專利名稱：：應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，尤其涉及應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法。
背景技術(shù)：
：國外曾報道應(yīng)用早熟染色體凝集技術(shù)來研究細(xì)胞在接受射線照射后染色體損傷狀況，這是一種快速而精確的研究方法。但是這種方法僅僅應(yīng)用于研究輻射誘導(dǎo)的染色體損傷，沒有明確提出染色體損傷和細(xì)胞輻射敏感性之間的必然關(guān)系，而且，沒有早熟染色體誘導(dǎo)效率的相關(guān)報道。癌癥是致死率很高的疾病之一。放射生物學(xué)家都把研發(fā)一種能夠預(yù)測腫瘤放射效應(yīng)的方法作為主要目標(biāo)。精確的腫瘤放射效應(yīng)的預(yù)測分析方法不僅可以為癌癥的治療提供理論依據(jù)，而且能夠給臨床醫(yī)生選擇診療方案提供極大的幫助?？寺⌒纬煞ㄊ且环N常用的研究腫瘤放射效應(yīng)的方法之一(Girin勿T，B咖heimA,Lubin民etal.InternationalJournalofRadiationOncologyBiologyPhysics,1994,30:789;WestCM,DavidsonSE，RobertsSA,etal.BritishJournalofCancer,1997,76:1184;CocoMartin,JM,MoorenE,OttenheimC，etal"InternationalJournalofRadiation,Biology,1999,75:1161;KawataT,ItoH，GeorgeK，改al.RadiationResearch,2003,159:597)，但是作為一種常規(guī)的方法，它至少需要14—21天的時間才能形成克隆，對于臨床診斷和治療就不太可行。應(yīng)用早熟染色體凝集技術(shù)來研究腫瘤的輻射效應(yīng)，從細(xì)胞處理到結(jié)果統(tǒng)計僅需要2天時間。自從Johnson等(JohnsonRTandRaoPN.Nature,1970,226:717)，Hittelman等(Hi他lman■andRaoPN.MutationResearch,1974，23:251)，Comforth等(CornforthMNandBedfordJS.Science,1983，222:1141)應(yīng)用早熟染色體凝集(prematurechromosomecondensationPCC)技術(shù)研究放射誘導(dǎo)的染色體損傷以來，PCC技術(shù)已經(jīng)成為一種研究輻射誘導(dǎo)各細(xì)胞周期時相染色體原初損傷的成熟的方法，尤其在G2期，這一技術(shù)效果更佳。G,和G2是細(xì)胞周期的兩個階段，G,是和程前間期，G2是分裂前間期。研究資料報道了不同種類的細(xì)胞系經(jīng)不同種類的射線如X射線、Y射線以及重離子束照射后表現(xiàn)出了線性劑量依賴關(guān)系。但大多的研究側(cè)重于對細(xì)胞G2期的研究，對于G,期以及Gt期和G2期相關(guān)性的研究報道很少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法。利用早熟染色體凝集預(yù)測研究了Y射線對肝癌細(xì)胞SMMC-7721的輻射效應(yīng)，結(jié)果表明G,和G2期細(xì)胞內(nèi)的染色單體和等點染色單體斷裂數(shù)與照射劑量之間存在著線性相關(guān)性，染色單體斷裂總數(shù)與細(xì)胞存活率之間存在良好的線性相關(guān)性。說明輻射誘導(dǎo)的染色單體斷裂可以作為預(yù)測SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)在輻射敏感性的指標(biāo)，也可為臨床診斷和治療肝癌提供依據(jù)。本發(fā)明的目的可以通過采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，其主要特點包括有如下步驟(1)培養(yǎng)細(xì)胞，待其處于對數(shù)生長期時開始操作；(2)在照射前5分鐘加入45—55nmol/L早熟染色體凝集誘導(dǎo)劑蛋白絲氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制劑CalyculinA;(3)分別按照不同劑量對細(xì)胞進(jìn)行照射；(4)用克隆形成法測定照射后細(xì)胞的存活率；(5)胰酶消化，收集各劑量照射點細(xì)胞，通過低滲、固定處理，滴片制作早熟染色體凝集染色體樣本；(6)計數(shù)染色體斷裂的結(jié)果，并和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)進(jìn)行擬合，從而得出染色體斷裂與細(xì)胞輻射敏感性之間的關(guān)系。所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法還包括有所述的早熟染色體凝集誘導(dǎo)劑CalyculinA的制備，將Calyculin-A溶于濃度大于99.99%的乙醇里制成lmM的儲存液；照射前將其加入需照射細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)，終濃度為50nM。