專利名稱：一種上皮組織癌前病變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物模型，具體涉及上皮組織癌前病變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)南方最常見的頭頸惡性腫瘤。目前，NPC的5年生存率仍維持在50％～60％左右。雖然治療越早，5年生存率越高，在臨床實(shí)踐中，卻有70％左右的NPC病例在得到確診并接受治療時(shí)，已屆臨床III、IV期，而針對(duì)這樣的晚期患者缺乏有效根治手段，大大影響了療效。因此，在NPC綜合性防治策略中，依然特別強(qiáng)調(diào)預(yù)防及早診早治，并將早期診斷和治療作為NPC二級(jí)預(yù)防的主要內(nèi)容。但是，二級(jí)預(yù)防并不能對(duì)本病的發(fā)病率產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響，而一級(jí)預(yù)防尚缺乏有效手段。
由于NPC的發(fā)生和發(fā)展與鼻咽癌前病變地關(guān)系密切，鼻咽癌前病變的防治便成為可能降低NPC發(fā)病率的重要環(huán)節(jié)，起到一級(jí)預(yù)防的作用。然而，在人體進(jìn)行鼻咽癌前病變的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究存在很大的難度，包括許多技術(shù)性和倫理學(xué)問題。當(dāng)前，由于缺乏理想的實(shí)驗(yàn)研究用動(dòng)物模型，因而影響了上皮組織癌前病變的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)行。
目前，獲得鼻咽癌或鼻咽癌前病變動(dòng)物模型的方法主要是化學(xué)誘導(dǎo)法，即利用二亞硝基哌嗪(DNP)和佛波二酯(TPA)皮下注射的方法直接誘導(dǎo)癌變。但是，該方法主要應(yīng)用于大鼠，并且其法造模時(shí)間長(zhǎng)(一般需要10個(gè)月到一年以上)，實(shí)驗(yàn)造模過程中常出現(xiàn)動(dòng)物的意外死亡，效果不穩(wěn)定(由于存在個(gè)體差異，對(duì)DNP的敏感性不一致，因此往往成模時(shí)間不一)，成功率較低，難以廣泛用于防治該病的藥物篩選和發(fā)病機(jī)制的系統(tǒng)研究。或者將人胚鼻咽粘膜移植于裸鼠皮下后，再用二亞硝基哌嗪皮下給藥法誘發(fā)其癌變，這是一種間接研究鼻咽上皮細(xì)胞癌變的方法，與鼻咽癌變的自然發(fā)生存在較大的差異，也不能大范圍地應(yīng)用于鼻咽癌變機(jī)制以及防治藥物篩選、療效評(píng)價(jià)及預(yù)后評(píng)估等方面的系統(tǒng)研究(湖南醫(yī)學(xué)院腫瘤研究室。亞硝胺類化合誘發(fā)大鼠鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究?？茖W(xué)通報(bào)，1978，28(10)756-759；唐發(fā)清，蔣海鷹，陳朝暉，等。鼻咽上皮癌變過程中端粒酶活性和端粒酶RNA的表達(dá)。中華病理學(xué)雜志，2001，30(2)125-128)。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備技術(shù)被認(rèn)為是遺傳學(xué)中繼基因連鎖分析、體細(xì)胞遺傳和DNA重組之后的第四代現(xiàn)代生物技術(shù)，是當(dāng)今生命科學(xué)中一個(gè)發(fā)展最快、最熱門的技術(shù)領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已逐漸廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究，并已成為醫(yī)學(xué)研究的重要手段，對(duì)于疾病的預(yù)防和治療研究發(fā)揮著重要作用。
姚開泰等曾構(gòu)建了EDL-2、PLUNC-p雙啟動(dòng)子調(diào)控鼻咽癌來源的潛伏膜蛋白1(LMP1)的表達(dá)載體，采用受精卵前核顯微注射法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果表明，在所獲得的58只轉(zhuǎn)基因首建鼠中，4只整合陽性，其中的一只轉(zhuǎn)基因小鼠在鼻咽、前胃、舌根等部位檢測(cè)到了外源基因的表達(dá)，未觀察到鼻咽組織明顯的病理改變(張玲，藍(lán)軻，姚開泰，等.用鼻咽相對(duì)特異性調(diào)控區(qū)建立N-LMP1轉(zhuǎn)基因小鼠.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)英文版，2003年，35(12)1072-1076)。姚開泰等還制備了轉(zhuǎn)EDL2控制的N-LMP1基因陽性小鼠6只，其中1只4月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)了鼻咽黏膜上皮不典型增生(藍(lán)軻，喬貴林，姚開泰，等。