專(zhuān)利名稱(chēng)：一種惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗生素生產(chǎn)領(lǐng)域，特別涉及一種惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克 拉維酸鉀的方法。
背景技術(shù)：
由于青霉素的廣泛使用，某些細(xì)菌尤其是金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素產(chǎn)生了耐
藥性；青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)藥物均含有一個(gè)共同的e-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，屬e-內(nèi)酰胺 類(lèi)抗生素。當(dāng)使用具有這種結(jié)構(gòu)的抗生素時(shí)，部分病原菌通過(guò)產(chǎn)生e—內(nèi)酰胺酶 這一機(jī)制而產(chǎn)生耐藥性。研究和臨床應(yīng)用結(jié)果表明，克拉維酸鉀等e—內(nèi)酰胺酶 抑制劑可大大提高上述病原菌對(duì)e -內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的敏感性。
克拉維酸鉀本身的抗菌活性很弱，但它是強(qiáng)力、廣譜的e-內(nèi)酰胺酶抑制劑。 不論在體外或體內(nèi)都能同耐藥的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，特別是同金黃色葡 萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和奇異變形菌所產(chǎn)生的e—內(nèi)酰胺酶結(jié)合，從而抑制耐 藥性細(xì)菌對(duì)e -內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的分解作用,恢復(fù)青霉素類(lèi)及頭孢菌素類(lèi)抗生素對(duì) 許多產(chǎn)生e —內(nèi)酰胺酶的耐藥菌的抗菌活性。
目前為止，克拉維酸鉀的生產(chǎn)大多采用深層液態(tài)發(fā)酵法菌種為棒狀鏈霉菌， 種子液和發(fā)酵培養(yǎng)基為含有黃豆粉和甘油的合成培養(yǎng)基，在液體發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā) 酵。為了保證鏈霉菌得到充足的供氧，需要持續(xù)不斷的攪拌，不僅耗能大，而且 攪拌產(chǎn)生的剪切力還會(huì)對(duì)損害菌絲體，影響其生長(zhǎng)代謝。另外，克拉維酸鉀產(chǎn)量 不高，且容易分解，使得發(fā)酵液中濃度很低，導(dǎo)致產(chǎn)品分離成本很高。
惰性載體固態(tài)發(fā)酵是一種新的固態(tài)發(fā)酵方式，它是以固態(tài)惰性載體為固態(tài)發(fā) 酵過(guò)程中的固相，以吸附在惰性載體上的培養(yǎng)液作為營(yíng)養(yǎng)物，它具有很多優(yōu)點(diǎn)i) 應(yīng)用范圍廣。惰性載體固態(tài)發(fā)酵除了不能直接利用農(nóng)作物原料，它的應(yīng)用范圍要
廣的多，將應(yīng)用領(lǐng)域拓寬到了以前液態(tài)發(fā)酵一統(tǒng)天下的領(lǐng)域，大大拓寬了固態(tài)發(fā) 酵的應(yīng)用前景；2)惰性載體的性質(zhì)穩(wěn)定，回收方便，可重復(fù)使用；3)降低了產(chǎn)物 分離成本；4)不需要機(jī)械攪拌，能耗低。惰性載體吸附固態(tài)發(fā)酵主要適用于好 氧的高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)，比如克拉維酸鉀和蛋白酶等。
針對(duì)克拉維酸鉀生產(chǎn)中的問(wèn)題和惰性載體固態(tài)發(fā)酵的特點(diǎn)，本發(fā)明采用惰性 載體固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)克拉維酸鉀，并且設(shè)計(jì)特定的發(fā)酵罐，菌種為棒狀鏈霉菌， 使用含有甘油和黃豆提取液的液態(tài)培養(yǎng)基，發(fā)酵罐內(nèi)填充多孔的惰性載體，可以 吸附菌體和發(fā)酵培養(yǎng)基，其獨(dú)特的界面環(huán)境十分有利于發(fā)酵系統(tǒng)的傳熱傳質(zhì)，菌 體可以得到充分的供氧，不需要機(jī)械攪拌，節(jié)省了能耗，也避免了攪拌引起的菌 絲體損傷，提高了發(fā)酵代謝產(chǎn)物中的克拉維酸鉀濃度，節(jié)省產(chǎn)品的分離成本，并 且可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決克拉維酸鉀生產(chǎn)中耗能高、產(chǎn)量不高等問(wèn)題，提供了 一種惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法，達(dá)到既可以提高發(fā)酵系 統(tǒng)的傳熱傳質(zhì)，降低耗能，又提高產(chǎn)量的目的。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供的惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法，其步驟如下 1)制備棒狀鏈霉菌種子液