所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法還包括有所述的克隆形成法包括細(xì)胞培養(yǎng)、消化、細(xì)胞種植、形成克隆。所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法所述的染色體的制備，細(xì)胞經(jīng)照射后在37°C，5%C02的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30~120分鐘；收集細(xì)胞，75mMKCl低滲處理15"25分鐘，卡諾氏液固定，最后以少量固定液懸浮細(xì)胞，滴片，在熱蒸汽上烘干，溫度在85"90。C，2%-5%姬姆薩Giemsa染色。所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，包括有按照Savage(SavageJRK.JournalofMedicalGenetics,1975,13:103)報道的標(biāo)準(zhǔn)，每個劑量點不少于40個的G2期細(xì)胞染色體，并計算其染色單體和等點染色單體的斷裂數(shù)，同時，記錄在此過程中出現(xiàn)的G,期細(xì)胞，每個等點染色單體斷裂被計為兩個斷裂。這是因為一個等點染色體斷裂是指發(fā)生在兩條染色單體同一位置的兩個斷裂。本發(fā)明還包括有G,和G2期細(xì)胞內(nèi)的染色單體和等點染色單體斷裂數(shù)與照射劑量之間的關(guān)系為Gi期細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)小于G2期細(xì)胞的數(shù)量，兩者之間的比值介于12.5和20之間。由于改進(jìn)了國外報道的技術(shù)方法，首次測定了化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞在經(jīng)射線照射后發(fā)生早熟染色體凝集的誘導(dǎo)效率，即化學(xué)誘導(dǎo)劑CalyculinA花萼海綿素誘導(dǎo)的02早熟染色體凝集是G,早熟染色體凝集的5到8倍，即Gi期細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)小于G2期細(xì)胞的數(shù)量，兩者之間的比值介于12.5和20之間。這樣就避免了檢測所有細(xì)胞周期時相早熟染色體凝集的工作量大、而且除G2期外其他時相早熟染色體凝集損傷不易分辨和計數(shù)的缺點，在以后的工作中，只要檢測G2早熟染色體凝集，就可以來判定受試細(xì)胞的輻射敏感性。所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，包括有染色單體斷裂總數(shù)與細(xì)胞存活率之間的關(guān)系為S=exp(-0.03D-0.06D2)，其中R2=l，a和(3值分別為0.03和0.06。本發(fā)明的有益效果是，公開了一種應(yīng)用于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法。本發(fā)明可以快速、精確地預(yù)測腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性；耗時短，24小時之內(nèi)可以給出結(jié)果；工作量小，只需要檢測40個G2期細(xì)胞內(nèi)的染色體斷裂類型和數(shù)目就可以給出結(jié)果。本發(fā)明廣泛地應(yīng)用到腫瘤臨床放射治療機(jī)構(gòu)，用于放射治療計劃的制定。圖1為SMMC-7721細(xì)胞存活曲線；圖2為G,與G2期染色單體斷裂劑量效應(yīng)關(guān)系；圖3為G2期細(xì)胞等點染色單體斷裂與照射劑量之間的關(guān)系；圖4為G2期染色單體斷裂數(shù)和等點染色單體斷裂數(shù)與細(xì)胞存活之間的關(guān)系。具體實施例方式以下結(jié)合附圖所示之最佳實施例作進(jìn)一步詳述實施例l:一種應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，有如下步驟(1)培養(yǎng)細(xì)胞，待其處于對數(shù)生長期時開始操作；細(xì)胞培養(yǎng)人類肝癌細(xì)胞系SMMC-7721(購自CCTCC)用含有10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)液在37aC，5%C02的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(2)在照射前5分鐘加入50nmol/L早熟染色體凝集誘導(dǎo)劑蛋白絲氨酸維氨酸磷酸酶抑制劑CalyculinA;(2)分別按照不同劑量對細(xì)胞進(jìn)行照射；細(xì)胞照射指數(shù)生長期的人類肝癌細(xì)胞SMMC-7721在蘭州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院6()0)源產(chǎn)生的Y射線(劑量率0.20^111111)進(jìn)行照射。