專利名稱：雷丸菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)雷丸菌絲的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)液體深層發(fā)酵生產(chǎn)雷丸菌絲的工藝。
背景技術(shù)：
雷丸分布于我國(guó)浙江、安徽、福建、河南、河北、江蘇、廣西、云南、貴州、湖南、四川、甘肅、陜西等地，其菌核生長(zhǎng)于發(fā)黃且開(kāi)花的老竹根上或老竹兜下面，有時(shí)生于棕櫚、桐樹(shù)上或某些朽樹(shù)上。殺蟲(chóng)消積除熱的功效。大量研究表明，雷丸是一具有多重作用的藥用真菌。雷丸蛋白酶有多種驅(qū)蟲(chóng)作用，對(duì)絳蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、陰道毛滴蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)等多種寄生蟲(chóng)病均有顯著療效；雷丸多糖可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，有的還有一定抗癌性；雷丸凝集素具凝血活性。
由于野生資源的匱乏和生長(zhǎng)環(huán)境的惡化，許多名貴藥用真菌瀕臨滅絕，如何挽救這些寶貴的藥用資源、滿足藥物開(kāi)發(fā)需要顯得尤為重要，利用微生物技術(shù)分離篩選出活性菌株，采用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的藥材生產(chǎn)很有必要。加上雷丸生長(zhǎng)于竹根下，采集十分困難，故發(fā)酵培養(yǎng)雷丸菌藥物有廣泛的應(yīng)用前景，其工業(yè)化生產(chǎn)不受季節(jié)限制，并可縮短生產(chǎn)周期，產(chǎn)品的數(shù)量及質(zhì)量也易于保證和控制。
上個(gè)世紀(jì)中后期發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)已成功應(yīng)用于多種藥用真菌的大規(guī)模生產(chǎn)，其中以液體發(fā)酵技術(shù)最為成熟。本發(fā)明是適合于雷丸菌工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，該發(fā)明將液體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到雷丸菌菌絲的大規(guī)模生產(chǎn)在國(guó)內(nèi)尚屬首例，研究結(jié)果表明該方案是可行的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雷丸菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)雷丸菌絲的工藝。
工藝的步驟如下1)固體斜面培養(yǎng)將雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)接種到配制的斜面培養(yǎng)基上，溫度20～30℃，培養(yǎng)160～240小時(shí)，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；2)搖床種子培養(yǎng)將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在20～30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150～200rpm，培養(yǎng)62～96小時(shí)，得到雷丸菌液體種子；3)雷丸菌液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以體積比計(jì)接種量為5～15％，罐溫20～30℃、罐壓0.4～1.0kg/cm，攪拌速率100～250rpm，通氣量1∶0.3～1∶1.2，發(fā)酵時(shí)間100～200小時(shí)，得到雷丸菌絲。
所述的斜面培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，馬鈴薯100～300克、葡萄糖或蔗糖10～30克、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、維生素B1微量和瓊脂15～25克。具體制備方法為取新鮮去皮馬鈴薯100～300克，切成0.5立方厘米左右的立方塊，立即用水沖洗，用1000毫升蒸餾水煮沸20min，紗布過(guò)濾，取濾液加15～25克瓊脂、10～30克葡萄糖或蔗糖、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、維生素B1微量加熱溶解，加水定容至1000毫升，滅菌后即為斜面培養(yǎng)基。
種子培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米漿40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，pH4.0～7.0。具體制備方法為取葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米漿40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，將各組分混合溶解，加水定容至1000毫升，調(diào)pH至4.0～7.0，滅菌后即為種子培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米漿50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，培養(yǎng)基的pH值為4.0～7.0。具體制備方法為取葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米漿50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO4～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，將上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敵做消泡劑，調(diào)pH到4.0～7.0，滅菌后即為發(fā)酵培養(yǎng)基。
本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明中種子培養(yǎng)基提供了菌絲短期內(nèi)快速生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)72小時(shí)左右即可進(jìn)行深層發(fā)酵；(2)本發(fā)明中液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)成分配比合理，能夠保證雷丸菌的生長(zhǎng)需要，培養(yǎng)基材料豐富，整個(gè)分批發(fā)酵過(guò)程中只需一次配料、一次滅菌即可，具有省時(shí)、省工，又減少了由于中途加料造成染菌的機(jī)會(huì)；
(3)采用本發(fā)明中的液體深層通氣發(fā)酵工藝進(jìn)行分批發(fā)酵，每升發(fā)酵液可得到10～15克的干菌絲；(4)本發(fā)明是適合于雷丸菌大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，對(duì)于該菌以后的工業(yè)化生產(chǎn)有很大的指導(dǎo)意義。
具體實(shí)施例方式
雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC No.AS 5.158，屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，多孔菌屬。