將購(gòu)自中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心的棒狀鏈霉菌 Sfre/^owycM, C/ovw/^e/w, aC /5/S=J7UC2706A其保藏號(hào)為CCMCC 4.3，接 種于棒狀鏈霉菌斜面培養(yǎng)基，29'C下接種培養(yǎng)；再接種于棒狀鏈霉菌種子培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至產(chǎn)生菌絲體，得到棒狀鏈霉菌種子液；
所述棒狀鏈霉菌斜面培養(yǎng)基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基，其所含組分及配比為可溶 性淀粉20g, KN03lg， MgSO40.5g, K2HPO40.5g， NaCL0.5g， FeSO40.01g，瓊脂 15~20g,水1000ml;
所述棒狀鏈霉菌種子培養(yǎng)基所含組分及配比每1升棒狀鏈霉菌種子培養(yǎng)基
含甘油20g,黃豆粉提取液200g和胨5g/L,其余為水；其pH7.0;
2) 制備棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基
棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基所含組分及配比為每1升棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基含 甘油4~12g、黃豆粉提取液300g、胨10g、氯化鋰20g、鳥(niǎo)氨酸2g和KH2P04 0.8g， 其余為水；
3) 發(fā)酵前的準(zhǔn)備
將預(yù)先切成小塊并經(jīng)清洗干燥后的惰性載體裝填于發(fā)酵罐內(nèi)，所述惰性載體
的裝填高度為發(fā)酵罐罐體體積的1/4，-3/4，發(fā)酵罐內(nèi)距惰性載體充填層上方10cm
處設(shè)置一其上布滿(mǎn)直徑lmm孔洞的分布板；蓋好發(fā)酵罐蓋后，在12rC下滅菌20 分鐘；
將步驟l)得到的棒狀鏈霉菌種子液儲(chǔ)于種子液儲(chǔ)罐中； 將步驟2)制得的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，儲(chǔ)于棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng) 基儲(chǔ)罐中；
所述棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐和所述種子液儲(chǔ)罐分別與發(fā)酵罐頂端相連 通；發(fā)酵罐底部設(shè)有與儲(chǔ)氣罐相連通的無(wú)菌空氣進(jìn)口和與發(fā)酵代謝產(chǎn)物儲(chǔ)罐相連 通的發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口；
4) 制備發(fā)酵代謝產(chǎn)物
先將種子液儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌種子液從發(fā)酵罐頂端泵入發(fā)酵罐內(nèi)，泵入的 棒狀鏈霉菌種子液先經(jīng)分布板均勾分散開(kāi)，然后從分布板的小孔中慢慢流下，滴 落到惰性載體上并逐漸滲透其中，當(dāng)發(fā)酵罐底部的發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口有液體流出 時(shí)，說(shuō)明棒狀鏈霉菌種子液已經(jīng)布滿(mǎn)惰性載體表面，完成棒狀鏈霉菌的接種；
接種完成后，將棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基從發(fā) 酵罐頂端勻速泵入發(fā)酵罐內(nèi)，泵入的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基同樣經(jīng)過(guò)分布板均勻 分布后再流到惰性載體表面，由于惰性載體的多孔性，棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基被 吸附于惰性載體表面并形成液膜，棒狀鏈霉菌種子液中的菌絲體在液膜上生長(zhǎng)繁 殖，并產(chǎn)生發(fā)酵代謝產(chǎn)物；隨著棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的不斷加入，惰性載體吸 附的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基越來(lái)越多，逐漸超過(guò)其吸收能力，后加入的棒狀鏈霉 菌發(fā)酵培養(yǎng)基就會(huì)將惰性載體產(chǎn)生的發(fā)酵代謝產(chǎn)物排擠出來(lái)，流至發(fā)酵罐底部并 從發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口排出，儲(chǔ)于發(fā)酵代謝產(chǎn)物儲(chǔ)罐中，完成一個(gè)發(fā)酵周期；在發(fā)酵過(guò)程中，所述棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基從上向下流動(dòng)并發(fā)酵生成發(fā)酵代 謝產(chǎn)物的同時(shí)，無(wú)菌空氣從發(fā)酵罐底部的無(wú)菌空氣進(jìn)口進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)，經(jīng)惰性載 體內(nèi)部的孔隙流動(dòng)，供給所述棒狀鏈霉菌菌絲體生長(zhǎng)代謝所需的氧氣，最后從設(shè) 于發(fā)酵罐頂部的氣體出口排出；
