專利名稱：具有脂肪酶活性的多肽和編碼其的多核苷酸的制作方法
相關(guān)申請的相互參照
本申請要求2004年9月30日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/614,508、2004年10月21日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/621,304、和2004年10月21日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?0/621,222的權(quán)益，這些申請?jiān)诖艘胱鳛閰⒖肌?br> 背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及具有脂肪酶活性的分離多肽和編碼該多肽的分離多核苷酸。本發(fā)明也涉及包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法。
相關(guān)技術(shù)的說明 三?；视退饷甘谴呋岣视王ニ饣蛐纬傻拿浮Ｈ；视退饷甘嵌嘤猛镜拿割?，且經(jīng)常具有超過一種的活性，例如脂肪酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、膽甾醇酯酶、角質(zhì)酶、酰胺酶、半乳糖脂酶、及其他酯酶型的活性。哪種活性是主要活性將取決于酶和條件的應(yīng)用。
三?；视退饷笇儆贗UBMB酶命名法3.1.1。EC3是指水解酶，EC3.1是指作用于酯鍵，以及EC3.1.1是指羧酸酯水解酶。相關(guān)的酶歸入指向磷二酯水解酶的EC3.1.4。
脂肪酶(EC3.1.1.3)是催化各種羧基酯水解，例如催化三酸甘油酯釋放脂肪酸的酶。酯酶(EC3.1.1.1)是催化水溶性羧酸酯水解的酶，包括催化短鏈脂肪酸甘油三酸酯產(chǎn)生醇類和羧酸陰離子。
一些脂肪酶還具有磷脂酶活性和/或半乳糖脂肪酶活性(參見例如，美國專利號6,103,505和美國專利號6,852,346)。
磷脂酶是催化由在sn3位置用磷酸酯化，在sn1和sn2位置有2個(gè)脂肪酸的丙三醇骨架組成的磷脂水解的酶。磷酸可依次被氨基醇酯化。
存在催化脂肪?；糠炙獾膸最惲字?。這些磷脂酶包括磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、和溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)。磷脂酶C(EC 3.1.4.3)和磷脂酶D(EC 3.1.4.4)水解來自磷脂的磷酸基團(tuán)，但不像磷脂酶A1、磷脂酶A2、和磷脂酶B水解脂肪酸。
磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)從二酰甘油磷脂催化在sn1位置的一個(gè)脂?；拿擋Ｗ饔靡援a(chǎn)生溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)從二酰甘油磷脂催化在sn2位置的一個(gè)脂酰基的脫酰作用以產(chǎn)生溶血磷脂和脂肪酸。溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)，亦稱磷脂酶B，催化溶血磷脂中脂?；乃?。磷脂酶C(EC 3.1.4.3)催化磷脂酰膽堿水解為1，2-二酰甘油和磷酸膽堿。磷脂酶D(EC 3.1.4.4)催化磷脂酰膽堿的末端磷酸二酯鍵水解以產(chǎn)生膽堿和磷脂酸。
半乳糖脂酶(EC 3.1.1.26)通過除去一個(gè)或兩個(gè)脂肪酸來催化半乳糖脂的水解。
已知用脂肪分解酶配制的去污劑對于除去脂肪染色劑具有改進(jìn)的特性。例如，LIPOLASETM(Novozymes A/S，Bagsvaerd，丹麥)，獲得自真菌Thermomyces lanuginosus(也稱為Humicola lanuginosa)的微生物脂肪酶，已經(jīng)被引入許多商業(yè)品牌的去污劑。脂肪酶也已經(jīng)被用于脫膠工藝和烘焙。
EI-Shahed等，1988，Eqypt.J.Microbiol.23357-372和Mohawed等，1988，Eqypt.J.Microbiol.23537-547公開了兩種煙曲霉(Aspergillusfumigatus)脂肪酶。
WO03/12071公開了來自煙曲霉的編碼脂肪酶的基因。
Mayordomo等，2000，J.Agric.Chem.48105-109公開了來自構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的冷活性脂肪酶的分離、純化、和表征。
脂肪酶具有許多商業(yè)用途，但在使用條件下起作用并且可通過微生物發(fā)酵以高產(chǎn)率產(chǎn)出的脂肪酶很少有被鑒定出來。在本領(lǐng)域中需要具有改進(jìn)特性的備選脂肪酶。
本發(fā)明的目的是提供具有脂肪酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及具有脂肪酶活性的分離多肽，選自 (a)具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽； (b)由至少在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交的核苷酸序列編碼的多肽；和 (c)包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸保守取代、缺失、和/或插入的變體。
本發(fā)明也涉及編碼具有脂肪酶活性的多肽的分離多核苷酸，選自 (a)編碼具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少60％同一性的氨基酸序列多肽的多核苷酸； (b)具有與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列有至少60％同一性的多核苷酸；和 (c)至少在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸。
在優(yōu)選的方面，該成熟多肽是SEQ ID NO2的第25至396位氨基酸、SEQ ID NO4的第25至283位氨基酸、SEQ ID NO6的第20至318位氨基酸、SEQ ID NO8的第19至348位氨基酸、SEQ ID NO10的第25至393位氨基酸、SEQ ID NO12的第20至294位氨基酸、SEQ ID NO14的第25至308位氨基酸、或SEQ ID NO16的第26至404位氨基酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO1的第73至1256位核苷酸、SEQ ID NO3的第73至944位核苷酸、SEQ ID NO5的第58至1085位核苷酸、SEQ ID NO7的第55至1044位核苷酸、SEQ ID NO9的第73至1179位核苷酸、SEQ ID NO11的第58至1038位核苷酸、SEQ ID NO13的第73至1119位核苷酸、或SEQ ID NO15的第76至1280位核苷酸。
本發(fā)明也涉及包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體，和重組的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及用于生產(chǎn)這種具有脂肪酶活性的多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)包括包含編碼該多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。
本發(fā)明也涉及在去污劑、脫膠、和烘焙中使用該具有脂肪酶活性的多肽的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建體，其中該基因可操作地連接至編碼包括、或由SEQ ID NO1的第1至72位核苷酸、SEQID NO3的第1至72位核苷酸、SEQ ID NO5的第1至57位核苷酸、SEQID NO7的第1至54位核苷酸、SEQ ID NO9的第1至72位核苷酸、SEQID NO11的第1至57位核苷酸、SEQ ID NO13的第1至72位核苷酸、SEQ ID NO15的第1至75位核苷酸組成的信號肽的核苷酸序列，其中該基因?qū)τ谠摵塑账嵝蛄惺峭庠吹摹?br> 附圖簡述

圖1顯示pSMO224的限制性圖譜。
圖2顯示煙曲霉脂肪酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為煙曲霉lip1，SEQ ID NOs1和2)。
圖3顯示pAILo1的限制性圖譜。
圖4顯示pBM121b的限制性圖譜。
圖5顯示pBM120a的限制性圖譜。
圖6顯示pSMO218的限制性圖譜。
圖7顯示pSMO223的限制性圖譜。
圖8顯示煙曲霉脂肪酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為煙曲霉lip2，SEQ ID NOs3和4)。
圖9顯示pHyGe026的限制性圖譜。
圖10A和10B顯示Magnaporthe grisea脂肪酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為Magnaporthe grisea lip1，SEQ ID NOs5和6)。
圖11顯示pHyGe010的限制性圖譜。
圖12顯示pCrAm138的限制性圖譜。
圖13顯示Magnaporthe grisea脂肪酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為Magnaporthe grisea lip2，SEQ ID NOs7和8)。
圖14顯示pBM135g的限制性圖譜。
圖15顯示Magnaporthe grisea脂肪酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為Magnaporthe grisea lip3，SEQ ID NOs9和10)。
圖16顯示pJLin171的限制性圖譜。
圖17顯示構(gòu)巢曲霉脂肪酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為構(gòu)巢曲霉lip1，SEQ ID NOs11和12)。
圖18顯示pJLin167的限制性圖譜。
圖19顯示pJLin170的限制性圖譜。
圖20A和B顯示構(gòu)巢曲霉脂肪酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為構(gòu)巢曲霉lip2，SEQ ID NOs13和14)。
圖21顯示pJSF8c的限制性圖譜。
圖22顯示pBM141的限制性圖譜。
圖23顯示構(gòu)巢曲霉脂肪酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為構(gòu)巢曲霉lip3，SEQ ID NOs15和16)。
定義 脂肪酶活性術(shù)語“脂肪酶活性″在此定義為催化三?；视退鉃橹舅岬娜；视王；饷富钚?E.C.3.1.1.3)。脂肪酶的底物范圍包括三酸甘油酯、二酸甘油酯、和單酸甘油酯，但為了本發(fā)明的目的，利用p-硝基苯基丁酸酯作為底物來測定脂肪酶活性。一個(gè)單位的脂肪酶活性等于在pH7.5，25℃，每分鐘能夠釋放1μmole丁酸的酶量。如在此定義的，包括在術(shù)語“脂肪酶活性”內(nèi)的是還具有磷脂酶活性和/或半乳糖脂酶活性的多肽。
本發(fā)明的多肽與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16具有至少20％、優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％、以及最優(yōu)選至少100％的脂肪酶活性的成熟多肽。
磷脂酶活性術(shù)語“磷脂酶活性”在此定義為從磷脂催化脂肪酸水解的磷脂?；；饷?EC 3.1.1.4、EC 3.1.1.5、和EC 3.1.1.32)。磷脂由在sn3位置用磷酸酯化，在sn1和sn2位置有兩個(gè)脂肪酸的丙三醇骨架組成。磷酸可依次被氨基醇酯化。
磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)從二?；视土字呋趕n1位置的一個(gè)脂?；拿擋Ｗ饔靡援a(chǎn)生溶血磷脂和脂肪酸。
磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)從二酰基甘油磷脂催化在sn2位置的一個(gè)脂?；拿擋Ｗ饔靡援a(chǎn)生溶血磷脂和脂肪酸。
溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)，也稱為磷脂酶B，催化溶血磷脂中脂?；乃?。
為了本發(fā)明的目的，磷脂酶A1、磷脂酶A2、和溶血磷脂酶活性根據(jù)WO2005/040410，利用來源于大豆的磷脂酰膽堿(Avanti Polar Lipids Inc.，AL，USA)作為底物來測定。
半乳糖脂酶活性術(shù)語“半乳糖脂酶活性”在此定義為通過除去一個(gè)或兩個(gè)脂肪酸催化半乳糖脂水解的1，2-二酰基-3-β-D-半乳糖-sn-甘油?；饷?EC3.1.1.26)。半乳糖脂酶活性根據(jù)WO2005/040410利用提取自小麥粉的雙半乳糖甘油二酯(DGDG)或單半乳糖甘油二酯(MGDG)作為底物來測定。DGDG是由兩個(gè)脂肪酸和二半乳糖組成的半乳糖脂。MGDG是由兩個(gè)脂肪酸和半乳糖組成的半乳糖脂。
分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”如在此使用的，是指通過SDS-PAGE所測定的為至少20％純、優(yōu)選至少40％純、更優(yōu)選至少60％純、更優(yōu)選至少80％純、最優(yōu)選至少90％純、以及最優(yōu)選至少95％純。
基本上純的多肽術(shù)語“基本上純的多肽”在此表示按重量計(jì)包含至多10％、優(yōu)選至多8％、更優(yōu)選至多6％、更優(yōu)選至多5％、更優(yōu)選至多4％、更優(yōu)選至多3％、更優(yōu)選至多2％、最優(yōu)選至多1％、以及最優(yōu)選至多0.5％的與其天然締合的其他多肽物質(zhì)的多肽制品。因此優(yōu)選基本上純的多肽是按重量計(jì)以至少92％純、優(yōu)選至少94％純、更優(yōu)選至少95％純、更優(yōu)選至少96％純、更優(yōu)選至少96％純、更優(yōu)選至少97％純、更優(yōu)選至少98％純、更優(yōu)選至少99％、最優(yōu)選至少99.5％純、以及最優(yōu)選100％純的總多肽物質(zhì)存在于制品中。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式。特別地，優(yōu)選該多肽是“本質(zhì)上純的形式”(essentially pure form)，即該多肽制品基本上(essentially)不含與其天然締合的其他多肽物質(zhì)。這可通過例如借助于眾所周知的重組方法或經(jīng)典的純化方法制備多肽來實(shí)現(xiàn)。
在此術(shù)語“基本上純的多肽”和術(shù)語“分離的多肽”以及“分離形式的多肽”同義。
成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在此定義為，以其翻譯后和任何翻譯后修飾，例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用等的最后形式具有脂肪酶活性的多肽。
同一性兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的關(guān)系是通過參數(shù)“同一性”來描述的。
為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)氨基酸序列之間同一性的程度通過Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS5151-153)，利用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)來確定，使用同一性表格和下列多個(gè)比對參數(shù)缺口罰分為10，和缺口長度罰分為10。成對序列對比參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，以及對角線(diagonals)＝5。
為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)核苷酸序列之間同一性的程度通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur and Lipman，1983，Proceedings of the NationalAcademy of Science USA80726-730)，利用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)來確定，使用同一性表格和下列多個(gè)比對參數(shù)缺口罰分為10，和缺口長度罰分為10。成對序列對比參數(shù)是Ktuple＝3，缺口罰分＝3，以及窗口＝20。
同源序列術(shù)語“同源序列”在此定義為在tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，in Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener and S.A.Krawetz，ed.，pp.185-219)中與Thermomyces lanuginosus脂肪酶(登錄號O59952)產(chǎn)生小于0.001的E值(或期望積分)的預(yù)測蛋白質(zhì)。
多肽片段術(shù)語“多肽片段”在此定義為從SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽；或其同源序列；其中該片段具有脂肪酶活性。在優(yōu)選的方面，片段包含SEQ ID NO2的成熟多肽的至少325個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少340個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選至少355個(gè)氨基酸殘基，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，片段包含SEQ ID NO4的成熟多肽的至少215個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少230個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選至少245個(gè)氨基酸殘基，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，片段包含SEQ ID NO6的成熟多肽的至少255個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少270個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選至少285個(gè)氨基酸殘基，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，片段包含SEQ ID NO8的成熟多肽的至少285個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少300個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選至少315個(gè)氨基酸殘基，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，片段包含SEQ ID NO10的成熟多肽的至少320個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少335個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選至少350個(gè)氨基酸殘基，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，片段包含SEQ ID NO12的成熟多肽的至少230個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少245個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選至少260個(gè)氨基酸殘基，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，片段包含SEQ ID NO14的成熟多肽的至少240個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少255個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選至少270個(gè)氨基酸殘基，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，片段包含SEQ ID NO16的成熟多肽的至少320個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少340個(gè)氨基酸殘基，以及最優(yōu)選至少360個(gè)氨基酸殘基，或其同源序列。
亞序列術(shù)語“亞序列”在此定義為從SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列的5′和/或3′末端缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核苷酸序列；或其同源序列；其中該亞序列編碼具有脂肪酶活性的多肽片段。在優(yōu)選的方面，亞序列包含SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列的至少975個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少1020個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選至少1060個(gè)核苷酸，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，亞序列包含SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列的至少645個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少690個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選至少735個(gè)核苷酸，或其同源序列。在優(yōu)選的方面，亞序列包含SEQ ID NO5的成熟多肽編碼序列的至少765個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少810個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選至少855個(gè)核苷酸，或其同源序列。在優(yōu)選的方面，亞序列包含SEQ ID NO7的成熟多肽編碼序列的至少855個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少900個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選至少945個(gè)核苷酸，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，亞序列包含SEQ ID NO9的成熟多肽編碼序列的至少960個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少1005個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選至少1050個(gè)核苷酸，或其同源序列。在優(yōu)選的方面，亞序列包含SEQ ID NO11的成熟多肽編碼序列的至少690個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少735個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選至少780個(gè)核苷酸，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，亞序列包含SEQ ID NO13的成熟多肽編碼序列的至少720個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少765個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選至少810個(gè)核苷酸，或其同源序列。在另外優(yōu)選的方面，亞序列包含SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列的至少1020個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少1020個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選至少1080個(gè)核苷酸，或其同源序列。
等位變體術(shù)語“等位變體”在此表示占據(jù)相同染色體位點(diǎn)的基因的任何兩個(gè)或多個(gè)備選形式。等位變化通過突變天然產(chǎn)生，并且可能導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可能是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可能編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”如在此使用的，是指通過瓊脂糖電泳所測定的為至少20％純、優(yōu)選至少40％純、更優(yōu)選至少60％純、更優(yōu)選至少80％純、最優(yōu)選至少90％純、以及最優(yōu)選至少95％純。
基本上純的多核苷酸術(shù)語“基本上純的多核苷酸”如在此使用的，是指不含其他外來的或不需要的核苷酸，并且是適用于遺傳工程化蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)形式的多核苷酸制品。因此，基本上純的多核苷酸按重量計(jì)包含至多10％、優(yōu)選至多8％、更優(yōu)選至多6％、更優(yōu)選至多5％、更優(yōu)選至多4％、更優(yōu)選至多3％、更優(yōu)選至多2％、最優(yōu)選至多1％、以及最優(yōu)選至多0.5％的與其天然締合的其他多核苷酸物質(zhì)。然而基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸按重量計(jì)算是至少90％純，優(yōu)選至少92％純，更優(yōu)選至少94％純，更優(yōu)選至少95％純，更優(yōu)選至少96％純，更優(yōu)選至少97％純，更優(yōu)選至少98％純，最優(yōu)選至少99％，以及更優(yōu)選至少99.5％純。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選是基本上純的形式。特別地，優(yōu)選在此公開的多核苷酸是“本質(zhì)上純的形式”，即，該多核苷酸制品基本上不含與其天然締合的其他多核苷酸物質(zhì)。在此術(shù)語“基本上純的多核苷酸”和術(shù)語“分離的多核苷酸”以及“分離形式的多核苷酸”同義”。多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成的起源，或其任何組合。
成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在此定義為編碼具有脂肪酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。
cDNA術(shù)語″cDNA″在此定義為可通過從獲得自真核細(xì)胞的成熟、拼接、mRNA分子逆轉(zhuǎn)錄制備的DNA分子。cDNA缺乏通常存在于相應(yīng)的基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的、初級RNA轉(zhuǎn)錄本是在作為成熟拼接的mRNA出現(xiàn)前通過一系列步驟加工的mRNA前體。這些步驟包括通過稱為拼接的過程除去內(nèi)含子序列。來源于mRNA的cDNA因此缺乏任何內(nèi)含子序列。
核酸構(gòu)建體術(shù)語″核酸構(gòu)建體″如在此使用的，是指分離自天然存在的基因或已經(jīng)被改變而以不會(huì)另外(not otherwise)天然存在的方式包含核酸節(jié)段的單鏈-或雙鏈的核酸分子。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含為表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需要的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體和術(shù)語“表達(dá)盒”同義。
調(diào)控序列術(shù)語“調(diào)控序列”在此定義為包括為表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸所必需或有利的所有組分。每個(gè)調(diào)控序列對于編碼該多肽的核苷酸序列可能是天然的或彼此是天然或外來的。這種調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號肽序列、和轉(zhuǎn)錄終止子。至少該調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。調(diào)控序列可能為了導(dǎo)入促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)連接的特異限制性位點(diǎn)的目的而擁有連接子。
可操作連接的術(shù)語“可操作連接的”在此表示其中調(diào)控序列被置于相對于多核苷酸序列的編碼序列適當(dāng)?shù)奈恢枚沟迷撜{(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列表達(dá)的構(gòu)型。
編碼序列當(dāng)在此使用時(shí)，術(shù)語“編碼序列”是指直接確定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框來確定，其通常從ATG起始密碼子或備選的起始密碼子，例如GTG和TTG開始，并且以例如TAA、TAG和TGA的終止密碼子結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組的核苷酸序列。
表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽生產(chǎn)的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。
表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”在此定義為包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且其與保證其表達(dá)的附加核苷酸可操作連接的線性或環(huán)狀DNA分子。
宿主細(xì)胞術(shù)語″宿主細(xì)胞″如在此使用的，包括對用包括本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等易感的任何細(xì)胞類型。
修飾術(shù)語“修飾”在此是指由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽組成的多肽，或其同源序列的任何化學(xué)修飾；以及編碼這種多肽的DNA的遺傳操作。修飾可以是取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸以及置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)鏈。
人工變體當(dāng)在此使用時(shí)，術(shù)語“人工變體”是指通過表達(dá)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，或其同源序列的改變核苷酸序列的生物體生產(chǎn)的具有脂肪酶活性的多肽。改變的核苷酸序列是通過修飾在SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15，或其同源序列中公開的核苷酸序列的人為介入來獲得的。
