸。即，來自水稻的本發(fā)明的變異型ALS蛋白質(zhì)具有第95位甘氨酸被置換為丙氨酸(標記為G95A)的氨基酸序列。編碼來自水稻的變異型ALS蛋白質(zhì)的基因(以下稱為"變異型ALS基因")的堿基序列及變異型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別示于序列號1及序列號2。圖1表示比較來自水稻的變異型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列和來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列的結(jié)果。需要說明的是，圖1中，第1列氨基酸序列表示變異型ALS蛋白質(zhì)，第2列氨基酸序列表示野生型ALS蛋白質(zhì)。來自水稻的變異型ALS基因(序列號1)與編碼來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)的基因相比較，編碼野生型ALS蛋白質(zhì)中的第95位的甘氨酸的密碼子被置換為編碼丙氨酸的密碼子。圖2-1~圖2-3表示比較來自水稻的變異型ALS基因的堿基序列和編碼來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)的基因的堿基序列得到的結(jié)果。需要說明的是，圖2-1~圖2-3中，第一列堿基序列表示變異型ALS基因，第二列堿基序列表示編碼野生型ALS蛋白質(zhì)的基因。該變異型ALS基因可以通過在編碼存在于日本型水稻品種臺中65號的基因組DNA中的野生型ALS蛋白質(zhì)的基因中導(dǎo)入上述變異而得到。作為導(dǎo)入變異的方法，可以使用現(xiàn)有的公知方法，例如可以使用部位特異性變異導(dǎo)入法。部位特異性變異導(dǎo)入法可以使用市售的試劑盒、例如Mutan-K(寶酒造抹式會社制)、GeneEditor(普洛麥格(Promega)#土制)、ExSite(stratagene牙土制)等力口以實施。需要i兌明的是，編碼變異ALS蛋白質(zhì)的基因可以由變異抹培養(yǎng)細胞中得到，所述變異抹培養(yǎng)細胞是在PC類除草劑存在下培養(yǎng)PC類除草劑敏感性的野生抹培養(yǎng)細胞后表現(xiàn)出對PC類除草劑的抗性的細胞。本發(fā)明的變異型ALS基因不限定于序列號1所示的來自水稻的基因，可以廣泛從來自植物的ALS基因中得到。例如，可以通過在來自玉米、小麥、大麥、大豆、棉、油菜、糖蘿卜、黑麥草(Loliummultiflorum)、煙草及擬南芥(ThaleCress)等的ALS基因中導(dǎo)入相同的變異，得到本發(fā)明的變異型ALS基因。此處，所謂相同的變異是指將相當(dāng)于來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)的第95位甘氨酸(因植物的不同，有時不是第95位)的甘氨酸變異為丙氨酸的變異。來自玉米的2種變異型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別示于序列號3和4。來自小麥的2種變異型ALS蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列分別示于序列號5和6。來自棉的2種變異型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別示于序列號7和8。來自油菜的2種變異型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別示于序列號9和10。來自煙草的2種變異型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別示于序列號11和12。來自黑麥草的變異型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號13。來自擬南芥的變異型ALS蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列號14。變異型ALS蛋白質(zhì)無論來自何種植物，只要相當(dāng)于來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)的第95位甘氨酸的甘氨酸被置換為丙氨酸，就對PC類除草劑特異性地顯示抗性。變異型ALS蛋白質(zhì)與野生型ALS蛋白質(zhì)相比較，對PC類除草劑具有優(yōu)異的抗性。