專利名稱：：用于獲得無(wú)毒利什曼原蟲前鞭毛體的方法、獲得的前鞭毛體及其應(yīng)用的制作方法用于獲得無(wú)毒利什曼原蟲前鞭毛體的方法、獲得的前鞭毛體及其應(yīng)用本發(fā)明涉及用于獲得無(wú)毒利什曼原蟲前鞭毛體的方法。它還涉及獲得的前鞭毛體及其用途，特別是在免疫預(yù)防中的用途。利什曼病構(gòu)成全世界分布的地方性寄生蟲感染，其代表影響發(fā)展中國(guó)家以及例如南歐的那些國(guó)家的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題，在那里它們被視為免疫低下個(gè)體中的機(jī)會(huì)性疾病。目前不存在針對(duì)利什曼病，更具體而言針對(duì)對(duì)此負(fù)責(zé)的傳染劑即利什曼原蟲的有效的免疫預(yù)防或免疫治療方法。利什曼原蟲是屬于錐蟲科(7y;77a/2"o則〃c^e)和利什曼原蟲屬(Ze/s力則/7/a)的有鞭毛的原生動(dòng)物。這個(gè)科包括可以感染人和某些動(dòng)物例如嚙齒類動(dòng)物、犬科動(dòng)物或哺乳動(dòng)物的寄生蟲。利什曼原蟲屬原生動(dòng)物的生物周期在白蛉(小型食血為生的雙翅目昆蟲)這一無(wú)脊推動(dòng)物媒介宿主和許多脊推動(dòng)物(包括人)之間共有。利什曼原蟲具有異主寄生的寄生發(fā)育周期，在這個(gè)過(guò)程中2個(gè)不同的形態(tài)學(xué)階段互相跟隨。在白蛉中，該寄生蟲以可移動(dòng)的、細(xì)胞外的、有鞭毛的形式存在于昆蟲消化管內(nèi)，稱為前鞭毛體階段。在無(wú)脊推動(dòng)物宿主中，該寄生蟲轉(zhuǎn)化為直徑2-6pm的不移動(dòng)的卵圓形，具有非常短的鞭毛殘余，稱為無(wú)鞭毛體，其將居住于在網(wǎng)狀組織細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞內(nèi)的寄生泡之中。雌性食血為生的媒介昆蟲經(jīng)由污染的脊推動(dòng)物宿主的血液通過(guò)攝取被寄生的巨噬細(xì)胞而被感染。大多數(shù)被攝入的無(wú)鞭毛體隨后在接下來(lái)的數(shù)小時(shí)內(nèi)被消滅。存活者轉(zhuǎn)化為前鞭毛體，其將定居在中部腸，在那里它們活躍地繁殖。它們隨后向著消化道的前面和口腔部分遷移，并隨后經(jīng)歷分化從而導(dǎo)致形成發(fā)育后期的前鞭毛體，其對(duì)于脊推動(dòng)物宿主是非常有傳染性的。當(dāng)脊推動(dòng)物宿主被受感染的雌性白蛉叮咬時(shí)，它被發(fā)育后期的前鞭毛體污染。這些前鞭毛體形式與唾液一起注入到真皮內(nèi)，隨后將被網(wǎng)狀組織系統(tǒng)的細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞吞噬，在其內(nèi)它們分化為不移動(dòng)的、細(xì)胞內(nèi)的無(wú)鞭毛體形式。它們隨后在寄生泡(吞嗟溶酶體)內(nèi)通過(guò)裂殖而活躍地繁殖，直至引起宿主細(xì)胞裂解，從而允許被釋放的無(wú)鞭毛體通過(guò)定居在其他健康的巨噬細(xì)胞中而傳播感染。被白蛉再次叮咬將導(dǎo)致白蛉的感染，并且將允許寄生蟲將其循環(huán)永久持續(xù)下去。盡管在這個(gè)領(lǐng)域中存在進(jìn)展，但由于涉及的個(gè)體數(shù)目、該疾病所覆蓋的地理區(qū)的范圍、以及觀察到的臨床現(xiàn)象的多樣性和嚴(yán)重度，迄今利什曼病仍是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，可以看出需要針對(duì)利什曼病的有效疫苗和用于治療這些寄生蟲疾病的新型治療和/或疫苗靶。在感染過(guò)程中，注入到哺乳動(dòng)物宿主中的有傳染性的前鞭毛體形式必須逃避宿主的免疫應(yīng)答以便能夠隨后侵入巨噬細(xì)胞。該寄生蟲因此必須釆用允許它逃避這種免疫應(yīng)答并且能夠適應(yīng)新環(huán)境的機(jī)制。因此，在侵入過(guò)程中宿主生物體對(duì)寄生蟲的早期識(shí)別可能是對(duì)于感染具有抵抗力的關(guān)鍵步驟。表面抗原，脂磷酸聚糖(LPG)和gp63(金屬蛋白酶)，也稱為leishmanolysine，在20世紀(jì)8Q年代被發(fā)現(xiàn)。LPG是前鞭毛體形式的主要的表面分子，其作為毒力因子的作用已4皮證實(shí)。gp63是主要的表面蛋白酶，也被視為毒力因子。第三種類型的抗原，稱為"前鞭毛體表面抗原"(PSA)，在1988-1989年被發(fā)現(xiàn)。它們構(gòu)成前鞭毛體形式的主要表面抗原。已在許多寄生微生物(線蟲、原生動(dòng)物...)中非常廣泛地研究的排泄/分泌抗原(antigenesd'excr"ion-s厶cr6tion)(ESA)，在這些寄生蟲的感染和防御機(jī)制中起著重要作用，因?yàn)樗鼈兙哂羞h(yuǎn)距離發(fā)揮作用的可能性。