5)將步驟4)所得發(fā)酵代謝產(chǎn)物經(jīng)堿性陰離子樹(shù)脂交換，用5倍于樹(shù)脂量的 含1.5%氯化鋰的質(zhì)量百分濃度95%的乙醇溶液進(jìn)行解析，得到克拉維酸鉀粗品。
本發(fā)明提供的惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法，還包括步 驟6):將所得克拉維酸鉀鹽粗品通過(guò)732樹(shù)脂交換成克拉維酸鉀鉀水溶液，再進(jìn) 行過(guò)炭脫色、冷凍干燥得克拉維酸鉀純品。
所述的惰性載體為聚氨酯泡沫塑料載體或聚氯乙烯泡沫塑料載體。
所述步驟4)中將棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基泵入 發(fā)酵罐中的流速0.03—0.05ml/min。
所述步驟4)的種子液儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌種子液泵入發(fā)酵罐內(nèi)的流速為0.03 一0.05ml/min。
所述步驟4)中的在棒狀鏈霉菌培養(yǎng)基從上向下流動(dòng)并發(fā)酵生成發(fā)酵代謝產(chǎn)物 的同時(shí)，無(wú)菌空氣從發(fā)酵罐底部的空氣進(jìn)口進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)的流速為5—15ml/min。
本發(fā)明所使用的發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)
如圖1所示，發(fā)酵罐11的罐蓋通過(guò)法蘭與罐體相連，蓋上設(shè)有棒狀鏈霉菌發(fā) 酵培養(yǎng)基進(jìn)口 A、棒狀鏈霉菌種子液進(jìn)口 B和氣體出口 C;棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng) 基進(jìn)口 A通過(guò)管道與棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐1相連通，管道上連有蠕動(dòng)泵；
棒狀鏈霉菌種子液入口 B通過(guò)蠕動(dòng)泵與種子液儲(chǔ)罐10相連通；氣體出口 C直接開(kāi) 口于無(wú)菌空氣中；發(fā)酵罐11的底部設(shè)有無(wú)菌空氣進(jìn)口 D和發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口 E， 無(wú)菌空氣進(jìn)口 D通過(guò)管道與儲(chǔ)氣罐相連通，管道上連有壓縮機(jī)和無(wú)菌空氣流量計(jì); 發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口 E與發(fā)酵代謝產(chǎn)物儲(chǔ)罐2相連通，用來(lái)儲(chǔ)存發(fā)酵代謝產(chǎn)物；
本發(fā)明方法的發(fā)酵前的準(zhǔn)備
發(fā)酵罐11內(nèi)裝填預(yù)先切成小塊并經(jīng)清洗干燥后的惰性載體，惰性載體的裝填高度為發(fā)酵罐罐體體積的1/4~3/4,發(fā)酵罐11內(nèi)距惰性載體充填層上方10cm處設(shè)
置一上面布滿(mǎn)直徑lmm孔洞的分布板;蓋好發(fā)酵罐蓋后，在121'C下滅菌20分鐘;
所述惰性載體為聚氨酯泡沫塑料載體或聚氯乙烯泡沫塑料載體；
棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，儲(chǔ)于棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐l中； 將棒狀鏈霉菌接種到棒狀鏈霉菌種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，至菌絲產(chǎn)生，得棒
狀鏈霉菌種子液，儲(chǔ)于棒狀鏈霉菌種子液儲(chǔ)罐10中；
本發(fā)明方法的棒狀鏈霉菌接種
將棒狀鏈霉菌種子液儲(chǔ)罐10中的棒狀鏈霉菌種子液用蠕動(dòng)泵從種子液進(jìn)口 B 泵入發(fā)酵罐ll內(nèi)后，先經(jīng)分布板被均勻分散開(kāi)，然后從分布板的小孔中慢慢流下, 滴落到惰性載體上并逐漸滲透其中，當(dāng)發(fā)酵罐11底部的發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口 E有液 體流出時(shí)，說(shuō)明棒狀鏈霉菌種子液已布滿(mǎn)惰性載體表面，完成棒狀鏈霉菌的接種;
本發(fā)明方法的發(fā)酵