發(fā)明詳述 具有脂肪酶活性的多肽 在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少60％，優(yōu)選至少65％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，以及最優(yōu)選至少97％、98％、或99％同一性程度的、具有脂肪酶活性的氨基酸序列的分離多肽(此后″同源多肽″)。在優(yōu)選的方面，該同源多肽具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽相差10個(gè)氨基酸、優(yōu)選5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選4個(gè)氨基酸，更優(yōu)選3個(gè)氨基酸，最優(yōu)選2個(gè)氨基酸，以及最優(yōu)選1個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO2的氨基酸序列。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO2的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO2的第25至396位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO2的第25至396位氨基酸。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO2的成熟多肽組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO2的第25至396位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO2的第25至396位氨基酸組成。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO4的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO4的氨基酸序列。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO4的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO4的第25至283位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ IDNO4的第25至283位氨基酸。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO4的氨基酸序列或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO4的氨基酸序列組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO4的第25至283位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO4的第25至283位氨基酸組成。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO6的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO6的氨基酸序列。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO6的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO6的第20至318位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ IDNO6的第20至318位氨基酸。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO6的氨基酸序列或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO6的氨基酸序列組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO6的第20至318位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO6的第20至318位氨基酸組成。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO8的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO8的氨基酸序列。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO8的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO8的第19至348位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ IDNO8的第19至348位氨基酸。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO8的氨基酸序列或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO8的氨基酸序列組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO8的第19至348位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO8的第19至348位氨基酸組成。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO10的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO10的氨基酸序列。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO10的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO10的第25至393位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ IDNO10的第25至393位氨基酸。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO10的氨基酸序列或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO10的氨基酸序列組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO10的第25至393位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO10的第25至393位氨基酸組成。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO12的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO12的氨基酸序列。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO12的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO12的第20至294位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ IDNO12的第20至294位氨基酸。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO12的氨基酸序列或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO12的氨基酸序列組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO12的第20至294位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO12的第20至294位氨基酸組成。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO14的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO14的氨基酸序列。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO14的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO14的第25至308位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ IDNO14的第25至308位氨基酸。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO14的氨基酸序列或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO14的氨基酸序列組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO14的第25至308位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO14的第25至308位氨基酸組成。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括SEQ ID NO16的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO16的氨基酸序列。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO16的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ ID NO16的第26至404位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段。在另外優(yōu)選的方面，多肽包括SEQ IDNO16的第26至404位氨基酸。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO16的氨基酸序列或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO16的氨基酸序列組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO16的第26至404位氨基酸，或其等位變體；或其具有脂肪酶活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO16的第26至404位氨基酸組成。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及由在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件，以及最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼的具有脂肪酶活性的分離多肽(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)的核苷酸。此外，該亞序列可編碼具有脂肪酶活性的多肽片段。在優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO1的第73至1256位核苷酸、SEQ ID NO3的第73至944位核苷酸、SEQ ID NO5的第58至1085位核苷酸、SEQ ID NO7的第55至1044位核苷酸、SEQ ID NO9的第73至1179位核苷酸、SEQ ID NO11的第58至1038位核苷酸、SEQ ID NO13的第73至1116位核苷酸、或SEQID NO15的第76至1280位核苷酸。
SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的核苷酸序列；或其亞序列；以及SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的氨基酸序列；或其片段；可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法用來設(shè)計(jì)核酸探針以從不同種屬的菌株鑒定和克隆編碼具有脂肪酶活性多肽的DNA。特別地，這種探針可用于按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法與感興趣種屬的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這種探針可能比起完整的序列來是相當(dāng)短的，但應(yīng)該是至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，以及最優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸長度。然而優(yōu)選該核酸探針是至少100個(gè)核苷酸長度。例如，核酸探針可以是至少200個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸長度。甚至可使用較長的探針，例如是至少600個(gè)核苷酸，至少優(yōu)選至少700個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少800個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少900個(gè)核苷酸長度的核酸探針。DNA和RNA探針都能被使用。該探針一般被標(biāo)記來用于檢測相應(yīng)的基因(例如，使用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)。這種探針包括在本發(fā)明中。
因此從這種其他的生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫可用于篩選與上述探針雜交和編碼具有脂肪酶活性多肽的DNA。來自這種其他生物體的基因組或其他DNA可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他的分離技術(shù)來區(qū)分。來自文庫的DNA或分離的DNA可被轉(zhuǎn)移和固定至硝化纖維或其他合適的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15；或其亞序列同源的克隆或DNA，該載體材料被用于Southern印跡。
為了本發(fā)明的目的，雜交表明該核苷酸序列與相應(yīng)于SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列；包含于SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列；其互補(bǔ)鏈；或其亞序列的標(biāo)記核酸探針在極低至極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。在這些條件下與該核酸探針雜交的分子可利用X光膠片檢測。
在優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO1的第73至1256位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是編碼SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO1。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含于在大腸桿菌NRRL B-30774中的質(zhì)粒pSMO224中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有脂肪酶活性的多肽。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含在質(zhì)粒pSMO224中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30774中。
在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO3的第73至944位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是編碼SEQ ID NO4的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO3。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含于在大腸桿菌NRRL B-30773中的質(zhì)粒pSMO223中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有脂肪酶活性的多肽。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含在質(zhì)粒pSMO223中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30773中。
在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO5的成熟多肽編碼序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO5的第58至1085位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是編碼SEQ ID NO6的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO5。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含于在大腸桿菌NRRL B-30772中的質(zhì)粒pHyGe026中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有脂肪酶活性的多肽。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含在質(zhì)粒pHyGe026中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30772中。
在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO7的成熟多肽編碼序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO7的第55至1044位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是編碼SEQ ID NO8的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO7。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含于在大腸桿菌NRRL B-30781中的質(zhì)粒pCrAm138中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有脂肪酶活性的多肽。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含在質(zhì)粒pCrAm138中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30781中。
在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO9的成熟多肽編碼序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO9的第73至1179位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是編碼SEQ ID NO10的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO9。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含于在大腸桿菌NRRL B-30779中的質(zhì)粒pBM135g中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有脂肪酶活性的多肽。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含在質(zhì)粒pBM135g中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30779中。
在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO11的成熟多肽編碼序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO11的第58至1038位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是編碼SEQ ID NO12的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO11。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含于在大腸桿菌NRRL B-30755中的質(zhì)粒pJLin171中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有脂肪酶活性的多肽。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含在質(zhì)粒pJLin171中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30755中。
在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO13的成熟多肽編碼序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO13的第73至1116位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是編碼SEQ ID NO18的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO13。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含于在大腸桿菌NRRL B-30754中的質(zhì)粒pJLin170中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有脂肪酶活性的多肽。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含在質(zhì)粒pJLin170中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30754中。
在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO15的第76至1280位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是編碼SEQ ID NO16的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是SEQ ID NO15。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含于在大腸桿菌NRRL B-30780中的質(zhì)粒pBM141中的多核苷酸序列，其中其多核苷酸序列編碼具有脂肪酶活性的多肽。在另外優(yōu)選的方面，該核酸探針是包含在質(zhì)粒pBM141中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30780中。
對于至少100個(gè)核苷酸長度的長探針，極低至極高嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為在42℃，在5X SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切和變性的鮭魚精DNA中，以及對于極低和低嚴(yán)謹(jǐn)為25％甲酰胺，對于中等和中-高嚴(yán)謹(jǐn)為35％甲酰胺，或?qū)τ诟吆蜆O高嚴(yán)謹(jǐn)為50％甲酰胺，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法最適地預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。
對于至少100個(gè)核苷酸長度的長探針，載體材料最后利用2X SSC，0.2％SDS，優(yōu)選至少在45℃(極低嚴(yán)謹(jǐn))，更優(yōu)選至少在50℃(低嚴(yán)謹(jǐn))，更優(yōu)選至少在55℃(中等嚴(yán)謹(jǐn))，更優(yōu)選至少在60℃(中-高嚴(yán)謹(jǐn))，更優(yōu)選至少在65℃(高嚴(yán)謹(jǐn))，以及最優(yōu)選至少在70℃(極高嚴(yán)謹(jǐn))洗滌3次，每次15分鐘。
對于大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸長度的短探針，嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為在低于利用Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 481390)所述的算法計(jì)算的Tm大約5℃至大約10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM一元磷酸鈉(sodium monobasicphosphate)，0.1mM ATP，和每ml 0.2mg酵母RNA，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法最適地預(yù)雜交、雜交、和雜交后洗滌12至24小時(shí)。
對于大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸長度的短探針，載體材料在6X SCC加0.1％SDS洗滌15分鐘，一次，以及利用6X SSC，在低于計(jì)算的Tm 5℃至10℃，洗滌15分鐘，兩次。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16；或其同源序列的成熟多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的人工變體。優(yōu)選地，氨基酸變化具有次要的特性，也就是說不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；一般為1個(gè)至大約30個(gè)氨基酸的小的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基端甲硫氨酸殘基；最多大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過變化凈電荷或另外的功能，例如聚組氨酸區(qū)、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的促進(jìn)純化的小的延伸。
保存取代的實(shí)例在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天門冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)組的范圍之內(nèi)。通常不改變特異活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York進(jìn)行描述。最通常發(fā)生的互換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
除20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸之外，非標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸、和α-甲基絲氨酸)可被野生型多肽的氨基酸殘基取代。有限數(shù)目的非保守氨基酸，不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然的氨基酸可被氨基酸殘基替代?！胺翘烊坏陌被帷逡呀?jīng)在蛋白質(zhì)合成后被修飾，和/或在其側(cè)鏈具有不同于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然的氨基酸可化學(xué)合成，優(yōu)選是可商業(yè)購買的，并且包括六氫吡啶羧酸、噻唑烷羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3，3-二甲基脯氨酸。
備選地，氨基酸變化具有該多肽的理化性質(zhì)被改變的這種特性。例如，氨基酸變化可能改善多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，變化最適pH等等。
親本多肽中的必需氨基酸可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來鑒定，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham and Wells，1989，Science 2441081-1085)。在后者的技術(shù)中，在分子中的每個(gè)殘基導(dǎo)入單個(gè)丙氨酸突變，并且測試所得到的突變分子的生物活性(即，脂肪酶活性)，以鑒定對該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。也參見，Hilton et al.，1996，J.Biol.Chem.2714699-4708。酶的活性部位或其他的生物學(xué)相互作用還可通過結(jié)構(gòu)的物理分析來確定，如通過例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記的技術(shù)結(jié)合假定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來測定。參見例如，de Vos et al.，1992，Science 255306-312；Smith et al.，1992，J.Mol.Biol.224899-904；Wlodaver et al.，1992，F(xiàn)EBS Lett.30959-64。必需氨基酸的同一性還可從與本發(fā)明所述多肽相關(guān)的多肽的同一性分析來推斷。
可利用已知的誘變、重組、和/或改組方法，繼之以適當(dāng)?shù)暮Y選程序產(chǎn)生和測試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，例如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 24153-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862152-2156；WO95/17413；或WO95/22625公開的方法。能被使用的其他方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman et al.，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利號5,223,409；WO 92/06204)、和定區(qū)域誘變(Derbyshire et al.，1986，Gene 46145；Ner et al.，1988，DNA 7127)。
誘變/改組方法可與高通量、自動(dòng)篩選方法結(jié)合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆、誘變多肽的活性(Ness et al.，1999，Nature Biotechnology 17893-896)。編碼活性多肽的誘變DNA分子可從宿主細(xì)胞回收并且利用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法容許快速測定感興趣多肽中個(gè)別氨基酸殘基的重要性，并且可被應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
SEQ ID NO2，例如SEQ ID NO2的第25至396位氨基酸的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、更優(yōu)選3、最優(yōu)選2，以及最優(yōu)選1。
SEQ ID NO4，例如SEQ ID NO4的第25至283位氨基酸的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、更優(yōu)選3、最優(yōu)選2，以及最優(yōu)選1。
SEQ ID NO6，例如SEQ ID NO6的第20至318位氨基酸的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、更優(yōu)選3、最優(yōu)選2，以及最優(yōu)選1。
SEQ ID NO8，例如SEQ ID NO8的第19至348位氨基酸的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、更優(yōu)選3、最優(yōu)選2，以及最優(yōu)選1。
SEQ ID NO10，例如SEQ ID NO2的第25至393位氨基酸的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、更優(yōu)選3、最優(yōu)選2，以及最優(yōu)選1。
SEQ ID NO12，例如SEQ ID NO12的第20至294位氨基酸的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、更優(yōu)選3、最優(yōu)選2，以及最優(yōu)選1。
SEQ ID NO14，例如SEQ ID NO14的第25至308位氨基酸的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、更優(yōu)選3、最優(yōu)選2，以及最優(yōu)選1。
SEQ ID NO16，例如SEQ ID NO2的第26至404位氨基酸的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10、優(yōu)選9、更優(yōu)選8、更優(yōu)選7、更優(yōu)選至多6、更優(yōu)選5、更優(yōu)選4、更優(yōu)選3、最優(yōu)選2，以及最優(yōu)選1。
具有脂肪酶活性的多肽的來源 本發(fā)明的多肽可獲得自任何屬的微生物。為了本發(fā)明的目的，如在此使用的術(shù)語“獲得自”結(jié)合給定的來源應(yīng)指由核苷酸序列編碼的多肽是通過該來源或通過其中已經(jīng)被插入來自該來源的核苷酸序列的菌株生產(chǎn)的。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是細(xì)胞外分泌的。
本發(fā)明的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，多肽可以是革蘭氏陽性細(xì)菌的多肽，例如具有脂肪酶活性的芽孢桿菌屬多肽，例如，具有脂肪酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)多肽；或具有脂肪酶活性的鏈霉菌屬(Streptomyces)多肽，例如，具有脂肪酶活性的淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)多肽；或具有脂肪酶活性的革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，例如，具有脂肪酶活性的大腸桿菌或假單胞菌屬(Pseudomonas)多肽。
