專利名稱：小蜜環(huán)菌屬真菌的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物的培養(yǎng)方法，特別涉及一種藥用真菌的培養(yǎng)方法，確切地說是小蜜環(huán)菌真菌的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
亮菌(Armillariella tabescens)和蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)同屬真菌界、擔子菌門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、小蜜環(huán)菌屬。小蜜環(huán)菌又名假蜜環(huán)菌，其屬下主要有亮菌和蜜環(huán)菌兩種真菌，均為藥用真菌。
亮菌臨床主要用于治療急慢性肝炎、急性膽囊炎、慢性膽囊炎急性發(fā)作，其它膽道疾病并發(fā)急性感染，慢性胃炎，還可以用于防輻射、抗腫瘤、增強人體免疫力、治療放療、化療引起的白細胞減少癥、小兒黃疸、加速造血組織DNA的合成等。目前，投入臨床使用的主要有亮菌甲素注射液、亮菌口服液、亮菌糖漿、亮菌片劑等。
蜜環(huán)菌具有抗炎、抗腫瘤、抗輻射、促進造血機能、降低血糖、增強免疫力、提高記憶力等作用，還可治療由不同病因引起的眩暈綜合癥、血管性頭疼等常見病、多發(fā)病，并具有一定的抑制腫瘤生長等藥理和保健功能。目前已開發(fā)出多種與密環(huán)菌有關(guān)的藥品和保健品，如蜜環(huán)菌片、腦心舒口服液、蜜環(huán)菌浸膏、蜜環(huán)菌糖漿等。
目前，公知的亮菌和蜜環(huán)菌培養(yǎng)方法有固態(tài)發(fā)酵和液體深層發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵周期過長、容易染菌、藥效成分分離困難；液體深層發(fā)酵，時間雖短，但需要一定的設(shè)備，投資大，短時間難以實現(xiàn)，發(fā)酵菌絲的生物量和活性物質(zhì)含量偏低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所稱的小蜜環(huán)菌屬真菌的培養(yǎng)方法，是指小蜜環(huán)菌屬真菌處于靜置懸浮狀態(tài)下進行培養(yǎng)的方法，旨在培養(yǎng)得到真菌菌索并從中提取多糖等目標化合物用作原料藥。
所述的靜置懸浮培養(yǎng)就是在培養(yǎng)過程中不搖蕩、不攪拌，菌種懸浮在液體培養(yǎng)基的表層或淺表層處生長發(fā)育成菌索。所要解決的技術(shù)問題是使菌株懸浮而不沉降。
菌株懸浮的前提條件是菌種為固體菌種，培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，即固體菌種懸浮在液體培養(yǎng)基中。解決菌種懸浮的技術(shù)方案有兩種，一是在液體培養(yǎng)基的表層或淺表層設(shè)置起支架作用的支撐物，如不銹鋼絲網(wǎng)或不銹鋼鉤架或海綿等；二是在培養(yǎng)菌種(種子培養(yǎng)階段)時于固態(tài)培養(yǎng)基中添加增浮劑，如作物秸桿粉末或粗糠(稻殼)或鋸末等，自這樣的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的固體菌種會懸浮在液體培養(yǎng)基中。
本培養(yǎng)方法以亮菌和蜜環(huán)菌為出發(fā)菌株，包括母種培養(yǎng)、固體菌種培養(yǎng)和靜置懸浮培養(yǎng)，與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別在于固體菌種通過靜置懸浮培養(yǎng)成菌索。
本靜置懸浮培養(yǎng)方法之一是將固體菌種接種在位于液體培養(yǎng)基表層或淺表層處的起支架作用的支撐物上，于24～28℃條件下靜置培養(yǎng)16～22天，優(yōu)選25～27℃，靜置培養(yǎng)18～20天。