接種完成后，將棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐l中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基通 過(guò)蠕動(dòng)泵從棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)口 A勻速泵入發(fā)酵罐11中，棒狀鏈霉菌發(fā)酵 培養(yǎng)基流入罐內(nèi)同樣經(jīng)分布板均勻分布后再流到惰性載體表面，由于惰性載體的 多孔性，棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基被吸附在惰性載體表面并形成液膜；棒狀鏈霉菌 種子液的菌體在液膜上面生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物；隨著棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基 的不斷加入，惰性載體吸附的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基越來(lái)越多，逐漸超過(guò)其吸附 能力，后加入的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基就會(huì)將惰性載體產(chǎn)生的發(fā)酵代謝產(chǎn)物排擠 出來(lái)，流至發(fā)酵罐底部從發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口E排出，儲(chǔ)于發(fā)酵代謝產(chǎn)物儲(chǔ)罐2中；
棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基流動(dòng)的同時(shí)，無(wú)菌空氣從發(fā)酵罐11底部的無(wú)菌空氣進(jìn)口 D
進(jìn)入罐內(nèi)，在惰性載體內(nèi)部的孔隙內(nèi)流動(dòng)，以供給棒狀鏈霉菌菌絲體生長(zhǎng)代謝所需的
氧氣，最后從罐頂部的氣體出口C排出；
在發(fā)酵過(guò)程中，棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基沿著惰性載體不斷向下流動(dòng)，進(jìn)入罐內(nèi) 的無(wú)菌空氣則沿著惰性載體的孔隙不斷向上流動(dòng)，棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的流動(dòng)和 無(wú)菌空氣的流動(dòng)都是連續(xù)的，棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基不斷被泵入發(fā)酵罐內(nèi)，又不斷 的流出發(fā)酵罐外，整個(gè)過(guò)程只需要接種一次菌種，就可以源源不斷的得到發(fā)酵產(chǎn)
物，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵過(guò)程的連續(xù)化。
本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)
(1) 由于惰性載體的使用和發(fā)酵罐的合理選擇和設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)過(guò)程的連 續(xù)化，提高了生產(chǎn)效率；反應(yīng)器設(shè)計(jì)為立式，發(fā)酵液自上面流入，然后靠自身重 力從下面流出；發(fā)酵罐的上部有一個(gè)分布板，起分散發(fā)酵液的作用；操作開(kāi)始時(shí)， 先以很低的流量滴加棒狀鏈霉菌種子液，棒狀鏈霉菌種子液被分布板所阻隔，均 勻的分散開(kāi)來(lái)，然后慢慢的流入下面的惰性載體中，均勻的被惰性載體吸住。然 后，發(fā)酵液以很低的流量加入發(fā)酵罐，經(jīng)過(guò)分布板慢慢滲入惰性載體；惰性載體 具有很好的吸水性和孔隙率，吸附在惰性載體上的發(fā)酵液形成液膜，四周是連續(xù) 的無(wú)菌空氣，微生物就在液膜內(nèi)生長(zhǎng)；隨著發(fā)酵液的不斷加入，惰性載體吸附量 越來(lái)越大，但超過(guò)起它的吸附上限時(shí)，上面的新發(fā)酵液憑借施加在惰性載體的重 力作用，將惰性載體中的發(fā)酵代謝產(chǎn)物擠出，使其向下流動(dòng)，然后惰性載體再吸 附新加入的發(fā)酵液；發(fā)酵液就以此方式向下流動(dòng)；然后被擠出的發(fā)酵代謝產(chǎn)物流 出發(fā)酵罐，完成一個(gè)發(fā)酵周期；整個(gè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)了連續(xù)進(jìn)料出料，而且只需要接種 一次，真正實(shí)現(xiàn)了固態(tài)發(fā)酵的連續(xù)化；
(2) 不需要機(jī)械攪拌，耗能低現(xiàn)有技術(shù)中的深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀 需要持續(xù)不斷的攪拌，才能保證菌體始終獲得足夠的氧氣，能耗很大；而本發(fā)明 發(fā)酵方式由于使用了多孔吸附惰性載體，發(fā)酵液在惰性載體表面形成液膜，菌體 生長(zhǎng)在液膜上，整個(gè)體系具有很大的比表面積，可以保證始終足夠的氧氣供應(yīng)， 不需要機(jī)械攪拌，從而節(jié)省了大量能耗；