本發(fā)明的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽，例如假絲酵母(Candida)、克魯維氏酵母(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母(Pichia)、糖酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母(Yarrowia)多肽；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽，例如具有脂肪酶活性的枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐殖菌屬(Humicol)、稻瘟霉屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、草根霉屬(Thielavia)、彎勁霉屬(Tolypocladium)、或木霉屬(Trichoderma)多肽。
在優(yōu)選的方面，多肽是具有脂肪酶活性的卡爾斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyce douglasii、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地糖酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。
在另外優(yōu)選的方面，多肽是具有脂肪酶活性的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus，)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense，大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、或產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧氏木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或綠色木霉(Trichoderma viride)多肽。
在另外優(yōu)選的方面，多肽是具有脂肪酶活性的Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielavia australeinsis、Thielaviafimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、Thielaviaspededonium、Thielavia setosa、Thielavia subthermophila、Thielavia terrestris、Thielavia terricola、Thielavia thermophila、Thielavia variospora、或Thielaviawareingii多肽。
在更優(yōu)選的方面，多肽是煙曲霉多肽，例如，SEQ ID NO2或SEQ IDNO4的多肽，或其成熟多肽。
在另外更優(yōu)選的方面，多肽是Magnaporthe grisea多肽，以及最優(yōu)選Magnaporthe grisea FGSC 8958(Fungal Genetics Stock Center，Kansas City，MO)多肽，例如，SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、或SEQ ID NO10的多肽，或其成熟多肽。
在另外更優(yōu)選的方面，該多肽是構(gòu)巢曲霉多肽，并且最優(yōu)選構(gòu)巢曲霉A1000(Fungal Genetics Stock Center，Kansas City，MO)多肽，例如，SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的多肽，或其成熟多肽。
可以理解對于上述種屬，本發(fā)明包括完全的和不完全的狀態(tài)，及其他分類學(xué)上的等價(jià)物，例如，無性型，無論它們已知的種屬名稱。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地識別合適等價(jià)物的同一性。
這些種屬的菌株可在許多菌種保藏處由公眾容易地獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)、和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern RegionalResearch Center)(NRRL)。
此外，這種多肽可利用上述探針從其他來源，包括分離自自然界(例如土壤、堆肥、水等)的微生物鑒定和獲得。用于從天然生境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。然后多核苷酸可通過類似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得。一旦已經(jīng)用探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，該多核苷酸可通過利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)分離或克隆(參見例如，Sambrook et al.，1989，同上文)。
本發(fā)明的多肽也包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另外的多肽融合在該多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽通過將編碼另外多肽的核苷酸序列(或其部分)融合至本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生。用于生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使得它們處于框內(nèi)并且該融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制之下。
多核苷酸 本發(fā)明也涉及具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。
在優(yōu)選的方面，核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。在另外更優(yōu)選的方面，核苷酸序列是包含于在大腸桿菌NRRL B-30774中的質(zhì)粒pSMO224中的序列。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另外優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQ ID NO1的第73至1256位核苷酸。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含于在大腸桿菌NRRL B-30774中的質(zhì)粒pSMO224中的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明也包括編碼具有SEQ ID NO2或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明也涉及編碼具有脂肪酶活性的SEQ ID NO2的片段的SEQ ID NO1的亞序列。
在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pSMO223中的序列，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30773中。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQID NO3的成熟多肽編碼區(qū)。在另外優(yōu)選的方面，核苷酸序列是SEQ ID NO3的第73至944位核苷酸。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pSMO223中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30773中。本發(fā)明也包括編碼具有SEQ ID NO4或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO3或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明也涉及編碼具有脂肪酶活性的SEQ ID NO4的片段的SEQ ID NO3的亞序列。
在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pHyGe026中的序列，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30772中。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQID NO5的成熟多肽編碼區(qū)。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQ IDNO5的第58至1085位核苷酸。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pHyGe026中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30772中。本發(fā)明也包括編碼具有SEQ ID NO6或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ IDNO5或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明也涉及編碼具有脂肪酶活性的SEQ IDNO6的片段的SEQ ID NO5的亞序列。
在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列如SEQ ID NO7所示。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pCrAm138中的序列，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30781中。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQ ID NO7的成熟多肽編碼區(qū)。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQID NO7的第55至1044位核苷酸。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pCrAm138中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30781中。本發(fā)明也包括編碼具有SEQ ID NO8或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO7或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明也涉及編碼具有脂肪酶活性的SEQ ID NO8的片段的SEQ SEQ ID NO7的亞序列。。
在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列如SEQ ID NO9所示。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pBM135g中的序列，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30779中。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQID NO9的成熟多肽編碼區(qū)。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQ IDNO9的第79至1179位核苷酸。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pBM135g中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30779中。本發(fā)明也包括編碼具有SEQ ID NO10或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQID NO9或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明也涉及編碼具有脂肪酶活性的SEQID NO10的片段的SEQ ID NO9的亞序列。
在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列如SEQ ID NO11所示。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pJLin171中的序列，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30755中。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQID NO11的成熟多肽編碼區(qū)。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQ IDNO11的第58至1038位核苷酸。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pJLin171中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30755中。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pJLin171中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30755中。本發(fā)明也包括編碼具有SEQ ID NO12或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO11或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明也涉及編碼具有脂肪酶活性的SEQ ID NO12的片段的SEQ ID NO11的亞序列。
在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列如SEQ ID NO13所示。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pJLin170中的序列，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30754中。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQID NO13的成熟多肽編碼區(qū)。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQ IDNO13的第73至1116位核苷酸。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pJLin170中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30754中。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pJLin170中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30754中。本發(fā)明也包括編碼具有SEQ ID NO14或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO13或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明也涉及編碼具有脂肪酶活性的SEQ ID NO14的片段的SEQ ID NO13的亞序列。
在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列如SEQ ID NO15所示。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pBM141中的序列，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30780中。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQID NO15的成熟多肽編碼區(qū)。在另外優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是SEQ IDNO15的第76至1280位核苷酸。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pBM141中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30780中。在另外更優(yōu)選的方面，該核苷酸序列是包含在質(zhì)粒pBM141中的成熟多肽編碼區(qū)，其中該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30780中。本發(fā)明也包括編碼具有SEQ ID NO16或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO15或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明也涉及編碼具有脂肪酶活性的SEQ ID NO16的片段的SEQ ID NO15的亞序列。
本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中包括至少一個(gè)突變的突變多核苷酸，其中該突變的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，該成熟多肽是SEQ ID NO2的第25至396位氨基酸。
本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列中包括至少一個(gè)突變的突變多核苷酸，其中該突變的核苷酸序列編碼SEQ ID NO4的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，該成熟多肽是SEQ ID NO4的第25至283位氨基酸。
本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO5的成熟多肽編碼序列中包括至少一個(gè)突變的突變多核苷酸，其中該突變的核苷酸序列編碼SEQ ID NO6的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，該成熟多肽是SEQ ID NO6的第20至318位氨基酸。
本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO7的成熟多肽編碼序列中包括至少一個(gè)突變的突變多核苷酸，其中該突變的核苷酸序列編碼SEQ ID NO8的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，該成熟多肽是SEQ ID NO8的第19至348位氨基酸。
本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO9的成熟多肽編碼序列中包括至少一個(gè)突變的突變多核苷酸，其中該突變的核苷酸序列編碼SEQ ID NO10的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，該成熟多肽是SEQ ID NO10的第25至393位氨基酸。
本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO11的成熟多肽編碼序列中包括至少一個(gè)突變的突變多核苷酸，其中該突變的核苷酸序列編碼SEQ ID NO12的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，該成熟多肽是SEQ ID NO12的第20至294位氨基酸。
本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO13的成熟多肽編碼序列中包括至少一個(gè)突變的突變多核苷酸，其中該突變的核苷酸序列編碼SEQ ID NO14的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，該成熟多肽是SEQ ID NO14的第25至308位氨基酸。
本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中包括至少一個(gè)突變的突變多核苷酸，其中該突變的核苷酸序列編碼SEQ ID NO16的成熟多肽。在另外優(yōu)選的方面，該成熟多肽是SEQ ID NO16的第26至404位氨基酸。
用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸可通過例如，利用已知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選以檢測具有共用結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的克隆DNA片段來進(jìn)行。參見例如，Innis et al.，1990，PCRA Guide to Methods and Application，AcademicPress，New York?？墒褂闷渌暮怂釘U(kuò)增方法，例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化的轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。該多核苷酸可能克隆自草根霉屬的菌株，或另外的或相關(guān)的生物體，并且因此例如可能是編碼核苷酸序列區(qū)域的多肽的等位或種屬變體。
本發(fā)明也涉及具有與SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列有至少60％，優(yōu)選至少65％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，以及最有選至少97％同一性程度的核苷酸序列、編碼活性多肽的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO1的第73至1256位核苷酸。
本發(fā)明也涉及具有與SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，以及最優(yōu)選至少97％同一性程度的核苷酸序列，編碼活性多肽的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO3的第73至944位核苷酸。
本發(fā)明也涉及具有與SEQ ID NO5的成熟多肽編碼序列有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，以及最優(yōu)選至少97％同一性程度的核苷酸序列，編碼活性多肽的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO5的第58至1085位核苷酸。
本發(fā)明也涉及具有與SEQ ID NO7的成熟多肽編碼序列有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，以及最優(yōu)選至少97％同一性程度的核苷酸序列，編碼活性多肽的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO7的第55至1044位核苷酸。
本發(fā)明也涉及具有與SEQ ID NO9的成熟多肽編碼序列有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，以及最優(yōu)選至少97％同一性程度的核苷酸序列，編碼活性多肽的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO9的第73至1179位核苷酸。
本發(fā)明也涉及具有與SEQ ID NO11的成熟多肽編碼序列有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少97％同一性程度的核苷酸序列，編碼活性多肽的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQID NO11的第58至1038位核苷酸。
本發(fā)明也涉及具有與SEQ ID NO13的成熟多肽編碼序列有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少97％同一性程度的核苷酸序列，編碼活性多肽的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQID NO13的第73至1116位核苷酸。
本發(fā)明也涉及具有與SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少97％同一性程度的核苷酸序列，編碼活性多肽的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，該成熟多肽編碼序列是SEQID NO15的第76至1280位核苷酸。
編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的改變可能是為合成基本上類似于該多肽的多肽所必需的。術(shù)語與多肽“基本上相似的”是指非天然存在形式的多肽。這些多肽可能以一些工程化的方式不同于分離自其天然來源的多肽，例如特異活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等有不同的人工變體。該變體序列可根據(jù)作為SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的多肽編碼區(qū)存在的核苷酸序列，例如其亞序列，和/或通過導(dǎo)入不產(chǎn)生另外的由該核苷酸序列編碼的多肽氨基酸序列，但相應(yīng)于將被用于生產(chǎn)該酶的宿主生物體的密碼子利用率的核苷酸取代，或通過導(dǎo)入可能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代來進(jìn)行構(gòu)建。對于核苷酸取代的概述參見例如Ford et al.，1991，Protein Expression and Purification 295-107。
對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是這種取代可在對該分子功能至關(guān)重要的區(qū)域外產(chǎn)生并且仍然生成活性多肽。對由本發(fā)明的分離多核苷酸編碼的多肽，并且因此優(yōu)選沒有經(jīng)受取代的多肽的活性所必需的氨基酸殘基可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來鑒定，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(參見例如，Cunningham and Wells，1989，Science 2441081-1085)。在后者的技術(shù)中，在分子的每個(gè)帶陽電荷的殘基導(dǎo)入突變，并且測試所得到的突變分子的脂肪酶活性以鑒定對該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。底物酶相互作用的位點(diǎn)還可通過分析立體結(jié)構(gòu)來確定，如通過例如核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親合標(biāo)記的技術(shù)來測定(參見例如，de Vos et al.，1992，Science 255306-312；Smith et al.，1992，Journal of Molecular Biology 224899-904；Wlodaver et al.，1992，F(xiàn)EBS Letters 30959-64)。
本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明多肽的分離多核苷酸，其如在此定義的，在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件，以及最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11，SEQ ID NO13，or SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈，或其等位變體和亞序列雜交(Sambrooket al.，1989，supra)。在優(yōu)選的方面，SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列是第73至1259位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列是第73至947位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO5的成熟多肽編碼序列是58至1088位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO7的成熟多肽編碼序列是55至1044位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO9的成熟多肽編碼序列是第73至1179位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ IDNO11的成熟多肽編碼序列是58至1041位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO13的成熟多肽編碼序列是第73至1119位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列是第76至1280位核苷酸。
本發(fā)明也涉及通過(a)將DNA群在極低、低、中、中-高、高、或極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交；以及(b)分離編碼具有脂肪酶活性的多肽的雜交多核苷酸來獲得的分離多核苷酸。在優(yōu)選的方面，SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列是第73至1259位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列是第73至947位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO5的成熟多肽編碼序列是58至1088位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO7的成熟多肽編碼序列是55至1044位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO9的成熟多肽編碼序列是第73至1179位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO11的成熟多肽編碼序列是58至1041位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ IDNO13的成熟多肽編碼序列是第73至1119位核苷酸。在另外優(yōu)選的方面，SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列是第76至1280位核苷酸。
核酸構(gòu)建體 本發(fā)明也涉及包括與指導(dǎo)編碼序列在合適宿主細(xì)胞中，在與該調(diào)控序列相適合的條件下表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列可操作連接的本發(fā)明的分離多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
編碼本發(fā)明多肽的分離多核苷酸可以多種方式被操作以保證該多肽的表達(dá)。在其插入載體之前該多核苷酸序列的操作可能根據(jù)該表達(dá)載體而是合乎需要或必需的。利用重組DNA方法來改變多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
調(diào)控序列可以是合適的啟動(dòng)子序列，由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識別的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的、和雜合啟動(dòng)子，并且可從編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。
用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從大腸桿菌lac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xyM和xylB基因，和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 753727-3731)獲得的啟動(dòng)子，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer et al.，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 8021-25)。進(jìn)一步的啟動(dòng)子在″Useful proteins from recombinant bacteria″in Scientific American，1980，24274-94；和Sambrook et al.，1989，supra中有描述。