其可以通過將編碼變異型ALS蛋白質(zhì)的基因組合入大腸桿菌等的表達載體，確定由被該表達載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌得到的變異型ALS的除草劑敏感性來判斷。此處，作為PC類除草劑，如化學(xué)式l所示，可以舉出雙草醚鈉、嘧硫草醚鈉(pyrithiobac_sodium)、嘧草醚(pyriminobac)?；瘜W(xué)式1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>作為咪唑啉酮類除草劑，如化學(xué)式3所示，可以舉出咪唑奮啉酸(imazaquin)、咪口坐煙酸(imazapyr)?；瘜W(xué)式3嘧硫草醚鈉嘧草醚對PC類除草劑特異性地顯示抗性是指對除PC類除草劑之外的磺酰脲類除草劑、咪唑啉酮類除草劑的抗性顯著低于對PC類除草劑的抗性。需要說明的是，作為磺酰脲類除草劑，如化學(xué)式2所示，可以舉出氯磺隆(chlorsulfuron)、千嘧石黃隆(bensulfuron一methyl)、p比口密石黃隆(pyrazosulfuron-ethyl)、口坐p比口密石黃隆(imazosulfuron)?；瘜W(xué)式2咪峻P套啉酸咪峻煙酸本發(fā)明中，可以構(gòu)筑通過利用變異型ALS基因，能有效地轉(zhuǎn)化目標基因的轉(zhuǎn)化方法。即，變異型ALS基因可以用作植物轉(zhuǎn)化試驗中的選擇性標記物。例如，使用目標基因轉(zhuǎn)化植物細胞時，將具有變異型ALS基因與目標基因的重組載體導(dǎo)入植物細胞內(nèi)后，在PC類除草劑的存在下培養(yǎng)該植物細胞。結(jié)果判定目標基因與變異型ALS基因一起導(dǎo)入在PC類除草劑的存在下生存的植物細胞中。另外，目標基因以及編碼變異型ALS蛋白質(zhì)的基因是否被導(dǎo)入植物細胞的染色體中可以在觀察該植物的表現(xiàn)型后，通過基因組雜交(genomicsouthernhybridization)或PCR調(diào)查上述基因是否存在于基因組上而確認。作為轉(zhuǎn)化才直物的方法，可以4吏用現(xiàn)有的/>知方法。例如，可以舉出<吏用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)將外來基因?qū)肽繕瞬胖蔽锛氃掳姆椒?。具體而言，在含有根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA序列的雙載體中插入變異型ALS基因以及目標基因。將該Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌等中。然后，將在大腸桿菌等中增殖的保持變異型ALS基因以及目標基因的雙載體轉(zhuǎn)化至含有輔助質(zhì)粒(helperplasmid)的根癌農(nóng)桿菌中。接下來，使該根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染作為目標的植物后，鑒定轉(zhuǎn)化植物。被鑒定的轉(zhuǎn)化植物為培養(yǎng)細胞時，可以通過現(xiàn)有的公知方法使該植物細胞再生為完整的植物。另外，將具有變異型ALS基因以及目標基因的重組載體轉(zhuǎn)化至目標植物時，可以使用現(xiàn)有的公知方法直接導(dǎo)入植物體中。并且，作為轉(zhuǎn)化具有變異型ALS基因以及目標基因的重組載體的方法，可以使用聚乙二醇法、電穿孑L(ElectroPoration)法、基因槍(particlegun)法等。另一方面，變異型ALS基因以及目標基因可以轉(zhuǎn)化到單子葉植物和雙子葉植物等所有種類的植物中。作為轉(zhuǎn)化編碼變異型ALS蛋白質(zhì)的基因的對象作物，例如可以舉出水稻、玉米、小麥、大麥、大豆、棉、油菜、黑麥草以及煙草等。并且，通過導(dǎo)入變異型基因和目標基因，可以轉(zhuǎn)化草坪草或樹木等。任一情況下，都可以通過將變異型ALS基因轉(zhuǎn)化到植物中而賦予該植物對PC類除草劑的特異抗性。特別是由于PC類除草劑與磺酰脲類除草劑或咪唑啉酮類除草劑不同，為水溶性，故容易處理，可以排除有機溶劑對宿主細胞的影響，所以，優(yōu)選用作轉(zhuǎn)化中的藥物。另外，PC類除草劑顯示比咪唑啉酮類除草劑強約1OO倍的ALS抑制活性，故用微量的PC除草劑即可篩選轉(zhuǎn)化體。下面，使用實施例更加詳細地說明本發(fā)明。但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限定于下述實施例。