專(zhuān)利名稱(chēng)：甘藍(lán)雜交種“爭(zhēng)春”、“寒光2號(hào)”指紋圖譜的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘藍(lán)種子鑒定技術(shù)，具體地說(shuō)是甘藍(lán)的DNA指紋圖譜及建 立方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，我國(guó)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的甘藍(lán)(5rawz'caoferaceavar. ca/w'toto)主栽 品種基本上為雜種一代。雜種一代能綜合親本的許多優(yōu)良性狀，經(jīng)濟(jì)效益 較好。
但是在制種過(guò)程中會(huì)由于管理措施不當(dāng)和自交不親和性本身的缺陷而 常常產(chǎn)生自交種子，即假雜種，導(dǎo)致種子純度下降。因此，提高雜交種純 度是雜種優(yōu)勢(shì)利用研究領(lǐng)域的重要課題。目前，品種鑒定和種子純度分析 方法大致有三種，即大田形態(tài)、生化標(biāo)記和DNA指紋圖譜鑒定法。傳統(tǒng)的 大田鑒定法以種子、幼苗、葉、花、果實(shí)、花粉等組織器官的顏色、形態(tài) 等農(nóng)藝性狀作為鑒定的觀測(cè)指標(biāo)，在生產(chǎn)實(shí)踐中雖然是一種較為可行的方 法，但大田鑒定需要額外占用土地，周期長(zhǎng)、花費(fèi)大，不僅受季節(jié)限制， 而且很多性狀的^現(xiàn)受栽培措施及環(huán)境因子的影響，鑒定者的觀察經(jīng)驗(yàn)也 制約著鑒定的準(zhǔn)確性。大田鑒定最大的缺陷是不能及時(shí)提供種子純度信息， 不能在種子大量交易前提供有關(guān)種子的質(zhì)量信息，對(duì)種子質(zhì)量不能起到預(yù) 先監(jiān)督的作用。生化鑒定方法包括蛋白質(zhì)電泳和同工酶電泳，已得到日益 廣泛的應(yīng)用，但不能完全顯示品種間的多態(tài)性，難以對(duì)親緣關(guān)系較近的品 種進(jìn)行有效的區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于甘藍(lán)種子鑒定技術(shù)的DNA指紋圖譜及 建立方法和應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的
DNA指紋圖譜鑒定法是以DNA的多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記方法，可 以彌補(bǔ)和克服在種子純度的形態(tài)學(xué)鑒定及同工酶、種子蛋白電泳鑒定中的 許多缺陷和難題。本發(fā)明利用SRAP、 RAPD技術(shù)構(gòu)建了長(zhǎng)江中下游地區(qū)甘 藍(lán)主栽品種"爭(zhēng)春"、"寒光2號(hào)"與其各自親本的DNA指紋圖譜，可以為這 些品種的鑒定和純度檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而保護(hù)生產(chǎn)者和使用者的合法 權(quán)益。
本發(fā)明的甘藍(lán)雜交種"爭(zhēng)春"、"寒光2號(hào)"及其親本的DNA指紋圖譜， 是由"1"和"0"組成的數(shù)據(jù)，"爭(zhēng)春"母本的數(shù)據(jù)為111111111011110;"爭(zhēng)春"
的數(shù)據(jù)為111111111111111;"爭(zhēng)春"父本的數(shù)據(jù)為111101111111111;"寒光2 號(hào)"母本的數(shù)據(jù)為1100111111111111110;"寒光2號(hào)"的數(shù)據(jù)為 1111111111111101111;"寒光2號(hào)"父本的數(shù)據(jù)為0111111110111101111。其
中所述數(shù)字"r表示圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)增帶存在，數(shù)字"o"表示在某個(gè)位
置上沒(méi)有擴(kuò)增條帶存在。
所說(shuō)的"爭(zhēng)春"、"寒光2號(hào)"甘藍(lán)雜交種和親本,可以采用上海市農(nóng)業(yè)科學(xué) 院園藝研究所公開(kāi)銷(xiāo)售的產(chǎn)品；