(3) 對(duì)菌絲體損害小產(chǎn)克拉維酸鉀的菌體是放線菌，長(zhǎng)有豐富的菌絲體， 機(jī)械攪拌容易損傷菌絲，從而影響其生長(zhǎng)代謝；本發(fā)明由于采用惰性載體固態(tài)發(fā) 酵沒(méi)有機(jī)械攪拌，因此避免了菌絲的損傷，使得菌體生長(zhǎng)代謝更旺盛；
(4) 產(chǎn)物濃度高，降低了分離成本惰性固態(tài)惰性載體為固定相，流動(dòng)的發(fā)
酵液與流動(dòng)的氣體都是流動(dòng)相，發(fā)酵液沿著惰性載體向下流動(dòng)，而氣體沿著惰性 載體內(nèi)的連通孔隙向上流動(dòng)；液相是不連續(xù)的，以液膜方式存在，而氣體是連續(xù) 相，無(wú)處不在；微生物就生活在液膜里，靠液膜中的發(fā)酵液和附近的無(wú)菌空氣來(lái)
生長(zhǎng)代謝，惰性載體固態(tài)發(fā)酵的這種結(jié)構(gòu)為微生物的生長(zhǎng)提供了巨大且維持穩(wěn)定 的比表面積，極大地促進(jìn)了氣體地傳遞；比現(xiàn)有技術(shù)中的液態(tài)發(fā)酵需要持續(xù)不停 的攪拌才能保證良好的通氣條件，此方法節(jié)約了大量能源，而且提高了產(chǎn)率。
總之，本發(fā)明的方法不需要機(jī)械攪拌，傳熱傳質(zhì)情況良好；所使用的惰性載體為 來(lái)源廣泛價(jià)格便宜的聚氨酯泡沫塑料或聚氯乙烯泡沫塑料，孔隙度大，可多次使用， 易于高壓滅菌；該方法可節(jié)約大量能源，而且克拉維酸鉀的產(chǎn)率得以提高。


附圖1為本發(fā)明方法使用的發(fā)酵裝置的結(jié)構(gòu)示意其中棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐1 發(fā)酵代謝產(chǎn)物儲(chǔ)罐2
棒狀鏈霉菌發(fā)酵種子液儲(chǔ)罐10
棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基入口 A
氣體出口C
發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口E
發(fā)酵罐ll
棒狀鏈霉菌發(fā)酵種子液入口 B 無(wú)菌空氣入口D
具體實(shí)施例方式
圖1為本發(fā)明方法使用的發(fā)酵裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；由圖1可知，發(fā)酵罐11內(nèi) 裝填預(yù)先切成小塊并經(jīng)清洗干燥后的惰性載體，惰性載體的裝填高度為發(fā)酵罐罐 體體積的1/4~3/4，發(fā)酵罐11內(nèi)距惰性載體充填層上方10cm處設(shè)置一上面布滿(mǎn)直 徑lmm孔洞的分布板；蓋好發(fā)酵罐蓋后，在121'C下滅菌20分鐘；所裝填的惰性 載體為聚氨酯泡沫塑料載體或聚氯乙烯泡沫塑料載體。
實(shí)施例1
用本發(fā)明的方法制備克拉維酸鉀，其步驟如下
l)制備棒狀鏈奪菌種子液
將購(gòu)自中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心的棒狀鏈霉菌
(S/r印to加yces, C7av "gemy, CO C7"7S-J7UC270W,其保藏號(hào)為CCMCC 4.3)
接種于棒狀鏈霉菌斜面培養(yǎng)基，29'C下接種培養(yǎng)；再接種于棒狀鏈霉菌種于培養(yǎng)
基中培養(yǎng)至產(chǎn)生菌絲體，得到棒狀鏈霉菌種子液裝于圖1中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵種
子液儲(chǔ)罐10內(nèi)；
所述棒狀鏈霉菌斜面培養(yǎng)基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基，其所含組分及配比為可溶
性淀粉20g， KN03lg, MgSO40.5g, K2HPO40.5g, NaCL0.5g, FeSO40.01g，瓊脂 15~20g，水畫(huà)ml;
所述棒狀鏈霉菌種子培養(yǎng)基所含組分及配比每1升棒狀鏈霉菌種子培養(yǎng)基
含甘油20g,黃豆粉提取液200g和胨5g,其余為水；其pH7.0;
2) 制備棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基
每1升棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基含甘油4~12g、黃豆粉提取液300g、胨10g、 氯化鋰20g、鳥(niǎo)氨酸2g和KH2PO4 0.8g，其余為水；并裝于棒狀鏈霉菌發(fā)酵種子液 儲(chǔ)罐10內(nèi)；
3) 制備發(fā)酵代謝產(chǎn)物
先將種子液儲(chǔ)罐10中的棒狀鏈霉菌種子液用蠕動(dòng)泵從其頂端泵入發(fā)酵罐11 內(nèi)，先經(jīng)分布板均勻分散開(kāi)，然后從分布板的小孔中慢慢流下，滴落到惰性載體 上并逐漸滲透其中，當(dāng)發(fā)酵罐底部的發(fā)酵液出口有液體流出時(shí)，說(shuō)明棒狀鏈霉菌 種子液已經(jīng)布滿(mǎn)惰性載體表面，完成棒狀鏈霉菌的接種；