在利什曼原蟲中，研究工作長(zhǎng)時(shí)間受到難以以足夠研究它們的量擁有ESA的限制。所有這些抗原看起來(lái)在前鞭毛體形式的存活和傳染性中起決定作用。本發(fā)明人在這個(gè)領(lǐng)域中的先前工作已導(dǎo)致制備出了沒(méi)有大分子且不含胎牛血清的完全限定培養(yǎng)基，其允許在無(wú)菌和無(wú)血清的條件下連續(xù)培養(yǎng)前鞭毛體和無(wú)鞭毛體形式。特別是在專利申請(qǐng)F(tuán)RNo.9305779中描述的這些培養(yǎng)基，已使得能夠在體外復(fù)制利什曼原蟲例如亞馬遜禾'M十曼原蟲(厶a/zazo/2e/^/s)和嬰兒禾'H十曼原蟲(Z.2'/7/a/2"/ff)的完整的寄生蟲發(fā)育周期，并且通過(guò)簡(jiǎn)單濃縮由寄生蟲代謝的培養(yǎng)基上清液而在天然條件下?lián)碛邢鄬?duì)豐富的ESA來(lái)源。因此可以表征利什曼原蟲的ESA。因此，在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的研究已顯示，亞馬遜利什曼原蟲ESA的主要免疫原具有45kDa的分子量。用針對(duì)這種主要免疫原而產(chǎn)生的、稱為E2的單克隆抗體來(lái)篩選前鞭毛體形式的cDNA表達(dá)文庫(kù)，已使得能夠分離并鑒別編碼PSA家族的蛋白質(zhì)的cDM克隆。這種抗體由鼠類雜交瘤IVD6/E2生產(chǎn)，所述鼠類雜交瘤于2004年11月lO曰以No.1-3318保藏在C.N.C.M(28rueduDrRoux，Paris,France),更特別地由于2006年2月3日以No.1-3570保藏在CNCM的鼠類雜交瘤產(chǎn)生。因此，首次鑒定出3種新的在亞馬遜利什曼原蟲的前鞭毛體形式中表達(dá)的PSA的cDNA序列。這些分離的cDNA由于LRR數(shù)目(4、6或7)而彼此不同。近來(lái)，已使用編碼亞馬遜利什曼原蟲PSA的DNA作為放射性標(biāo)記探針篩選了嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體的粘粒文庫(kù)。已鑒定出新的利什曼原蟲基因其編碼嬰兒利什曼原蟲的排泄/分泌蛋白質(zhì)，分子量為56kDa(LiPSA50s),屬于PSA家族。因此，已經(jīng)使用由基因組學(xué)提供的工具進(jìn)行了編碼PSA(利什曼原蟲的排泄/分泌產(chǎn)物的主要免疫原)的基因的功能研究。實(shí)驗(yàn)方法包括將能夠誘導(dǎo)PSA產(chǎn)生水平減少的質(zhì)粒構(gòu)建體引入利什曼原蟲前鞭毛體內(nèi)，以便研究這些改變對(duì)于寄生蟲的生物學(xué)及其毒力的影響。因此看起來(lái)，在表達(dá)載體中不定向地克隆編碼LiPSA50s蛋白的//W基因，在選擇后導(dǎo)致獲得了質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含在反義方向上的插入片段(反義Ldi),其允許PSA在經(jīng)修飾的嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體中的低表達(dá)。有利地，已證實(shí)這些結(jié)果可以推廣至利什曼原蟲物種和編碼可以使用的抗原性蛋白質(zhì)的基因的插入片段。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供基因的表達(dá)載體的新型構(gòu)建體，所述基因編碼利什曼原蟲前鞭毛體的抗原性蛋白質(zhì)。本發(fā)明還旨在這些構(gòu)建體用于獲得無(wú)毒利什曼原蟲前鞭毛體突變體的用途。根據(jù)另一方面，本發(fā)明旨在將這些無(wú)毒突變體應(yīng)用于免疫預(yù)防目的。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體的特征在于，它們包含在反義方向上的編碼利什曼原蟲前鞭毛體的抗原性肽或蛋白質(zhì)的基因的插入片段。有利地，將所述基因以反義方向克隆在表達(dá)載體中，允許所述肽或蛋白質(zhì)在經(jīng)修飾的利什曼原蟲前鞭毛體中的低表達(dá)。優(yōu)選地，所述載體的特征在于，它們包含利什曼原蟲PSA基因插入片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，涉及亞馬遜利什曼原蟲基因插入片段。亞馬遜利什曼原蟲PSA基因更特別地選自SEQIDNo.l-5。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，涉及嬰兒利什曼原蟲基因插入片段。嬰兒利什曼原蟲基因有利地選自SEQIDNo.6。本發(fā)明還旨在經(jīng)遺傳修飾的利什曼原蟲前鞭毛體，其特征在于，涉及用如上定義的載體轉(zhuǎn)染的無(wú)毒突變體。