用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO00/5 6900)、Fusariumvenenatum Quinn(WO00/56900)、尖孢鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶I、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶II、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶III、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶IV、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的基因獲得的啟動(dòng)子，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子雜合體)；及其突變、截短、和混合的(hybrid)啟動(dòng)子。
在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子獲得自釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫(metallothionine)蛋白(CUP1)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。用于酵母宿主細(xì)胞的其他有用啟動(dòng)子由Romanos et al.，1992，Yeast 8423-488描述。
調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼該多肽的核苷酸序列的3’末端可操作連接。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶的基因。
用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲得自釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)、和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。用于酵母宿主細(xì)胞的其他有用終止子由Romanos et al.，1992，supra描述。
調(diào)控序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，對宿主細(xì)胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列與編碼該多肽的核苷酸序列的5’末端可操作連接。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因獲得。
用于酵母宿主細(xì)胞的合適的前導(dǎo)序列獲得自釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因。
調(diào)控序列也可以是多腺苷酸化序列，與核苷酸序列的3’末端可操作連接，并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)，由宿主細(xì)胞識別為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多腺苷殘基的信號的序列。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何多腺苷序列都可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多腺苷酸化序列獲得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
用于酵母宿主細(xì)胞的有用多腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990描述。
調(diào)控序列也可以是編碼與多肽的氨基末端連接的氨基酸序列并且指導(dǎo)該編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的信號肽編碼區(qū)。核苷酸序列編碼序列的5’端可固有地包含天然連接具有編碼分泌多肽的編碼區(qū)節(jié)段的翻譯閱讀框的信號肽編碼區(qū)。備選地，編碼序列的5’端可包含與該編碼區(qū)外源的信號肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列非天然地包含信號肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要外來的信號肽編碼區(qū)。備選地，外來的信號肽編碼區(qū)可簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)，即分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，都可用于本發(fā)明。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼區(qū)是從芽孢桿菌NCIB 11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)、和枯草芽孢桿菌prsA的基因獲得的信號肽編碼區(qū)。進(jìn)一步的信號肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57109-137描述。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶、Humicola insolens葡聚糖內(nèi)切酶V、和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)。
在優(yōu)選的方面，該信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO2的第1至24位氨基酸的SEQ ID NO1的第1至72位核苷酸。
在另外優(yōu)選的方面，該信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO4的第1至24位氨基酸的SEQ ID NO3的第1至72位核苷酸。
在另外優(yōu)選的方面，該信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO6的第1至19位氨基酸的SEQ ID NO5的第1至42位核苷酸。
在另外優(yōu)選的方面，該信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO8的第1至18位氨基酸的SEQ ID NO7的第1至54位核苷酸。
在另外優(yōu)選的方面，該信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO10的第1至24位氨基酸的SEQ ID NO9的第1至72位核苷酸。
在另外優(yōu)選的方面，該信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO12的第1至19位氨基酸的SEQ ID NO11的第1至57位核苷酸。
在另外優(yōu)選的方面，該信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO14的第1至24位氨基酸的SEQ ID NO13的第1至72位核苷酸。
在另外優(yōu)選的方面，該信號肽編碼區(qū)是編碼SEQ ID NO16的第1至25位氨基酸的SEQ ID NO15的第1至75位核苷酸。
用于酵母宿主細(xì)胞的有用信號肽是從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得的。其他有用的信號肽編碼區(qū)由Romanos et al.，1992，supra描述。
調(diào)控序列也可以是編碼位于多肽氨基端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。所得到的多肽被稱為前酶或前多肽(或有時(shí)候?yàn)槊冈?。前多肽通常是無活性的并且可通過前肽從前多肽的催化或自催化裂解而被轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可獲得自枯草芽胞桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽胞桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜熱毀絲霉漆酶(WO95/33836)的基因。
當(dāng)信號肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基端時(shí)，前肽區(qū)緊鄰多肽的氨基端而信號肽區(qū)緊鄰前肽區(qū)的氨基端。
可能也需要添加容許調(diào)節(jié)多肽相對于宿主細(xì)胞生長而表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是導(dǎo)致基因表達(dá)根據(jù)化學(xué)或物理的刺激，包括存在調(diào)節(jié)化合物而打開或關(guān)閉的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKA α-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可用作調(diào)控序列。調(diào)節(jié)序列的其他實(shí)例是容許基因擴(kuò)增的調(diào)節(jié)序列。在真核系統(tǒng)中，這些包括在存在氨甲蝶呤時(shí)擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和伴隨重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列可操作連接。
表達(dá)載體 本發(fā)明也涉及包括本發(fā)明多核苷酸、啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。在此各種核酸和調(diào)控序列可被連接在一起以產(chǎn)生可能包括一個(gè)或多個(gè)容許在這種位點(diǎn)插入或取代該編碼多肽的核苷酸序列的方便限制性位點(diǎn)的重組表達(dá)載體。備選地，本發(fā)明的核苷酸序列可通過插入核苷酸序列或包括進(jìn)入適當(dāng)表達(dá)載體的序列的核酸構(gòu)建體而被表達(dá)。在制造表達(dá)載體時(shí)，編碼序列位于載體中以使得該編碼序列可操作地連接用于表達(dá)的適當(dāng)調(diào)控序列。
重組表達(dá)載體可以是能夠方便地經(jīng)受重組DNA方法并且可導(dǎo)致感興趣的核苷酸序列表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇一般取決于載體與其中被導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是線性或閉合的環(huán)形質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制的載體，即，作為染色體外實(shí)體存在，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可包含用于保證自我復(fù)制的任何方式。備選地，載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，整合到基因組中并且與其已經(jīng)被整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可使用一起包含將被導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總DNA的單個(gè)載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)容許容易選擇轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞的可選擇標(biāo)記?？蛇x擇的標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營養(yǎng)缺陷型(prototrophy to auxotrophs)等。
細(xì)菌的可選擇標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽胞桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、或四環(huán)素抗性的抗生素抗性的標(biāo)記。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素(phosphinothricin)轉(zhuǎn)乙酰酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸酯脫羧酶)、sC(硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶)、和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，及其等同物。優(yōu)選用于曲霉屬細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含容許該載體整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組或該載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主復(fù)制的元件。
對于整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴于編碼多肽的多核苷酸序列或用于通過同源或非同源重組使該載體整合進(jìn)入基因組的載體的任何其他元件。備選地，該載體可包含通過同源重組在染色體的準(zhǔn)確位置直接整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組的附加核苷酸序列。為了增加在準(zhǔn)確位置整合的可能性，該整合元件應(yīng)優(yōu)選包含足夠數(shù)目的核酸，例如100至10,000個(gè)堿基對、優(yōu)選400至10,000個(gè)堿基對，以及最優(yōu)選800至10,000個(gè)堿基對，其與相應(yīng)的靶序列具有高度同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。該整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中靶序列同源的任何序列。此外，該整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，載體可通過非同源重組被整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組。
對于自主復(fù)制，該載體可進(jìn)一步包括能夠使載體在所述的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。復(fù)制原點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的調(diào)節(jié)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語“復(fù)制原點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在此定義為使質(zhì)粒或載體能夠體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。
細(xì)菌的復(fù)制原點(diǎn)的實(shí)例是容許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184，以及容許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的復(fù)制原點(diǎn)。
用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制原點(diǎn)的實(shí)例是2micron復(fù)制原點(diǎn)、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、以及ARS4和CEN6的組合。
用于絲狀真菌細(xì)胞的復(fù)制原點(diǎn)的實(shí)例是AMA1和ANS1(Gems et al.，1991，Gene 9861-67；Cullen et al.，1987，Nucleic Acids Research 159163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分離和包括該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可根據(jù)WO00/24883中公開的方法來實(shí)現(xiàn)。
一個(gè)以上拷貝的本發(fā)明的多核苷酸可被插入宿主細(xì)胞以增加該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過將至少一個(gè)附加拷貝的序列整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組或通過包括可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因和該多核苷酸來獲得，其中包含擴(kuò)增拷貝的選擇標(biāo)記基因并且由此包含附加拷貝多核苷酸的細(xì)胞可通過在存在適當(dāng)?shù)倪x擇劑時(shí)培養(yǎng)該細(xì)胞來篩選。
用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的(參見例如，Sambrook et al.，1989，supra)。
宿主細(xì)胞 本發(fā)明也涉及包括被有利地用于重組生產(chǎn)多肽的本發(fā)明多核苷酸的重組宿主細(xì)胞。包括本發(fā)明多核苷酸的載體被導(dǎo)入宿主細(xì)胞以使得該載體如早先說明的作為染色體的組成部分或作為染色體外的自我復(fù)制載體來維持。術(shù)語″宿主細(xì)胞″包括由于在復(fù)制期間發(fā)生突變而與親本細(xì)胞不相同的親本細(xì)胞任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。
有用的單細(xì)胞微生物是細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽性細(xì)菌，包括但不限于，芽胞桿菌細(xì)胞，例如，嗜堿芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽胞桿菌、遲緩芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌、和蘇云金桿菌；或鏈霉菌細(xì)胞，例如，淺青紫鏈霉菌和鼠會(huì)鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌和假單胞菌屬。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、或枯草芽胞桿菌細(xì)胞。在另外優(yōu)選的方面，芽胞桿菌細(xì)胞是嗜堿的芽胞桿菌。
將載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞可例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，Changand Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)，利用感受態(tài)細(xì)胞(參見例如，Young and Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，orDubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56209-221)、電穿孔(參見例如，Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6742-751)、或接合(參見例如，Koehler and Thorne，1987，Journal ofBacteriology 1695771-5278)來實(shí)現(xiàn)。
宿主細(xì)胞也可以是真核生物，例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。
在優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所描述的)，以及卵菌門(如在Hawksworth et al.，1995，supra，page 171中所引用的)和所有的mitosporic真菌(Hawksworth et al.，1995，supra)。
在更優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。如在此使用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目)(Endomycetales)、產(chǎn)生擔(dān)子孢子酵母(basidiosporogenousyeast)、和屬于半知菌類(芽生菌)(the Fungi Imperfecti(Blastomycetes))的酵母。因?yàn)榻湍傅姆诸惪赡茉趯碛凶兓?，為了本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)定義為在Biology and Activities of Yeast(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.，andDavenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所說明的。
在更優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母、漢遜氏酵母(Hansenula)、克魯維氏酵母、畢赤氏酵母、糖酵母、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母(Yarrowia)細(xì)胞。
在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母、Saccharomyces diastaticus、Saccharomycesdouglasii、克魯弗糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地糖酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)細(xì)胞。在另外的最優(yōu)選方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)細(xì)胞。在另外的最優(yōu)選方面，酵母宿主細(xì)胞是Yarrowia lipolytica細(xì)胞。
在另外的更優(yōu)選方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌(Eumycota)亞門和卵菌門(Oomycota)的全部絲狀體(如Hawksworth et al.，1995，同上文所描述的)。絲狀真菌通常的特征在于菌絲的壁由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖、及其他復(fù)合多糖組成。營養(yǎng)生長是通過菌絲的伸長，而碳分解代謝是專性需氧的。相比之下，例如釀酒酵母的酵母營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞葉狀體的出芽，而碳分解代謝可能是發(fā)酵性的。
在更優(yōu)選的方面，絲狀的真菌宿主細(xì)胞是支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、短梗霉屬(Aureobasidium)、Bjerkandera，Ceriporiopsis，鬼傘屬(Coprinus)、Coriolus，隱球酵母屬(Cryptococcus)、Filibasidium，鐮孢屬、腐殖菌屬、Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、Neocallimastix，脈孢菌屬、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬、Phanerochaete，Phlebia，Piromyces，側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、Talaromyces，Thermoascus，草根霉屬、Tolypocladium，Trametes，或木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞。
在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉細(xì)胞細(xì)胞。在另外的最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、或Fusariumvenenatum細(xì)胞。在另外的最優(yōu)選方面，絲狀的真菌宿主細(xì)胞是Bjerkanderaadusta、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、灰蓋鬼傘(Corioluscinereus)、Coriolus hirsutus，Humicola insolens，Humicola lanuginosa，米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Phanerochaetechrysosporium，Phlebia radiata，Pleurotus eryngii，Thielavia terrestris，Trametesvillosa，Trametes versicolor，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康寧氏木霉、Trichoderma longibrachiatum，里氏木霉(Trichoderma reesei)、或綠色木霉(Trichoderma viride)細(xì)胞。
真菌細(xì)胞可通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、和細(xì)胞壁再生的本質(zhì)上已知的方法而被轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉和木霉宿主細(xì)胞的合適方法在EP 238023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 811470-1474中有描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢種屬的合適方法由Malardier et al.，1989，Gene 78147-156，和WO96/00787描述。酵母可利用由Becker and Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal ofBacteriology 153163；and Hinnen et al.，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751920描述的方法轉(zhuǎn)化。
生產(chǎn)方法 本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)在其野生型形式時(shí)能夠生產(chǎn)多肽的細(xì)胞；和(b)回收該多肽。在優(yōu)選的方面，該宿主細(xì)胞屬于曲霉屬。在更優(yōu)選的方面，該宿主細(xì)胞是煙曲霉。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，該宿主細(xì)胞是構(gòu)巢曲霉。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，該宿主細(xì)胞屬于Magnaporthe。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，該細(xì)胞是Magnaporthe grisea。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包括在SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變的突變核苷酸序列，其中該突變核苷酸序列編碼包括或由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽組成的多肽，以及(b)回收該多肽。
在優(yōu)選的方面，SEQ ID NO2的的成熟多肽是第25至396位氨基酸。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQ ID NO4的成熟多肽是第25至283位氨基酸。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQ ID NO6的成熟多肽是第20至318位氨基酸。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQ ID NO8的成熟多肽是第19至348位氨基酸。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQ ID NO10的成熟多肽是第25至393位氨基酸。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQ ID NO12的成熟多肽是第20至294位氨基酸。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQ ID NO14的成熟多肽是第25至308位氨基酸。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQ ID NO16的成熟多肽是第26至404位氨基酸。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，細(xì)胞利用本領(lǐng)域已知的方法在適于生產(chǎn)多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，細(xì)胞可通過在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行的搖瓶載培、和小規(guī)模的或大規(guī)模的發(fā)酵(包括連續(xù)的、分批的、分批補(bǔ)料、或固態(tài)發(fā)酵)，在合適的培養(yǎng)基和容許該多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)發(fā)生在利用本領(lǐng)域已知的方法包括碳和氮源和無機(jī)鹽的合適培養(yǎng)基中。合適的培養(yǎng)基可獲得自商業(yè)供應(yīng)者或可根據(jù)公開的組合物(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)來制備。如果該多肽分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，該多肽可從培養(yǎng)基直接回收。如果該多肽不分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，它可從細(xì)胞裂解物回收。
多肽可利用本領(lǐng)域已知的特異于該多肽的方法來檢測。這些檢測方法可包括特異抗體的使用，酶產(chǎn)物的形成，或酶底物的消失。例如，酶活性測定可如在此說明的用來測定多肽的活性。
所得到的多肽可利用本領(lǐng)域已知的方法來回收。例如，多肽可通過常規(guī)方法，包括但不限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀而從培養(yǎng)基回收。
本發(fā)明的多肽可通過本領(lǐng)域已知的多種方法來純化，包括但不限于，色譜法(例如，離子交換、親合性、疏水性的、色譜聚焦、和大小排阻)，電泳方法(例如，準(zhǔn)備性等電位焦距)、差異溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取法(參見例如，Protein Purification，J.-C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989)以獲得基本上純的多肽。
植物 本發(fā)明還涉及已經(jīng)用本發(fā)明的編碼具有脂肪酶活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化以使得表達(dá)和生產(chǎn)可回收數(shù)量的多肽的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、或植物細(xì)胞。該多肽可從植物或植物部分回收。備選地，包含重組多肽的植物或植物部分可用于改善食品或飼料的品質(zhì)，例如改善營養(yǎng)價(jià)值、適口性(palatability)、和流變(rheological)性質(zhì)，或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
轉(zhuǎn)基因的植物可以是雙子葉(雙子葉植物)或單子葉植物(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草類(grasses)，例如草地早熟禾(meadow grass)(藍(lán)草(blue grass)，早熟禾屬(Poa))，飼用牧草(forage grass)，例如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)、寒地型牧草(temperate grass)，例如Agrostis，和谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高梁和玉米(玉蜀黍)。
雙子葉植物的實(shí)例是煙草、豆莢，例如羽扇豆(lupin)、馬鈴薯、甜菜(sugarbeet)、豌豆、菜豆和大豆，和十字花科植物(十字花科(Brassicaceae)科)，例如花椰菜、油菜籽(rape seed)、和緊密相關(guān)的模型生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)。