接種完成后，將棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐1中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基通 過(guò)蠕動(dòng)泵從其頂端勻速泵入發(fā)酵罐11中，同樣經(jīng)過(guò)分布板均勻分布后再流到惰性 載體表面，由于惰性載體的多孔性，棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基被吸附于惰性載體表 面并形成液膜，棒狀鏈霉菌種子液中的菌絲體在液膜上生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生發(fā)酵代 謝產(chǎn)物；隨著棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的不斷加入，惰性載體吸附的棒狀鏈霉菌發(fā) 酵培養(yǎng)基越來(lái)越多，逐漸超過(guò)其吸收能力，后加入的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基就會(huì) 將惰性載體產(chǎn)生的發(fā)酵代謝產(chǎn)物排擠出來(lái)，流至發(fā)酵罐底部并從發(fā)酵代謝產(chǎn)物出 口排出，并儲(chǔ)于發(fā)酵代謝產(chǎn)物儲(chǔ)罐2中，完成一個(gè)發(fā)酵周期；
在上述棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基從上向下流動(dòng)并發(fā)酵生成發(fā)酵代謝產(chǎn)物的同 時(shí)，無(wú)菌空氣從發(fā)酵罐底部的無(wú)菌空氣進(jìn)口D進(jìn)入發(fā)酵罐ll內(nèi)，經(jīng)惰性載體內(nèi)部 的孔隙流動(dòng)，供給所述棒狀鏈霉菌菌絲體生長(zhǎng)代謝所需的氧氣，最后從設(shè)于發(fā)酵
罐11頂部的氣體出口 C排出；棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基沿著惰性載體不斷向下流動(dòng)， 進(jìn)入罐內(nèi)的無(wú)菌空氣則沿著惰性載體的孔隙不斷向上流動(dòng)；
在發(fā)酵過(guò)程中，棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的流動(dòng)和無(wú)菌空氣的流動(dòng)都是連續(xù)的， 棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基不斷被泵入發(fā)酵罐11內(nèi)，又不斷的流出發(fā)酵罐11外，整個(gè) 過(guò)程只需要接種一次菌種，就可以源源不斷的得到發(fā)酵代謝產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程 的連續(xù)化；
4)將步驟3)所得發(fā)酵代謝產(chǎn)物經(jīng)堿性陰離子樹(shù)脂交換，用LiCL的乙醇液處 理后制成克拉維酸鉀鹽粗品。
將所得克拉維酸鉀鹽粗品通過(guò)732樹(shù)脂交換后成克拉維酸鉀鉀水溶液，再進(jìn) 行過(guò)炭脫色、冷凍干燥得克拉維酸鉀鉀純品。
本實(shí)施例所用惰性載體為聚氨酯泡沫塑料載體；
本實(shí)施例步驟3)中將棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基 通過(guò)蠕動(dòng)泵從其頂端泵入發(fā)酵罐中的流速0.03ml/min。
本實(shí)施例步驟3)的種子液儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌種子液從其頂端泵入發(fā)酵罐內(nèi) 的流速為0.03ml/min。
本實(shí)施例步驟3)中的在棒狀鏈霉菌培養(yǎng)基從上向下流動(dòng)并發(fā)酵生成發(fā)酵代謝 產(chǎn)物的同時(shí)，無(wú)菌空氣從發(fā)酵罐底部的空氣進(jìn)口進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)的流速為5ml/min。
實(shí)施例2
用本發(fā)明的方法制備克拉維酸鉀，其步驟同實(shí)施例l，與實(shí)施例l不同的是 本實(shí)施例所用惰性載體為聚氯乙烯泡沫塑料載體；
本實(shí)施例步驟3)中將棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基 通過(guò)蠕動(dòng)泵從其頂端泵入發(fā)酵罐中的流速0.04ml/min。
本實(shí)施例步驟3)的種子液儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌種子液從其頂端泵入發(fā)酵罐內(nèi) 的流速為0.04ml/min。
本實(shí)施例步驟3)中的在棒狀鏈霉菌培養(yǎng)基從上向下流動(dòng)并發(fā)酵生成發(fā)酵代謝 產(chǎn)物的同時(shí)，無(wú)菌空氣從發(fā)酵罐底部的空氣進(jìn)口進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)的流速為13ml/min。
實(shí)施例3
用本發(fā)明的方法制備克拉維酸鉀，其步驟同實(shí)施例l，與實(shí)施例l不同的是-本實(shí)施例所用惰性載體為聚氯乙烯泡沫塑料載體；
本實(shí)施例步驟3)中將棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基 通過(guò)蠕動(dòng)泵從其頂端泵入發(fā)酵罐中的流速0.05ml/min。