靜置懸浮培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基優(yōu)選每升培養(yǎng)基含玉米粉5～15g， 黃豆粉 5～15g，葡萄糖5～15g， 蔗糖15～25g，KH2PO40.5～1.5g， MgSO40.2～1.0g。
最佳每升培養(yǎng)基含玉米粉10g，黃豆粉 10g，葡萄糖10g，蔗糖20g，KH2PO41g， MgSO40.5g。
所述的玉米粉和黃豆粉是指各自加水浸煮后分離得到的水浸煮液，合并后定容至所需的體積。
本靜置懸浮培養(yǎng)方法之二是將母種接種在添加有增浮劑的固體培養(yǎng)基上于24～28℃條件下固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)35～45天制備固體菌種，優(yōu)選25～27℃，培養(yǎng)38～42天制備固體菌種。將該固體菌種接種到液體培養(yǎng)中進行靜置懸浮培養(yǎng)時會自動懸浮在液體培養(yǎng)基上。
培養(yǎng)固體菌種的固體培養(yǎng)基優(yōu)選以下組分和重量份數(shù)玉米粉80～110份 麥麩 30～50份山芋粉40～60份增浮劑 40～60份水200～800份。
最佳玉米粉100份 麥麩 40份山芋粉50份增浮劑 50份水600份。
所述的增浮劑選自作物秸桿粉末或粗糠(稻殼)或鋸末等。
靜置懸浮培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基同上，即每升培養(yǎng)基中含玉米粉5～15g，黃豆粉 5～15g，
葡萄糖 5～15g，蔗糖15～25g，KH2PO40.5～1.5g， MgSO40.2～1.0g。
最佳每升培養(yǎng)基含玉米粉 10g， 黃豆粉 10g，葡萄糖 10g， 蔗糖 20g，KH2PO41g，MgSO40.5g。
所述的玉米粉和黃豆粉是指各自加水浸煮后分離得到的水浸煮液，合并后定容至所需的體積。
靜置懸浮培養(yǎng)溫度24～28℃，時間16～22天。優(yōu)選25～27℃，18～20天。
靜置培養(yǎng)結(jié)束后取出菌索用水提醇沉法提取多糖。即將菌索勻漿后加水于40～60℃條件下浸提2～3小時后分離，浸提2～3次，合并濾液，負壓濃縮后加95％乙醇直至多糖沉淀析出完全，過濾分離，將沉淀干燥便是多糖，無定形灰白色粉末。自亮菌菌索中可提取出8～10％(w/w)的亮菌多糖，自蜜環(huán)菌菌索中可提取出10～12％(w/w)的蜜環(huán)菌多糖。
活性多糖的毒性實驗研究急性毒性作用取20±2g雌雄各半的健康小鼠50只，隨機分成5組，將亮菌多糖及蜜環(huán)菌多糖分別按5g/kg/d，10g/kg/d劑量和生理鹽水分別對5組小鼠進行灌胃，每天上、中、下午各灌胃一次，連續(xù)灌胃4天，觀察其行為表現(xiàn)、體重、皮毛的色澤及形狀、對各種刺激的反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)、食欲、大小便的狀況及顏色、呼吸系統(tǒng)的狀況、瞳孔大小、眼瞼的狀況等。未發(fā)現(xiàn)小鼠因藥物中毒死亡現(xiàn)象，且所觀察的各狀況均正常。小鼠的胸腺、肝臟、腎臟、脾臟、胰臟石臘切片在高倍顯微鏡下觀察到亮菌、蜜環(huán)菌多糖5g/kg/d，10g/kg/d組各器官與其對照組相比，其組織結(jié)構(gòu)、細胞形狀均無明顯變化。小鼠對亮菌、蜜環(huán)菌多糖的最大耐受量＞10g/kg/d。試驗證明，亮菌、蜜環(huán)菌多糖無急性毒性作用。
長期毒性實驗將亮菌多糖及蜜環(huán)菌多糖分別設(shè)三個劑量組灌胃給藥，每天一次，連續(xù)180天。結(jié)果高、中、低劑量組的大鼠健康狀況、生長發(fā)育、外圍血象、肝腎功能均無影響，病理檢查亦無明顯變化。
活性多糖的藥理活性研究實驗證明亮菌多糖能提高受照小鼠存活率及SOD活性、升高白細胞、骨髓DNA含量，抑制小鼠精子畸變率、骨髓微核細胞數(shù)的增加，并使受照鼠胸腺、脾臟重量回升，還能增加內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)數(shù)，降低MDA含量，表明亮菌菌索多糖對γ射線所致小鼠輻射損傷有較好保護作用。