本發(fā)明還旨在獲得無(wú)毒形式的利什曼原蟲前鞭毛體的方法，其特征在于，所述方法包括-將編碼利什曼原蟲的抗原性肽或蛋白質(zhì)的基因不定向地插入表達(dá)載體中，-選擇包含在反義方向上的插入片段的構(gòu)建體，-使用所選擇的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染利什曼原蟲的前鞭毛體形式，-通過(guò)顯微操作來(lái)進(jìn)行所述經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的前鞭毛體的生物克隆，以獲得低表達(dá)或甚至不再表達(dá)編碼利什曼原蟲前鞭毛體的抗原性蛋白質(zhì)的基因的突變體。前鞭毛體形式的轉(zhuǎn)染有利地通過(guò)電穿孔來(lái)進(jìn)行。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)揭示所述肽或蛋白質(zhì)，使得能夠評(píng)估其在所述克隆中的產(chǎn)生水平。采用上述安排使得能夠研究利什曼原蟲的抗原性肽或蛋白質(zhì)的低表達(dá)對(duì)于轉(zhuǎn)化的前鞭毛體行為的影響，并從而鑒定其生物學(xué)作用。為此，通過(guò)顯微操作克隆了不同的經(jīng)遺傳修飾的寄生蟲(生物學(xué)克隆)，并在分子水平(所述抗原性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生水平、相應(yīng)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平)上進(jìn)行表征和比較。經(jīng)遺傳修飾和克隆的前鞭毛體的表的體外傳染能力:、、一、、，，,-寄生蟲毒力因子例如PSA的表征，使得能夠開(kāi)發(fā)用于治療和/或疫苗目的、干擾傳染過(guò)程的新型策略。特別地，本發(fā)明使得能夠獲得減毒的，或甚至無(wú)毒的林系，其可以在動(dòng)物和/或人的疫苗接種中使用。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)在隨后的實(shí)施例中給出，所述實(shí)施例參考了圖1-4，其分別如下-圖l和2，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法的分析結(jié)果，所述蛋白質(zhì)印跡法采用野生林LdiMonl的總多肽提取物的PSA，以及野生林、有義和反義的經(jīng)轉(zhuǎn)化的寄生蟲親林及其克隆的培養(yǎng)物上清液的排泄/分泌抗原；-圖3，關(guān)于編碼PSA的基因和持家基因的轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR結(jié)果；-圖4,在野生林或克隆對(duì)犬巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外感染的過(guò)程中測(cè)定的寄生指數(shù)(indiceparasitaire)。材料和方法I-體外培養(yǎng)1-嬰兒利什曼原蟲的無(wú)菌培養(yǎng)在下文描述的研究中使用的嬰兒利什曼原蟲野生株具有WHO參照MHOM/MA/67/ITMAP-263/克隆2，同工酶亞群MON-1。在表達(dá)載體pTEX中于有義或反義位置上克隆編碼嬰兒利什曼原蟲PSA(56kDa)的Ull基因(1404bp)后獲得了經(jīng)轉(zhuǎn)化的林系，隨后在嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體形式中通過(guò)電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在濃度增加的(直至50pg/ml)遺傳霉素存在下選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的寄生蟲LdipTEX、LdiIJ11反義。質(zhì)粒的存在和轉(zhuǎn)基因的方向(反義)通過(guò)DM印跡法來(lái)證實(shí)，并且轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)RNA印跡法來(lái)證實(shí)。前鞭毛體形式在無(wú)菌條件下在不包含任何作為血清替代物的大分子的完全限定培養(yǎng)基(無(wú)血清的RPMI199H培養(yǎng)基，pH7)中進(jìn)行培養(yǎng)，還在補(bǔ)充有青霉素(100單位/ml)和鏈霉素(1G0pg/ml)的、包含20%去補(bǔ)體的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(含20%血清的RPMI培養(yǎng)基，pH7.2)中進(jìn)行培養(yǎng)。各種不同的經(jīng)轉(zhuǎn)化的林系通過(guò)顯微操作技術(shù)進(jìn)行克隆。