(4)用克隆形成法測定照射后細(xì)胞的存活率；克隆形成法包括細(xì)胞培養(yǎng)、消化、細(xì)胞種植、形成克隆等步驟。(5)胰酶消化，收集各劑量照射點細(xì)胞，通過低滲、固定處理，滴片制作早熟染色體凝集染色體樣本。(6)計數(shù)染色體斷裂的結(jié)果，并和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)進(jìn)行擬合，從而得出染色體斷裂與細(xì)胞輻射敏感性之間的關(guān)系。觀察每個劑量點不少于40個的G2期細(xì)胞染色體，并計算其染色單體和等點染色單體的斷裂數(shù)，同時，記錄在此過程中出現(xiàn)的G!期細(xì)胞,每個等點染色單體斷裂被計為兩個斷裂。實施例2:本發(fā)明早熟染色體凝集誘導(dǎo)劑CalyculinA的制備方法，將Calyculin-A溶于100%的乙醇里制成lmM的儲存液；照射前將其加入需照射細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)，終濃度為50nM。實施例3:本發(fā)明染色體的制備方法，細(xì)胞經(jīng)照射后在37'C，5n/oC02的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘。收集細(xì)胞，75mM，KC1低滲處理20minutes,卡諾氏液固定，最后以少量固定液懸浮細(xì)胞，滴片，在熱蒸汽上烘干，溫度在85^9(TC，5。/。Giemsa姬姆薩染色。實施例4:包括有G，和G2期細(xì)胞內(nèi)的染色單體和等點染色單體斷裂數(shù)與照射劑量之間的關(guān)系為G,期細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)小于G2期細(xì)胞的數(shù)量，兩者之間的比值介于12.5和20之間。Calyculin-A是一種蛋白絲氨膨酪氨酸磷酸酶抑制劑，是一種有效的PCC誘導(dǎo)劑，它可以在細(xì)胞周期的各個時相誘導(dǎo)染色體凝集，尤其在G2期其誘導(dǎo)效率更高。Calyculin-A在50nM的濃度下可使混合細(xì)胞發(fā)生早熟染色體凝集，被凝集的染色體中，G,期細(xì)胞約占20W，80%左右為02期細(xì)胞，把這兩個時相細(xì)胞數(shù)的比例稱為PCC誘導(dǎo)效率。Calyculin-A誘導(dǎo)02期染色體凝集的效率是G,期的5—8倍，在各個劑量點，.當(dāng)計數(shù)40個G2期細(xì)胞時，分別有5到8個G,期細(xì)胞進(jìn)入計數(shù)范圍，說明在此實驗中PCC誘導(dǎo)效率是12.5%~20%，結(jié)果見表l。表1G,期與G2期早熟染色體凝集細(xì)胞數(shù)及比例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>該結(jié)果顯示G,期細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)小于G2期細(xì)胞的數(shù)量，兩者之間的比值介于12.5和20之間，通過重復(fù)實驗，我們發(fā)現(xiàn)了這一規(guī)律，因此，我們認(rèn)為可以利用這一比值關(guān)系的確定性來只采用G2期PCC分析染色體斷裂的結(jié)果，從而避免了大量繁重的工作，這也是該方法最有價值之處。實施例5:包括有染色單體斷裂總數(shù)與細(xì)胞存活率之間的關(guān)系為SDcp(-0.03D-0.06D2)，其中R2=l，a和p值分別為0.03和0.06。圖1為SMMC-7721經(jīng)Y射線照射后的存活曲線。該曲線經(jīng)線性平方擬合后結(jié)果良好，方程為S=exp(-0.03D-0.06D2)，R2=l，a和p值分別為0.03和0.06。|3值大于a值表明在細(xì)胞殺傷貢獻(xiàn)方面，高劑量輻射較好地克服了細(xì)胞修復(fù)即時效應(yīng)，存活率以指數(shù)形式衰減，而不像低劑量輻射時以線性衰減為主。在G期和G2期，染色單體斷裂數(shù)的增加與細(xì)胞存活率的下降都具有良好的線性相關(guān)性。圖2顯示了G,期和G2期細(xì)胞染色單體斷裂數(shù)與照射劑量之間的關(guān)系。不論在G,期還是G2期，染色單體斷裂數(shù)與劑量呈線性增長關(guān)系。在同一劑量點，Gi期平均每細(xì)胞染色單體斷裂數(shù)要少于G2期，兩者之間的比值介于12.5和20之間。圖3為G2期細(xì)胞等點染色單體斷裂與照射劑量之間的關(guān)系。經(jīng)線性回歸分析，其回歸方程為j^ftW+ft2c，/2=0.卯，說明兩者之間具有良好的線性相關(guān)。圖4為G2期染色單體斷裂數(shù)和等點染色單體斷裂數(shù)與細(xì)胞存活之間的關(guān)系。應(yīng)用直線回歸分析，在G2期細(xì)胞中，染色單體斷裂數(shù)和等點染色單體斷裂數(shù)與細(xì)胞存活率之間具有比較好的相關(guān)性。盡管個別數(shù)據(jù)點小幅偏離擬合曲線，但斷裂數(shù)隨著細(xì)胞存活率下降而增長的趨勢是明顯的。權(quán)利要求1.