亮菌多糖可以促使ConA誘導小鼠體內(nèi)T淋巴細胞自分泌IL-2。因此，亮菌多糖可以通過刺激淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子提高小鼠的免疫功能。
實驗表明，亮菌多糖動物半體內(nèi)抑瘤率為81％，體內(nèi)抑瘤率對S180為35.8％，對HAC為37.7％；亮菌多糖能抑制小鼠S180腫瘤的生長和增強巨噬細胞的活性。
亮菌多糖具有消炎，退黃疸和降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及解痙和鎮(zhèn)痛作用?？捎糜诩薄⒙愿窝准澳懙兰膊〉闹委?。
蜜環(huán)菌多糖具有中樞鎮(zhèn)靜作用，與中樞抑制劑戊巴比妥鈉有協(xié)同作用，能延長小鼠的睡眠時間，對中樞興奮藥五烯氮哇有拮抗作用，能降低尼古丁引起的小鼠死亡率，增加犬的腦血流量和冠狀動脈血流量；蜜環(huán)菌多糖對不同病因(高血壓、椎基底動脈供血不足、植物神經(jīng)功能紊亂及及陰虛陽亢型病人)引起的眩暈癥狀均有一定效果，療效高達70％～80％，對肢麻、耳鳴、癲癇、頑固性神經(jīng)衰弱、血管性頭痛、巴金森氏綜合癥和三叉神經(jīng)痛等也有一定的療效。
蜜環(huán)菌多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，能增加正常小鼠和環(huán)磷酰胺所致免疫功能抑制小鼠溶血素的含量，當劑量為100mg(kg.d)時，5天后能顯著增加兩種小鼠的空斑形成細胞數(shù)，體外試驗表明蜜環(huán)菌多糖對T細胞的功能有促進作用；同時，蜜環(huán)菌多糖還能增加小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分數(shù)和吞噬指數(shù)。
此外，蜜環(huán)菌多糖還具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、促進造血機能、降低血糖、提高記憶力、抑制腫瘤生長等作用。
試驗表明，自本靜態(tài)懸浮培養(yǎng)方法制備小蜜環(huán)菌屬真菌菌索中提取的活性多糖等目標化合物，可作為原料藥使用。
本培養(yǎng)方法，在實驗室中是將培養(yǎng)瓶置于恒溫箱或恒溫室內(nèi)培養(yǎng)，無需搖瓶振蕩，在工業(yè)裝置中只需對發(fā)酵容器保溫，無需攪拌。在靜置培養(yǎng)過程中，菌株自培養(yǎng)基中吸取營養(yǎng)，自空氣中吸收氧份，菌絲體向下方生長直至長成粗壯的菌索并充滿整個培養(yǎng)瓶。所得到的菌索以干重法計，其產(chǎn)量對亮菌可達15～20g/L，對蜜環(huán)菌可達35～40g/L。相對于固態(tài)發(fā)酵或液體深層發(fā)酵，操作簡單，分離方便，周期短，菌索產(chǎn)量高、活性多糖產(chǎn)率也高且穩(wěn)定。
具體實施例方式
(一)、液體培養(yǎng)基的配制現(xiàn)以配制1000ml液體培養(yǎng)基為例，非限定實施例敘述如下
1、取玉米粉、黃豆粉各8g，各自加100ml水煮沸20～30分鐘，分離，如此浸煮三次各得浸煮液300ml，合并浸煮液計600ml，取葡萄糖8g、蔗糖15g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O 0.3g加入浸煮液中攪拌溶解并定容至1000ml，消毒滅菌備用。
2、取玉米粉12g、黃豆粉12g、葡萄糖12g、蔗糖25g、KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O1g，操作同實施例1。
3、取玉米粉8g、黃豆粉12g、葡萄糖8g、蔗糖25g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O1g，操作同實施例1。
