專(zhuān)利名稱(chēng)：一種香草酸甲酯的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用麥角菌(Clavicepssp.) CGMCC N.o.3997制備香草酸甲酯的方法。
背景技術(shù)：
香草酸酯類(lèi)，如香草酸甲酯及香草酸乙酯，是一類(lèi)用途十分廣泛的香料，不 僅可作為香水，護(hù)膚護(hù)發(fā)，化妝品，理發(fā)用品，空氣清新劑，止汗露以及房屋 除臭劑等化工產(chǎn)品的添加劑，還可用作許多食品調(diào)味劑，用于食品、煙草、調(diào) 味品和日化香精中，是很好的定香劑。
香草酸甲酯還是合成很多藥物的原料，合成許多化工產(chǎn)品的原料和前體物質(zhì)。
目前，絕大多數(shù)的香草酸甲酯來(lái)源于化學(xué)合成，少量取自植物，香草酸甲酯 也是許多葡萄酒的主要揮發(fā)性香味成分，其來(lái)源是釀酒酵母或其它細(xì)菌將葡萄 中含有的香草酸甲酯葡萄糖苷類(lèi)物質(zhì)水解，并釋放出來(lái)。
香草酲是香草酸甲酯化學(xué)合成的重要前體。市場(chǎng)上供應(yīng)的香草醛有兩種:(l) 化學(xué)合成的香草醛，世界年銷(xiāo)量超過(guò)10,000噸，主要以愈創(chuàng)木酚和木質(zhì)素為原 料合成，其市場(chǎng)價(jià)格較低。(2)天然香草醛，是指由動(dòng)植物材料經(jīng)物理(包括蒸餾、 萃取)方法、酶法或微生物方法得到的。從植物中提取的天然香草醛主要來(lái)自天 然香子蘭花莢的醇提物，這種來(lái)源的天然香草醛價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于合成產(chǎn)品的價(jià)格 (曾有報(bào)道稱(chēng)達(dá)300倍之多)。天然香草酸的價(jià)格昂貴， 一方面是由于香子蘭花 莢的來(lái)源非常有限，受產(chǎn)地、天然因素的影響，培育、收獲和處理勞動(dòng)強(qiáng)度大， 成本高昂，特別是香子蘭種植過(guò)程中需要對(duì)花朵進(jìn)行人工授粉，難以大規(guī)模種 植。另一原因是人們對(duì)天然香味物質(zhì)的青睞有加。
天然香草醛的市場(chǎng)需求日益增長(zhǎng)，作為一種安全、可靠的香料和原料藥中間 體，其越來(lái)越受到重視。
目前使用的香草酸甲酯與香草醛的情況十分相似，大多數(shù)來(lái)源于化學(xué)合成； 而來(lái)自于植物根莖的天然香草酸甲酯由于來(lái)源困難、提取耗費(fèi)成本高、消耗大， 因而代價(jià)十分昂貴。若能通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)工業(yè)化制備，由于在原材料來(lái)源、 成本、產(chǎn)能、生態(tài)、環(huán)保效益等諸多方面顯示出極大優(yōu)勢(shì)，必將成為一大突破 亮點(diǎn)。來(lái)自于微生物制備的香草酸甲酯有望替代昂貴的植物來(lái)源產(chǎn)物或化學(xué)合 成產(chǎn)物而成為安全的天然綠色產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是用微生物培養(yǎng)的方法，即香草酸甲酯可從麥
角菌(Clavkepssp.) CGMCC No.3997經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、純化提取而得。本發(fā)明將 菌種在培養(yǎng)基上分別進(jìn)行斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)，再分離純化得到 產(chǎn)物香草酸甲酯。本發(fā)明的方法開(kāi)創(chuàng)了用麥角菌或同類(lèi)菌種甚至用生物方法制 備香草酸甲酯的先河。 一種的制備方法，其特征在于是
培養(yǎng)基
1. 斜面培養(yǎng)基(PDA) (%):馬鈴薯提取物20，葡萄糖2，瓊脂2， pH6.0。
2. 種子培養(yǎng)基(％):葡萄糖10 ，檸檬酸1 ，酵母膏0.01， KH2PO4 0.05， MgS04'7H20 0.03 ， KCI0.03 ， FeS04'7H20 0.0007 ， ZnS04.7H20 0.0006 ，氨 水調(diào)pH至5.0。
3. 采用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有蔗糖l%-30%，擰檬酸0.1%-3.0%,酵母粉 0-0.5%或蛋白胨0-0.1%，無(wú)機(jī)鹽包括KH2P04， MgS04， KC1， FeS04, ZnS04
等少量。
經(jīng)試驗(yàn)比較較優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基含有蔗糖1%-10%，擰檬酸0.1%-0.5%，酵
母粉0.01%-0.1%或蛋白胨0.01%-0.1%， KH2PO4 0.05%， MgS04 7H2O0.05%， KC1 0.012%, FeS04 7H:20 0.0007%， ZnS04 7H20 0.0006%。
培養(yǎng)條件