所述的生產(chǎn)雷丸菌絲的工藝是從野生雷丸菌核上分離純化得到的純菌株，依次經(jīng)固體斜面培養(yǎng)、搖床種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)完成。
菌株的18S核糖體DNA(18S rDNA)部分序列(NCBI登錄號(hào)AY944218)如下TTTTTCCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCTTGTGAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATACCTAGTAAGCGTGAGTCATCAGCTCGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGGCCTTGGGATTGGCTTCGGGGAGCCGGCAACGGCACCCTGTTGCTGAGAACTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA。
本發(fā)明的放罐標(biāo)準(zhǔn)是發(fā)酵液變得粘稠，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲開(kāi)始老化。
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例11)固體斜面培養(yǎng)將雷丸菌接種到配制的斜面培養(yǎng)基上，溫度20℃，培養(yǎng)160小時(shí)，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，馬鈴薯100克、葡萄糖10克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O 1克、維生素B1微量和瓊脂15克。
2)搖床種子培養(yǎng)將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在20℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)62小時(shí)，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖10克、蔗糖10克、玉米漿40毫升、酵母粉10克、KH2PO41克、MgSO4·7H2O 0.2克、維生素B10.01克，pH4.0。
3)雷丸菌液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以體積比計(jì)接種量為5％，罐溫20℃、罐壓0.4kg/cm，攪拌速率100rpm，通氣量1∶0.3，發(fā)酵時(shí)間100小時(shí)，得到雷丸菌絲。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，以每1000毫升計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成份為葡萄糖20克、蔗糖20克、玉米漿50毫升、酵母粉10克、KH2PO41克、MgSO4·7H2O 0.2克、維生素B10.01克，培養(yǎng)基的pH值為4.0。
實(shí)施例21)固體斜面培養(yǎng)將雷丸菌接種到配制的斜面培養(yǎng)基上，溫度30℃，培養(yǎng)240小時(shí)，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，馬鈴薯300克、蔗糖30克、KH2PO45克、MgSO4·7H2O 3克、維生素B1微量和瓊脂25克。
2)搖床種子培養(yǎng)將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)96小時(shí)，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖60克、蔗糖60克、蛋白水解液240毫升、酵母膏60克、KH2PO43克、MgSO4·7H2O 1克、維生素B10.05克，pH7.0。
3)雷丸菌液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以體積比計(jì)接種量為15％，罐溫30℃、罐壓1.0kg/cm，攪拌速率250rpm，通氣量1∶1.2，發(fā)酵時(shí)間200小時(shí)，得到雷丸菌絲。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖80克、蔗糖80克、蛋白水解液240毫升、酵母膏60克、KH2PO43克、MgSO4·7H2O1克、維生素B10.05克，培養(yǎng)基的pH值為7.0。
蛋白水解液的制備取新鮮原料黃豆粉、蝦粉、蠶蛹粉等，于600C烘箱中干燥6個(gè)小時(shí)，然后放于800C烘箱中干燥17個(gè)小時(shí)，稱取干粉100克，加入生石灰6克，水640毫升，在0.15Mpa下加壓水解2個(gè)小時(shí)，過(guò)濾，取濾液即得。
實(shí)施例31)固體斜面培養(yǎng)將雷丸菌接種到配制的斜面培養(yǎng)基上，溫度27℃，培養(yǎng)200小時(shí)，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，馬鈴薯200克、葡萄糖20克、KH2PO43克、MgSO4·7H2O 2克、維生素B1微量和瓊脂20克。
2)搖床種子培養(yǎng)將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在27℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)72小時(shí)，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖20克、蔗糖20克、玉米漿60毫升、酵母粉20克、KH2PO41.5克、MgSO4·7H2O 0.5克、維生素B10.02克，pH6.5。
3)雷丸菌液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以體積比計(jì)接種量為14％，罐溫27℃、罐壓0.8kg/cm，攪拌速率200rpm，通氣量1∶1.0，發(fā)酵時(shí)間150小時(shí)，得到雷丸菌絲。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖40克、蔗糖40克、玉米漿60毫升、酵母粉20克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O0.7克、維生素B10.02克，培養(yǎng)基的pH值為6.5。
實(shí)施例41)固體斜面培養(yǎng)將雷丸菌接種到配制的斜面培養(yǎng)基上，溫度26℃，培養(yǎng)220小時(shí)，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，馬鈴薯250克、蔗糖25克、KH2PO44克、MgSO4·7H2O 2.5克、維生素B1微量和瓊脂22克。
2)搖床種子培養(yǎng)將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在26℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)80小時(shí)，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖30克、蔗糖30克、蛋白水解液100毫升、酵母膏30克、KH2PO42克、MgSO4·7H2O 0.5克、維生素B10.03克，pH6.0。
3)雷丸菌液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以體積比計(jì)接種量為10％，罐溫26℃、罐壓0.6kg/cm，攪拌速率180rpm，通氣量1∶0.8，發(fā)酵時(shí)間160小時(shí)，得到雷丸菌絲。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖60克、蔗糖60克、蛋白水解液100毫升、酵母膏30克、KH2PO42.5克、MgSO4·7H2O0.8克、維生素B10.03克，培養(yǎng)基的pH值為6.0。