在顯微鏡下使用細(xì)的玻璃針提取單個(gè)寄生蟲，并放置在NNN培養(yǎng)基(Novy，macNeal，Nicolle)上。寄生蟲的培養(yǎng)通過(guò)在20%RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行移種來(lái)實(shí)施。經(jīng)遺傳修飾的前鞭毛體形式以及相應(yīng)的克隆通過(guò)在含血清的培養(yǎng)基中每周移種一次來(lái)保持連續(xù)培養(yǎng)，或在遺傳霉素(50jig/ml)存在下于25。C在無(wú)血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行適應(yīng)。寄生蟲濃度通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FacsCalibur,BecktonDickinson)來(lái)測(cè)定。寄生蟲的保存通過(guò)在3%DMSO(二曱亞砜)存在下將培養(yǎng)的生物體于-180。C低溫冷凍在液氮中來(lái)確保。2-巨噬細(xì)胞培養(yǎng)PBMC(夕卜周血單核細(xì)胞)通過(guò)Ficoll(FicollLymphoprep,密度1.077±0.001g/ml;AbCys，F(xiàn)rance)梯度并通過(guò)在環(huán)境溫度下以700g離心20分鐘而從健康犬的全血中分離。然后，將所述細(xì)胞在不含Ca27Mg'+的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水，0.01M,pH7.2)中通過(guò)在4。C下以400g離心10分鐘而洗滌3次，然后重懸浮于補(bǔ)充有10%胎牛血清、100單位/ml青霉素和100pg/ml鏈霉素的RPMI1640中，并隨后于37。C進(jìn)行培養(yǎng)。II-收獲并制備寄生蟲材料1-寄生蟲材料的收獲通過(guò)將無(wú)血清的寄生蟲培養(yǎng)物在4。C下以3000g離心10分鐘來(lái)收獲處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期(7天)的前鞭毛體形式。隨后將因而分離的寄生蟲粒狀沉淀和培養(yǎng)物上清液分開(kāi)進(jìn)行處理。2-寄生蟲裂解物的制備將寄生蟲粒狀沉淀在PBS中在前述離心條件下洗滌2次。最后一次洗滌后，收獲的寄生蟲的數(shù)目通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)定。將109個(gè)經(jīng)洗滌的寄生蟲重懸浮于低滲裂解溶液中包含1%TritonX100(Sigma)的50mMTris，pH8。于4。C孵育20分鐘后，在4。C和2000g下離心20分鐘使得能夠?qū)⒉蝗苄圆牧?碎片)和上清液(可溶性分子)分開(kāi)。該上清液相應(yīng)于總多肽提取物(TPE)。3-從由寄生蟲代謝的培養(yǎng)物上清液開(kāi)始來(lái)濃縮排泄/分泌抗原(ESA)將10ml由寄生蟲代謝的上清液通過(guò)微孔膜(0.22iara)進(jìn)行過(guò)濾，隨后在凍干前將其冷凍成貝殼狀物(coquille)。將凍千物吸收在1mlmilUQ水中以便于在4'C下透析48小時(shí)以去除鹽。笫二次凍干使得能夠?qū)⑶逡簼饪s200倍。III—生物化學(xué)分析l-蛋白質(zhì)含量測(cè)定才艮才居Bradford的方法，<吏用Biorad試齊寸(BioradProteinAssayKit11)，用BeckmanDU-600分光光度4義在595nm處進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。由標(biāo)準(zhǔn)的牛白蛋白溶液(1mg/mlBSA，Sigma)來(lái)制備5-20pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)范圍。2-在SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上的電泳分析(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)在微型凝膠類型的電泳槽(Biorad)中進(jìn)行在SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上的分析。所使用的丙稀酰胺百分比對(duì)于濃縮膠為5%,和對(duì)于分離膠為10%，這使得能夠分開(kāi)10-200kDa的蛋白質(zhì)。將TPE的蛋白質(zhì)濃縮物與包含4%SDS、20%甘油和在0.5MTris-HCl(pH6.8)中的0.5%溴酚藍(lán)的樣品緩沖液相混合(v/v)。在包含1%SDS的緩沖液(2.5mMTris/19.2mM甘氨酸，pH8.3)中在80V的恒壓下進(jìn)行電泳遷移。