本實(shí)施例步驟3)的種子液儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌種子液從其頂端泵入發(fā)酵罐內(nèi) 的流速為0.05ml/min。
本實(shí)施例步驟3)中的在棒狀鏈霉菌培養(yǎng)基從上向下流動(dòng)并發(fā)酵生成發(fā)酵代謝 產(chǎn)物的同時(shí)，無(wú)菌空氣從發(fā)酵罐底部的空氣進(jìn)口進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)的流速為15ml/min。
權(quán)利要求
1、一種惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法，其步驟如下1)制備棒狀鏈霉菌種子液將購(gòu)自中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心的棒狀鏈霉菌接種于棒狀鏈霉菌斜面培養(yǎng)基，29℃下接種培養(yǎng)；再接種于棒狀鏈霉菌種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至產(chǎn)生菌絲體，得到棒狀鏈霉菌種子液；所述棒狀鏈霉菌保藏號(hào)為為CCMCC 4.3；所述棒狀鏈霉菌斜面培養(yǎng)基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基，其所含組分及配比為可溶性淀粉20g，KNO3 1g，MgSO4 0.5g，K2HPO4 0.5g，NaCL 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.01g，瓊脂15～20g，水1000ml；所述棒狀鏈霉菌種子培養(yǎng)基所含組分及配比每1升棒狀鏈霉菌種子培養(yǎng)基含甘油20g，黃豆粉提取液200g和胨5g，其余為水，pH 7.0；2)制備棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基所述棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基所含組分及配比每1升棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基含甘油4～12g、黃豆粉提取液300g、胨10g、氯化鋰20g、鳥(niǎo)氨酸2g和KH2PO4 0.8g，其余為水；3)發(fā)酵前的準(zhǔn)備將預(yù)先切成小塊并經(jīng)清洗干燥后的惰性載體裝填于發(fā)酵罐內(nèi)，所述惰性載體的裝填高度為發(fā)酵罐罐體體積的1/4～3/4，發(fā)酵罐內(nèi)距惰性載體充填層上方10cm處設(shè)置一其上布滿(mǎn)直徑1mm孔洞的分布板；蓋好發(fā)酵罐蓋后，在121℃下滅菌20分鐘；將步驟1)得到的棒狀鏈霉菌種子液儲(chǔ)于種子液儲(chǔ)罐中；將步驟2)制得的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，儲(chǔ)于棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐中；所述棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐和所述種子液儲(chǔ)罐分別與發(fā)酵罐頂端相連通；發(fā)酵罐底部設(shè)有與儲(chǔ)氣罐相連通的無(wú)菌空氣進(jìn)口和與發(fā)酵代謝產(chǎn)物儲(chǔ)罐相連通的發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口；4)制備發(fā)酵代謝產(chǎn)物先將種子液儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌種子液從發(fā)酵罐頂端泵入發(fā)酵罐內(nèi)，泵入的棒狀鏈霉菌種子液先經(jīng)分布板均勻分散開(kāi)，然后從分布板的小孔中慢慢流下，滴落到惰性載體上并逐漸滲透其中，當(dāng)發(fā)酵罐底部的發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口有液體流出時(shí)，說(shuō)明棒狀鏈霉菌種子液已經(jīng)布滿(mǎn)惰性載體表面，完成棒狀鏈霉菌的接種；接種完成后，將棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基從發(fā)酵罐頂端勻速泵入發(fā)酵罐內(nèi)，泵入的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基同樣經(jīng)過(guò)分布板均勻分布后再流到惰性載體表面，由于惰性載體的多孔性，棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基被吸附于惰性載體表面并形成液膜，棒狀鏈霉菌種子液中的菌絲體在液膜上生長(zhǎng)繁殖，并產(chǎn)生發(fā)酵代謝產(chǎn)物；隨著棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的不斷加入，惰性載體吸附的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