誘導(dǎo)來自花藥培養(yǎng)的愈傷組織(callus)在水稻品種"臺中65號"孕穗期，選取能夠最多地獲得單核期花藥的葉耳間距68cm的幼穗。此時，莖在旗葉前的葉的節(jié)下進行在水中剪枝，將直接包裹幼穗的旗葉和旗葉前的葉的2片葉子以外的葉子除去。用含水的紙巾包裹莖的基部，用聚乙烯袋纟皮覆，在黑暗中'1(TC下進行510天的低溫處理。然后，用干凈的4t子取出幼穗，用70%乙醇滅菌10分鐘，在滅菌后的紙巾(Crecia,東京)上吸干水分。用滅菌后的鑷子打開含有單核期的花藥的半透明的穎花，僅取出花藥，放置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6CI培養(yǎng)基，表l)中。將其在持續(xù)明亮的環(huán)境中'30。C下進行培養(yǎng)，每隔三周在新的培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng)。表l.愈傷組織i秀導(dǎo)培養(yǎng)基(N6CI)pH5.8_N6無機鹽N6維生素蔗糖30g/l2.4-D2mg/1L(-)-脯氨酸2'878g/1脫乙酰吉蘭糖膠(gelrite)3g/1酪蛋白氨基酸(Casaminoacids)0.3g/l用雙草醚鈉篩選花藥培養(yǎng)愈傷組織將愈傷組織誘導(dǎo)后第5周的來自花藥培養(yǎng)的愈傷組織在含有0.25jiM雙草醚鈉的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周。然后，將增殖的愈傷組織用含有0.5^iM雙草醚鈉的再分化培養(yǎng)基(表2)培養(yǎng)4周，得到白化的再分化植物。傳代培養(yǎng)均隔2周進行。表2-再分化培養(yǎng)基(pH5.8)1吏總量為1升，；改入高壓釜中，加入雙草醚鈉[實施例3]雙草醚鈉抗性鑒定以上述方法篩選的個體的2個系統(tǒng)為G95A-1系統(tǒng)和G95A-2系統(tǒng)，由于為白化個體，故用MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，分林進行增殖。為了鑒定雙草醚鈉抗性的程度，將從G95A-l系統(tǒng)中分出的克隆個體移植在含有O、1、5、10、20jiM的雙草醚鈉的生根培養(yǎng)基(表3)中(圖3A:培養(yǎng)皿的左側(cè)，由于白化而呈白色)。克隆個體少的G95A-2系統(tǒng)僅用5pM進行鑒定。作為對照區(qū)，使用播種后第2周的野生型臺中65號(圖3各培養(yǎng)皿右側(cè))，觀察移植后第l周(圖3B)、第2周(圖3C)的植物體。結(jié)果為G95A-1及G95A-2兩個系統(tǒng)均在所有濃度的雙草醚鈉的培養(yǎng)基中可見新的生根，顯示了抗性，對照區(qū)的野生型在含有雙草醚鈉的培養(yǎng)基中均枯死。MS無才幾鹽N6維生素蔗糖30山梨醇502.4-D2itNAAlnBAP2n酪蛋白氨基酸2g/1L(-)-脯氨酸2.878g/l脫乙酰吉蘭糖膠4g/lwU>^3)表3-生根鑒定培養(yǎng)基(pH5.8)_MS無才幾鹽N6維生素蔗糖30g/l瓊脂_^_使總量為l升，；故入高壓釜中，加入雙草醚鈉雙草醚鈉抗性的白化系統(tǒng)的ALS基因序列解析將上述2個系統(tǒng)的葉(約0.5xlcm)放入1.5ml管中，在50。C下使其干燥2小時以上。在管內(nèi)放入4粒直徑為3mm的玻璃珠BZ-3(井內(nèi)盛榮堂)，用混合機MM300(Retsch)粉碎葉后，加入300pl的提取緩沖液(200mMTris—HC1(pH7.5)、250mMNaCl、25mMEDTA、0.5%SDS),混懸。將該混懸液以14,000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將200fil上清液轉(zhuǎn)移至新管中，加入200(il異丙醇。將其以14，000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，除去上清液，將所得的沉淀真空干燥3分鐘。在該沉淀中加入50(il的l/5xTE后，再以14,000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，以其為基因組DNA溶液。以制得的基因組DNA為模板，使用以下所示的引物，通過PCR-定向測序(directsequencing)解析ALS基因的整個區(qū)域的序列。PCR中，使用ExTaq(寶日醫(yī)生物技術(shù)(takara-bio)林式會社)。