植物部分的實(shí)例是莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子、和塊莖，以及包括這些部分的個(gè)別組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織parenchyme、維管組織、分生組織。特異的植物細(xì)胞隔室，例如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無論什么組織起源，被認(rèn)為是植物部分。同樣地，例如促進(jìn)本發(fā)明應(yīng)用的特異組織和分離細(xì)胞的植物部分也被認(rèn)為是植物部分，例如胚胎、胚乳、糊粉粒和種皮。
也包括在本發(fā)明范疇內(nèi)的是這種植物、植物部分、和植物細(xì)胞的后代。
表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來構(gòu)建。簡言之，植物或植物細(xì)胞通過將編碼本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體整合進(jìn)入植物宿主基因組或葉綠體基因組并且繁殖所得到的改變植物或植物細(xì)胞成為轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞來構(gòu)建。
表達(dá)構(gòu)建體便利地是包括可操作地連接有為在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該核苷酸序列所需要的合適調(diào)節(jié)序列的編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。此外，該表達(dá)構(gòu)建體可包括用于鑒定其中已經(jīng)整合有該表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞和為將該構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物所必需的DNA序列的選擇標(biāo)記(后者依賴于所使用的DNA導(dǎo)入方法)。
調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子和終止子序列以及任選地信號或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇根據(jù)例如需要何時(shí)、何處以及如何表達(dá)該多肽來確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成性的或可誘導(dǎo)的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異的，以及該基因產(chǎn)物可以被靶向特異的組織或植物部分，例如種子或葉片。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86506描述。
對于組成性的表達(dá)，可使用35S-CaMV、玉米泛素1、和水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(Franck et al.，1980，Cell 21285-294，Christensen et al.，1992，PlantMo.Biol.18675-689；Zhang et al.，1991，Plant Cell31155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來自儲(chǔ)存組織，例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的啟動(dòng)子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)，或來自代謝庫(sink)組織，例如分生組織(Ito et al.，1994，Plant Mol.Biol.24863-878)，種子特異的啟動(dòng)子，例如來自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或白蛋白啟動(dòng)子(Wu et al.，1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)、來自豆球蛋白B4的蠶豆啟動(dòng)子和來自蠶豆(Vicia faba)的未知的種子蛋白質(zhì)基因(Conrad et al.，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)、來自植物油體蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子(Chen et al.，1998，Plant and Cell Physiology 39935-941)、來自歐洲油菜(Brassica napus)的貯藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本領(lǐng)域已知的任何其他種子特異性啟動(dòng)子，例如如如WO91/14772所描述的。此外，啟動(dòng)子可以是葉特異的啟動(dòng)子，例如來自水稻或番茄的rbcs啟動(dòng)子(Kyozuka etal.，1993，Plant Physiology 102991-1000、小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(Mitra and Higgins，1994，Plant Molecular Biology 2685-93)、來自水稻的aldP基因啟動(dòng)子(Kagaya et al.，1995，Molecular and General Genetics248668-674)、或創(chuàng)傷(wound)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，例如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu et al.，1993，Plant Molecular Biology 22573-588)。同樣地，啟動(dòng)子可通過非生物的處理來誘導(dǎo)，例如溫度、干旱、或鹽度變化，或通過活化啟動(dòng)子的外部施加的物質(zhì)來誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素、植物激素，例如乙烯、脫落酸、和赤霉酸、和重金屬。
啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可用于在植物中獲得本發(fā)明多肽的更高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是置于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如，Xu et al.，1993，同上文，公開了使用水稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一個(gè)內(nèi)含子增強(qiáng)表達(dá)。
表達(dá)構(gòu)建體的選擇標(biāo)記基因和任何其他部分可從本領(lǐng)域可得到的那些來選擇。
核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法被整合進(jìn)入植物基因組，包括土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射、粒子轟擊、生物導(dǎo)彈轉(zhuǎn)化、和電穿孔(Gasser et al.，1990，Science 2441293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8535；Shimamoto et al.，1989，Nature 338274)。
目前，根癌土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的選擇方法(for a review，see Hooykas and Schilperoort，1992，Plant MolecularBiology 1915-38)并且還可用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管其他的轉(zhuǎn)化方法經(jīng)常被用于這些植物。目前，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的所選擇方法是粒子轟擊(涂有轉(zhuǎn)化DNA的金或鎢微粒)胚胎愈傷組織或發(fā)育的胚胎(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5158-162；Vasil et al.，1992，Bio/Technology 10667-674)。用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的備選方法是基于如Omirulleh等，1993，Plant MolecularBiology 21415-428描述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化后，選擇已經(jīng)整合有表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并且根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法使之再生成為完整植株。轉(zhuǎn)化過程經(jīng)常被設(shè)計(jì)用于在再生期間或在隨后的生成中利用例如用兩個(gè)單獨(dú)的T-DNA構(gòu)建體共同轉(zhuǎn)化或通過特異重組酶的選擇基因的位點(diǎn)特異切除來選擇性消除選擇基因。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)包括本發(fā)明的編碼具有脂肪酶活性多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收該多肽。
脂肪酶活性的去除或降低 本發(fā)明也涉及生產(chǎn)親本細(xì)胞突變體的方法，其包括使編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列，或其部分?jǐn)嗔?disrupting)或缺失，這導(dǎo)致當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)該突變細(xì)胞比所述親本細(xì)胞產(chǎn)生較少的該多肽。
突變細(xì)胞可利用本領(lǐng)域已知方法通過減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列表達(dá)來構(gòu)建，例如插入、斷裂、置換、或缺失。在優(yōu)選的方面，該宿主細(xì)胞是失活的。待改變或失活的核苷酸序列可以是例如對活性必要的編碼區(qū)或其部分，或?yàn)楸磉_(dá)編碼區(qū)所需要的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即足以影響核苷酸序列表達(dá)的部分。用于可能的改變的其他調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄活化子。
核苷酸序列的改變或失活可通過使親本細(xì)胞經(jīng)受誘變并且篩選其中核苷酸序列的表達(dá)已經(jīng)被減少或消除的突變細(xì)胞來進(jìn)行?？赡苁翘禺惢螂S機(jī)的誘變可例如通過利用合適的物理或化學(xué)誘變處理劑，通過利用合適的寡聚核苷酸，或通過使DNA序列經(jīng)受PCR產(chǎn)生的誘變來進(jìn)行。此外，誘變可通過利用這些誘變處理劑的任何組合來進(jìn)行。
適于本目的的物理或化學(xué)誘變處理劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲胲、亞硝酸、乙基磺酸甲烷(EMS)、亞硫酸氫鈉、蟻酸、和核苷酸類似物。
當(dāng)使用這種試劑時(shí)，誘變一般通過在存在選擇的誘變處理劑時(shí)在適宜條件下培養(yǎng)待誘變處理的親本細(xì)胞，以及篩選和/或選擇顯示減少或不表達(dá)基因的突變細(xì)胞來進(jìn)行。
核苷酸序列的改變或失活可通過導(dǎo)入、取代、或除去基因或?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄或翻譯需要的調(diào)節(jié)元件中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸來實(shí)現(xiàn)。例如，核苷酸可被插入或除去以使得導(dǎo)致形成終止密碼子的導(dǎo)入、起始密碼子的除去、或開放讀框的變化。這種改變或失活可通過定點(diǎn)誘變或?qū)е抡T變的PCR根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來實(shí)現(xiàn)。盡管原則上，改變可在體內(nèi)進(jìn)行，即直接在表達(dá)待改變核苷酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，優(yōu)選如下列例證的在體外進(jìn)行改變。
消除或減少細(xì)胞表達(dá)核苷酸序列的便利方式的實(shí)例是基于基因置換、基因缺失或基因斷裂的技術(shù)。例如，在基因斷裂方法中，體外誘變處理相應(yīng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列以產(chǎn)生然后被轉(zhuǎn)化進(jìn)入親本細(xì)胞以產(chǎn)生有缺陷基因的缺陷性核酸序列。通過同源重組，有缺陷的核酸序列替換內(nèi)源的核苷酸序列。可能需要有缺陷的核苷酸序列也編碼可用來選擇其中該核苷酸序列已經(jīng)被改變或破壞轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記。在特別優(yōu)選的方面中，該核苷酸序列用可選擇的標(biāo)記，例如在此描述的那些來斷裂。
備選地，該核苷酸序列的改變或失活可通過利用與該核苷酸序列互補(bǔ)的序列建立的反義技術(shù)或RNAi技術(shù)來進(jìn)行。更具體地說，通過細(xì)胞表達(dá)核苷酸序列可通過導(dǎo)入與在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與在細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交的基因的核苷酸序列互補(bǔ)的序列來減少或消除。在容許互補(bǔ)的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，翻譯的蛋白質(zhì)的數(shù)量因此被減少或消除。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括斷裂或缺失編碼多肽的核苷酸序列或其調(diào)控序列的親本細(xì)胞的突變細(xì)胞，這導(dǎo)致該突變細(xì)胞或無多肽與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的多肽或不產(chǎn)生多肽。
如此產(chǎn)生的有缺陷多肽的突變細(xì)胞作為用于表達(dá)同源和/或異源多肽的宿主細(xì)胞是特別有用的。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)同源或異源多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)該突變細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。術(shù)語″異源的多肽″在此定義為對于宿主細(xì)胞不是天然的多肽，其中已經(jīng)產(chǎn)生改變以變化天然序列的天然蛋白質(zhì)，或其表達(dá)由于通過重組DNA技術(shù)操作該宿主細(xì)胞而定量改變的天然蛋白質(zhì)。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)本發(fā)明多肽的細(xì)胞來生產(chǎn)基本上無脂肪酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，以及在發(fā)酵已經(jīng)完成之前、期間或之后通過能夠抑制脂肪酶活性的有效量試劑加入發(fā)酵肉湯來生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，從該發(fā)酵肉湯回收感興趣的產(chǎn)物，以及任選進(jìn)一步純化該回收產(chǎn)物的方法。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及通過在容許該產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞來生產(chǎn)基本上無脂肪酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，使所得到的培養(yǎng)肉湯經(jīng)受組合的pH和溫度處理以基本上降低該脂肪酶活性，以及從該培養(yǎng)肉湯回收該產(chǎn)物的方法。備選地，組合的pH和溫度處理可對培養(yǎng)肉湯回收的酶制劑進(jìn)行。組合的pH和溫度處理可任選地與用脂肪酶抑制劑加以處理相組合。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，有可能除去至少60％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少95％、以及最優(yōu)選至少99％的脂肪酶活性。脂肪酶活性的完全去除可通過利用這個(gè)方法來獲得。
組合的pH和溫度處理優(yōu)選在2-4或9-11的pH范圍內(nèi)，以及至少60-70℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行足夠的時(shí)段以達(dá)到預(yù)期效果，其中一般30至60分鐘是足夠的。
用于培養(yǎng)和純化感興趣產(chǎn)物的方法可通過本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行。
本發(fā)明用于生產(chǎn)基本上無脂肪酶的產(chǎn)物的方法在真核多肽的生產(chǎn)中具有特別的益處，特別是真菌蛋白質(zhì)，例如酶。該酶可選自例如，淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、細(xì)胞裂解酶、氧化還原酶、或植物細(xì)胞壁降解酶。這種酶的實(shí)例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠裂解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。脂肪酶缺陷的細(xì)胞也可用于表達(dá)感興趣藥物的異源蛋白質(zhì)，例如激素、生長因素、受體等。
可以理解術(shù)語″真核的多肽″不僅包括天然的多肽，而且包括已經(jīng)通過氨基酸取代、缺失或添加改變，或增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等的其他這種改變的多肽，例如酶。
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的基本上沒有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
組合物 本發(fā)明也涉及生產(chǎn)包括本發(fā)明多肽的組合物的方法。優(yōu)選地，該組合物在這種多肽中富集。術(shù)語″富集的″表明組合物的脂肪酶活性已經(jīng)增加，例如富集因子為至少1.1。
組合物可包括作為主要酶促成分的本發(fā)明多肽，例如單組分組合物。備選地，該組合物可包括多種酶促活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠裂解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。附加的酶可例如由屬于曲霉屬優(yōu)選棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis，F(xiàn)usarium crookwellense，大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、Fusarium toruloseum，F(xiàn)usariumtrichothecioides，或Fusarium venenatum；腐殖菌屬，優(yōu)選Humicola insolens或Humicola lanuginosa；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧氏木霉、Trichodermalongibrachiatum，里氏木霉或綠色木霉的微生物來生產(chǎn)。
多肽組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來制備并且可以是液體或干燥組合物的形式。例如，多肽組合物可以是顆粒狀或微顆粒的形式。被包括入組合物的多肽可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法被穩(wěn)定。
如下給出本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選使用的實(shí)施例。本發(fā)明多肽組合物的劑量以及使用該組合物的其他條件可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來確定。
用途 本發(fā)明還指向利用該具有脂肪酶活性的多肽或其組合物的方法。
在脫膠中的用途.本發(fā)明的多肽可被用來使含水的碳水化合物溶液或漿液脫膠以改善其可濾性，特別是淀粉水解物，尤其是難以過濾和產(chǎn)生渾濁濾液的小麥淀粉水解物。處理可利用本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行。參見例如，EP 219,269、EP 808,903、和美國專利號6,103,505。
在烘焙中的用途.本發(fā)明的多肽可根據(jù)美國專利號6,558,715被用于烘焙。
在去污劑中的用途.本發(fā)明的多肽可被加入去污劑去污劑組合物并因此成為該去污劑去污劑組合物的組分。
本發(fā)明的去污劑去污劑組合物可被配制為例如，手洗或機(jī)洗的去污劑去污劑組合物，包括適于染色織物預(yù)處理的洗滌添加劑組合物和漂洗添加的織物軟化劑組合物，或被配制為供普通家庭硬表面清潔操作之用的去污劑去污劑組合物，或被配制用于手洗或機(jī)洗操作。
在特定的方面，本發(fā)明提供包括如在此描述的本發(fā)明多肽的去垢添加劑。該去垢添加劑以及去污劑去污劑組合物可包括一種或多種酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶、和/或過氧化物酶。
通常所選擇酶的特性應(yīng)與選擇的去污劑相容(即，最適的pH、與其他酶促和非酶促成分的相容性等)，并且該酶應(yīng)以有效量存在。
纖維素酶合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌起源的酶。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽胞桿菌屬、假單胞菌屬，腐殖菌屬，鐮孢屬，草根霉屬，支頂孢屬的纖維素酶，例如，在US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中公開的由Humicola insolens、嗜熱毀絲霉和尖孢鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶。
特別合適的纖維素酶是具有護(hù)色(color care)益處的堿性或中性的纖維素酶。這種纖維素酶的實(shí)例是在EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纖維素酶。其他的實(shí)例是纖維素酶變體，例如在WO 94/07998、EP 0531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。
可商業(yè)購買的纖維素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(NovozymesA/S)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(Genencor International Inc.)、和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
蛋白酶合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物起源的蛋白酶。微生物起源是優(yōu)選的。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。該蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性的微生物蛋白酶或胰蛋白酶-樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草桿菌蛋白酶，特別是來源于芽胞桿菌的酶，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、和枯草桿菌蛋白酶168(在WO 89/06279中公開)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例是在WO89/06270和WO94/25583中描述的胰蛋白酶(例如豬或牛起源的胰蛋白酶)和鐮孢屬蛋白酶。
有用蛋白酶的實(shí)例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116、和WO 98/34946中描述的變體，特別是在下列的一個(gè)或多個(gè)位置27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、和274中具有取代的變體。
優(yōu)選可商業(yè)購買的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(Novozymes A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TM、和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌起源的脂肪酶。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的脂肪酶實(shí)例包括來自腐殖菌屬(同義于Thermomyces)的脂肪酶，例如，如在EP 258068和EP 305216中描述的，來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)，或如在WO 96/13580中描述的來自H.insolens，假單胞菌屬脂肪酶，例如，來自產(chǎn)堿假單孢菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單孢菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋蔥假單孢菌(P.cepacia)(EP 331376)、施氏假單孢菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、熒光假單孢菌(P.fluorescens)、假單胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)、芽孢桿菌脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois et al.，1993，Biochemica et Biophysica Acta，1131253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或B.pumilus(WO 91/16422)。
其他的實(shí)例是例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的脂肪酶變體。
優(yōu)選可商業(yè)購買的脂肪酶包括LipolaseTM、Lipolase UltraTM、和LipexTM(Novozymes A/S)。
淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括細(xì)菌或真菌起源的淀粉酶。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。淀粉酶包括，例如從芽胞桿菌，例如在GB 1,296,839中詳細(xì)描述的地衣芽孢桿菌的特殊菌株獲得的α-淀粉酶。
有用淀粉酶的實(shí)例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、和WO 97/43424中描述的變體，特別是在下列位置15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444中的一個(gè)或多個(gè)具有取代的變體。
可商業(yè)購買的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(來自Genencor International Inc.)。
過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌的起源。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用過氧化物酶的實(shí)例包括來自鬼傘屬，例如來自灰蓋鬼傘的過氧化物酶及其變體，例如在WO93/24618、WO 95/10602、和WO 98/15257中描述的過氧化物酶。
可商業(yè)購買的過氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes A/S)。
去污劑酶可通過添加包含一種或多種酶的單獨(dú)添加劑，或通過添加包括全部這些酶的組合添加劑而包括在去污劑去污劑組合物中。例如，可配制本發(fā)明的清潔添加劑，即單獨(dú)添加劑或組合添加劑為顆粒狀、液體、漿液等。優(yōu)選的清潔添加劑劑型是顆粒狀的，特別是無粉塵顆粒狀的，液體，特別是穩(wěn)定液體或漿液。
無粉塵的顆?？衫?，如在US 4,106,991和4,661,452中公開的進(jìn)行生產(chǎn)，并且可任選地通過本領(lǐng)域已知的方法來包被。蠟狀表面覆蓋劑(waxycoating materials)的實(shí)例是平均摩爾重量為1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；具有16到50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬烷基酚；其中醇含有12到20個(gè)碳原子且有15到80個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-和二-和三酸甘油酯。適合于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的例子在GB 1483591中提供。液體酶制品可通過例如，按照已有方法加入諸如丙二醇的多元醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸來穩(wěn)定。根據(jù)EP 238,216中公開的方法可制備保護(hù)的酶。
本發(fā)明的去污劑組合物可以是任何方便的形式，例如，棒狀，片劑，粉末，顆粒，糊劑或液體。液體去污劑可以是含水的，一般含高達(dá)70％的水和0-30％有機(jī)溶劑，或可不含水。
該去污劑組合物包括一種或多種表面活性劑，其可以是非離子的，包括半極性的和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子的。該表面活性劑一般以按重量計(jì)0.1％至60％的水平存在。
當(dāng)被包括其中時(shí)，該去污劑通常包含大約1％至大約40％的非離子表面活性劑，例如線性烷基苯磺酸鹽/酯、α-烯烴磺酸鹽/酯、烷基硫酸鹽/酯(脂肪醇硫酸鹽/酯)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽/酯、次級鏈烷磺酸鹽/酯、α-磺基(sulfp)脂肪酸甲酯、烷基或鏈烯基琥珀酸、或肥皂/脂肪酸鹽(soap)。
當(dāng)被包括其中時(shí)，該去污劑通常包含大約0.2％至大約40％的非離子表面活性劑，例如脂肪醇乙氧基化合物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸一乙醇酰胺，脂肪酸一乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡萄糖胺”)。
該去污劑可包含0-65％的洗滌增效助劑或絡(luò)合劑，例如沸石、二磷酸、三磷酸鹽/酯、膦酸鹽/酯、碳酸鹽/酯、檸檬酸鹽/酯、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙烯基三氨基戊乙酸、烷基或鏈烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽、或?qū)訝罟杷猁}(例如，來自Hoechst的SKS-6)。
該去污劑(detergent)可包括一種或多種聚合物。實(shí)例是羧甲基纖維素、聚(乙烯基吡硌烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧化物，例如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸酯共聚物。
該去污劑可包含可能包括H2O2來源的漂白系統(tǒng)，例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，其可與過酸形式的漂白活化劑相結(jié)合，例如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ醣交撬狨?。備選地，該漂白系統(tǒng)可包括例如酰胺、酰亞胺、或砜類型的過氧酸。