基越來(lái)越多，逐漸超過(guò)其吸收能力，后加入的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基就會(huì)將惰性載體產(chǎn)生的發(fā)酵代謝產(chǎn)物排擠出來(lái)，流至發(fā)酵罐底部并從發(fā)酵代謝產(chǎn)物出口排出，儲(chǔ)于發(fā)酵代謝產(chǎn)物儲(chǔ)罐中，完成一個(gè)發(fā)酵周期；在發(fā)酵過(guò)程中，所述棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基從上向下流動(dòng)并發(fā)酵生成發(fā)酵代謝產(chǎn)物的同時(shí)，無(wú)菌空氣從發(fā)酵罐底部的無(wú)菌空氣進(jìn)口進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)，經(jīng)惰性載體內(nèi)部的孔隙流動(dòng)，供給所述棒狀鏈霉菌菌絲體生長(zhǎng)代謝所需的氧氣，最后從設(shè)于發(fā)酵罐頂部的氣體出口排出；5)將步驟4)所得發(fā)酵代謝產(chǎn)物經(jīng)堿性陰離子樹(shù)脂交換，用5倍于樹(shù)脂量的含1.5％氯化鋰的重量百分濃度為95％的乙醇液處理后制成克拉維酸鉀粗品。
2、 按權(quán)利要求1所述的惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法， 其特征在于，還包括步驟6):將所得克拉維酸鉀鹽粗品通過(guò)732樹(shù)脂交換成克拉 維酸鉀鉀水溶液，再進(jìn)行過(guò)炭脫色、冷凍干燥得克拉維酸鉀純品。
3、 按權(quán)利要求1所述的惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法， 其特征在于，所述的惰性載體為聚氨酯泡沫塑料載體或聚氯乙烯泡沫塑料載體。
4、 按權(quán)利要求1所述的惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法， 其特征在于，所述步驟4)中將棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌發(fā)酵培 養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐中的流速0.03—0.05ml/min。
5、 按權(quán)利要求1所述的惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法， 其特征在于，所述步驟4)的種子液儲(chǔ)罐中的棒狀鏈霉菌種子液泵入發(fā)酵罐內(nèi)的流 速為0.03-0.05ml/min。
6、 按權(quán)利要求1所述的惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法， 其特征在于，所述步驟4)中的在棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基從上向下流動(dòng)并發(fā)酵生成 發(fā)酵代謝產(chǎn)物的同時(shí)，無(wú)菌空氣從發(fā)酵罐底部的空氣進(jìn)口進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)的流速為5 -15ml/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及的惰性載體吸附固態(tài)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸鉀的方法將棒狀鏈霉菌種子液和棒狀鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基先后從發(fā)酵罐頂部經(jīng)分布板分散向下流至惰性載體，種子液充填于載體內(nèi)，發(fā)酵培養(yǎng)基覆于載體上形成液膜，種子液的菌絲體在液膜上生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生發(fā)酵代謝產(chǎn)物，同時(shí)無(wú)菌空氣從罐底流經(jīng)分布板為發(fā)酵提供氧氣；隨發(fā)酵培養(yǎng)基的加入和載體吸附的超載，發(fā)酵代謝產(chǎn)物流出罐外；之后再經(jīng)堿性陰離子樹(shù)脂交換，5倍于樹(shù)脂量的含1.5％氯化鋰的95％乙醇液處理得克拉維酸鉀；發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵培養(yǎng)基不斷被泵入，又不斷流出，只需接種一次菌種，就可源源不斷得到發(fā)酵代謝產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵連續(xù)化；發(fā)酵過(guò)程不需攪拌，傳熱傳質(zhì)好，能耗低，克拉維酸鉀產(chǎn)率高。
文檔編號(hào)C12P17/18GK101173307SQ20061011430
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月3日
發(fā)明者麾 王, 陳洪章 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所