鼻咽癌來源潛伏膜蛋白1的表達(dá)誘發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠鼻咽不典型增生[J]。動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，23(5)46-48，54)。雖得到了單個(gè)的轉(zhuǎn)基因小鼠，但要使動(dòng)物模型真正廣泛應(yīng)用于癌變機(jī)理的研究，獲得外源基因表達(dá)水平較高、癌前病變表現(xiàn)明顯且穩(wěn)定遺傳的純系轉(zhuǎn)基因后代，則是制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物癌變模型必須解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定遺傳、自然發(fā)生的上皮細(xì)胞癌變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，以克服當(dāng)前上皮細(xì)胞癌變動(dòng)物模型通用制備方法中存在的上述缺點(diǎn)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下
一種上皮組織癌變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的制作方法，包括構(gòu)建pLMP1-p53mt重組表達(dá)質(zhì)粒，重組表達(dá)質(zhì)粒的體外表達(dá)，轉(zhuǎn)基因模型首建鼠的獲得，轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物的繁殖與篩選，其特征在于將獲得的轉(zhuǎn)基因首建鼠F0與野生型C57BL/6J小鼠交配，自然生產(chǎn)，獲得仔鼠，然后設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用PCR法篩選得到G1代轉(zhuǎn)基因陽性雜合子小鼠，再將同胞或同宗G1代陽性異性小鼠交配，獲得G2代，繼續(xù)以同樣方法繁殖篩選，以獲得純系轉(zhuǎn)基因后代；
引物上游序列為5′-GCC ATA CCA CAT TTG TAG AG-3′
引物下游序列為5′-TCC CAG TAA ATG GAG GGA G-3′。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明


圖1為可表達(dá)突變型p53和LMP1的重組表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。
圖2為G1代部分小鼠中雙基因同時(shí)檢測(cè)的PCR篩選電泳結(jié)果。
1為DNA標(biāo)記物；
2為陽性對(duì)照；
3，4，6，8，9，13，14，15，16，17為未攜帶外源基因的小鼠；
5，7，10，11，12，18為攜帶有外源基因的小鼠。
圖3為G3代部分小鼠中雙基因同時(shí)檢測(cè)的PCR篩選電泳結(jié)果。
1為DNA標(biāo)記物；
2為陽性對(duì)照；
3，7，10，12，15為未攜帶外源基因的小鼠；
4，5，6，8，9，11，13，14，16，17為攜帶有外源基因的小鼠。
圖4為G6代部分小鼠中雙基因同時(shí)檢測(cè)的PCR篩選電泳結(jié)果。
1為DNA標(biāo)記物；
2為陽性對(duì)照；
3，6，20為未攜帶外源基因的小鼠；
4，5，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19為攜帶有外源基因的小鼠。
圖5為突變型p53和LMP1基因在F0轉(zhuǎn)基因小鼠部分器官組織中表達(dá)活性的免疫組化法檢測(cè)。
A為對(duì)照鼠鼻咽組織(突變型p53)；B為轉(zhuǎn)基因鼠鼻咽組織(突變型p53)；
C為對(duì)照鼠鼻咽組織(LMP1)；D為轉(zhuǎn)基因鼠鼻咽組織(LMP1)；
E為PBS代替一抗檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠鼻咽組織；F為對(duì)照鼠食管(突變型p53)；
G為轉(zhuǎn)基因鼠食管(突變型p53)；H為對(duì)照鼠食管(LMP1)；
I為轉(zhuǎn)基因鼠食管(LMP1)；J為轉(zhuǎn)基因鼠食管(PBS代替一抗)。
圖6為G3代轉(zhuǎn)基因鼠部分器官組織病理切片圖。
A、B為轉(zhuǎn)基因小鼠中度異型增生的鼻腔黏膜組織，C為正常鼻腔黏膜組織對(duì)照
D、E為轉(zhuǎn)基因小鼠異型增生的鼻咽黏膜組織；F、為正常鼻咽黏膜組織對(duì)照
本發(fā)明針對(duì)難以獲得符合自然發(fā)病過程的理想上皮細(xì)胞癌前病變動(dòng)物模型的問題，通過基因工程技術(shù)培育出自然發(fā)生上皮細(xì)胞癌變的轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型。具體方法如下