本發(fā)明去污劑去污劑組合物的酶可利用傳統(tǒng)的穩(wěn)定劑來穩(wěn)定，例如多元醇，例如丙二醇或丙三醇，糖或糖醇，乳酸、硼酸、或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯、或苯基硼酸衍生物，例如4-甲?；交鹚幔⑶以摻M合物可如，例如WO 92/19709和WO 92/19708中所描述的加以配制。
該去污劑還可包含其他的傳統(tǒng)去污劑成分，例如織物調(diào)理劑，包括粘土、發(fā)泡劑、抑泡劑、防腐劑、污垢懸浮劑、抗-污垢再沉積劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、水溶增溶劑、晦暗抑制劑或芳香劑。
在該去污劑去污劑組合物中，任何酶可以相當(dāng)于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白的數(shù)量被加入。
在該去污劑去污劑組合物中，本發(fā)明的多肽可以相當(dāng)于每升洗滌液0.001-100mg蛋白質(zhì)，優(yōu)選0.005-50mg蛋白質(zhì)，更優(yōu)選0.01-25mg蛋白質(zhì)，更優(yōu)選0.05-10mg蛋白質(zhì)，最優(yōu)選0.05-5mg蛋白質(zhì)，以及最優(yōu)選0.01-1mg蛋白質(zhì)的數(shù)量被加入。
本發(fā)明的多肽也可被摻入在WO 97/07202中公開的去污劑配方，其由此并入作為參考。
信號肽 本發(fā)明也涉及包括與包括或由分別編碼包括或由SEQ ID NO2的第1至24位氨基酸、SEQ ID NO4的第1至24位氨基酸、SEQ ID NO6的第1至19位氨基酸、SEQ ID NO8的第1至18位氨基酸、SEQ ID NO10的第1至24位氨基酸、SEQ ID NO12的第1至19位氨基酸、SEQ ID NO14的第1至24位氨基酸、或SEQ ID NO16的第1至25位氨基酸組成的信號肽的SEQ ID NO1的第1至72位核苷酸、SEQ ID NO3的第1至72位核苷酸、SEQ ID NO5的第1至57位核苷酸、SEQ ID NO7的第1至54位核苷酸、SEQ ID NO9的第1至72位核苷酸、SEQ ID NO11的第1至57位核苷酸、SEQ ID NO13的第1至72位核苷酸、或SEQ ID NO15的第1至75位核苷酸組成的核苷酸序列可操作連接的蛋白質(zhì)編碼基因的核酸構(gòu)建體，其中該基因相對于該核苷酸序列是外源的。
本發(fā)明也涉及包括這種核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體，和重組的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在適于生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這種重組宿主細(xì)胞；和(b)回收該蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)對于宿主細(xì)胞可能是天然的或異源的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在此不意味著是指特定長度的編碼產(chǎn)物，并且因此包括肽、寡肽、和蛋白質(zhì)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”也包括組合形成編碼產(chǎn)物的兩個(gè)或多個(gè)多肽。該蛋白質(zhì)也包括其中包括獲得自至少兩個(gè)不同蛋白質(zhì)的部分或完全多肽序列的組合的混合多肽，其中一個(gè)或多個(gè)對于宿主細(xì)胞可以是異源的或天然的。蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白的天然存在的等位和工程化變體。
優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、或報(bào)告子。在更優(yōu)選的方面，該蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、或連接酶。在更優(yōu)選的方面，蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果膠裂解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
基因可從任何原核、真核或其他的來源獲得。
本發(fā)明通過不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明范圍的下列實(shí)施例進(jìn)一步加以描述。
實(shí)施例 材料 用作緩沖液和底物的化學(xué)制品至少試劑級的商業(yè)化產(chǎn)品。
菌株 煙曲霉(Aspergillus fumigatus)PaHa34、Magnaporthe grisea FGSC 8958(Fungal Genetics Stock Center)、和構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)A1000(Fungal Genetics Stock Center，Kansas City，MO)用作脂肪酶基因的來源。
培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的組成為每升24克馬鈴薯葡萄糖(dextrose)。
YP培養(yǎng)基的組成為每升10g酵母提取物和20g Bacto蛋白胨。
SOC培養(yǎng)基的組成為每升20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，2ml 5MNaCl，和2.5ml 1M KCl。
NZY+培養(yǎng)基的組成為每升10g NZ胺，5g酵母提取物，5g NaCl，12.5mM MgCl2，12.5mM MgSO4，和10ml 2M葡萄糖。
LB培養(yǎng)基的組成為每升10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，和5g NaCl。
MY25培養(yǎng)基的組成為每升25g maltodextrin，2g MgSO4·7H2O，10gKH2PO4，2g檸檬酸，2g K2SO4，2g尿素，10g酵母提取物，和1.5ml AMG痕量金屬溶液，調(diào)節(jié)至pH6。
AMG痕量金屬溶液的組成為每升14.3g ZnSO4·7H2O，2.5g CuSO4·5H2O，0.5g NiCl2·6H2O，13.8g FeSO4·7H2O，8.5g MnSO4·H2O，和3g檸檬酸。
CM的組成為每升6g酵母提取物，6g酪蛋白酸水解物，和10g蔗糖。
COVE選擇平板的組成為每升342.3g蔗糖，20ml COVE鹽溶液，10mM乙酰胺，15mM CsCl2，和25g Noble瓊脂。
COVE鹽溶液的組成為每升26g KCl，26g MgSO4·7H2O，76g KH2PO4，和50ml COVE痕量金屬溶液。
COVE痕量金屬溶液的組成為每升0.04g NaB4O7·10H2O，0.4gCuSO4·5H2O，1.2g FeSO4·7H2O，0.7g MnSO4·H2O，0.8g Na2MoO2·2H2O，和10g ZnSO4·7H2O。
2X YT平板的組成為每升16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl，和15g Bacto瓊脂。
實(shí)施例1煙曲霉部分基因組序列中脂肪酶基因的鑒定 利用查詢來自Thermomyces lanuginosus的脂肪酶序列(登錄號O59952)進(jìn)行煙曲霉部分基因組序列(The Institute for Genomic Research，Rockville，MD)的tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，in Bioinformatics Methods andProtocols，S.Misener and S.A.Krawetz，ed.，pp.185-219)。在tfasty輸出中，根據(jù)小于0.001的E值，鑒定幾個(gè)基因?yàn)榧俣ǖ闹久?。選擇在氨基酸水平與查詢序列有大于33％同一性的大約900bp和570bp的兩個(gè)基因組區(qū)域作進(jìn)一步的研究。根據(jù)與Thermomyces lanuginosus脂肪酶的同源性以及存在于真菌內(nèi)含子的5’和3’末端的保守序列預(yù)測假定脂肪酶基因的基因模型。
實(shí)施例2煙曲霉基因組DNA的提取 煙曲霉于37℃和240rpm，生長于在帶擋板的搖瓶中的250ml馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中。過濾收獲菌絲體，在TE(10mM Tris-1mM EDTA)中洗滌2次，并在液氮下冷凍。用研缽和杵研磨冷凍的菌絲體為精細(xì)的粉末，將其重懸在含有10mM Tris，100mM EDTA，1％Triton X-100，0.5M胍-HCl，和200mM NaCl的pH8.0緩沖液中。加入無Dnase的RNase A至濃度為20mg/升，該裂解物在37℃孵育30分鐘。離心除去細(xì)胞碎片，利用QIAGEN Maxi500柱(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)分離DNA。該柱子在10ml QBT中平衡，用30ml QC洗滌，并用15ml QF洗提(所有緩沖液來自QIAGEN Inc.，Valencia，CA)。DNA用異丙醇沉淀，在70％乙醇中洗滌，并通過離心回收。該DNA重懸在TE緩沖液中。
實(shí)施例3煙曲霉脂肪酶1基因的克隆 根據(jù)開放閱讀框的預(yù)測的起始和終止密碼子設(shè)計(jì)如下所示的兩個(gè)合成寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA PCR擴(kuò)增煙曲霉脂肪酶1基因。
正向引物 5’-GAGACGCATGCTTCACAAGTATAG-3’(SEQ ID NO17) 反向引物 5’-GTCACCTCTAGTTAATTAATCAGATTATCTTGC-3’(SEQ ID NO18) 粗體字表示編碼序列。
利用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)(Roche Diagnostics，曼海姆，德國)通過PCR擴(kuò)增感興趣的片段。將1μM的上述各個(gè)引物用于含有20ng煙曲霉基因組DNA，1X PCR緩沖液(Roche Diagnostics，曼海姆，德國)，其中有1.5mM MgCl2，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(各自為10mM)，和0.75μl DNA聚合酶混合物(3.5U/μl；Roche Diagnostics，曼海姆，德國)的PCR反應(yīng)，終體積為50μl。為了擴(kuò)增該片段，Eppendorf Mastercycler熱循環(huán)儀(漢堡，德國)被設(shè)計(jì)為1個(gè)循環(huán)的94℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；60℃，30秒；和72℃，1.25分鐘；15個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；60℃，30秒；和72℃，1.25分鐘，在每個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘；以及10℃保存。
反應(yīng)產(chǎn)物利用44mM Tris堿，44mM硼酸，0.5mM EDTA(TBE)緩沖液在0.8％瓊脂糖凝膠上顯像，根據(jù)制造商的指導(dǎo)，1.3kb的產(chǎn)物條帶利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)純化。
PCR片段和pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)利用制造商指定的條件連接以產(chǎn)生pSMO224(圖1)。根據(jù)制造商的指導(dǎo)使用2μl的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 One Shot感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。將2μl體積的連接混合物加入大腸桿菌細(xì)胞并且在冰上孵育20分鐘。隨后使細(xì)胞在42℃熱休克30秒，再在冰上放置2分鐘。將250μl體積的SOC培養(yǎng)基加入細(xì)胞，并且使該混合物在37℃和250rpm孵育1小時(shí)。孵育后，將克隆涂布在補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的2X YT平板上，并在37℃培養(yǎng)過夜來選擇質(zhì)粒。用無菌牙簽挑出生長在該平板上的6個(gè)克隆，并在37℃，250rpm，在含有補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的3ml LB培養(yǎng)基的15ml Falcon試管中生長過夜。含有命名為pSMO224的質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并利用BioRobot 9600(QlAGEN Inc.，Valencia，CA)制備質(zhì)粒DNA。
含有pSMO224的大腸桿菌TOP10 One Shot細(xì)胞保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，保藏號為NRRL B-30774，保藏日期為2004年9月16日。
實(shí)施例4 編碼脂肪酶1的煙曲霉基因組序列的表征 來自pSMO224的煙曲霉脂肪酶1基因的DNA測序用AppliedBiosystems Model 377XL DNA測序儀(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)，利用染料-終止子化學(xué)(Giesecke et al.，1992，Journal ofVirology Methods 3847-60)和引物步行策略進(jìn)行。細(xì)察核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)，并且所有的序列借助于PHRED/PHRAP軟件(University of Washington，Seattle，WA)進(jìn)行相互比較。
根據(jù)tfasty輸出和與來自Thermomyces lanuginosus的同源脂肪酶基因的序列對比來構(gòu)建序列的基因模型。該核苷酸序列(SEQ ID NO1)和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO2)如圖2所示。該基因組片段編碼被1個(gè)68bp的內(nèi)含子中斷的396個(gè)氨基酸的多肽。基因的％G+C含量是52.6％，而成熟蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域是52.9％。利用SignalP軟件程序(Nielsen et al.，1997，Protein Engineering 101-6)，預(yù)測24個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)包含分子量為41.5kDa的373個(gè)氨基酸。
脂肪酶序列的比較性序列對比使用Clustal W方法(Higgins，1989，同上文)，利用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)進(jìn)行，其中使用同一性表格和下列多個(gè)序列對比參數(shù)缺口罰分(gappenalty)為10，和缺口長度罰分(gap length penalty)為10。成對序列對比參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，以及對角線＝5。序列對比顯示煙曲霉脂肪酶1基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因(登錄號O59952)的推導(dǎo)的氨基酸序列共享23％的同一性。
實(shí)施例5pAlLo1表達(dá)載體的構(gòu)建 表達(dá)載體pAlLol通過改變，包括來自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶(NA2-tpi啟動(dòng)子)基因的啟動(dòng)子雜合體，黑曲霉淀粉葡糖苷酶終止子序列(AMG終止子)，和構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)的pBANe6(美國專利6,461,837)來構(gòu)建。pBANe6的改變通過定點(diǎn)誘變從amdS選擇標(biāo)記首先除去在第2051，2722，和3397bp位置的3個(gè)Nco I限制性位點(diǎn)來進(jìn)行。全部的變化被設(shè)計(jì)為是“沉默的”，使得amdS基因產(chǎn)物的實(shí)際蛋白質(zhì)序列無變化。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，利用下列引物(加下劃線的核苷酸表示變化的堿基)，用GeneEditor定點(diǎn)誘變試劑盒(Promega，Madison，WI)同時(shí)進(jìn)行這3個(gè)位點(diǎn)的去除 AMDS3NcoMut(2050)5’-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEQID NO19) AMDS2NcoMut(2721)5’-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQ ID NO20) AMDS1NcoMut(3396)5’-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3’(SEQ ID NO21) 然后將包括全部3個(gè)預(yù)期序列變化的質(zhì)粒遞交至定點(diǎn)誘變，其中使用QuickChange誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)，以去除在第1643位的AMG終止子末端的Nco I限制性位點(diǎn)。下列引物(加下劃線的核苷酸表示變化的堿基)被用于誘變 誘變AMG終止子序列的上游引物 5’-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’(SEQ ID NO22) 誘變AMG終止子序列的下游引物 5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQ ID NO23) pBANe6改變的最后步驟是在多接頭的起始，利用QuickChange誘變試劑盒和下列引物(加下劃線的核苷酸表示變化的堿基)添加新的Nco I限制性位點(diǎn)以產(chǎn)生pAlLo1(圖3)。
誘變NA2-tpi啟動(dòng)子的上游引物 5’-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3’(SEQ ID NO24) 誘變NA2-tpi啟動(dòng)子的下游引物 5’-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3’(SEQ ID NO25) 實(shí)施例6pBM120a表達(dá)載體的構(gòu)建 構(gòu)建質(zhì)粒pBM120a以獲得含有在曲霉種屬中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的雙NA2啟動(dòng)子(NA2-NA2-tpi)，并且包含用于在大腸桿菌中進(jìn)行選擇的氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒。
設(shè)計(jì)引物以從pJaL721(WO03/008575)PCR擴(kuò)增雙NA2啟動(dòng)子。加入限制性酶位點(diǎn)Sal I和Nco I(加下劃線的)用于將該雙啟動(dòng)子克隆入曲霉表達(dá)質(zhì)粒pAlLo1。
5’-GTCGACATGGTGTTTTGATCATTTTA-3’(SEQ ID NO26) 5’-CCATGGCCAGTTGTGTATATAGAGGA-3’(SEQ ID NO27) 感興趣的片段通過PCR，利用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)來擴(kuò)增。該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含1μl每μl 0.09μg的pJaL721，1μl各種引物(50pmol/μl)，5μl 10X PCR緩沖液，其含有15mM MgCl2，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(各自為10mM)，37.25μl水，和0.75μl DNA聚合酶混合物(3.5U/μl)。為了擴(kuò)增該片段，Eppendorf Mastercycler熱循環(huán)儀設(shè)定程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的94℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；55℃，30秒；和72℃，1.25分鐘；15個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；55℃，30秒；和72℃，1.25分鐘，在每個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘；以及10℃保存。將10微升的這個(gè)PCR反應(yīng)物與1μl 10X DNA加樣染料(25％甘油，10mM TrispH7.0，10mM EDTA，0.025％溴酚藍(lán)，0.025％二甲苯腈藍(lán))混合，并利用TBE緩沖液在1.0％(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳。在Nucleotech(Nucleotech，SanMateo，CA)凝膠顯像系統(tǒng)上用UV光觀察1128bp的PCR產(chǎn)物。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，該P(yáng)CR產(chǎn)物被直接連接入pPC2.1-TOPO。將1μl體積的新鮮PCR產(chǎn)物，3μl的雙蒸水，和1μl的TOPO克隆載體用移液器混合，并在室溫下孵育5分鐘。
孵育后，將2μl的該混合物用于轉(zhuǎn)化OneShot感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。將2μl體積的連接混合物加入該大腸桿菌細(xì)胞，并在冰上孵育5分鐘。隨后，使細(xì)胞在42℃熱休克30秒，然后置于冰上2分鐘。將250μl體積的SOC培養(yǎng)基加入該細(xì)胞，并使該混合物在37℃和250rpm培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后，將克隆涂布在補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的2X YT平板上，并在37℃培養(yǎng)過夜用于選擇質(zhì)粒。用無菌牙簽挑取生長在平板上的8個(gè)克隆，并在含有補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的3ml LB培養(yǎng)基的15mlFalcon試管中，在37℃，250rpm生長過夜。該質(zhì)粒利用QIAGEN BioRobot9600分離。
將4μl體積所得到的質(zhì)粒小提物用Eco RI消化。消化反應(yīng)物通過如先前描述用于PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠色譜法和UV分析法加以分析。含有插入的分離質(zhì)粒利用1μl質(zhì)粒模板，1.6ng M13引物(正向或反向)(MWGBiotech；High Point；NC)，并加水至6μl來測序。DNA測序用AppliedBiosystems Model 377測序儀XL(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)，利用染料-終止子化學(xué)來進(jìn)行。所得到的質(zhì)粒命名為pBM121b(圖4)。
5μl體積的pBM121b用Sal I和Nco I消化。消化反應(yīng)物如上所述通過瓊脂糖凝膠電泳來分析，并連接至先前已經(jīng)用Sal I和Nco I消化的載體pAlLo1。所得到的表達(dá)質(zhì)粒命名為pBM120a(圖5)。
實(shí)施例7表達(dá)煙曲霉脂肪酶1基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)如下所示的2個(gè)合成寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA PCR擴(kuò)增煙曲霉脂肪酶1基因。
正向引物 5’-TACACAACTGGCCATGCTTCACAAGTATAG-3’(SEQ ID NO28) 反向引物 5’-GTCACCTCTAGTTAATTAATCAGATTATCTTGC-3’(SEQ ID NO29) 粗體字表示編碼序列。其余的序列與pBM120a的插入位點(diǎn)同源。
感興趣的片段通過PCR，利用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)來擴(kuò)增。將1μM的上述各個(gè)引物分別用于含有20 ng煙曲霉基因組DNA，1X PCR緩沖液(Roche Diagnostics，曼海姆，德國)，其有1.5mM MgCl2，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(各自為10mM)，和0.75μl DNA聚合酶混合物(3.5U/μl；Roche Diagnostics，曼海姆，德國)的PCR反應(yīng)物，終體積為50μl。為了擴(kuò)增該片段，Eppendorf Mastercycler熱循環(huán)儀設(shè)定程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的94℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；60℃，30秒；和72℃，1.25分鐘；15個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；60℃，30秒，和72℃，1.25分鐘，在每個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘；以及10℃保存。
該反應(yīng)產(chǎn)物利用TBE緩沖液在0.8％瓊脂糖凝膠上顯像，根據(jù)制造商的指導(dǎo)，利用QIAquick PCR純化試劑盒來純化1.3kb的產(chǎn)物條帶。
將含有煙曲霉脂肪酶1基因的1.3kb PCR片段，利用InFusion克隆試劑盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA)克隆入pBM120a，其中該載體用Nco I和Pac I消化。該消化的載體利用有TBE緩沖液的0.7％瓊脂糖凝膠，通過凝膠電泳來純化，利用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)提取該P(yáng)CR片段，并利用QIAquick PCR純化試劑盒純化。該基因片段和消化的載體通過反應(yīng)連接在一起而產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pSMO218(圖6)。連接反應(yīng)(50μl)由1X InFusion緩沖液(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，1X BSA(BDBiosciences，Palo Alto，CA)，1μl Infusion酶(1∶10稀釋)(BD Biosciences，PaloAlto，CA)，用Nco I和Pac I消化的100ng pBM120a，和50ng煙曲霉脂肪酶1基因PCR純化產(chǎn)物組成。該反應(yīng)物在室溫下孵育30分鐘。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將2μl的反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SoloPackGold超感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，La Jolla，CA)。將1μl β-巰基乙醇加入該感受態(tài)細(xì)胞，并在冰上孵育10分鐘。然后將2μl體積的連接混合物加入該大腸桿菌細(xì)胞，并在冰上孵育30分鐘。隨后，使細(xì)胞在54℃熱休克60秒，然后置于冰上2分鐘。在42℃，將150μl體積的NZY+培養(yǎng)基加入該細(xì)胞，并使該混合物在37℃和250rpm培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后，將克隆涂布到補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的2X YT平板上，并在37℃培養(yǎng)過夜來選擇質(zhì)粒。用無菌牙簽挑取生長在該平板上的6個(gè)克隆，并在含有補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的3mlLB培養(yǎng)基的15ml Falcon試管中，在37℃，250rpm生長過夜。含有pSMO218質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并且質(zhì)粒DNA利用QIAGEN BioRobot 9600來制備。
實(shí)施例8煙曲霉脂肪酶1基因在米曲霉BECh2中的表達(dá) 米曲霉BECh2(Δalp，Δamy，CPA-，KA-，Δnpl)原生質(zhì)體根據(jù)Christensen等，1988，Bio/Technology 61419-1422的方法來制備。使用5μg pSMO218來轉(zhuǎn)化米曲霉BECh2。
用pSMO218轉(zhuǎn)化米曲霉BECh2產(chǎn)生25個(gè)轉(zhuǎn)化子。該轉(zhuǎn)化子被分離至單獨(dú)的Cove平板。長滿的25個(gè)轉(zhuǎn)化子的Cove平板用4ml 0.01％Tween 20洗滌。將200μl孢子懸浮液分別接種到在125ml塑料搖瓶中的25ml MY25培養(yǎng)基中，并在34℃，250rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)3和5天后，移出培養(yǎng)物上清液用于脂肪酶測定和SDS-PAGE分析。
如下測定脂肪酶活性將200μl底物(20ml 100mM MOPS pH7.5，4.95ml DMSO，和50μl p-硝基苯基丁酸酯)加入20μl稀釋的酶樣品。因此樣品用100mM MOPS pH7.5，4mM CaCl2，和0.01％Triton X-100稀釋。在96-孔微滴定平板中，于室溫(25℃)孵育15分鐘后，利用SpectraMAX 250微平板閱讀儀(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)，獲得405nm處的吸光率。LIPOLASETM(Thermomyces lanuginosus脂肪酶；Novozymes A/S，Bagsvaerd，丹麥))可用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線以測定脂肪酶單位(LUs)。
脂肪酶測定結(jié)果表明在第3天，若干轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生超過未轉(zhuǎn)化對照的脂肪酶活性。10μl上清液的SDS-PAGE分析(BioRad Criterion 10-20％SDS-PAGE)顯示大約41kDa的條帶。
實(shí)施例9重組的煙曲霉脂肪酶1的底物特異性的確定 煙曲霉脂肪酶1的底物特異性利用由4-硝基酚(PNP)脂肪酶底物組成的平板篩選來測定。
如表1所描述的，制備由利用不同4-硝基酚(PNP)脂肪酶底物的一組12個(gè)測定組成的平板篩選。
表1.PNP底物和緩沖液條件的平板篩選 這些測定在384-孔平板中，利用8個(gè)不同稀釋度的各個(gè)待評估樣品(7μl)和80μl底物來進(jìn)行。該測定物在環(huán)境溫度下孵育達(dá)到24小時(shí)。在大約1，2，3，5，和24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，在405nm處讀取測定物。對于各個(gè)單獨(dú)的測定，結(jié)果計(jì)算為OD/小時(shí)。為了得到釋放的PNP量的準(zhǔn)確評估，必須利用轉(zhuǎn)換因子使原始的OD值進(jìn)行數(shù)學(xué)地歸一化。該轉(zhuǎn)換因子是實(shí)驗(yàn)確定的值，其對于補(bǔ)償PNP在低pH和存在去污劑時(shí)(Triton X100)比在pH9.5具有更低的OD讀取值這一事實(shí)是必要的。該因子使數(shù)據(jù)歸一化至已經(jīng)獲得的OD讀取值，這使得淬滅反應(yīng)以對于各種條件產(chǎn)生最大的OD同時(shí)還在那個(gè)時(shí)間點(diǎn)停止反應(yīng)成為可能；即PNP-脂肪酸底物在高pH不穩(wěn)定，該標(biāo)記物脫離但在高pH脂肪酶不存在，并且該標(biāo)記的底物在pH9以上以及對于較短鏈長度的脂肪酸底物是特別不穩(wěn)定的。
表1中，頂部的2行(1和2)是用于pH比率(9.5/7.0)的測定。第3和10行用于“長鏈(Slu)/短鏈(Lu)；比較。
平板篩選的結(jié)果顯示在表2中。
表2 無數(shù)據(jù)＝在這個(gè)測試的一個(gè)測定中，無足夠的活性來產(chǎn)生足夠的信號ALF004(表達(dá)煙曲霉脂肪酶1的米曲霉BeCH2)測試數(shù)據(jù)由最多2個(gè)獨(dú)立篩選測定事件的平均值組成；LIPOLASETM測試數(shù)據(jù)由最多17個(gè)獨(dú)立篩選測定事件的平均值組成。