甘藍(lán)DNA指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟
1) 提取及純化甘藍(lán)基因組的DNA;
2) 用獲得的甘藍(lán)DNA為模板進(jìn)行RAPD分析；
3)選擇有代表性的多態(tài)性RAPD擴(kuò)增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無(wú) 構(gòu)建供試材料DNA指紋圖譜。
其中所述"爭(zhēng)春"、"寒光2號(hào)"甘藍(lán)雜交種及其各自親本都有其特異的 DNA指紋，可以相互區(qū)分開(kāi)來(lái)。所述RAPD擴(kuò)增中采用的引物為S42，是 由上海生工生物工程有限公司合成的寡核苷酸隨機(jī)引物，其堿基序列為 GGACCCAACC。
本發(fā)明的DNA指紋圖譜可以應(yīng)用于"爭(zhēng)春"和"寒光2號(hào)"甘藍(lán)雜交種種
子純度的鑒定。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1. 本發(fā)明創(chuàng)建了"爭(zhēng)春"、"寒光2號(hào)"甘藍(lán)雜交種及其親本的DNA指 紋圖譜，公開(kāi)了用DNA指紋分析技術(shù)對(duì)甘藍(lán)種子鑒定的研究結(jié)果，建立的 方法能從遺傳本質(zhì)上對(duì)甘藍(lán)種子進(jìn)行鑒定，因此準(zhǔn)確、可靠，具有法律效 應(yīng)。
2. 采用本發(fā)明，在對(duì)"爭(zhēng)春"和"寒光2號(hào)"甘藍(lán)種子樣品進(jìn)行真實(shí)檢測(cè) 時(shí)，用目前廣泛應(yīng)用的快速、徼量DNA提取法提取待測(cè)樣品的DNA，用 提取的DNA作為模板，進(jìn)行RAPD分析，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以知道該DNA 指紋，因此，就能迅速判斷出它的真實(shí)性。
3. 由于本發(fā)明DNA指紋圖譜是用圖的形式表式，看起來(lái)比較直觀、 易懂；并由于轉(zhuǎn)換成了數(shù)碼形式，便于計(jì)算機(jī)識(shí)讀和分析。


圖1為本發(fā)明建立的引物S42的RAPD指紋圖譜，其中M為DGL2000 DNA標(biāo)識(shí)；1為"爭(zhēng)春"母本；2為"爭(zhēng)春"；3:為"爭(zhēng)春"父本；4為"寒光2號(hào)，，
母本5為"寒光2號(hào)"；6為"寒光2號(hào)"父本；箭頭標(biāo)出的為互補(bǔ)型特征片
段o
圖2 RAPD指紋圖譜線(xiàn)段示意，其中l(wèi)為"爭(zhēng)春"母本；2為"爭(zhēng)春"; 3:為"爭(zhēng)春"父本;4為"寒光2號(hào)"母本;5為"寒光2號(hào)";6為"寒光2號(hào)"父本。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例采用SDS法提取甘藍(lán)品種"爭(zhēng)春"、"寒光2號(hào)"及其各自親 本的基因組DNA，通過(guò)RAPD分子標(biāo)記方法構(gòu)建其DNA指紋圖譜用于種 子純度鑒定。具體操作如下
1、 選用的試驗(yàn)材料
材料為甘藍(lán)雜交種"爭(zhēng)春"與"寒光2號(hào)"及其各自親本
2、 甘藍(lán)DNA的提取及純化 按如下程序提取各個(gè)甘藍(lán)材料的基因組DNA:
取新鮮組織2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml離心管，加入8ml提 取液(100mMTrispH8.0, 50mMEDTA, 500mMNaCl， 1.5%SDS)， 65。C 情況下30分鐘，不時(shí)顛倒混勻，加2，5ml5M乙酸鉀冰浴10分鐘，加5 ml 氯仿，顛倒混勻，10000rmp離心8分鐘，取上清移入新管，加2 / 3體積預(yù) 冷異丙醇，顛倒混勻，-20匸置1-2小時(shí)，挑出絮狀白色DNA， 70%乙醇洗 1-2次，吹干，溶于100ul(或適量)TE中，并在1%瓊脂糖凝膠上電泳，月J 標(biāo)準(zhǔn)XDNA作對(duì)照，估算甘藍(lán)DNA樣品的濃度，獲得高純度甘藍(lán)DNA。
3、 用獲得高純度甘藍(lán)DNA為模板進(jìn)行RAPD分析