(1)構(gòu)建pLMP1-p53mt重組表達(dá)質(zhì)粒以質(zhì)粒pSG5.LMP1作為模板，設(shè)計(jì)上、下游引物，用序列高保真的DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱PCR)擴(kuò)增，獲得的啟動(dòng)子區(qū)EDL-2，再經(jīng)拼接、克隆而得到將LMP1自身啟動(dòng)子及調(diào)控區(qū)域置于LMP1基因5’端上游的融合基因，再將其插入pLXSN vector多克隆酶切位點(diǎn)之間，得到本發(fā)明的中間表達(dá)載體，再設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒pCMV-p53mt為模板，用序列高保真的DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的突變型p53融合基因(包括啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)、基因編碼區(qū)和終止區(qū)及多聚腺苷酸合成信號(hào)區(qū))，再經(jīng)拼接、克隆入中間表達(dá)載體而得到本發(fā)明所需要的重組雙癌基因表達(dá)質(zhì)粒pLMP1-p53mt。
(2)重組表達(dá)載體的體外表達(dá)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法將步驟(1)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞和鼻咽癌HNE1細(xì)胞，進(jìn)行體外表達(dá)驗(yàn)證。
(3)轉(zhuǎn)基因模型首建鼠的獲得將步驟(1)中的重組表達(dá)質(zhì)粒酶切線性化，顯微注射小鼠受精卵，再將經(jīng)處理的受精卵移植到假孕母鼠中，產(chǎn)出小鼠，并通過PCR篩選和Southern雜交的方法驗(yàn)證獲得F0轉(zhuǎn)基因小鼠。
(4)轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物的繁殖與篩選將F0首建鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配獲得仔鼠，利用PCR法進(jìn)行篩選，得到G1代轉(zhuǎn)基因陽性雜合子小鼠。為了提高PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率，重新設(shè)計(jì)引物(稱為第5對(duì)引物)，上游位于突變型p53基因的3′端，下游位于LMP1基因的EDL啟動(dòng)子區(qū)，只需通過1對(duì)引物就可進(jìn)行雙基因檢測(cè)。將同胞或同宗G1代陽性小鼠異性交配，獲得G2代，以同樣方法反復(fù)繁殖，獲得純系轉(zhuǎn)基因后代。
用于突變型p53基因和LMP1雙基因整合檢測(cè)的第5對(duì)引物，上游序列為5′-GCCATA CCA CAT TTG TAG AG-3′；下游序列為5′-TCC CAG TAA ATG GAG GGA G-3′，產(chǎn)物為491bp。PCR反應(yīng)條件94℃4min，97℃40s、54℃25s、72℃18s；94℃30s、54℃25s、72℃18s，34個(gè)循環(huán)；72℃8min。
在以往的研究中，PCR擴(kuò)增出現(xiàn)的假陽性率高，不能作為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物篩選的標(biāo)準(zhǔn)。本研究中設(shè)計(jì)了一對(duì)特殊引物，成功地篩選出雙癌基因陽性小鼠，準(zhǔn)確率高，且簡(jiǎn)單方便，成本降低。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為
1、在PCR檢測(cè)中，用1對(duì)引物準(zhǔn)確篩選出雙轉(zhuǎn)基因陽性后代小鼠；
2、F0首建鼠在第一次與野生鼠交配時(shí)，增加交配次數(shù)，以獲得盡可能多的G1代小鼠，從而能從G1代中篩選出足量的陽性鼠，能夠?qū)崿F(xiàn)G1代異性同胞的交配，以便大量獲得的陽性后代；
3、本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出明顯的上皮細(xì)胞癌變傾向，并且該表型可以垂直遺傳。因此，轉(zhuǎn)突變型p53和LMP1基因小鼠的成功構(gòu)建，將在上皮細(xì)胞癌變機(jī)理和防治措施研究中產(chǎn)生重要的理論意義和實(shí)際意義。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例鼻咽、鼻腔癌前病變轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制作步驟