采用二級(jí)發(fā)酵，冷凍管保藏的菌種接種到斜面培養(yǎng)基，于25'C培養(yǎng)，斜面孢 子成熟后，制備孢子懸液，以孢子懸液接種種子培養(yǎng)基，在搖床上25。C培養(yǎng)4-5 天后，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)條件為pH5-7，溫度22-28'C，發(fā)酵周期 5-12天。較優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件為pH5.0-6.0，溫度23-26。C，發(fā)酵周期8-10天。
產(chǎn)物的分離純化
取發(fā)酵液離心，取出菌絲體以丙酮浸泡。浸泡液經(jīng)減壓濃縮后溶解在丙酮 石油醚(10 : 1)中，拌入適量硅膠(200 300.目)混合均勻，適當(dāng)千燥后將硅
膠裝入己用石油醚丙酮(ioo : l)預(yù)先平衡好的硅膠柱中，用石油醚丙酮 (io: l)系統(tǒng)恒定洗脫，分部收集，TLC跟蹤檢測(cè)各流出部分，收集合并含 目標(biāo)產(chǎn)物的部分，減壓濃縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品I。
離心獲取的發(fā)酵上清液用乙酸乙酯萃取，分出萃取相減壓濃縮。將濃縮液直 接上硅膠層析柱，以石油醚丙酮(50 : i)，石油醚丙酮(io : i)以及石油醚 丙酮(9 : 1)進(jìn)行梯度洗脫:，分部收集，TLC跟蹤檢測(cè)各流出部分，收集合并含
目標(biāo)產(chǎn)物的部分，減壓濃縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品II。
將粗品i和ii合并，得到粗品m。將粗品ni加入已用石油醚丙酮noo: i)
預(yù)先平衡好的硅膠柱(40xl.5cm)中進(jìn)行第二次梯度洗脫，洗脫系統(tǒng)為石油醚 丙酮(ioo : i)，石油醚丙酮(50 : i)，石油醚丙酮(40 : i);分部收集，tlc 跟蹤檢測(cè)各流出部分，合并含目標(biāo)產(chǎn)物的部分，濃縮后得到黃色油狀物質(zhì)，經(jīng)
hplc分析，其純度在95%以上。
將上述制備物溶解于少量丙酮，在甲醇中結(jié)晶，得白色粉末狀晶體，經(jīng)HPLC 分析，其純度達(dá)98%以上。
分析檢測(cè)方法
hplc (定性和定量)
色譜柱ZORBAx80AExtend-C18 (4.6x250mm， 5pm)，流動(dòng)相，甲醇:水= 60:40，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量5(il，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。
tlc (定性)
采用Merck硅膠層析板GF254，展開(kāi)體系如下
石油醚:丙酮=5:2 RfK)..5
氯仿:甲醇=9:1 Rf=0.46 產(chǎn)物的理化性質(zhì)
項(xiàng)目 性質(zhì)描述
外觀白色粉末狀結(jié)晶
溶解性易溶于乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑，難溶于甲醇，
不溶于水
熔點(diǎn)rc)64 70
質(zhì)譜183.09 CM+H)， 205.07(M+Na)
ESI-MS(m/z)
分子量182
分子式C9腦04
UV ;axeth咖乂nm)220、 265、 295
產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的確證:
根據(jù)理化性質(zhì)、紫外、質(zhì)譜、氫譜和碳譜以及碳?xì)湎嚓P(guān)譜的綜合分析，并參 照文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，確定所得到的物質(zhì)為香草酸甲酯。結(jié)構(gòu)如下


圖l.為精制后樣品的HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。 實(shí)施例1 搖瓶發(fā)酵
取冷凍管保藏的麥角菌CGMCC No.3997菌種接種到斜面培養(yǎng)基，于25°C 培養(yǎng)，斜面孢子成熟后，制備孢子懸液。以孢子懸液接種種子培養(yǎng)基，在搖床 上25'C培養(yǎng)4天，將種子培養(yǎng)液以10%接種量轉(zhuǎn)種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培 養(yǎng)基配方為(％):蔗糖IO，檸檬酸O.l，蛋白胨0.02， KH2P04 0.05, MgS(V7H20 0.05， KC1 0.012， FeS04.7H20 0.0001， ZnS04'7H20 0.0006;氨水調(diào)pH至5.8; 發(fā)酵溫度26"C，發(fā)酵周期9天。
實(shí)施例2 搖瓶發(fā)酵
同實(shí)施例1獲取種子培養(yǎng)液后，以10%接種量轉(zhuǎn)種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā) 酵培養(yǎng)基配方為(％):蔗糖3，檸檬酸0.3，蛋白胨0.08， KH2P04 0.05, MgSO4'7H2O0.05， 〈C1 0.012， FeS04.7H20 0.0001 ， ZnS04'7H20 0.0006;氨水 調(diào)pH至5.^發(fā)酵溫奪24^，發(fā)酵周期8天。
搖瓶發(fā)酵