與Thermomyces lanuginosus脂肪酶(LIPOLASETM)和ALF004的平板篩選結(jié)果相比較，得到下列觀察結(jié)果 1.在pH9.5相對于pH 7的PNP-棕櫚酸酯的活性比對于ALF004相對于LIPOLASETM要低40-倍(40-fold lower)，表明煙曲霉脂肪酶1在pH9.5相對于LipolaseTM具有非常低的活性，或在pH7.0，它比LIPOLASETM具有高得多的活性，或兩者相組合。
2.ALF004相對于LIPOLASETM，P/V，D/V，和D/B的比率也是相當(dāng)不同的，表明在這兩種脂肪酶之間存在一些?；兓L度特異性的差異。
實(shí)施例10煙曲霉脂肪酶2基因的克隆 根據(jù)開放閱讀框的預(yù)測的起始和終止密碼子，設(shè)計(jì)如下所示的2個(gè)合成寡核苷酸引物來從實(shí)施例2中制備的基因組DNA PCR擴(kuò)增煙曲霉脂肪酶2基因。
正向引物 5’-GAGACACATGTTTCACCCAG-3’(SEQ ID NO30) 反向引物5’-GTCACCTCTAGTTAATTAATCAGTTAGTTGAGC-3’(SEQ ID NO31) 粗體字表示編碼序列。
如實(shí)施例3中所描述的，利用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)，通過PCR擴(kuò)增該片段。該反應(yīng)產(chǎn)物利用TBE緩沖液在0.7％瓊脂糖凝膠上顯像，根據(jù)制造商的指導(dǎo)，利用QIAquick PCR純化試劑盒純化1.2kb的產(chǎn)物條帶。然后根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將PCR產(chǎn)物克隆入pCR2.1-TOPO以產(chǎn)生pSMO223(圖7)。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將2μl的反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 OneShot感受態(tài)細(xì)胞。將2μl體積的連接混合物加入大腸桿菌細(xì)胞并在冰上培養(yǎng)20分鐘。隨后，使該細(xì)胞在42℃熱休克30秒，然后置于冰上2分鐘。將250μl體積的SOC培養(yǎng)基加入該細(xì)胞，并且該混合物在37℃和250rpm培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后，將該克隆涂布在補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的2X YT平板上，并在37℃培養(yǎng)過夜來選擇質(zhì)粒。用無菌牙簽挑取生長在平板上的6個(gè)克隆，并在含有補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的3ml LB培養(yǎng)基的15ml Falcon試管中，在37℃，250rpm生長過夜。含有pSMO223的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并利用QIAGEN BioRobot 9600來制備質(zhì)粒DNA。
含有pSMO223的大腸桿菌TOP10 One Shot細(xì)胞保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，保藏號為NRRL B-30773，保藏日期為2004年9月16日。
實(shí)施例11編碼脂肪酶2的煙曲霉基因組序列的的表征 來自pSMO223的煙曲霉脂肪酶2基因的DNA測序用AppliedBiosystems Model 377 XL DNA測序儀，利用染料-終止子化學(xué)(Giesecke et al.，1992，supra)和引物步行策略來進(jìn)行。細(xì)察核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)，并借助于PHRED/PHRAP軟件(University of Washington，Seattle，WA)將序列進(jìn)行相互比較。
根據(jù)tfasty輸出和與來自Thermomyces lanuginosus的同源脂肪酶基因的排列對比來構(gòu)建該序列的基因模型。該核苷酸序列(SEQ ID NO3)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)如圖8所示。該基因組片段編碼被45和50bp的2個(gè)內(nèi)含子中斷的283個(gè)氨基酸的多肽。該基因的％G+C含量是47.1％，成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的是47.2％。利用SignalP軟件程序(Nielsen et al.，1997，supra)，預(yù)測出24個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)包含分子量為28.9kDa的259個(gè)氨基酸。
脂肪酶序列的比較性序列對比利用使用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Clustal W方法(Higgins，1989，supra)，其中使用同一性表格和下列多個(gè)比對參數(shù)缺口罰分為10和缺口長度罰分為10。成對排列(pairwise alignment)參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，和對角線＝5。該序列對比顯示煙曲霉脂肪酶2基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因(登錄號O59952)的推導(dǎo)的氨基酸序列共享35％的同一性。
實(shí)施例12Magnaporthe grisea的部分基因組序列中脂肪酶基因的鑒定 Magnaporthe grisea的部分基因組序列(Broad Institue MIT，Boston，MA)的tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，supra)利用從Thermomyces lanuginosus(登錄號O59952)查詢脂肪酶序列來進(jìn)行。幾個(gè)基因根據(jù)在tfasty輸出中小于0.001的E值被鑒定為假定的脂肪酶。選擇在氨基酸水平與查詢序列具有大于30％同一性的大約930bp、750bp、和720bp的3個(gè)基因組區(qū)域來用于進(jìn)一步的研究。根據(jù)與Thermomyces lanuginosus脂肪酶的同源性以及存在于真菌內(nèi)含子5’和3’末端的保守序列來預(yù)測該假定的脂肪酶基因的基因模型。
實(shí)施例13Magnaporthe grisea基因組DNA的提取 400μl Magnaporthe grisea(FGSC 8958，F(xiàn)ungal Genetics Stock Center)孢子在帶有擋板的搖瓶中的50ml CM培養(yǎng)基中，于25℃和250rpm生長4天。然后根據(jù)制造商的指導(dǎo)，利用DNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)從菌絲體提取基因組DNA。
實(shí)施例14Magnaporthe grisea脂肪酶1基因的克隆 根據(jù)開放閱讀框的預(yù)測的起始和終止密碼子外側(cè)的基因組序列設(shè)計(jì)如下所示的兩個(gè)合成寡核苷酸引物以從實(shí)施例13中制備的基因組DNA PCR擴(kuò)增Magnaporthe grisea脂肪酶1基因。
正向引物 5′-CCTTGCCCACGCCTTTGGTTC-3’(SEQ ID NO32) 反向引物 5′-CTCATAGCAGCAGGCGAAGCC-3’(SEQ ID NO33) 兩個(gè)引物表示編碼序列外側(cè)的序列。
50皮摩爾的上述各種引物被用于包含300ng Magnaporthe grisea基因組DNA，1X Herculase反應(yīng)緩沖液(Stratagene，La Jolla，CA)，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(各自為10mM)，和2.5單位的Herculase HotstartDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)的PCR反應(yīng)，終體積為50μl。擴(kuò)增在EppendorfMastercycler熱循環(huán)儀中進(jìn)行，程序設(shè)為1個(gè)循環(huán)的98℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的98℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，1分20秒；15個(gè)循環(huán)的98℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，1分20秒，在各個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；以及1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘。然后加熱塊(block)達(dá)到10℃保溫(soak)循環(huán)。
反應(yīng)產(chǎn)物利用40mM Tris堿-20mM乙酸鈉-1mM EDTA二鈉(TAE)緩沖液在1.0％瓊脂糖凝膠上泳動(dòng)，其中檢測到1.2kb的產(chǎn)物條帶。PCR產(chǎn)物根據(jù)制造商的指導(dǎo)利用QIAquick PCR純化試劑盒純化。
設(shè)計(jì)如下顯示的兩個(gè)合成寡核苷酸引物從上述PCR產(chǎn)物擴(kuò)增編碼脂肪酶1基因的Magnaporthe grisea基因。
正向引物 5’-ACACAACTGGCCATGAAGGTCTCGTTCGTGTCATCG-3′(SEQID NO34) 反向引物 5’-AGTCACCTCTAGTTATCAGTAGCAAGCGCTAATGG-3′(SEQ IDNO35) 粗體字表示編碼序列。其余的序列與pBM120a的插入位點(diǎn)同源。
50皮摩爾的上述每一引物被用于包含2μl上述的1.2kb PCR產(chǎn)物，1XHerculase反應(yīng)緩沖液，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(各自為10mM)，2.5單位的Herculase Hotstart DNA聚合酶的PCR反應(yīng)，終體積為50μl。擴(kuò)增在Eppendorf Mastercycler熱循環(huán)儀中進(jìn)行，程序設(shè)為1個(gè)循環(huán)的98℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的98℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，1分20秒；15個(gè)循環(huán)的98℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，1分20秒，在各個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；以及1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘。然后加熱塊達(dá)到10℃保溫循環(huán)。
反應(yīng)產(chǎn)物利用TAE緩沖液在1.0％瓊脂糖凝膠上泳動(dòng)，其中檢測到1.1kb的產(chǎn)物條帶。該1.1kb的PCR產(chǎn)物根據(jù)制造商的指導(dǎo)利用QIAquick PCR純化試劑盒純化。
將該1.1kb的片段克隆入pCR2.1-TOPO載體。該基因片段根據(jù)制造商的指導(dǎo)利用QIAquick PCR純化試劑盒純化。該片段和pCR2.1-TOPO載體利用制造商指定的條件進(jìn)行連接而產(chǎn)生質(zhì)粒pHyGe026(圖9)。2μl的反應(yīng)物被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌One Shot感受態(tài)細(xì)胞。含有質(zhì)粒pHyGe026的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并且質(zhì)粒DNA利用BioRobot 9600來制備。
含有pHyGe026的大腸桿菌TOP10 One Shot細(xì)胞保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，保藏號為NRRL B-30772，保藏日期為2004年9月13日。
實(shí)施例15編碼脂肪酶1基因的Magnaporthe grisea基因組序列的表征 來自pHyGe026的Magnoporthe grisea脂肪酶1基因的DNA測序利用染料-終止子化學(xué)(Giesecke et al.，1992，同上文)和引物步行策略用AppliedBiosystems Model 377XL DNA測序儀進(jìn)行。核對核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)，并且將所有的序列借助PHRED/PHRAP軟件(University of Washington，Seattle，WA)相互進(jìn)行比較。
脂肪酶基因的基因模型根據(jù)與Thermomyces lanuginosa脂肪酶(登錄號O59952)的同源性以及存在于真菌內(nèi)含子5’和3’末端的保守序列加以預(yù)測。該核苷酸序列(SEQ ID NO5)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO6)顯示在圖10A和10B中。該基因組片段編碼被54和77bp的2個(gè)內(nèi)含子中斷的318個(gè)氨基酸的多肽。該基因的％G+C含量是60.9％，成熟多肽編碼序列的(SEQ ID NO6的第58至1088位核苷酸)是60.5％。利用SignalP軟件程序(Nielsen et al.，1997，同上文)，預(yù)測出19個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)包含分子量為34kDa的299個(gè)氨基酸。
脂肪酶序列的比較性序列對比利用使用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Clustal W方法(Higgins，1989，同上文)來確定，其中使用同一性表格和下列多個(gè)比對參數(shù)缺口罰分為10，和缺口長度罰分為10。成對排列參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，和對角線＝5。該序列對比顯示該Magnaporthe脂肪酶1基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因(登錄號O59952)的推導(dǎo)的氨基酸序列共享31.3％的同一性。
實(shí)施例16用于表達(dá)Magnaporthe grisea脂肪酶1基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建 將含有Magnaporthe grisea脂肪酶1基因的PCR片段利用InFusion克隆試劑盒克隆入pBM120a。該載體用Nco I和Pac I消化。該消化的載體是通過凝膠電泳純化，并利用QIAquick凝膠提取試劑盒提取。該基因片段和消化的載體在反應(yīng)中連接在一起，而產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pHyGe010(圖11)，其中該脂肪酶基因的轉(zhuǎn)錄在串聯(lián)的NA2-tpi啟動(dòng)子的控制之下。該連接反應(yīng)物(20μl)的組成為1X InFusion緩沖液，1X BSA，1μl Infusion酶(1∶10稀釋)，用NcoI和Pac I消化的50ng pBM120a，和30ng純化的Magnaporthe grisea脂肪酶PCR產(chǎn)物。該反應(yīng)在室溫下孵育30分鐘。2μl的反應(yīng)物根據(jù)制造商的指導(dǎo)被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SoloPackGold超感受態(tài)細(xì)胞。含有pHyGe010的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并且質(zhì)粒DNA利用QIAGENBioRobot 9600來制備。
實(shí)施例17Magnaporthe grisea脂肪酶1基因在米曲霉中的表達(dá) 米曲霉BECh2原生質(zhì)體根據(jù)Christensen等，1988，supra的方法來制備。60μg的pHyGe010被用于轉(zhuǎn)化米曲霉BECh2。
用pHyGe010轉(zhuǎn)化米曲霉BECh2產(chǎn)生14個(gè)轉(zhuǎn)化子。每個(gè)轉(zhuǎn)化子都被轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的Cove平板。長滿的(confluent)14個(gè)轉(zhuǎn)化子的Cove平板用4ml0.01％Tween20洗滌。200μl的孢子懸浮液分別被接種到在125ml塑料搖瓶中的25ml MY25培養(yǎng)基中，并在34℃，250rpm培養(yǎng)。培育3、4、和5天后，移出培養(yǎng)物上清液用于脂肪酶測定和SDS-PAGE分析。
脂肪酶活性如實(shí)施例8中所描述的來測定。
脂肪酶測定結(jié)果表明在第3，4，和5天，幾個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生超過未轉(zhuǎn)化對照的脂肪酶活性。
25μl上清液的SDS-PAGE(BioRad Criterion 8-16％SDS-PAGE)分析顯示大約37kDa的主條帶。
實(shí)施例18重組的Magnaporthe grisea脂肪酶1的底物特異性的確定 Magnaporthe grisea脂肪酶1的底物特異性如實(shí)施例9中所描述的利用由4-硝基酚(PNP)脂肪酶底物組成的平板篩選來確定。
平板篩選的結(jié)果顯示在表3中。
表3 無數(shù)據(jù)＝?jīng)]有足夠的活性在這個(gè)測試的一個(gè)測定中產(chǎn)生足夠的信號 Hyge027(表達(dá)Magnaporthe grisea脂肪酶1的米曲霉BECh2)測試數(shù)據(jù)由最多4個(gè)獨(dú)立篩選測定事件的平均值組成；LIPOLASETM(Thermomyceslanuginosus脂肪酶)測試數(shù)據(jù)由最多17個(gè)獨(dú)立篩選測定事件的平均值組成。
比較Thermomyces lanuginosus脂肪酶(LIPOLASETM)和Hyge027的平板篩選結(jié)果，產(chǎn)生下列觀察結(jié)果 (1)對于Hyge027對照LIPOLASETM，在存在或缺少triton時(shí)，在pH7.5(V7.5-/+和P7.5+/-)存在對戊酸酯或棕櫚酸酯的活性比率的顯著差異。
(2)對癸酸酯對照戊酸酯(D/V)、棕櫚酸酯對照丁酸酯(P/B)、和癸酸酯對照丁酸酯(D/B)的活性比率對于Hyge027對照LIPOLASETM是顯著不同的，表明在兩種脂肪酶之間存在一些?；兓L度的特異性差異。
實(shí)施例19Magnaporthe grisea脂肪酶2基因的克隆 根據(jù)開放閱讀框的預(yù)測的起始和終止密碼子設(shè)計(jì)如下所示的兩個(gè)合成寡核苷酸引物以從實(shí)施例13中制備的基因組DNA PCR擴(kuò)增Magnaporthegrisea脂肪酶2基因。
正向引物5’-CCATGGCCATGATGAGGTTCCCCAGCGTGCTCA-3’(SEQ ID NO36) 反向引物5’-TTTAATTAAGCCACGGTCTTGTTGGCTTC-3’(SEQID NO37) 粗體字表示編碼序列。其余的序列與pBM120a的酶限制性插入位點(diǎn)同源。
該基因利用HerculaseTMHotstart DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)通過PCR來擴(kuò)增。50ng的上述各種引物被用于含有300 ng Magnaporthe grisea基因組DNA的PCR反應(yīng)。該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)混合物也包含1X Herculase PCR緩沖液，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(各自為10mM)，和2.5單位的HerculaseTM DNA聚合酶混合物，終體積為50μl。為了擴(kuò)增該片段，Peltien熱循環(huán)儀(MJ Research Inc.，Watertown，MA)程序設(shè)為1個(gè)循環(huán)的94℃，2分鐘；30個(gè)循環(huán)的94℃，1分鐘；50℃，1分鐘；72℃ 1分鐘；1個(gè)循環(huán)的72℃，10分鐘；以及4℃保存。
該P(yáng)CR產(chǎn)物利用TAE緩沖液在1％瓊脂糖凝膠上按大小分離，1kb的產(chǎn)物條帶根據(jù)制造商的指導(dǎo)利用QIAquick凝膠純化試劑盒純化。然后該P(yáng)CR產(chǎn)物根據(jù)制造商的指導(dǎo)被克隆入pCR2.1-TOPO而產(chǎn)生質(zhì)粒pCrAm138(圖12)。2μl的連接反應(yīng)物被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 One Shot感受態(tài)細(xì)胞。含有質(zhì)粒pCrAm138的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并且質(zhì)粒DNA利用QIAGEN BioRobot 9600來制備。
含有pCrAm138的大腸桿菌TOP10 One Shot細(xì)胞保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，保藏號為NRRL B-30781，保藏日期為2004年10月12日。
實(shí)施例20編碼脂肪酶2的Magnaportha grisea基因組序列的表征 包含在pCrAm138中的Margnoportha grisea脂肪酶2基因的DNA測序利用染料-終止子化學(xué)(Giesecke et al.，1992，supra)和引物步行策略，用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XL自動(dòng)化DNA測序儀進(jìn)行。核對核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)，并且將所有的序列借助PHRED/PHRAP軟件(University of Washington，Seattle，WA)彼此進(jìn)行比較。
脂肪酶基因的基因模型根據(jù)與Thermomyces lanuginosus脂肪酶(登錄號O59952)的同源性以及存在于真菌內(nèi)含子5’和3’末端的保守序列來預(yù)測。該核苷酸序列(SEQ ID NO7)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO8)如圖13所示。該基因組片段編碼分子量為37.7kDa的348個(gè)氨基酸的多肽。該基因的％G+C含量是64％，成熟多肽編碼序列(SEQ ID NO7的第55至1044位核苷酸)的是64％。利用SignalP軟件程序(Nielsen et al.，1997，supra)，預(yù)測出18個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)包含分子量為35.9kDa的330個(gè)氨基酸。
脂肪酶序列的比較性序列對比利用使用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Clustal W方法(Higgins，1989，supra)來確定，其中使用同一性表格和下列多個(gè)比對參數(shù)缺口罰分為10和缺口長度罰分為10。成對排列參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，和對角線＝5。該序列對比顯示Magnaporthe脂肪酶2基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因(登錄號O59952)的推導(dǎo)的氨基酸序列共享37.8％的同一性。
實(shí)施例21Magnaporthe grisea脂肪酶3基因的克隆 根據(jù)開放閱讀框的預(yù)測的起始和終止密碼子設(shè)計(jì)如下所示的兩個(gè)合成寡核苷酸引物以從實(shí)施例13中描述的基因組DNA PCR擴(kuò)增Magnaporthegrisea脂肪酶3基因。
正向引物 5’-ACACAACTGGCCATGTTGTGGCGTCGGGCGGGTGGCCTCT-3’(SEQ ID NO38) 反向引物 5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATTAGAGCTCATCCTGGCCAGGAGCCAC-3’(SEQ ID NO39) 粗體字表示編碼序列。其余的序列與pBM120a的插入位點(diǎn)同源。
該感興趣的片段利用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)通過PCR來擴(kuò)增。50皮摩爾的上述每一引物被用于包含300ng Magnaporthe grisea基因組DNA的PCR反應(yīng)。該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)混合物也包含1X PCR緩沖液，其具有1.5mM MgCl2，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(分別為10mM)，和0.75μl的DNA聚合酶混合物(3.5U/μl)，終體積為50μl。EppendorfMastercycler熱循環(huán)儀被用于擴(kuò)增該片段，程序設(shè)為1個(gè)循環(huán)的94℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，2分鐘；15個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，2分鐘；在各個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘；以及10℃保存(hold)。
該1.2kb的反應(yīng)產(chǎn)物利用TBE緩沖液在1.0％瓊脂糖凝膠上顯像。然后根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將4微升的該產(chǎn)物克隆入pCR2.1-TOPO以產(chǎn)生pBM135a。2μl的反應(yīng)物被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 One Shot感受態(tài)細(xì)胞。含有pBM135a的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并且質(zhì)粒DNA利用QIAGEN BioRobot 9600來制備。
來自pBM135a的Magnaporthe grisea脂肪酶3基因的DNA測序使用染料-終止子化學(xué)(Giesecke et al.，1992，supra)和引物步行策略，用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XL自動(dòng)化DNA測序儀來進(jìn)行。核對核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)，并且將所有的序列借助ContigExpress軟件(Informax，Inc.，Bethesda，MD)彼此進(jìn)行比較。測序結(jié)果表明pBM135a中缺少ATG起始密碼子。定購與上述oligo編號998205相同序列的第二個(gè)正向引物。利用pBM135a作為DNA模板，該新的oligo編號998524被用于PCR反應(yīng)來再擴(kuò)增感興趣的基因。
利用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)，50皮摩爾998524和998232被用于含有1μl 1∶10稀釋的pBM1 35a mini DNA的PCR反應(yīng)。該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)混合物也包含1X PCR緩沖液，其具有1.5mM MgCl2，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(分別為10mM)，和0.75μl DNA聚合酶混合物(3.5U/μl)，終體積為50μl。Eppendorf Mastercycler熱循環(huán)儀被用于擴(kuò)增該片段，程序設(shè)為1個(gè)循環(huán)的94℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，1分15秒；15個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，1分15秒，在各個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘；以及10℃保存。
該1.2kb的反應(yīng)產(chǎn)物利用TBE緩沖液在1.0％瓊脂糖凝膠上顯像。從凝膠切下該1.2kb的片段，并利用Qiagen凝膠提取試劑盒純化。然后根據(jù)制造商的指導(dǎo)，2微升的該產(chǎn)物被克隆入pCR2.1-TOPO以產(chǎn)生pBM135g(圖14)。2μl的反應(yīng)物被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 One Shot感受態(tài)細(xì)胞。含有pBM135g的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并且質(zhì)粒DNA利用QIAGEN BioRobot 9600來制備。
含有pBM135g的大腸桿菌TOP10 One Shot細(xì)胞保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，保藏號為NRRLB-30779，保藏日期為2004年10月12日。
實(shí)施例22 編碼脂肪酶3的Magnaporthe grisea基因組序列的表征 來自質(zhì)粒pBM135g的Magnaporthe grisea脂肪酶3基因的DNA測序利用染料-終止子化學(xué)(Giesecke et al.，1992，supra)和引物步行策略，用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XL自動(dòng)化DNA測序儀來進(jìn)行。核對核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)，并且將所有的序列借助ContigExpress軟件進(jìn)行分析。
該脂肪酶基因的基因模型根據(jù)與Thermomyces lanuginosus脂肪酶(登錄號O59952)的同源性以及存在于真菌內(nèi)含子5’和3’末端的保守序列來預(yù)測。pBM135g的基因組編碼序列(SEQ ID NO9)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQID NO10)如圖15所示。該基因組片段編碼393個(gè)氨基酸的多肽。該基因的％G+C含量是58.71％，該成熟多肽編碼序列(SEQ ID NO9的第73至1179位核苷酸)的是58.4％。利用SignalP軟件程序(Nielsen et al.，1997，supra)，預(yù)測出24個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)包含分子量為40.8 kDa的369個(gè)氨基酸。
脂肪酶序列的比較性序列對比利用使用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Clustal W方法(Higgins，1989，supra)來確定，其使用同一性表格和下列多個(gè)比對參數(shù)缺口罰分為10和缺口長度罰分為10。成對排列參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，和對角線＝5。該序列對比顯示該Magnaporthe grisea脂肪酶3基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因(登錄號O59952)的推導(dǎo)的氨基酸序列共享20.5％的同一性。
實(shí)施例23構(gòu)巢曲霉的基因組序列中脂肪酶基因的鑒定 構(gòu)巢曲霉的部分基因組序列(The Institute for Genomic Research，Rockville，MD)的tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，supra)利用從Thermomyceslanuginosus(登錄號O59952)查詢脂肪酶蛋白質(zhì)序列來進(jìn)行。幾個(gè)基因根據(jù)tfasty輸出中小于0.001的E值被鑒定為假定的同系物。鑒定出在氨基酸水平與查詢序列有45.8、34、和33％同一性的大約780bp、600bp、和960bp的3個(gè)基因組區(qū)域。該假定脂肪酶基因的基因模型根據(jù)與Thermomyceslanuginosus脂肪酶的同源性以及存在于真菌內(nèi)含子5’和3’末端的保守序列來預(yù)測。
實(shí)施例24構(gòu)巢曲霉基因組DNA的提取 400μl構(gòu)巢曲霉A1000(Fungal Genetics Stock Center，Kansas City，MO)孢子在帶有擋板的搖瓶中的50ml YP培養(yǎng)基中，于37℃和250rpm生長24小時(shí)。然后根據(jù)制造商的指導(dǎo)，利用DNeasy Plant Mini試劑盒從菌絲體提取基因組DNA。