1、構(gòu)建雙癌基因真核表達(dá)質(zhì)粒
設(shè)計(jì)引物(加上接頭，稱第1對(duì)引物)以pSG5.LMP1為模板擴(kuò)增，得到EDL-2啟動(dòng)子及其調(diào)控區(qū)。然后用EcoR I和BamH I分別雙酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物和pSG5.LMP1，回收啟EDL-2動(dòng)子區(qū)、pSG5.LMP1的載體部分pSG5和LMP1基因，將EDL-2與pSG5連接得到質(zhì)粒pSG5.EDL；用BamH I酶切pSG5.EDL，去磷酸化，與LMP1基因連接，得到pEDL.LMP1，用Bgl II酶切鑒定連接的LMP1基因的正反方向；再用EcoR I和Xba I雙酶切pLXSN和正向插入的pEDL.LMP1，將前者的4.3kb片段和后者的3.4kb片段連接得到質(zhì)粒pLMP1；以質(zhì)粒pCMV-p53mt為模板，設(shè)計(jì)引物(稱第2對(duì)引物)擴(kuò)增，得到突變型p53融合基因(包括啟動(dòng)子區(qū)、基因編碼區(qū)、終止區(qū)和多聚腺苷酸合成信號(hào))，用Spe I和BsrG I雙酶切pLMP1和突變型p53融合基因部分(即PCR產(chǎn)物)，連接得到質(zhì)粒pLMP1-p53mt。所述重組表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1，表達(dá)載體具有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)、LTR啟動(dòng)子區(qū)、CMV強(qiáng)啟動(dòng)子及其周圍調(diào)控序列、突變型p53基因和EDL-2啟動(dòng)子其周圍的調(diào)控序列以及潛伏膜蛋白1基因、SV40病毒晚期轉(zhuǎn)錄單元的多聚腺苷酸合成信號(hào)，雙癌基因真核表達(dá)質(zhì)粒pLMP1-p53mt序列為9.1kb，經(jīng)部分測(cè)序鑒定連接正確。
質(zhì)粒DNA的提取、PCR產(chǎn)物的回收按試劑盒說明書進(jìn)行。質(zhì)粒DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化、瓊脂糖凝膠電泳分析以及感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)等均按《分子克隆》第二版進(jìn)行。
引物序列 由上海生物工程有限公司合成。第1對(duì)引物用于特異性啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增，上游序列為5’-CGG AAT TCA TGG CGG CGG TGA TCC ACA-3’，含EcoR I位點(diǎn)；下游序列為5’-GAT AGG ATC CCT CGA GAG TGA GGC ACA-3’，含BamH I位點(diǎn)，產(chǎn)物為782bp。PCR反應(yīng)條件94℃30s、72℃50s，35個(gè)循環(huán)；72℃8min。
第2對(duì)引物用于p53mt融合基因的擴(kuò)增，上游序列為5’-ACT AGT AAT CAA TTA CGGGGT CA-3’，含Spe I位點(diǎn)；下游序列為5’-TGT ACA CAA CTA GAA TGC AGT GA-3’，含BsrG I位點(diǎn)，產(chǎn)物為2053bp。PCR反應(yīng)條件94℃30s、60℃30、72℃90s，35個(gè)循環(huán)；72℃8min。
2.重組真核表達(dá)載體的體外表達(dá)
(1)轉(zhuǎn)染HNE1和HeLa細(xì)胞
常規(guī)培養(yǎng)HNE1和HeLa細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞株HNE1和人宮頸癌細(xì)胞株HeLa，復(fù)蘇后接種于含15％胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，D-Hanks液洗滌2次，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化傳代，隔天換液。使用時(shí)制備細(xì)胞懸液，并按實(shí)驗(yàn)要求調(diào)成所需細(xì)胞密度。