一種應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，其特征包括有如下步驟(1)培養(yǎng)細(xì)胞，待其處于對數(shù)生長期時開始操作；(2)在照射前5分鐘加入45-55nmol/L早熟染色體凝集誘導(dǎo)劑蛋白絲氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制劑CalyculinA；(3)分別按照不同劑量對細(xì)胞進(jìn)行照射；(4)用克隆形成法測定照射后細(xì)胞的存活率；(5)胰酶消化，收集各劑量照射點細(xì)胞，通過低滲、固定處理，滴片制作早熟染色體凝集染色體樣本；(6)計數(shù)染色體斷裂的結(jié)果，并和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)進(jìn)行擬合，從而得出染色體斷裂與細(xì)胞輻射敏感性之間的關(guān)系。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，其特征還包括有所述的早熟染色體凝集誘導(dǎo)劑CalyculinA的制備，將Calyculin-A溶于濃度大于99.99n/。的乙醇里制成lmM的儲存液；照射前將其加入需照射細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)，終濃度為50nM。3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，其特征還包括有所述的克隆形成法包括細(xì)胞培養(yǎng)、消化、細(xì)胞種植、形成克隆。4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，其特征包括有所述的染色體的制備，細(xì)胞經(jīng)照射后在36—37.5°C，4.5—5.5n/oC02的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3O"120分鐘；收集細(xì)胞，75mMKCl低滲處理15—25分鐘，卡諾氏液固定，最后以少量固定液懸浮細(xì)胞，滴片，在熱蒸汽上烘干，溫度在85—9(TC，2%-5%姬姆薩染色。5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，其特征包括有觀察每個劑量點不少于40個的G2期細(xì)胞染色體，并計算其染色單體和等點染色單體的斷裂數(shù)，同時，記錄在此過程中出現(xiàn)的G;期細(xì)胞，每個等點染色單體斷裂被計為兩個斷裂。6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，其特征包括有G,和G2期細(xì)胞內(nèi)的染色單體和等點染色單體斷裂數(shù)與照射劑量之間的關(guān)系為G,期細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)小于G2期細(xì)胞的數(shù)量，兩者之間的比值介于12.5和20之間。7.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，其特征包括有染色單體斷裂總數(shù)與細(xì)胞存活率之間的關(guān)系為:S=exp(-0.03D-0.06D2)，其中R2=l，a和p值分別為0.03和0.06。全文摘要本發(fā)明主要涉及預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，尤其涉及應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法。一種應(yīng)用早熟染色體凝集預(yù)測腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的方法，其主要特點包括有如下步驟(1)培養(yǎng)細(xì)胞，待其處于對數(shù)生長期時開始操作；(2)在照射前5分鐘加入早熟染色體凝集誘導(dǎo)劑蛋白絲氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制劑CalyculinA；(3)分別按照不同劑量對細(xì)胞進(jìn)行照射；(4)用克隆形成法測定照射后細(xì)胞的存活率；(5)胰酶消化，收集各劑量照射點細(xì)胞，通過低滲、固定處理，滴片制作早熟染色體凝集染色體樣本；(6)計數(shù)染色體斷裂的結(jié)果，并和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)進(jìn)行擬合，從而得出染色體斷裂與細(xì)胞輻射敏感性之間的關(guān)系。本發(fā)明可以快速、精確地預(yù)測腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性；耗時短，24小時之內(nèi)可以給出結(jié)果；工作量小，只需要檢測40個G₂期細(xì)胞內(nèi)的染色體斷裂類型和數(shù)目就可以給出結(jié)果。文檔編號C12Q1/02GK101126719SQ20061010503公開日2008年2月20日申請日期2006年8月15日優(yōu)先權(quán)日2006年8月15日發(fā)明者李文建,楊建設(shè)申請人:中國科學(xué)院近代物理研究所