反應(yīng)在9^C下初期變性l分鐘后，將94。C30秒、58。C30秒、72。C40秒的循環(huán)進行40次。組合ALSF2和ALS2R的引物時，加入PCRx增強子(英杰(invitrogen)社)，在94。C下初期變性1分鐘后，將94。C1分鐘、5(TC1分鐘、72。Cl分鐘的循環(huán)進行40次。對各個PCR產(chǎn)物實施瓊脂糖凝膠電泳，使用MiniEluteGelExtractionkit(QIAGEN社)進行精制。以該PCR產(chǎn)物為才莫壽反，<吏用ABISequencingkit,由下述引物進4亍測序反應(yīng)。使用ALSF2、ALS2R的引物時，加入測序Rx增強子溶液A(英杰社)。測序反應(yīng)條件為將96。C10秒、50。C5秒、60。C4分鐘的循環(huán)進行35次。測序反應(yīng)后，用ABIPRISM310GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,U.S.A.)確定石成基序列。ALSF2(5，-CCACCACCCACCATGGCTACG-3，，正義引物，與ALS基因的第-12-9位對應(yīng)；序列號15)ALS2R(5，-GAAGAGGTGGTTGGTGATGA-3，，反義引物，與ALS基因的第326-345位對應(yīng)；序列號16)ALS12(5,-GCAACCAACCTCGTGTCCGC—3,正義引物，與ALS基因的第436-455位相對應(yīng)；序列號17)ALS22(5，—GAAGGCTTCCTGTATGACGC-3，，反義引物，與ALS基因的第620-639位相對應(yīng)；序列號18)ALS13(5，-GAATTGCGCTGGTTTGTTGA-3,，正義引物，與ALS基因的第868-887位相對應(yīng)；序列號19)ALS23(5，_CTCAATTTTCCCTGTCACACG-3，，反義引物，與ALS基因的第1051—1071位相對應(yīng);序列號20)ALS24F(5，-GGTAGCTTCCTCATGAACAT-3',正義引物，與ALS基因的第1537-1556位相對應(yīng)；序列號21)ALS24R(5，-AATGTTCATGAGGAAGCTAC_3，，反義引物，與ALS基因的第1538-1557位相對應(yīng)；序列號22)ALS25(5，—CATTCAGGTCAAACATAGGCC—3，，反義引物，與ALS基因的第1919-1989位相對應(yīng)；序列號23)由此確定上述2系統(tǒng)的ALS基因序列，結(jié)果兩者的ALS的第95位氨基酸均通過l個堿基置換從甘氨酸(GGC)置換為丙氨酸(GCC)。制作表達GST融合G95A變異型ALS的載體導(dǎo)入pUC18載體中的來自水稻的W548L/S62712點變異型ALS(參見WO02/44385A1)為模板，將用縮聚了第95位的甘氨酸部分的密碼子得到的正義引物ALS_M5(5，-TACCCGGGCNNNGCGTCCATGGAGATCCA-3，與氨基酸序列中的第92-IOI位相對應(yīng)；序列號24)和與第191-196位氨基酸序列對應(yīng)的反義引物ALS-RspA(5，-TGTGCTTGGTGATGGA-3，；序列號25)擴增的PCR生成物克隆至pT7Blue-T載體，用該載體通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(HB-101林)。由相同的引物組合進行菌落PCR，進行序列解析，得到第95位的甘氨酸(GGC)部分變異為絲氨酸(AGC)、半胱氨酸(TGC)、酪氨酸(TAT)、丙氨酸(GCA)、纈氨酸(GTG)、亮氨酸(CTG)、異亮氨酸(ATA)、甲硫氨酸(ATG)、色氨酸(TGG)、苯丙氨酸(TTT)、天冬氨酸(GAT)、谷氨酸(GAG)、精氨酸(CGG)的菌落。對于丙氨酸變異體，液體培養(yǎng)大腸桿菌后，提取質(zhì)粒，用SmaI切斷。電泳后，由瓊脂糖凝膠精制變異型ALS基因片段，用SmaI消化后，進行BAP處理將其精制，將得到的來自水稻的W548L/S62712點變異型ALS基因連接到pUC18載體上。由得到的帶有G95A/W548L/S627I3點變異型ALS基因的pUC18載體上切下含有G95A部分的NcoI片革殳，Ncol處理后，與BAP處理后的導(dǎo)入了野生型ALS基因的大腸桿菌蛋白質(zhì)表達載體(pGEX-2T)進行連接，得到具有G95Al點變異型ALS基因的pGEX-2T表達載體(圖4)。確認導(dǎo)入了G95A變異型ALS基因的pGEX-2T載體的堿基序列將由該載體轉(zhuǎn)化得到的大腸桿菌(JM109林)在2mP10根中37。