在轉(zhuǎn)染前一天，在24孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)預(yù)先置放無菌蓋玻片，每孔加500μL不含抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×105。在轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，要求細(xì)胞密度最好達(dá)到90％～95％。吸棄原培養(yǎng)液，PBS(pH7.2)漂洗一次，加入用無雙抗(青霉素和鏈霉素)、無血清RPMI 1640培養(yǎng)液配制的脂質(zhì)體-質(zhì)?；旌衔?脂質(zhì)體1∶50；質(zhì)粒DNA終濃度為4μg/mL)，常規(guī)條件培養(yǎng)6h后，換成含10％胎牛血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，分析外源基因的表達(dá)。
(2)外源基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)
通過RT-PCR檢測(cè)外源基因RNA的表達(dá)水平。按試劑盒說明書進(jìn)行。RT-PCR引物根據(jù)LMP1基因(稱為第3對(duì)引物)和突變型p53基因(稱為第4對(duì)引物)設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成。
第3對(duì)引物用于LMP1基因整合和表達(dá)的檢測(cè)上游序列為5′-TCT TAG GTC TCTGGA TCT AC-3′；下游序列為5′-TTG TCA TCA GTG TTG TCA GG-3′，產(chǎn)物為496bp。PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃8min。第4對(duì)引物用于突變型p53基因的整合和表達(dá)檢測(cè)，上游序列為5′-CAA GAT GTT TTA CCA ACT GGC C-3′；下游序列為5′-CAG CTC GTG GTGAGG CTC C-3′，產(chǎn)物為504bp。PCR反應(yīng)條件94℃4min，97℃40s、60℃30s、72℃30s；94℃30s、60℃30s、72℃30s，34個(gè)循環(huán)；72℃8min。
RT-PCR檢測(cè)到，經(jīng)pLMP1-p53mt質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的HNE1細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中有LMP1基因的表達(dá)，經(jīng)pLXSN轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組均無LMP1的表達(dá)；同樣方法檢測(cè)到，經(jīng)pLMP1-p53mt轉(zhuǎn)染的HNE1細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中有突變型p53基因的表達(dá)，經(jīng)pLXSN轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組均無突變型p53基因的表達(dá)。結(jié)果說明，該重組表達(dá)質(zhì)粒可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備。
3.轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
注射用雙癌基因真核表達(dá)質(zhì)粒DNA的制備環(huán)行雙癌基因重組質(zhì)粒DNA經(jīng)Spe I單酶切斷線性化，用凝膠純化QIAGEN試劑盒回收目的片段。DNA溶解在顯微注射緩沖液[Tris·HCI(pH7.4)10mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)0.1mmol/L]，其終濃度為1.7μg/mL。
雄鼠輸精管的結(jié)扎、供體鼠的超排卵及交配、假孕母鼠的準(zhǔn)備、受精卵的采集、顯微注射及移植等均參考文獻(xiàn)(孫晗笑主編.轉(zhuǎn)基因技術(shù)理論與應(yīng)用[M]。河南醫(yī)科大學(xué)出版社，2000年9月第1版)。外源基因被注射入C57BL/6J(♀)與CBA(♂)的雜交一代受精卵雄性原核，然后，移植入假孕母鼠輸卵管，產(chǎn)出仔小鼠。
實(shí)驗(yàn)中共注射了707枚受精卵，將其移植入30只假孕母鼠的輸卵管中，其中26只母鼠懷孕，假孕母鼠懷孕率為86.67％；共出生子代鼠179只。
4.轉(zhuǎn)基因首建鼠的篩選
(1)鼠尾基因組DNA的提取
剪取出生3wk的小鼠尾尖1.0～1.5cm，加入0.7mL的消化裂解液[Tris HCl 0.1moL/L(pH8.0)，EDTA 0.01moL/L，NaCl 0.2moL/L，SDS 1％]、35μL(10mg/mL)蛋白酶和10μL(10mg/mL)RNase，充分混勻，于55℃搖蕩過夜；加入0.7mL苯酚溶液，用等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次；乙醇沉淀DNA；室溫蒸發(fā)乙醇，加入0.2mL TE，4℃過夜，溶解DNA。
(2)PCR檢測(cè)