蛋白水解液的制備取新鮮原料黃豆粉、蝦粉、蠶蛹粉等，于600C烘箱中干燥6個(gè)小時(shí)，然后放于800C烘箱中干燥17個(gè)小時(shí)，稱取干粉100克，加入6mol/l的鹽酸600毫升，在沸水浴中水解30分鐘，過(guò)濾后收集濾液。
實(shí)施例51)固體斜面培養(yǎng)將雷丸菌接種到配制的斜面培養(yǎng)基上，溫度28℃，培養(yǎng)180小時(shí)，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；所述的斜面培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，馬鈴薯150克、葡萄糖15克、KH2PO43.6克、MgSO4·7H2O 1.2克、維生素B1微量和瓊脂18克。
2)搖床種子培養(yǎng)將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在28℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速170rpm，培養(yǎng)90小時(shí)，得到雷丸菌液體種子；所述的種子培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖40克、蔗糖40克、玉米漿100毫升、酵母粉40克、KH2PO42.5克、MgSO4·7H2O 0.8克、維生素B10.04克，pH5.5。
3)雷丸菌液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以體積比計(jì)接種量為12％，罐溫28℃、罐壓0.5kg/cm，攪拌速率220rpm，通氣量1∶0.6，發(fā)酵時(shí)間120小時(shí)，得到雷丸菌絲。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖50克、蔗糖50克、玉米漿90毫升、酵母粉、KH2PO42.2克、MgSO4·7H2O 0.6克、維生素B10.04克，培養(yǎng)基的pH值為5.5。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。
本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神和主要特征的具體形式來(lái)概述。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明而不能限制本發(fā)明，權(quán)利要求書指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說(shuō)明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種雷丸菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)雷丸菌絲的工藝，其特征在于，工藝的步驟如下1)固體斜面培養(yǎng)將雷丸菌(Laccocephalum mylittae，formerly called Polyporus mylittae)接種到配制的斜面培養(yǎng)基上，溫度20～30℃，培養(yǎng)160～240小時(shí)，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；2)搖床種子培養(yǎng)將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在20～30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150～200rpm，培養(yǎng)62～96小時(shí)，得到雷丸菌液體種子；3)雷丸菌液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以體積比計(jì)接種量為5～15％，罐溫20～30℃、罐壓0.4～1.0kg/cm，攪拌速率100～250rpm，通氣量1∶0.3～1∶1.2，發(fā)酵時(shí)間100～200小時(shí)，得到雷丸菌絲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雷丸菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)雷丸菌絲的工藝，其特征在于，所述的斜面培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，馬鈴薯100～300克、葡萄糖或蔗糖10～30克、KH2PO42～5克、MgSO4·7H2O 1～3克、維生素B1微量和瓊脂15～25克。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雷丸菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)雷丸菌絲的工藝，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖10～60克、蔗糖10～60克、玉米漿40～200毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，pH4.0～7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雷丸菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)雷丸菌絲的工藝，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以每1000毫升計(jì)，葡萄糖20～80克、蔗糖20～80克、玉米漿50～100毫升或蛋白水解液60～240毫升、酵母粉或酵母膏10～60克、KH2PO41～3克、MgSO4·7H2O 0.2～1克、維生素B10.01～0.05克，培養(yǎng)基的pH值為4.0～7.0。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雷丸菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)雷丸菌絲的工藝，其特征在于，工藝的步驟如下固體斜面培養(yǎng)將雷丸菌接種到配制的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到高活性的固體斜面雷丸菌種；搖床種子培養(yǎng)將上述高活性的固體斜面雷丸菌種接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，得到雷丸菌液體種子；雷丸菌液體深層通氣發(fā)酵培養(yǎng)將上述雷丸菌液體種子接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，得到雷丸菌絲。本發(fā)明的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分配比合理，能夠保證雷丸菌的生長(zhǎng)需要，整個(gè)分批發(fā)酵過(guò)程中只需一次配料、一次滅菌即可，省時(shí)、省工，又減少了由于中途加料造成染菌的機(jī)會(huì)；適合于雷丸菌大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，對(duì)于該菌以后的工業(yè)化生產(chǎn)有很大的指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1869196SQ200610051608
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日
發(fā)明者李永泉, 周立華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)