RAPD反應(yīng)在Mastercycler 5333型PCR儀上完成，引物是S42 (上海生 工公司產(chǎn)品)。RAPD"PCR反應(yīng)體系為為20^1，其中25 mmol/LMgCl22.0nl: 10xPCR Buffer 2.0^h 10 mmol/L dNTP 0,5^1; 5 U/pl Taq E 0.5^1; 20ng/pl Primer 1.5^1; lOng/W模板DNA 3^1;滅菌雙蒸水10.5^1。適宜的RAPD擴(kuò) 增程序?yàn)?4"C5min; 94'C1 min， 37,C1 min, 72'C 1.5 min (40 cycles); 72'C10 min。 RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析采用濃度為15 g/L的瓊脂糖凝膠(含 0.15ng/LEB)，電泳緩沖液為lxTAE，保持卯V恒壓(4 5 V/cm)電泳1.5~2 h，凝膠成像儀成像分析。
4、 RAPD引物篩選
先以"寒光2號(hào)"品種為模板DNA對(duì)200個(gè)RAPD隨機(jī)引物進(jìn)行篩選， 選出適用于甘藍(lán)且擴(kuò)增產(chǎn)物條帶豐富的引物50個(gè)，再對(duì)雜交品種與其親本 DNA按母本、雜交種、父本的順序組成的兩組材料分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 個(gè)引物中，對(duì)兩組材料擴(kuò)增表現(xiàn)有弱帶、特異型、偏父型、偏母型、互補(bǔ) 型等譜帶類(lèi)型。能對(duì)"爭(zhēng)春"、"寒光2號(hào)"兩組材料擴(kuò)增出互補(bǔ)型譜帶的引物 分別為S42、 S103、 S193和S42、 S89、 S151。其中引物S42對(duì)2個(gè)品種純 度鑒定均有效，其對(duì)"爭(zhēng)春"模板組擴(kuò)增產(chǎn)生的互補(bǔ)特征片段大小約為550 與1050 bp,對(duì)"^光2號(hào)"模板組擴(kuò)增產(chǎn)生的互補(bǔ)特征片段大小約為300、 600與875bp(圖1)。
5、數(shù)字指紋的建立根據(jù)上述RAPD指紋圖譜，以1和0分別代表某 個(gè)等位基因位點(diǎn)擴(kuò)增出的DNA條帶的有無(wú)，按照從上到下即由小片段向大 片段的讀帶方向，將RAPD指紋圖譜轉(zhuǎn)換為由l和O組成的字符串，即構(gòu) 成數(shù)字指紋。為方便建立相應(yīng)的數(shù)字指紋，可先依照RAPD指紋圖譜繪制
直觀的線(xiàn)段示意圖(圖2)，再根據(jù)示意圖建立數(shù)字指紋，是由"r，和"o"組成
的數(shù)據(jù)，艮卩"爭(zhēng)春"母本的數(shù)據(jù)為111111111011110;"爭(zhēng)春"的數(shù)據(jù)為 111111111111111;"爭(zhēng)春"父本的數(shù)據(jù)為111101111111111;"寒光2號(hào)"母本 的數(shù)據(jù)為1100111111111111110;"寒光2號(hào)"的數(shù)據(jù)為1111111111111101111; "寒光2號(hào)"父本的數(shù)據(jù)為0111111110111101111。其中所述數(shù)字"l"表示圖譜 中某個(gè)位置上有擴(kuò)增帶存在，數(shù)字"O"表示在某個(gè)位置上沒(méi)有擴(kuò)增條帶存在。
實(shí)施例2
本發(fā)明的DNA指紋圖譜用于"爭(zhēng)春"和"寒光2號(hào)"種子純度的鑒定 從制種基地生產(chǎn)的"爭(zhēng)春"和"寒光2號(hào)"雜交種中各隨機(jī)抽取50—80個(gè) 單株，用微量DNA提取法提取各單株樣品的DNA,用提取的DNA作為模 板，用S42引物對(duì)其進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖上進(jìn)行電 泳分析。如果利用S42標(biāo)記分析査出的單株DNA指紋是"111111111111111" 即為"爭(zhēng)春"真雜種株，DNA指紋是"111111111011110"或"111101111111111" 即為"爭(zhēng)春"親本自交株，也就是假雜種株。