取0.5μL DNA為模板，PCR檢測(cè)基因的整合。方法同2，0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
(3)小鼠基因組DNA的Southern blot檢測(cè)
取PCR陽性的小鼠基因組DNA 10μg，以同種普通小鼠基因組DNA及注射用外源基因作為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，以內(nèi)切酶BamHI充分消化，0.8％瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至尼龍膜。DNA雜交以EDL-2及其調(diào)控區(qū)為探針，按照“DNA隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒”所述方法以地高辛標(biāo)記探針。信號(hào)檢測(cè)參照地高辛檢測(cè)試劑盒的方法進(jìn)行。
利用PCR從179只小鼠中篩選出9只攜帶突變型p53基因的小鼠，同時(shí)用LMP1基因引物擴(kuò)增也為陽性，陽性率為5.03％。將PCR陽性的首建鼠尾DNA進(jìn)行Southern blot檢測(cè)，確證9只小鼠均為陽性。
5.轉(zhuǎn)基因小鼠模型的繁殖和篩選
將F0首建鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，自然生產(chǎn)，獲得仔鼠，利用PCR法進(jìn)行篩選，得到G1代轉(zhuǎn)基因陽性雜合子小鼠。為了獲得盡可能多的陽性G1代小鼠，將每只首建鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配10批以上，并且盡量縮短每批交配的時(shí)間，一旦發(fā)現(xiàn)雌性小鼠出現(xiàn)陰栓，就將雄鼠隔開。將同胞或同宗G1代陽性異性小鼠交配，獲得G2代，用同樣的方法重復(fù)繁殖和篩選，獲得純系轉(zhuǎn)基因后代。根據(jù)外源基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)強(qiáng)弱和病理特征表現(xiàn)是否明顯，最后建成2個(gè)單系的轉(zhuǎn)LMP1-p53mt基因小鼠模型。圖2～4分別為部分G1、G3、G6代轉(zhuǎn)基因小鼠PCR篩選電泳結(jié)果?？梢钥闯?，即使在G6代，PCR電泳結(jié)果雙癌基因也為陽性，并且隨著傳代次數(shù)的增加，陽性率越來越高。
6.轉(zhuǎn)基因小鼠不同器官組織中突變型p53蛋白和LMP1的表達(dá)檢測(cè)和定量分析
隨機(jī)抽取1只F0轉(zhuǎn)基因小鼠(6月齡)，注射25％烏拉坦麻醉后，分別取鼻腔黏膜、鼻咽黏膜、肺、食管、胃、大腸、肝、腎、脾組織，于4％多聚甲醛中固定24h以上，然后脫水、透明、石蠟包埋、切片，切片厚4μm。以同齡C57BL/6J小鼠相應(yīng)器官組織為對(duì)照。免疫組化檢測(cè)程序按即用型SABC免疫組化染色試劑盒操作步驟進(jìn)行，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。陽性細(xì)胞著色顯示棕黃色顆粒，顆粒位于胞漿或膜上(見圖5)。從圖5可以看出，轉(zhuǎn)基因小鼠各器官組織中突變型P53蛋白主要表達(dá)于胞漿中，LMP1則主要表達(dá)于細(xì)胞膜和胞漿中。
定量分析方法與結(jié)果 以細(xì)胞內(nèi)有明顯的棕黃色信號(hào)顆?；蛐盘?hào)斑為陽性，不著色為陰性。PBS取代一抗作為陰性對(duì)照，已知陽性組織作為陽性對(duì)照。利用HPIAS-1000高清晰度病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)p53mt和LMP1蛋白表達(dá)進(jìn)行圖像分析。先在顯微鏡下仔細(xì)觀察每張切片的轉(zhuǎn)入基因表達(dá)狀況，選取蛋白產(chǎn)物表達(dá)陽性者進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)測(cè)量。每次測(cè)量前，均以統(tǒng)一的空白片作標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)整系統(tǒng)光度值，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)灰度，在同一灰度條件下，避開無細(xì)胞的區(qū)域；在同一光強(qiáng)下，選擇表達(dá)陽性的視野(20×)，用鼠標(biāo)按細(xì)胞的形態(tài)畫出細(xì)胞輪廓，啟用自動(dòng)測(cè)量程序檢測(cè)陽性細(xì)胞的平均灰度值。每個(gè)組織切片共檢測(cè)5個(gè)區(qū)域。系統(tǒng)設(shè)定白色最大灰度為256，黑色最小灰度為0。因此，灰度值越小，代表其陽性反映程度越高。