C下培養(yǎng)12小時，用質(zhì)粒^是取裝置(TOMYDP-480)提取(500^1)質(zhì)粒后，通過離心濃縮，濃縮至200^il左右。用GFXPCR和GelPurificationkit(AmershamBioscience)進行脫鹽，最終用200^il滅菌水洗脫。使用BigDyeTerminatorver,l.lcyclesequencingkit(AppliedBiosystems)，對該質(zhì)粒進行測序反應(yīng)。[總?cè)萘?0ial(模板DNA13pl、質(zhì)粒(3.2pmol/pl)l(il、pre-mix4|il、稀釋緩沖液2pl),反應(yīng)條件初期變性96°C(5分鐘)、將變性96。C(5秒)-退火50。C(5秒)-延伸60。C(4分鐘)的循環(huán)進行40次，最終循環(huán)的延伸為60。C(9分鐘)]測序反應(yīng)后，<吏用AutoSeqG-50column(AmershamBioscience)，用凝膠過濾除去反應(yīng)液中的熒光堿基。將反應(yīng)樣品用ABIPRIZM310geneticanalyser進行測定，確il序列。作為測序用的引物，^吏用以下序列的引物。PGEX-5(5，-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3，，正義引物，ALS基因的上游；序列號26)ALS-RspC(5，-CAGCGACGTGTTCGCCTA-3，，正義引物，與ALS基因的第258-275位對應(yīng)；序列號27)ALS-Ml(5，-CCCCAGCCGCATGATCGGCACCGACGCCTT-3，，正義引物，與ALS基因的第510-539位對應(yīng)；序列號28)ALS-Rsp3(5，-CTGGGACACCTCGATGAAT—3，，正義引物，與ALS基因的第720-738位對應(yīng)；序列號29)ALS-RSp7(5'-AACTGGGATACCAGTCAGCTC-3，，反義引物，與ALS基因的第886-906位對應(yīng)；序列號30)ALS-Rspl(5，-GCTCTGCTACAACAGAGCACA-3',正義引物，與ALS基因的第1192-1212位對應(yīng)；序列號31)3-1—3(5，-GATTGCCTCACCTTTCG—3，，反義引物，與ALS基因的第1346-1362位對應(yīng)；序列號32)4—83—10(5'-CAGCCCAAATCCCATTG-3',反義引物，與ALS基因的第1457-1473位對應(yīng)；序列號33)3-1-4(5，-AGGTGTCACAGTTGTTG-3',正義引物，與ALS基因的第1506-1522位對應(yīng)；序列號34)ALS-RspB(5'-TCAAGGACATGATCCTGGATGG-3',正義引物，與ALS基因的第1892-1913位對應(yīng)；序列號35)ALS-Rsp2(5，—AGTCCTGCCATCACCATCCAG—3，，反義引物，與ALS基因的第1卯6-1926位對應(yīng)；序列號36)pGEX—3(5，一CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG—3，，反義引物，ALS基因的下游；序列號37)G95A變異型ALS的表達與ALS的配制比ffl#A,1/;A1佴AAII^mn《a沐S—刑-2T以及具有野生型ALS基因的pGEX-2T(參見WO02/44385Al)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在27。C下分別在含有2ml氨卡西林的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(前培養(yǎng))。使用lml該前培養(yǎng)液，在含有250ml氨節(jié)西林的LB液體培養(yǎng)基中分別進行主培養(yǎng)。培養(yǎng)一夜后，加入lmMIPTG,進一步培養(yǎng)3小時4小時，由此進行GSP融合蛋白質(zhì)的表達誘導(dǎo)。需要說明的是，菌體用ALS提取緩沖液(含有30%甘油和0.5mMMgCl2的磷酸鉀緩沖液pH7.5)洗滌后在-80。C下保存。按照下述方法由大腸桿菌配制和精制ALS。首先，將預(yù)先保存在-80°〇的大腸桿菌的顆?；鞈以诎?^提取緩沖液中(相對于由50ml培養(yǎng)液中得到的顆粒，添加2.5mlALS提取緩沖液)。對該混懸液進行超聲波處理(HeatSystems-Ultrasonics社制，SonicatorW-225R,微型芯片，輸出控制8，間隔約l秒，40秒2次)后，在4。