4、取玉米粉12g、黃豆粉8g、葡萄糖12g、蔗糖15g、KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O0.3g，操作同實施例1。
5、取玉米粉、黃豆粉各10g、葡萄糖10g、蔗糖20g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O0.6g，操作同實施例1。
(二)、種子培養(yǎng)1、亮菌一級母種培養(yǎng)培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基。
培養(yǎng)條件25～28℃于暗光照下培養(yǎng)12天，pH自然。
2.1亮菌二級種子培養(yǎng)(固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng))將步驟1活化好的母種用接種鏟挑出1塊接種于固體培養(yǎng)基(500ml瓶，裝料量為達到瓶子高度的2/3。)中，每瓶裝有下列培養(yǎng)基，扣緊瓶蓋，瓶蓋內(nèi)有一層專用耐高溫聚乙烯塑料膜和一層牛皮紙。
培養(yǎng)基組分玉米粉100g，麥麩50g，山芋粉50g，飲用水600ml。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度26℃，pH自然條件下培養(yǎng)40天。
用本培養(yǎng)方法制備的亮菌固體菌種適用于使用支撐物的靜置懸浮培養(yǎng)。
2.2亮菌二級種子培養(yǎng)(固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng))將步驟1活化好的母種用接種鏟挑出1塊接種于固體培養(yǎng)基(500ml瓶，裝料量為達到瓶子高度的2/3。)中，每瓶裝有下列任一培養(yǎng)基，扣緊瓶蓋，瓶蓋內(nèi)有一層專用耐高溫聚乙烯塑料膜和一層牛度紙。
培養(yǎng)基組分(1)、玉米粉80g，麥麩30g，山芋粉40g，麥秸桿粉末40g，飲用水300g。
(2)、玉米粉110g，麥麩50g，山芋粉60g，稻秸桿粉末60g，飲用水700g。
(3)、玉米粉80g，麥麩50g，山芋粉40g，粗糠60g，飲用水600g。
(4)、玉米粉110g，麥麩30g，山芋粉60g，鋸末40g，飲用水600g。
(5)、玉米粉100g，麥麩50g，山芋粉50g，粗糠30g、麥秸桿粉末20g，飲用水600g。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度26℃，pH自然條件下培養(yǎng)40天。
用本培養(yǎng)方法制備的亮菌固體菌種適用于直接接種在液體培養(yǎng)基中進行靜置懸浮培養(yǎng)，本固體菌種可懸浮在液體培養(yǎng)基的表層或淺表層處。
蜜環(huán)菌的一級母種培養(yǎng)和二級種子培養(yǎng)與亮菌相同，得到的固體菌種或使用支撐物進行靜置懸浮培養(yǎng)，或直接接種在液體培養(yǎng)基中進行靜置懸浮培養(yǎng)。
(三)、靜置懸浮培養(yǎng)1、使用支撐物進行靜置懸浮培養(yǎng)以8目不銹鋼絲網(wǎng)為例，非限定實施例敘述如下將實施例(一)1～5的任一培養(yǎng)基裝瓶，500ml瓶，裝瓶量300ml，在培養(yǎng)基表層處設(shè)置不銹鋼絲網(wǎng)。
用接種鏟挑取實施例(二)2.1步驟中制備的亮菌固體菌種接種在不銹鋼絲網(wǎng)上，將接種后的培養(yǎng)瓶置于恒溫箱(室)中，于25～27℃、pH自然條件下培養(yǎng)18～20天。
用實施例(二)2.1方法制備的蜜環(huán)菌固體菌種同樣接種在支撐物上進行靜置懸浮培養(yǎng)，方法同上。
2、將固體菌種直接接種在液體培養(yǎng)基中進行靜置懸浮培養(yǎng)將實施例(一)1～5的任一培養(yǎng)基裝瓶，500ml瓶，裝瓶量300ml。
用接種鏟挑取實施例(二)2.2步驟中制備的亮菌固體菌種接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)的液體培養(yǎng)基中，菌種懸浮在培養(yǎng)基的表層處，將接種后的培養(yǎng)瓶置于恒溫箱中，于25～27℃，pH自然條件下培養(yǎng)18～20天。