統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS 12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料多組比較采用方差分析，并進(jìn)行兩兩比較；兩組比較采用t檢驗(yàn)。
表1 F0轉(zhuǎn)基因鼠不同器官組織中LMP1基因表達(dá)的平均灰度值(n＝5，x±s)
與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ帐蟊容^，*P＜0.05，**P＜0.01
表2 F0轉(zhuǎn)基因小鼠不同器官組織中p53mt基因表達(dá)的平均灰度值(n＝5，x±s)
與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ帐蟊容^，*P＜0.05，**P＜0.01
F0轉(zhuǎn)基因小鼠突變型p53和LMP1的免疫組化染色法檢測(cè)結(jié)果在鼻咽、鼻腔、肺、食管、胃組織的上皮細(xì)胞胞漿中檢測(cè)到了LMP1基因的表達(dá)，其中以鼻腔和鼻咽部表達(dá)水平最高(見表1)，在各器官組織中均檢測(cè)到了突變型p53基因的表達(dá)，在鼻腔和食管的表達(dá)水平最高(見表2)，其次是鼻咽、大腸和肺。LMP1在鼻咽和鼻腔表達(dá)水平最高，可能與調(diào)控該基因的啟動(dòng)子區(qū)的相對(duì)嗜鱗狀上皮特性相關(guān)。
G3代轉(zhuǎn)基因小鼠鼻腔黏膜、鼻咽組織、肺、食管、胃、大腸、肝、腎、脾組織中突變型p53和LMP1的表達(dá)結(jié)果在鼻咽、鼻腔、肺、食管、胃組織的上皮細(xì)胞胞漿中檢測(cè)到了LMP1基因的表達(dá)，其中以鼻腔和鼻咽部表達(dá)水平最高(見表3)，在各組織中均檢測(cè)到了突變型p53基因的表達(dá)，在鼻腔和鼻咽組織的表達(dá)水平最高(見表4)，其次是大腸和肺。
表3 轉(zhuǎn)基因鼠不同器官組織中LMP1基因表達(dá)的平均灰度值(n＝10，x±s)
注與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4 轉(zhuǎn)基因小鼠不同器官組織中突變型p53基因表達(dá)的平均灰度值(n＝10，x±s)
注與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
7、轉(zhuǎn)基因小鼠相關(guān)器官組織的病理組織學(xué)檢查
陽性轉(zhuǎn)基因小鼠各相關(guān)器官組織的切片方法同6。切片厚4μm，H-E染色，光學(xué)顯微鏡下閱片，觀察病理變化。以同齡C57BL/6J小鼠器官組織為對(duì)照。
分別觀察6月齡、8月齡、10月齡、12月齡、14月齡、16月齡、18月齡轉(zhuǎn)基因小鼠模型各相關(guān)器官組織的形態(tài)學(xué)變化(主要是病理變化)，G3代8月齡小鼠模型的部分病理檢測(cè)結(jié)果見圖6鼻腔黏膜、鼻咽、食管、胃、大腸、肺出現(xiàn)炎癥，鼻腔黏膜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并且表現(xiàn)出上皮細(xì)胞排列無序，細(xì)胞中度不典型性變，增生；鼻咽組織也有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮有典型增生及灶性鱗狀化生；食管出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮層次增多，但細(xì)胞無異型性；胃出現(xiàn)腸上皮化生；腸腔黏液分泌增多，固有膜纖維組織增生；其它部位未出現(xiàn)明顯病變。結(jié)果說明，模型已經(jīng)成功建立，按隨機(jī)抽樣方法，從各代轉(zhuǎn)基因小鼠模型中抽樣進(jìn)行同樣觀察，模型上皮細(xì)胞癌變相關(guān)生物學(xué)表型能穩(wěn)定遺傳。
8、轉(zhuǎn)基因小鼠模型鼻腔和鼻咽黏膜組織細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因表達(dá)活性的檢測(cè)
G3代轉(zhuǎn)基因小鼠鼻腔黏膜、鼻咽組織常規(guī)石蠟切片，以同齡C57BL/6J小鼠組織為對(duì)照。免疫組化檢測(cè)bax、bcl-2、PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)基因的表達(dá)活性。檢測(cè)和定量分析方法同6。陽性細(xì)胞顯棕黃色著色顆粒，bax、bcl-2陽性著色顆粒位于胞漿，PCNA陽性著色顆粒位于細(xì)胞核。