C、15000xg下離心20分鐘，以該上清液作為粗酶溶液。由此，配制GST融合G95A變異型ALS蛋白質(zhì)以及GST融合野生型ALS蛋白質(zhì)的粗酶溶液。測定表達ALS的活性用于活性測定反應(yīng)的反應(yīng)溶液是在由20mM的丙酮酸鈉、0.5mM的硫胺素焦磷酸、0.5mMMgCl2、10nM黃素腺嘌呤二核苷酸、10mM纈氨酸(為了抑制來自大腸桿菌的ALS活性而添加)以及20mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)形成的溶液中，混合作為活性測定對象的GST融合ALS得到的溶液。使用0.5ml該反應(yīng)溶液。測定反應(yīng)在添加作為測定對象的GST融合ALS后，在37。C下進行30分鐘。另外，測定反應(yīng)通過添加0.05ml6N硫酸使其停止。然后，將反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)溶液在37。C下培養(yǎng)60分鐘。由此，使反應(yīng)溶液中所含的乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酮。接下來，為了定量反應(yīng)溶液中所含的3-羥基丁酮，添加0.05ml0.5%(w/v)的肌酸和0.05ml溶解在2.5N氬氧化鈉中的5。/。(w/v)的a-萘酚，在37。C下培養(yǎng)10分鐘。然后，通過比色反應(yīng)溶液在525nm下的吸光度，對3-羥基丁酮進行定量，評價ALS活性。需要說明的是，以反應(yīng)O小時作為對照區(qū)。測定藥物的抑制活性時，將雙草醚鈉和嘧硫草醚鈉制成100倍濃度的水溶液，添加至反應(yīng)液中。水溶性低的嘧草醚、氯-黃隆、節(jié)嘧磺隆、咪唑會啉酸以及咪唑煙酸制成100倍濃度的丙酮溶液，添加至反應(yīng)液中。G95A變異型ALS的藥物感受性果為雙草醚鈉、嘧碌^草醚鈉以及嘧草醚的抑制活性極弱(以100pM實現(xiàn)50%以下的抑制活性)，氯磺隆的抑制活性強，另外，千嘧磺隆、。米唑卩奎啉酸以及口米唑煙酸也顯示抑制活性(表4)。表4G95A變異型ALS的藥物感受性BSPSPMCSBMIQIP第l次17.9%12.1%22.9%0.00230.2681.65346.041第2次16.8%12.8%23.3%0.00300.2941.88644.612第3次18.4%18.1%29.2%0.00270.2711.84849.705第4次-一—0.0028一一—第5次———0.0021一——第6次-——0.0019一——平均17.7%14.3%25.1%0.00250.2781.8046.8SE0.47%1.9%2.0%0.00020.0080.071.52BS:雙草醚鈉；PS:嘧」琉草醚鈉，PM:嘧草醚CS:氯磺??；BM:節(jié)嘧磺隆IQ:咪哇奮啉酸；IP:咪唑煙酸需要說明的是，表4中沒有單位的數(shù)值均為抑制50%的濃度，單位為pM，單位為。/。的數(shù)值表示在100[iM時的抑制百分比。SE為標準誤差。比較各藥物將G95A變異型ALS抑制50%的濃度與將野生型ALS(GST融合野生型ALS)抑制50%的濃度，算出以將野生型ALS抑制50。/o的濃度為基準的G95A變異型ALS的藥物抗性比(RS比)，雙草醚鈉、嘧硫草醚鈉以及嘧草醚的RS比分別為16,000倍以上、9，1OO倍以上、13,000倍以上，但氯石黃隆、節(jié)嘧磺隆、咪唑會啉酸以及咪唑煙酸的RS比為0.19、40、0.82、4.9,G95A變異型ALS對PC除草劑特異性地顯示強抗性(表5及圖5)。需要說明的是，圖5中，BS為雙草醚鈉，PS為嘧硫草醚鈉，PM為嘧草醚，CS為氯磺隆，BM為卡嘧磺隆，IQ為咪唑p奎p林酸，IP為。米唑煙酸。表5G95A變異型ALS的藥物抗性比<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>[總結(jié)]由以上的實施例可知，在來自水稻的野生型ALS蛋白質(zhì)中導(dǎo)入了G95A變異的變異型ALS蛋白質(zhì)對嘧啶基羧基類除草劑特異性地顯示抗性。通過利用上述顯示優(yōu)異的特異性的變異型ALS蛋白質(zhì)的特性，能確實有效地在PC類除草劑的存在下篩選表達變異型ALS蛋白質(zhì)的細胞和不表達的細胞。需要說明的是，上述實施例中，使用來自水稻的ALS基因，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限定于使用來自水稻的變異型ALS基因的轉(zhuǎn)化方法。