如果利用S42標(biāo)記分析查出的 單株DNA指紋是"1111111111111101111"即為"寒光2號(hào)"真雜種株，DNA指 紋是"1100111111111111110"或"0111111110111101111"即為"寒光2號(hào)"親本 自交株，也就是假雜種株。然后用假雜種株數(shù)除以總分析的株數(shù)，即可獲 得制種基地生產(chǎn)的甘藍(lán)雜交種的純度，較大田種植調(diào)查純度既省時(shí)又便捷， 可以為這些甘藍(lán)雜交種子的銷(xiāo)售及時(shí)地提供純度信息。如果鑒定的純度低 于85%，就不能夠作為種子進(jìn)行銷(xiāo)售，就可能避免假種子傷農(nóng)事件的發(fā)生。 如果鑒定的種子純度高于95%以上，就可以作為精品種子銷(xiāo)售，優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)， 使農(nóng)民和種子經(jīng)銷(xiāo)商均獲得好的經(jīng)濟(jì)效益。
權(quán)利要求
1.甘藍(lán)DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括如下步驟1)提取及純化甘藍(lán)基因組的DNA；2)用獲得的甘藍(lán)DNA為模板進(jìn)行RAPD分析；3)選擇有代表性的多態(tài)性RAPD擴(kuò)增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無(wú)構(gòu)建供試材料DNA指紋圖譜。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，甘藍(lán)雜交種"爭(zhēng)春"、"寒 光2號(hào)"及其各自親本都有其特異的DNA指紋，可以相互區(qū)分開(kāi)來(lái),具體 的指紋數(shù)據(jù)是由"1"和"0"組成，"爭(zhēng)春"母本為111111111011110;"爭(zhēng)春"為111111111111111;"爭(zhēng)春"父本為111101111111111;"寒光2號(hào)"母本為 1100111111111111110;"寒光2號(hào)"為1111111111111101111;"寒光2號(hào)"父本為oiiiiiiiioiiiioiiii，其中所述數(shù)字"r表示圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)增 帶存在，數(shù)字"o"表示在某個(gè)位置上沒(méi)有擴(kuò)增條帶存在。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RAPD擴(kuò)增中采用 的引物為S42，其堿基序列為GGACCCAACC。
4. 權(quán)利要求2所述的建立方法所建立的DNA指紋圖譜的應(yīng)用，其特 征在于，用于甘藍(lán)雜交種"爭(zhēng)春"和"寒光2號(hào)"種子純度的鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種甘藍(lán)雜交種及其親本DNA指紋圖譜及其建立方法和應(yīng)用。建立方法包括1)甘藍(lán)DNA的提取及純化；2)用獲得的高純度甘藍(lán)DNA為模板進(jìn)行RAPD分析；3)選擇有代表性的多態(tài)性RAPD擴(kuò)增條帶構(gòu)建供試材料DNA指紋圖譜；在該DNA指紋圖譜中“爭(zhēng)春”、“寒光2號(hào)”甘藍(lán)雜交種及其親本都有特異的DNA指紋，可以相互區(qū)分開(kāi)來(lái)。由于本發(fā)明DNA指紋圖譜是用圖的形式表示，看起來(lái)比較直觀、易懂；并將其轉(zhuǎn)換成數(shù)碼表示形式，便于計(jì)算機(jī)識(shí)讀和分析。本發(fā)明能從遺傳本質(zhì)上對(duì)“爭(zhēng)春”、“寒光2號(hào)”甘藍(lán)雜交種的種子進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，檢測(cè)迅速。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101177682SQ20061011825
公開(kāi)日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者任云英, 沖 劉, 薄天岳, 陳錦秀 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院