與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ帐笙啾?，轉(zhuǎn)基因小鼠模型鼻腔黏膜和鼻咽上皮組織中bcl-2和PCNA表達(dá)水平顯著增高，bax表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)(見表5)。細(xì)胞的凋亡活性是受相關(guān)基因程序化控制的，促進(jìn)凋亡的基因與抗凋亡基因形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其中Bcl-2家族是較先被注意到與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系的基因之一，bcl-2過度表達(dá)可促使細(xì)胞提高對(duì)各種致命因素的抵抗力，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。家族的另一成員bax的過度表達(dá)可促使細(xì)胞凋亡。bcl-2和bax二者的比值在一定程度上可反應(yīng)細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)。正常組織中，兩者表達(dá)水平處于平衡狀態(tài)。PCNA是一種反映細(xì)胞增殖活性的客觀指標(biāo)。轉(zhuǎn)基因小鼠鼻腔和鼻咽組織中bcl-2的高表達(dá)使bax/bcl-2比值失衡，細(xì)胞正常凋亡受到抑制，生存期限延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖相對(duì)速度增加，導(dǎo)致組織上皮細(xì)胞過度增殖，PCNA表達(dá)水平顯著增高，也提示細(xì)胞增殖活性提高。因此，轉(zhuǎn)基因小鼠鼻咽組織和鼻腔粘膜發(fā)生的癌前病變可能與抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)和bax的表達(dá)降低及二者比值增高密切相關(guān)。
表5 轉(zhuǎn)基因小鼠模型bax、bcl-2和PCNA表達(dá)的平均灰度值(n＝10，x±s)
注與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
權(quán)利要求
1、一種上皮組織癌前病變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的制作方法，包括構(gòu)建pLMP1-p53mt重組表達(dá)質(zhì)粒，重組表達(dá)質(zhì)粒的體外表達(dá)，轉(zhuǎn)基因模型首建鼠的獲得，轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物的繁殖與篩選，其特征在于將獲得的轉(zhuǎn)基因首建鼠F0與野生型C57BL/6J小鼠交配，自然生產(chǎn)，獲得仔鼠，然后設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用PCR法篩選得到G1代轉(zhuǎn)基因陽性雜合子小鼠，再將同胞或同宗G1代陽性異性小鼠交配，獲得G2代，繼續(xù)以同樣方法繁殖篩選，以獲得純系轉(zhuǎn)基因后代，
引物上游序列為5′-GCC ATA CCA CAT TTG TAG AG-3′；
引物下游序列為5′-TCC CAG TAA ATG GAG GGA G-3′。
全文摘要
本發(fā)明涉及上皮細(xì)胞癌前病變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，將構(gòu)建的雙癌基因轉(zhuǎn)入(C57BL/6J♀×CBA♂)受精卵獲得F0首建鼠，首建鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，自然生產(chǎn)得仔鼠，設(shè)計(jì)一對(duì)雙基因檢測(cè)引物，用PCR法篩選仔鼠，得G1代轉(zhuǎn)基因陽性雜合仔小鼠，經(jīng)同胞或同宗G1陽性異性小鼠交配得G2代，以同樣方法繁殖獲得純系轉(zhuǎn)基因后代；對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠不同器官組織中雙癌基因的表達(dá)檢測(cè)和定量分析，在F0和G3代組織中均檢測(cè)到雙基因的表達(dá)，其中，以鼻腔和鼻咽部位的表達(dá)水平最高；對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠病理組織切片檢查，在G3代8月齡小鼠的切片中，鼻腔與鼻咽粘膜均出現(xiàn)明顯病變；本發(fā)明制作的上皮細(xì)胞癌變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的雙癌基因可穩(wěn)定遺傳，為上皮細(xì)胞癌變的機(jī)理和防治研究提供有價(jià)值的動(dòng)物模型。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1879893SQ200610031600
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月30日
發(fā)明者何迎春, 田道法, 唐發(fā)清, 劉書靜, 毛積芳 申請(qǐng)人:湖南中醫(yī)藥大學(xué)