通過(guò)放置10pg已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(Markl2WideRangeProteinStandard/SeeBluePlus2Pre-StainedStandard,Novex)獲得凝膠的校準(zhǔn)。3-用硝酸銀揭示蛋白質(zhì)通過(guò)在乙酸(10%)和乙醇(40%)存在下洗滌l小時(shí)而去除SDS后，隨后乙酸本身通過(guò)在50%乙醇中進(jìn)行2次30分鐘的漂洗來(lái)去除。然后，將凝膠在染色混合物中孵育15分鐘19.4%AgNO3-0.36%NaOH。在milliQ水中洗滌5次后，在1%檸檬酸中包含0.02%曱醛(w/v)的揭示溶液顯現(xiàn)出了凝膠上的蛋白質(zhì)。這種染色方法的揭示閾值是2ng蛋白質(zhì)當(dāng)量。IV-免疫學(xué)分析1-蛋白質(zhì)印跡法已在SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠中分離后，將蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Amersham，Hybond-CExtra)上。轉(zhuǎn)移在半千條件下進(jìn)行。膜隨后在TBS-5%乳封閉溶液中飽和1小時(shí)。膜于環(huán)境溫度在攪動(dòng)下與F5單克隆抗體一起孵育過(guò)夜，所述F5單克隆抗體針對(duì)PSA并在小鼠中獲得(MABF5),其在TBS中稀釋至1/50。在TBS中進(jìn)行3次5分鐘的洗滌后，結(jié)合的抗體用在TBS中稀釋至1/500的偶聯(lián)有過(guò)氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白G的二抗(Tebu)來(lái)檢測(cè)，并于環(huán)境溫度在攪動(dòng)下孵育45分鐘。接下來(lái)，在TBS中進(jìn)行3次5分鐘的洗涂，隨后用包含溶解在5ml曱醇中的15mg4-氯-1-萘酚的溶液來(lái)揭示該反應(yīng)，向其中加入包含15pl30%HA的25mlTBS。通過(guò)用蒸餾水洗滌膜來(lái)中止反應(yīng)。2-在寄生蟲上的間接免疫熒光處于其培養(yǎng)的穩(wěn)定期(7天)中的寄生蟲用在不含Ca"/Mg2+的PBS中的1%甲醛固定，隨后洗滌。一旦固定后，寄生蟲就沉積在用Teflon包被的孔(10個(gè)孔，50ml/孔)上，并在空氣中干燥。每個(gè)孔隨后用在(飽和)封閉溶液(1%山羊血清，0.5%BSA，在PBS中)中稀釋的F5單克隆抗體(MABF5)于37。C處理30分鐘。然后，洗滌細(xì)胞，并將其與綴合有異硫氰酸熒光素(FITC)的二抗(山羊抗小鼠免疫球蛋白G抗血清)一起于37。C孵育30分鐘，所述二抗在包含1/7500伊文思藍(lán)的PBS溶液中稀釋至1/300。在光子熒光顯微鏡(Leitz)下觀察載玻片。V-分子分析1-總RM的提取通過(guò)在4。C下以3000g將不含血清的寄生蟲培養(yǎng)物離心10分鐘來(lái)收獲前鞭毛體形式。將寄生蟲粒狀沉淀在PBS中在上述離心條件下洗滌2次。最后一次洗滌后，為了裂解寄生蟲和抑制內(nèi)源性核糖核酸酶(RNA酶)，通過(guò)在1ralTrizol(TrizolReagent,GibcoBRL)中渦旋振蕩來(lái)將細(xì)胞分開(kāi)，隨后在環(huán)境溫度下孵育5分鐘。將裂解物在0.2ml氯仿中在環(huán)境溫度下孵育2分鐘，隨后在4-C下以12000g離心15分鐘從而得到2個(gè)相，水相和有機(jī)相。RM只存在于回收的水相中。然后，RNA通過(guò)加入0.5ml異丙醇而沉淀，并在環(huán)境溫度下孵育10分鐘，隨后在4'C下以12000g離心10分鐘。將粒狀沉淀在1ml的75%乙醇中進(jìn)行洗滌，隨后在4'C下以7500g離心5分鐘，然后吸收在40jul水(不含RNA酶)中。為了去除可能存在的DNA，將溶解的RNA粒狀沉淀吸收在1jilDM酶I+0.1體積10xDNA酶I緩沖液中，并于37。C孵育20分鐘。在加入5piDNA酶滅活試劑，于環(huán)境溫度下孵育2分鐘，并隨后在4'C下以10000g離心1分鐘之后，回收包含RNA的上清液?？俁NA通過(guò)在260nm處讀取吸光度，采用分光光度法進(jìn)行定量(1OD單位-40iag/ml單鏈RNA)。提取的RNA的品質(zhì)、量和大小通過(guò)電泳來(lái)驗(yàn)證，所述電泳在0.01%溴化乙錠(ETB)存在下，在0.5xTAE緩沖液中，在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行。使用的大小標(biāo)記是SmartLadder(Eurogentec)。在遷移后，就在312nm的UV下顯現(xiàn)總RM。所挑選的關(guān)于提取物品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)是不存在DNA以及顯現(xiàn)出3條相等強(qiáng)度的核糖體RM條帶。