同實(shí)施例1獲取種子培養(yǎng)液后，以10%接種量轉(zhuǎn)種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā) 酵培養(yǎng)基配方為(％):蔗糖2，檸檬酸0.4，酵母粉0.01, KH2P04 0.05， MgSO4'7H2〇0.05， KC1 0.012， FeS04.7H20 0.0001 ， ZnS04.7H20 0.0006;氨水 調(diào)pH至6.0;發(fā)酵M度23。C,發(fā)酵周期10天。
實(shí)施例4 玻璃發(fā)酵罐發(fā)酵
同以上實(shí)施例獲取種子培養(yǎng)液后，以10q/。接種量轉(zhuǎn)種到裝有4L發(fā)酵培養(yǎng)基 的10L玻璃發(fā)酵罐中。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(X):蔗糖5，擰檬酸0.5，酵母粉0.06， KH2PO4 0.05， MgSO4'7H2O0.05， KC1 0.012, FeS04.7H20 0.0001 ， ZnS04.7H20 0.0006;氨水調(diào)pH至5.5;發(fā)酵溫度25。C，發(fā)酵周期8天。
實(shí)施例5 產(chǎn)物的粗制
如實(shí)施例4方法發(fā)酵收集發(fā)酵液。兩罐合并得發(fā)酵液約7L，離心后取出菌 絲體約600g,以600ml丙酮浸泡。浸泡液經(jīng)減壓濃縮后溶解在20ml丙酮石油 醚(10 : 1)中，拌入25g硅膠(200 300目)混合均勻，適當(dāng)干燥后將硅膠裝
入已用石油醚丙酮(ioo : i)預(yù)先平衡好的硅膠柱中，用石油醚丙酮(io : i) 系統(tǒng)恒定洗脫，分部收集，tlc跟蹤檢測(cè)各流出部分，收集合并含目標(biāo)產(chǎn)物的 部分，減壓濃縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品I 。
離心獲取的發(fā)酵上清液用等量乙酸乙酯萃取，分出萃取相減壓濃縮。將濃 縮液直接上硅膠層析柱，以石油醚丙酮(50 : i)，石油醚丙酮(io : i)以及石 油醚丙酮(9 : l)進(jìn)行梯度洗脫，分部收集，TLC跟蹤檢測(cè)各流出部分，收集合 并含目標(biāo)產(chǎn)物的部分，減壓濃縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品II。
將粗品i和n合并，得到粗品m。將粗品m加入已用石油醚:丙酮(ioo: i)
預(yù)先平衡好的硅膠柱(40xl.5cm)中進(jìn)行第二次梯度洗脫，洗脫系統(tǒng)依次為石
油醚丙酮(ioo : i)，石油醚丙酮(50 : 1)，石油醚丙酮(40 : i);分部收集, tlc跟蹤檢測(cè)各流出部分，，合并含目標(biāo)產(chǎn)物的部分，濃縮后得到黃色油狀物質(zhì)，
經(jīng)HPLC分析，其純度在95%以上。
實(shí)施例6 產(chǎn)物的精制
將實(shí)施例5所述制備物溶解于少量丙酮，在甲醇中結(jié)晶，干燥后得白色粉 末狀晶體約230mg，經(jīng)HPLC分析，其純度達(dá)98%以上。
權(quán)利要求
1.一種香草酸甲酯的制備方法，其特征在于是從麥角菌(Claviceps sp.)CGMCCNo.3997經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、純化提取而得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有蔗糖 1%-30%，檸檬酸0.1%-3.0%，酵母粉0-0.5%或蛋白胨0-0.1%，無(wú)機(jī)鹽包 括少量KH2P04， MgS04, KC1， FeS04， ZnS04等，發(fā)酵培養(yǎng)條件為pH5-7，溫度22-28 ，發(fā)酵周期6-14天。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基含有蔗糖1%-10%，檸檬酸0.1%-0.5%，酵母粉0.01%-0.1%或蛋白胨0.01%-0.1%， KH2P04 0.05%， MgSO4-7H2O0.05%， KC1 0.012%， FeS04-7H20 0細(xì)7%， ZnS04-7H20 0.0006%，發(fā)酵培養(yǎng)條件為pH5.0-6.0，溫度23-26 ，發(fā)酵周期8-10天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)培養(yǎng)麥角菌CGMCC No.3997菌株制備香草酸甲酯的微生物方法，即在含有可利用的碳源和氮源以及無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上分別對(duì)CGMCC No.3997菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)，獲得的發(fā)酵液中生成有香草酸甲酯產(chǎn)物，從培養(yǎng)液中分離、純化得到高純度的香草酸甲酯。本發(fā)明開(kāi)創(chuàng)了用麥角菌或同類(lèi)菌種甚至用生物方法制備香草酸甲酯的先河，具有多方面的優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12P7/62GK101200736SQ20061014727
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2006年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月14日
發(fā)明者楊志鈞, 羅敏玉, 許向前, 陳代杰 申請(qǐng)人:宋征宇