用實施例(二)2.2方法制備的蜜環(huán)菌菌種靜置懸浮培養(yǎng)的方法同上。
權(quán)利要求
1.一種小蜜環(huán)菌屬真菌的培養(yǎng)方法，以亮菌和蜜環(huán)菌為出發(fā)菌株，包括母種培養(yǎng)、固體菌種培養(yǎng)和靜置懸浮培養(yǎng)，其特征在于所述的靜置懸浮培養(yǎng)就是將固體菌種直接接種在位于液體培養(yǎng)基表層或淺表層處起支架作用的支撐物上于24～28℃條件下靜置培養(yǎng)16～22天；所述的支撐物選自不銹鋼絲網(wǎng)或不銹鋼鉤架或海綿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于直接接種在支撐物上的固體菌種于25～27℃條件下靜置培養(yǎng)18～20天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中含玉米粉5～15g，黃豆粉5～15g，葡萄糖5～15g，蔗糖 15～25g，KH2PO40.5～1.5g，MgSO40.2～1.0g。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基為每升培養(yǎng)基中含玉米粉10g，黃豆粉10g，葡萄糖10g，蔗糖 20g，KH2PO41g，MgSO40.5g。
5.一種小蜜環(huán)菌屬真菌的培養(yǎng)方法，以亮菌和蜜環(huán)菌為出發(fā)菌株，包括母種培養(yǎng)、固體菌種培養(yǎng)和靜置懸浮培養(yǎng)，其特征在于在固體菌種培養(yǎng)時將母種接種在添加有增浮劑的固體培養(yǎng)基上于24～28℃條件下固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)35～45天；所述的增浮劑選自作物秸桿粉末或粗糠或鋸末。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于母種在固體培養(yǎng)基上于25～27℃、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)38～42天。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的固體培養(yǎng)基有以下組分和重量份數(shù)玉米粉80～110份麥麩 30～50份山芋粉40～60份 增浮劑40～60份水200～800份。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的固體培養(yǎng)基為玉米粉100份麥麩 40份山芋粉50份 增浮劑50份水600份。
全文摘要
一種小蜜環(huán)菌屬真菌的培養(yǎng)方法，以亮菌和蜜環(huán)菌為出發(fā)菌株，將經(jīng)種子培養(yǎng)得到的固體菌種懸浮在液體培養(yǎng)基中于靜置狀態(tài)下24～28℃時培養(yǎng)16～22天制備亮菌菌索和蜜環(huán)菌菌索，旨在自菌索中提取活性多糖等目標化合物用作原料藥。在液體培養(yǎng)基中設(shè)置支撐物使固體菌種懸浮，或者在固體培養(yǎng)基中添加增浮劑經(jīng)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)得到的固體菌種會自動懸浮在液體培養(yǎng)基中。本培養(yǎng)方法較之現(xiàn)有的固態(tài)發(fā)酵或液體深層發(fā)酵操作簡單、分離方便、周期短、菌索產(chǎn)量高，活性多糖產(chǎn)率也高且穩(wěn)定。
文檔編號C12N1/14GK1923999SQ20061009607
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月13日
發(fā)明者沈業(yè)壽, 馬金寶, 鄭媛, 李賡, 李峰 申請人:安徽大學