2一RT-PCR單鏈cDNA通過(guò)實(shí)施RT-PCR來(lái)合成，使用1jig總RNA、2pldNTP混合物(5mM)、0.2特異引物(10pM)和H20qs13pl?；旌衔镉?5。C孵育2分鐘，隨后在水上孵育2分鐘，然后加入下列物質(zhì)4pl5x緩沖液、1DTT(0.1M)、1SuperaseIn(40U)(RNA酶抑制劑，Ambion)和1piSuperscriptII(200U)(逆轉(zhuǎn)錄酶，InvUrogen)?；旌衔镉?2°C孵育50分鐘，隨后通過(guò)于7(TC熱休克15分鐘來(lái)使反應(yīng)失活。單鏈cDNA通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，使用3plcDNA、12.5PCRMastermix(P腦ega)、1pl5和3'P特異引物(10jiM)和H20qs25nl。使用下列引物SEQIDNo.7-nhinspl:-CATCGCTTACCCCTTGTT-3'SEQIDNo.8-nhinsp2:5'-GTGGCCAATCGCGACA-3'SEQIDNo.9-P1RT:-ATGGCGCTGTGCGTGCGTCGG-3,SEQIDNo.10-P4RT:-GCGCGCGACAGCAGCGGCAT-3,。在熱循環(huán)儀(GeneAmpPCRSystem2400,AppliedBiosystems)中使用和進(jìn)行的PCR反應(yīng)程序如下94°C5分鐘，隨后為27個(gè)循環(huán)(94°C30秒、55°Cl分鐘、72°C1分鐘)，和72°C10分鐘。PCR產(chǎn)物通過(guò)在1%瓊脂糖凝膠上的電泳來(lái)證實(shí)。VI-生物學(xué)分析1-生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)從5xl()5個(gè)寄生蟲/ml的起始濃度開(kāi)始，在RPMI20%培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)10天來(lái)實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)。寄生蟲濃度通過(guò)混合500plPBS、5pl培養(yǎng)物和0.5pl碟化丙錠，采用流式細(xì)胞術(shù)(FacsCalibur，BecktonDickinson)來(lái)測(cè)定。2-在寄生蟲/巨噬細(xì)胞相互作用中的體外感染從健康犬的全血中分離的106個(gè)PBMC/孔(200)分配在LabTek培養(yǎng)室(NalgeNuncInternational)中。在37°C、5%C02下孵育30分鐘后，將LabTel^用RPMI10%輕輕地進(jìn)行洗滌以去除未粘附的細(xì)胞。在成熟5天后由培養(yǎng)的單核細(xì)胞獲得巨噬細(xì)胞。在37。C和5。/。C02下，以10:1的寄生蟲巨噬細(xì)胞比率，用穩(wěn)定培養(yǎng)期的前鞭毛體形式體外感染成熟的巨噬細(xì)胞30分鐘、2小時(shí)和48小時(shí)。隨后將巨噬細(xì)胞輕輕地洗滌2次以去除未被吞噬的寄生蟲。30分鐘、2小時(shí)和48小時(shí)后，細(xì)胞用甲醇固定并用吉姆薩(Giemsa)染色。在油浸光學(xué)顯微鏡(放大1000x)下觀察300個(gè)巨噬細(xì)胞，并測(cè)定被寄生蟲感染的巨噬細(xì)胞的百分比，每個(gè)巨噬細(xì)胞的無(wú)鞭毛體數(shù)目和寄生指數(shù)(P.I.)。P.I,目。結(jié)果-在經(jīng)轉(zhuǎn)化的克隆中評(píng)估PSA的產(chǎn)生水平圖l和2報(bào)告了PSA的蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)果，它們分別采用下列材料，.總多肽提取物(TPE)，其來(lái)源于野生抹LdiMonl的寄生蟲粒狀沉淀的，.排泄/分泌抗原(ESA)，其來(lái)源于由野生林LdiMonl、經(jīng)轉(zhuǎn)化的寄生蟲親抹(LdipTEX、LdiIJ11有義和LdiIJ11反義)及其相應(yīng)克隆代謝的培養(yǎng)基上清液(每個(gè)泳道5pg蛋白當(dāng)量的總提取物)。注意到對(duì)于野生林LdiMonl沒(méi)有觀察到條帶，而相反地，與在LdipTEX中的表達(dá)相比較，對(duì)于LdiIJ11有義在TPE和ESA水平上清晰可見(jiàn)過(guò)表達(dá)，以及用LdiIJll反義觀察到PSA表達(dá)的減少。-通過(guò)RT-PCR分^斤PSA轉(zhuǎn)錄物對(duì)于編碼PSA的基因的轉(zhuǎn)錄物以及對(duì)于編碼核苷水解酶的持家基因的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行RT-PCR。