通常，已知ALS基因在不同的植物間顯示高同源性。另外，ALS基因中的特定變異對多種植物賦予相同的影響。由此，通過本實施例可知，例如來自玉米、小麥、大麥、大豆、棉、油菜、黑麥草以及煙草的具有與G95A變異相同的變異的變異型ALS蛋白質(zhì)也同樣對嘧咬基，1基類除草劑特異性地顯示抗性。產(chǎn)業(yè)上的可利用性如以上詳細說明所述，根據(jù)本發(fā)明，利用對PC類除草劑顯示極高的抗性的變異型乙酰乳酸合成酶作為選擇標記物，可以提供高效的轉(zhuǎn)化方法o本說明書中引用的所有刊物、專利和專利申請直接作為參考引入本說明書中。權(quán)利要求1、一種轉(zhuǎn)化方法，所述方法包括以下步驟使用含有目標基因和編碼變異型乙酰乳酸合成酶的基因的重組載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞的步驟，所述變異型乙酰乳酸合成酶是相當(dāng)于來自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸變異為丙氨酸的變異型乙酰乳酸合成酶；和在嘧啶基羧基類除草劑的存在下培養(yǎng)上述步驟中所得的轉(zhuǎn)化細胞的步驟，其特征在于，使用編碼所述變異型乙酰乳酸合成酶的基因作為選擇標記物。2、如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，編碼所述變異型乙酰乳酸合成酶的基因為編碼以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因，(a)由序列號2中記載的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)；(b)由序列號2中記載的氨基酸序列的第95位的丙氨酸之外的至少l個以上氨基酸被置換、缺失或加成的氨基酸序列形成，且對嘧啶基羧基類除草劑具有抗性，具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。3、如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述宿主細胞是植物細胞。4、一種植物培育方法，所述方法包括以下步驟使用含有目標基因和編碼變異型乙酰乳酸合成酶的基因的重組載體，轉(zhuǎn)化植物細胞的步驟，所述變異型乙酰乳酸合成酶是相當(dāng)于來自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸變異為丙氨酸的變異型乙酰乳酸合成酶；和在嘧啶基羧基類除草劑的存在下培養(yǎng)上述步驟中所得的轉(zhuǎn)化植物的步驟，其特征在于，使用編碼所述變異型乙酰乳酸合成酶的基因作為選擇標記物。5、如權(quán)利要求4所述的植物培育方法，其特征在于，編碼所述變異型乙酰乳酸合成酶的基因為編碼以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因，(a)由序列號2中記載的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)；(b)由序列號2中記載的氨基酸序列的第95位的丙氨酸之外的至少l個以上氨基酸被置換、缺失或加成的氨基酸序列形成，且對嘧啶基羧基類除草劑具有抗性，具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。全文摘要使用對PC類除草劑的特異性優(yōu)異的變異ALS基因，有效地選擇轉(zhuǎn)化細胞。包括以下步驟，即使用含有目標基因和編碼相當(dāng)于來自水稻的野生型乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列中的第95位的甘氨酸變異為丙氨酸的變異型乙酰乳酸合成酶的基因的重組載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞的步驟；和在嘧啶基羧基類除草劑的存在下培養(yǎng)上述步驟中所得的轉(zhuǎn)化細胞的步驟，使用編碼所述變異型乙酰乳酸合成酶的基因作為選擇標記物。文檔編號C12N5/10GK101175849SQ20068001603公開日2008年5月7日申請日期2006年5月9日優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日發(fā)明者奧崎文子,河合清,清水力,角康一郎,鳥山欽哉申請人:組合化學(xué)工業(yè)株式會社;國立大學(xué)法人東北大學(xué)