獲得的結(jié)果在圖3中給出。與LdipTEX相比較，在LdiIJ11有義中觀察到編碼PSA的轉(zhuǎn)錄物的水平明顯增加，并且在LdiIJll反義中觀察到顯著減少。對(duì)于野生林LdiMonl沒(méi)有觀察到信號(hào)。-在寄生蟲-巨噬細(xì)胞相互作用中的體外感染能力圖4報(bào)告了在野生林或于不同孵育時(shí)間選擇的不同克隆對(duì)犬巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外感染的過(guò)程中測(cè)定的寄生指數(shù)30分鐘(寄生蟲附著至巨噬細(xì)胞)、2小時(shí)(寄生蟲穿透)和48小時(shí)(無(wú)鞭毛體的存活和繁殖)。注意到，在30分鐘和2小時(shí)時(shí)，LdiIJll有義前鞭毛體所顯示的寄生指數(shù)比LdiIJll反義前鞭毛體高大約2倍，而LdiIJll反義前鞭毛體低大約2倍。在感染48小時(shí)后得到相同結(jié)果。VII-pTEX、有義和反義突變體的體內(nèi)作用的研究通過(guò)IP用108個(gè)前鞭毛體/100pi感染Balb/C小鼠測(cè)量寄生蟲血癥(寄生蟲負(fù)荷)的方案參考文獻(xiàn)BuffetP.A.等人，1995.爿/〃邁/cro6/"a，"c力譜Merw.第39巻2167-2168準(zhǔn)備每個(gè)器官1個(gè)15ml試管，含4mlSDM或RPMI培養(yǎng)基/20%FCS將試管+培養(yǎng)基稱重(重量=T,單位為g)細(xì)胞濾器+小培養(yǎng)皿(1個(gè)細(xì)胞濾器用于屬于相同組/批次的小鼠的2個(gè)相同器官)+1ml注射器對(duì)于器官脾和肝對(duì)于脾取出整個(gè)脾對(duì)于肝只取出小葉-將器官稱重(在試管中的器官+培養(yǎng)基，重量-T0，單位為g)-在4ml培養(yǎng)基中用Potter勻漿器或細(xì)胞濾器研磨/勻漿。對(duì)于寄生蟲血癥/脾-在96孔板中，對(duì)于笫1個(gè)孔取出250細(xì)胞，并用150寄生蟲在150pl培養(yǎng)基中制備2倍系列稀釋物，然后對(duì)于隨后的孔取出150pl以在150pi培養(yǎng)基中稀釋...。制備2xl2個(gè)稀釋物孔(2排)。-于26-28t:孵育7和15天后，在倒置顯舉鏡(xioo或x200物鏡)下檢查所述平板。-對(duì)于每個(gè)孔記錄寄生蟲的不存在或存在。記錄其中存在寄生蟲的最后一個(gè)孔。對(duì)于寄生蟲血癥/肝-在96孔板中，對(duì)于含有225培養(yǎng)基的第1個(gè)孔取出25細(xì)胞，并用50pl寄生蟲在150|nl培養(yǎng)基中制備4倍系列稀釋物，然后對(duì)于隨后的孔取出50以在l50pl培養(yǎng)基中稀釋...。制備2x12個(gè)稀釋物孔(2排)。-于26-28。C孵育7和15天后，在倒置顯微鏡(xlOO或x200物鏡)下檢查所述平板。-對(duì)于每個(gè)孔記錄寄生蟲的不存在或存在。記錄其中存在寄生蟲的最后一個(gè)孔。最終滴度相應(yīng)于其中孔包含至少1個(gè)寄生蟲的最后一個(gè)稀釋度。以下列方式計(jì)算在相應(yīng)的器官中的寄生蟲數(shù)目/克(寄生蟲負(fù)荷):寄生蟲數(shù)目=(兩次重復(fù)中每個(gè)的滴度倒數(shù)的幾何平均值/經(jīng)勻漿的切片的重量)x400寄生蟲負(fù)荷=F艮^稀釋l郝'液x400器官重量(g)注意-400相應(yīng)于在第1個(gè)孔中接種的經(jīng)勻漿的器官的倒數(shù)部分<103至〉106在感染后14天時(shí)的點(diǎn)寄生蟲血癥(在15天時(shí)讀取)，以一式兩份和2倍系列稀釋物來(lái)進(jìn)行寄生蟲負(fù)荷-(限度稀釋度的倒數(shù)/器官重量(g))x400第3批，反義小鼠l脾0.130.2512308123080874424580.130.2512308第1批，pTEX小鼠1脾小鼠2脾小鼠3脾小鼠4脾第2批，有義小鼠1脾小鼠2脾小鼠3脾小鼠4脾小鼠5脾器官重量(g)0.140.140.160.160.140.140.160.160.140.140.190.190.240.240.170.170.150.15寄生蟲負(fù)荷寄生蟲負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)差寄生蟲負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)差g寄生蟲g-l平均值總平均值3663002747251295071831501831501602561200645684079872457146849832222912834000059936281947987257142857404100210529774211166783311790941270593328470647062667133318861079126734856756無(wú)小鼠l的試驗(yàn)22927紅色結(jié)果不予考慮23671517無(wú)小鼠1的試驗(yàn)1和2,和無(wú)小鼠2的試驗(yàn)限度稀釋度0.00780.01560.01560.03130.06250.03130.06250.0313<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>寄生蟲血癥(2個(gè)月)脾紅色結(jié)果不予考慮笠1p丁EX器官重量(g)0.140.140.170.180.14限度稀釋度0.0.0.0.0.016008031016008寄生蟲負(fù)荷寄生蟲g-l18285736571475294142222365714寄生蟲負(fù)荷的平均值寄生蟲負(fù)荷的總平均值264127標(biāo)準(zhǔn)差g118470有義NI=0.10.150.120.140.14未感染NININININI反義0.11NI0.120.190.13NI0.14NI0.18NI0.5000.50006667421100018132914200680011538.6勢(shì)溢也被17/185t"12345批12345批123456丄鼠鼠鼠鼠鼠2鼠鼠鼠鼠鼠3鼠鼠鼠鼠鼠鼠*、、、、、、、、、、、、、、、、脾pTEX有義反義寄生蟲負(fù)荷g-l"15天2個(gè)月15天10791226412756756236701517874418132458標(biāo)準(zhǔn)差脾2個(gè)月11847002914pTEX有義反義寄生蟲負(fù)荷g-l標(biāo)準(zhǔn)差15天2個(gè)月15天2個(gè)月673482641272292711847023670151708744181324582914寄生蟲血癥(2個(gè)月)肝pTEX有義器官重量(g)0.120.10.140.140.120.17NI0.18NI0.12NINI0.09NI0.14限度稀釋度0.0003910.0000240.0062500.0062500.006250寄生蟲負(fù)荷寄生蟲g-l1638400004571434571435333330000024952384825404025557:43989,有小鼠1無(wú)小鼠1反義0.12NI0.160.1NI0.08NI0.120.1NI0.0250.02501000000013333303888961162，肝肝肝肝肝，肝肝肝肝肝，肝肝肝肝肝肝批1234512345123456l鼠鼠鼠鼠鼠2鼠鼠鼠鼠鼠3鼠鼠鼠鼠鼠鼠第小小小小小第小小小小小第小小小小h小權(quán)利要求1.編碼利什曼原蟲前鞭毛體的抗原性蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)載體，其特征在于，它包含在反義方向上的PSA基因插入片段。2.權(quán)利要求l的載體，其特征在于，它包含亞馬遜利什曼原蟲基因插入片段。3.權(quán)利要求2的載體，其特征在于，所述亞馬遜利什曼原蟲基因相應(yīng)于下列序列中的一種SEQIDNo.1-5。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的載體，其特征在于，它包含嬰兒利什曼原蟲基因插入片段。5.權(quán)利要求4的載體，其特征在于，所述嬰兒利什曼原蟲基因相應(yīng)于SEQIDNo.6。6.經(jīng)遺傳修飾的利什曼原蟲前鞭毛體，其特征在于，涉及用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)染的無(wú)毒突變體。7.獲得無(wú)毒形式的前鞭毛體的方法，其特征在于，所述方法包括-將編碼利什曼原蟲的抗原性肽或蛋白質(zhì)的基因不定向地插入利什曼原蟲表達(dá)載體中，-選擇包含在反義方向上的插入片段的載體，-使用所選擇的載體轉(zhuǎn)染利什曼原蟲的前鞭毛體形式，-通過(guò)顯微操作來(lái)進(jìn)行所述經(jīng)遺傳修飾的前鞭毛體的生物克隆，以獲得低表達(dá)或甚至不再表達(dá)編碼利什曼原蟲前鞭毛體的抗原性蛋白質(zhì)的基因的突變體。8.權(quán)利要求7的前鞭毛體用于制備疫苗的用途。全文摘要本發(fā)明涉及編碼利什曼原蟲前鞭毛體的抗原性蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)載體，其特征在于它包含在反義方向上的PSA基因插入片段。本發(fā)明可應(yīng)用于制備低表達(dá)或不再表達(dá)編碼利什曼原蟲前鞭毛體的抗原性蛋白質(zhì)的基因的突變體，以及應(yīng)用于其治療和/或疫苗用途。文檔編號(hào)C12N15/79GK101155919SQ200680011538公開(kāi)日2008年4月2日申請(qǐng)日期2006年2月10日優(yōu)先權(quán)日2005年2月10日發(fā)明者J-L·勒梅爾,P·霍爾茲穆勒,R·布拉斯-貢薩爾維斯申請(qǐng)人:發(fā)育研究院