實(shí)施例25構(gòu)巢曲霉脂肪酶1基因的克隆 根據(jù)開放閱讀框的預(yù)測的起始和終止密碼子設(shè)計(jì)如下所示的2個(gè)合成寡核苷酸引物以從實(shí)施例24中制備的基因組DNA PCR擴(kuò)增編碼脂肪酶的構(gòu)巢曲霉基因。
正向引物 5’-ACACAACTGGCCATGATCCGTTTGGGGTATTCTGCC-3’(SEQID NO40) 反向引物 5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATTACTGGCAGGCAGTGATAT-3’(SEQ ID NO41) 粗體字表示編碼序列。其余的序列與pBM120a的插入位點(diǎn)同源(參見實(shí)施例6)。
感興趣的片段利用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)通過PCR來擴(kuò)增。將1μM的上述各個(gè)引物用于含有20ng構(gòu)巢曲霉基因組DNA，1X PCR緩沖液，其具有1.5mM MgCl2，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(分別為10mM)，和0.75μl DNA聚合酶混合物(3.5U/μl)的PCR反應(yīng)，終體積為50μl。為了擴(kuò)增該片段，EppendorfMastercycler熱循環(huán)儀設(shè)置程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的94℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；59.5℃，30秒；和72℃，1.25分鐘；15個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；59.5℃，30秒；和72℃，1.25分鐘，在各個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘；以及10℃保存。
該反應(yīng)產(chǎn)物利用TBE緩沖液在0.7％瓊脂糖凝膠上顯像，根據(jù)制造商的指導(dǎo)，利用QIAquick PCR純化試劑盒純化1.1 kb的產(chǎn)物條帶。利用制造商指定的條件，連接該P(yáng)CR片段和pCR2.1-TOPO來產(chǎn)生質(zhì)粒pJLin171(圖16)。
根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將2μl的反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 OneShot感受態(tài)細(xì)胞。將2μl體積的連接混合物加入大腸桿菌細(xì)胞并在冰上培養(yǎng)20分鐘。隨后，使該細(xì)胞在42℃熱休克30秒，然后置于冰上2分鐘。將250μl體積的SOC培養(yǎng)基加入該細(xì)胞，并且該混合物在37℃和250rpm培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后，將該克隆涂布在補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的2X YT平板上，并在37℃培養(yǎng)過夜來選擇質(zhì)粒。用無菌牙簽挑取生長在平板上的12個(gè)克隆，并在含有補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的3ml LB培養(yǎng)基的15ml Falcon試管中，在37℃，250rpm生長過夜。含有pJLin171的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并利用QIAGEN BioRobot 9600來制備質(zhì)粒DNA。
含有pJLin171的大腸桿菌TOP10 One Shot細(xì)胞保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，保藏號為NRRLB-30755，保藏日期為2004年7月21日。
實(shí)施例26編碼脂肪酶1的構(gòu)巢曲霉基因組序列的表征 來自質(zhì)粒pJLin171的構(gòu)巢曲霉脂肪酶1基因的DNA測序利用染料-終止子化學(xué)(Giesecke et al.，1992，supra)和引物步行策略，用AppliedBiosystems Model 377XL DNA測序儀來進(jìn)行。核對核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)，并且所有的序列借助PHRED/PHRAP軟件(University of Washington，Seattle，WA)來進(jìn)行分析。
該脂肪酶基因的基因模型根據(jù)與Thermomyces lanuginosus脂肪酶的同源性以及存在于真菌內(nèi)含子5’和3’末端的保守序列來預(yù)測。核苷酸序列(SEQ ID NO11)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO12)如圖17所示。該基因組片段編碼被47bp、59bp、和50bp的3個(gè)內(nèi)含子中斷的294個(gè)氨基酸的多肽。該基因的％G+C含量是54.5％，該成熟蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域(SEQ IDNO11的第58至1038位核苷酸)的是54.5％。利用SignalP軟件程序(Nielsenet al.，1997，supra)，預(yù)測出19個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)包含分子量為29.4kDa的275個(gè)氨基酸。
脂肪酶序列的比較性序列對比利用使用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Clustal W方法(Higgins，1989，supra)來確定，其使用同一性表格和下列多個(gè)比對參數(shù)缺口罰分為10和缺口長度罰分為10。成對排列參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，和對角線＝5。該序列對比顯示該構(gòu)巢曲霉脂肪酶1基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因(登錄號O59952)的推導(dǎo)的氨基酸序列共享48％的同一性。
實(shí)施例27表達(dá)構(gòu)巢曲霉脂肪酶1基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建 含有構(gòu)巢曲霉脂肪酶1基因的1.1kb PCR片段(實(shí)施例25)利用InFusion克隆試劑盒被克隆入pBM120a，其中該載體用Nco I和Pac I消化。該消化的載體通過凝膠電泳，利用有TBE緩沖液的0.7％瓊脂糖凝膠來純化，該P(yáng)CR片段利用QIAquick凝膠提取試劑盒提取，并利用QIAquick PCR純化試劑盒來純化。該基因片段和消化的載體在反應(yīng)中連接在一起而產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pJLin167(圖18)。該連接反應(yīng)物(50μl)的組成為1X InFusion緩沖液，1XBSA，1μl Infusion酶(1∶10稀釋)，100ng用Nco I和Pac I消化的pBM120a，和50ng純化的構(gòu)巢曲霉脂肪酶1基因PCR產(chǎn)物。該反應(yīng)在室溫下孵育30分鐘。2μl的該反應(yīng)物根據(jù)制造商的指導(dǎo)被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SoloPackGold超感受態(tài)細(xì)胞。將1μl的β-巰基乙醇加入感受態(tài)細(xì)胞，并在冰上孵育10分鐘。然后將2μl體積的該連接混合物加入大腸桿菌細(xì)胞并在冰上孵育30分鐘。隨后，該細(xì)胞在54℃熱休克60秒，并置于冰上2分鐘。將在42℃的150μl體積的NZY+培養(yǎng)基加入該細(xì)胞，并且該混合物在37℃和250rpm培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后，將該克隆涂布在補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的2X YT平板上，并在37℃培養(yǎng)過夜來選擇質(zhì)粒。用無菌牙簽挑取生長在平板上的12個(gè)克隆，并在含有補(bǔ)充有每ml 100μg氨芐青霉素的3ml LB培養(yǎng)基的15ml Falcon試管中，在37℃，250rpm生長過夜。含有pJLin167的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并利用QIAGEN BioRobot 9600來制備質(zhì)粒DNA。
實(shí)施例28構(gòu)巢曲霉脂肪酶1基因在米曲霉BECh2中的表達(dá) 米曲霉BECh2(Δalp，Δamy，CPA-，KA-，Δnp1)原生質(zhì)體根據(jù)Christensen等，1988，Bio/Technology 61419-1422的方法來制備。使用5μg pJLin167來轉(zhuǎn)化米曲霉BECh2。
用pJLin1 67轉(zhuǎn)化米曲霉BECh2產(chǎn)生34個(gè)轉(zhuǎn)化子。該轉(zhuǎn)化子被分離至單獨(dú)的Cove平板。長滿的28個(gè)轉(zhuǎn)化子的Cove平板用4ml 0.01％Tween 20洗滌。將200μl孢子懸浮液分別接種到在125ml塑料搖瓶中的25ml MY25培養(yǎng)基中，并在34℃，250rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)3和5天后，移出培養(yǎng)物上清液用于脂肪酶測定和SDS-PAGE分析。
脂肪酶活性如實(shí)施例8中所描述的來測定。脂肪酶測定結(jié)果表明在第3和5天，28個(gè)轉(zhuǎn)化子中有27個(gè)產(chǎn)生遠(yuǎn)超過未轉(zhuǎn)化對照的脂肪酶活性。
10μl上清液的SDS-PAGE(BioRad Criterion 10-20％SDS-PAGE)分析顯示大約30kDa的主條帶。
實(shí)施例29重組的構(gòu)巢曲霉脂肪酶1的純化和表征 使生產(chǎn)最高產(chǎn)量構(gòu)巢曲霉脂肪酶1的米曲霉轉(zhuǎn)化子中的1個(gè)在500mlMY25培養(yǎng)基中于30℃，250rpm生長4天來用于純化。上清液利用SEITZ-EKS濾器(PALL Corporation，Waldstetten，德國)在壓力下無菌過濾。然后該無菌過濾的上清液被調(diào)節(jié)至pH9，并加入氯化鈉至終濃度為2M。
癸胺瓊脂糖通過UpFront Chromatography A/S，Lers Parkalle Denmark定制。該癸胺瓊脂糖基質(zhì)被填入50ml的柱，然后用含有2M氯化鈉的50mM硼酸鹽，pH9緩沖液洗滌和平衡。然后過濾的發(fā)酵上清液利用Akta探測系統(tǒng)被施加到柱上。未結(jié)合的物質(zhì)用含有2M氯化鈉的50mM硼酸鹽，pH9緩沖液洗滌。結(jié)合的蛋白質(zhì)用含有30％2-丙醇的50mM硼酸鹽，pH9緩沖液作為洗脫液來洗提。
收集10ml餾分(fraction)并根據(jù)由Svendsen等，in Methods inEnzymology，Lipases Part a Biotechnology Vol.284 pages 317-340 Edited byByron Rubin and Edward A.Dennis，Academic Press，1997，New York描述的測定來分析脂肪酶活性。然后匯集包含脂肪酶活性的餾分并稀釋調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度低于4mSi。
用50mM硼酸鹽，pH9緩沖液洗滌和平衡50ml FFQ Sepharose(Pharmacia Amersham，Uppsala，Sweden)柱子。然后將含有活性的癸胺瓊脂糖匯集物施加到該柱子上并用相同的緩沖液洗滌以除去未結(jié)合的物質(zhì)。然后利用包含0.5M氯化鈉的50mM硼酸鹽，pH9緩沖液的線性鹽梯度來洗提結(jié)合的蛋白質(zhì)。
收集10ml餾分并如上所述分析活性，且還通過SDS-PAGE分析餾分的純度。最好的餾分包含最高的脂肪酶活性，并且匯集通過SDS-PAGE判斷最好的純度。SDS-PAGE顯示分子量在33至35kDa之間的純蛋白質(zhì)條帶、通?？磥硎怯捎谔腔饔玫牡鞍踪|(zhì)。
根據(jù)WO 2005/040410，在pH7評估構(gòu)巢曲霉脂肪酶1的底物特異性。該結(jié)果顯示該構(gòu)巢曲霉脂肪酶1有效降解磷脂，例如卵磷脂(和烷基化的磷脂酰乙醇胺)以及triliolein。
實(shí)施例30重組的構(gòu)巢曲霉脂肪酶1的熱穩(wěn)定性的測定 純化的重組構(gòu)巢曲霉脂肪酶1(實(shí)施例29)的熱穩(wěn)定性通過差示掃描量熱法(DSC)來測定。將熱變性溫度，Td，作為以恒定程序加熱速率加熱酶溶液后獲得的熱像圖(Cp對T)中變性峰(主要吸熱峰)的頂端。Cp是指熱容量(恒壓下)。T是指溫度。
根據(jù)制造商的指導(dǎo)，VP-DSC差示掃描量熱儀(MicroCal Inc.，Northampton，MA)被用于該熱穩(wěn)定性測定。樣品酶和參照溶液在加載樣品進(jìn)入量熱計(jì)之前被立即仔細(xì)地放氣(參照沒有酶的緩沖液)。樣品酶(大約1mg/ml)和參照溶液(大約0.5ml)在5℃預(yù)熱平衡20分鐘。以大約90 K/hr的掃描速率從5℃至95℃進(jìn)行DSC掃描。變性溫度以大約+/-1℃的精確度來測定。
表4中顯示的結(jié)果表明該構(gòu)巢曲霉脂肪酶1在50mM乙酸鹽，pH5.0緩沖液具有63℃的熱變性溫度，并且在50mM甘氨酸，pH10.0緩沖液中為55℃。
表4.熱穩(wěn)定性測定 實(shí)施例31構(gòu)巢曲霉脂肪酶2基因的克隆 根據(jù)開放閱讀框的預(yù)測的起始和終止密碼子設(shè)計(jì)如下所示的兩個(gè)合成寡核苷酸引物以從實(shí)施例24中制備的基因組DNA PCR擴(kuò)增構(gòu)巢曲霉脂肪酶2基因。
正向引物 5’-ACACAACTGGCCATGTATTTCCTTCTCTCCGTCATC-3’(SEQID NO42) 反向引物 5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATCAGCCTAGTGGGCAAGCAT-3’(SEQ ID NO43) 粗體字表示編碼序列。其余的序列與pBMl20a的插入位點(diǎn)同源。
該片段利用如實(shí)施例25中描述的Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)通過PCR來擴(kuò)增。該反應(yīng)產(chǎn)物利用TBE緩沖液在0.7％瓊脂糖凝膠上顯像，并根據(jù)制造商的指導(dǎo)，利用QIAquick PCR純化試劑盒來純化1.2kb的產(chǎn)物條帶。然后根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆入pCR2.1-TOPO來產(chǎn)生pJLin170(圖19)。如實(shí)施例25中所描述的，將2μl的該反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 One Shot感受態(tài)細(xì)胞。含有pJLin170的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并利用QIAGEN BioRobot 9600來制備質(zhì)粒DNA。
含有pJLin170的大腸桿菌TOP10 One Shot細(xì)胞保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，保藏號為NRRLB-30754，保藏日期為2004年7月21日。
實(shí)施例32編碼脂肪酶2的構(gòu)巢曲霉基因組序列的表征 來自質(zhì)粒pJLin170的構(gòu)巢曲霉脂肪酶2基因的DNA測序利用染料-終止子化學(xué)(Giesecke et al.，1992，supra)和引物步行策略，用AppliedBiosystems Model 377XL DNA測序儀來進(jìn)行。核對核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)，并且序列借助PHRED/PHRAP軟件(University of Washington，Seattle，WA)來進(jìn)行相互比較。
該脂肪酶基因的基因模型根據(jù)與Thermomyces lanuginosus脂肪酶的同源性以及存在于真菌內(nèi)含子5’和3’末端的保守序列來預(yù)測。該核苷酸序列(SEQ ID NO13)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO14)如圖20所示。該基因組片段編碼被49bp、73bp、和70bp的3個(gè)內(nèi)含子中斷的308個(gè)氨基酸的多肽。該基因的％G+C含量是51.7％，該成熟蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域(SEQ IDNO13的第73至1116位核苷酸)的是51.9％。利用SignalP軟件程序(Nielsenet al.，1997，supra)，預(yù)測出24個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)包含分子量為30.5kDa的284個(gè)氨基酸。
脂肪酶序列的比較性序列對比利用使用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Clustal W方法(Higgins，1989，supra)來確定，其使用同一性表格和下列多個(gè)比對參數(shù)缺口罰分為10和缺口長度罰分為10。成對排列參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，和對角線＝5。該序列對比顯示該構(gòu)巢曲霉脂肪酶2基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因(登錄號O59952)的推導(dǎo)的氨基酸序列共享37％的同一性。
實(shí)施例33構(gòu)巢曲霉脂肪酶3基因的克隆 根據(jù)開放閱讀框的預(yù)測的起始和終止密碼子設(shè)計(jì)如下所示的兩個(gè)合成寡核苷酸引物以從實(shí)施例24中制備的基因組DNA PCR擴(kuò)增構(gòu)巢曲霉脂肪酶3基因。
正向引物 5’-ACACAACTGGCCATGACGGTGTCTCTTGACAGTTTATTCC-3’(SEQ ID NO44) 反向引物 5’-AGTCACCTCTAGTTAATTAATCACCCCCCTGACAAATCTCCCTTGG-3’(SEQ ID NO45) 粗體字表示編碼序列。其余的序列與pBM120a的插入位點(diǎn)同源。
感興趣的片段利用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)通過PCR來擴(kuò)增。將50皮摩爾的上述各個(gè)引物用于含有25 ng構(gòu)巢曲霉基因組DNA，1X PCR緩沖液，其具有1.5mM MgCl2，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(分別為10mM)，和0.75μl DNA聚合酶混合物(3.5U/μl)的PCR反應(yīng)，終體積為50μl。 Eppendorf Mastercycler熱循環(huán)儀被用于擴(kuò)增該片段，程序設(shè)為1個(gè)循環(huán)的94℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，3分鐘；15個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，3分鐘，在各個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘；以及10℃保存。
該反應(yīng)產(chǎn)物利用TBE緩沖液在1.0％瓊脂糖凝膠上顯像，并根據(jù)制造商的指導(dǎo)，利用QIAquick PCR純化試劑盒純化1.3kb的產(chǎn)物條帶。
實(shí)施例34表達(dá)構(gòu)巢曲霉脂肪酶3基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建 含有實(shí)施例33中描述的構(gòu)巢曲霉脂肪酶3基因的PCR片段利用InFusion克隆試劑盒被克隆入pBM120a表達(dá)載體。該載體用限制性核酸內(nèi)切酶Nco I和Pac I消化(使用制造商指定的條件)。該消化的載體通過凝膠電泳純化，并利用QIAquick凝膠提取試劑盒提取，該P(yáng)CR片段利用QIAquick PCR純化試劑盒來純化。該基因片段和消化的載體在反應(yīng)中連接在一起而產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pJSF8c(圖21)。該連接反應(yīng)物(20μl)的組成為1XInFusion緩沖液，1X BSA，1μl Infusion酶(1∶10稀釋)，100ng用Nco I和PacI消化的pBM1 20a，和50ng純化的構(gòu)巢曲霉脂肪酶3基因PCR產(chǎn)物。該反應(yīng)在室溫下孵育30分鐘。然后將2μl該反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SoloPackGold超感受態(tài)細(xì)胞。含有pJSF8c質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并利用QIAGEN BioRobot 9600來制備質(zhì)粒DNA。
實(shí)施例35構(gòu)巢曲霉脂肪酶3基因克隆載體的構(gòu)建 在實(shí)施例33中描述的2個(gè)合成寡核苷酸引物被用于從質(zhì)粒pJSF8c PCR擴(kuò)增構(gòu)巢曲霉脂肪酶3基因的基因組編碼區(qū)域。
感興趣的片段利用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)通過PCR來擴(kuò)增。將50皮摩爾的上述各個(gè)引物用于含有1∶10稀釋的質(zhì)粒，pJSF8c，mini DNA的PCR反應(yīng)。該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)混合物還包含具有1.5mM MgCl2，1μl dATP，dTTP，dGTP，和dCTP混合物(分別為10mM)，和0.5μl DNA聚合酶混合物(3.5U/μl)的1X PCR緩沖液，終體積為50μl。Eppendorf Mastercycler熱循環(huán)儀被用于擴(kuò)增該片段，程序設(shè)為1個(gè)循環(huán)的94℃，2分鐘；10個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，1分，15秒；15個(gè)循環(huán)的94℃，15秒；62℃，30秒；和72℃，1分15秒，在各個(gè)連續(xù)的循環(huán)加5秒延伸；1個(gè)循環(huán)的72℃，7分鐘；以及10℃保存。
根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將該1.3kb的PCR產(chǎn)物克隆入pCR2.1-TOPO來產(chǎn)生pBM141(圖22)。將2μl的該反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 One Shot感受態(tài)細(xì)胞。含有pBM141的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子通過限制性消化來檢測，并利用QIAGEN BioRobot 9600來制備質(zhì)粒DNA。
含有pBM141的大腸桿菌TOP10 One Shot細(xì)胞保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，保藏號為NRRLB-30780，保藏日期為2004年10月12日。
實(shí)施例36編碼脂肪酶3的構(gòu)巢曲霉基因組序列的表征 來自質(zhì)粒pJSF8c和pBM141的構(gòu)巢曲霉脂肪酶3基因的DNA測序利用染料-終止子化學(xué)(Giesecke et al.，1992，supra)和引物步行策略，用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XL自動(dòng)化DNA測序儀(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)來進(jìn)行。核對核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)，并且全部序列借助ContigExpress軟件(Informax，Inc.，Bethesda，MD)加以分析。
該假定的脂肪酶基因的基因模型根據(jù)與Thermomyces lanuginosus脂肪酶的同源性以及存在于真菌內(nèi)含子5’和3’末端的保守序列來預(yù)測。該基因組編碼序列(SEQ ID NO15)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO16)對于pJSF8c和pBM141是相同的，并如圖23所示。該基因組片段編碼被68 bp的1個(gè)內(nèi)含子中斷的404個(gè)氨基酸的多肽。該基因的％G+C含量是52.14％，該成熟蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域(SEQ ID NO15的第76至1280位核苷酸)的是52.3％。利用SignalP軟件程序(Nielsen et al.，1997，supra)，預(yù)測出25個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)包含分子量為42.4kDa的380個(gè)氨基酸。
脂肪酶序列的比較性序列對比利用使用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Clustal W方法(Higgins，1989，supra)來確定，其使用同一性表格和下列多個(gè)比對參數(shù)缺口罰分為10和缺口長度罰分為10。成對排列參數(shù)是Ktuple＝1，缺口罰分＝3，窗口＝5，和對角線＝5。該序列對比顯示該構(gòu)巢曲霉脂肪酶3基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因(登錄號O59952)的推導(dǎo)的氨基酸序列共享21.6％的同一性。
生物材料的保藏 下列生物材料已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的條件在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)培養(yǎng)物保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604進(jìn)行保藏，并給出下列保藏號 該菌株于下述條件下保藏確保在本專利申請未決期間，由專利與商標(biāo)委員依據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授權(quán)的人能夠獲得該培養(yǎng)物。該保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本，或其后續(xù)文本的國家，依據(jù)該外國專利法律的要求，可以獲得該保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對實(shí)施本發(fā)明的許可，實(shí)施本發(fā)明是對政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。
在此描述并要求的本發(fā)明不局限于在此公開的具體實(shí)施方案的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在作為本發(fā)明的某些方面的說明。任何等同的實(shí)施方案確定地包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除去在這里顯示和描述的之外，對本發(fā)明前述的說明書的各種更改，對于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員是顯而易見的。這樣的更改也確定地落在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下，以包含定義的本說明書為準(zhǔn)。
在此引用各種參考文獻(xiàn)，其公開整體地并入作為參考。
關(guān)于微生物保藏的說明
(細(xì)則13之二)
關(guān)于微生物保藏的說明
(細(xì)則13之二)
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(細(xì)則13之二)
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(細(xì)則13之二)
序列表
<110>諾維信股份有限公司(Novozymes，Inc.)
諾維信公司(Novozymes A/S)
<120>具有脂肪酶活性的多肽和編碼其的多核苷酸
<130>10679.504-WO
<150>60/614,508
<151>2004-09-30
<150>60/621,304
<151>2004-10-21
<150>60/621,222
<151>2004-10-21
<160>45
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1259
<212>DNA
<213>煙曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400>1
atgcttcaca agtatagcct gttctgtctc actattttct cctgcctctt cgttgtgagc 60
gtggatgggg caatactcgg tagggatgat gaaggccgac agcagatacc tgatgaactc120
tttgaatcac tcgaagagct ctcacgtatc gttgatgttt cgtactgtgt tgggaccact180
gaaattcgga agccattcaa gtgtctcagt cattgtagtg aattccaggg cttcgaactg240
gtcaccgtat gttgaaagcc tctcacttat atgttgtctt tctgtccaag cttgatggct300
tagatcgtct ccagacatgg aataccggtc ctttcctttc cgattcctgt ggctatgtaa360
ccctctccca cgaaccatct ccgaagcgga tcatcgttgc ctttcgcggc acttactcga420
tcgccaacac gatcatcgat ctatccgcct atcctcaggc ctatgtaccg tatcatcccg480
aggatggaaa agtgtccgac catttacaat gtctgaactg cacagttcat gcggggtttt540
tggcctcgtg gagcaatgct cgcgccatag tactcgagca cgtagctgtg gcaagggccc600
ggtacccgga ttacagcttg gttttgaccg gccactcgct tggcggcgcc gtcgccgctc660
ttgccggggt cgaaatgcaa ctgcgcgggt gggagccaca agtgaccact ttcggagagc720
caagaatcgg aaacaaggct tttgtggaat ttcttgatcg gatctttgat ctagatggct780
tgggagctga tgcccaggac accagatttc gaagagtcac acatatcaac gatccggtcc840
ccctactccc attgtcagaa tggggttatg agatgcatgc gggagagatc tttatcgcta900
aggaggagct ctcgcctcta ccccatgata tcagactgtg ccagggcgac aacgatgcgc960
gatgcattgc aggaacggat ggagctgtaa cgcgcatgct gaacgagttg gatgataccg 1020
ttttgcccaa gcagcctcta gcgaaacgag tccagtcacc ccatcaggcc gttttggcag 1080
acgtggatcc tcatagtagt gcagatgtcg acgagcaagt acagacgcca ttcagcctgc 1140
cttggcatct tattccctcc agataccgac tgtgggagct gttcttcgct catcgtgatt 1200
atttctggcg gcttgggctt tgtgtaccag gcggtgatcc gactggcaag ataatctga1259
<210>2
<211>396
<212>PRT
<213>煙曲霉
<400>2
Met Leu His Lys Tyr Ser Leu Phe Cys Leu Thr Ile Phe Ser Cys Leu
1 5 10 15
Phe Val Val Ser Val Asp Gly Ala Ile Leu Gly Arg Asp Asp Glu Gly
20 25 30
Arg Gln Gln Ile Pro Asp Glu Leu Phe Glu Ser Leu Glu Glu Leu Ser
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Arg Ile Val Asp Val Ser Tyr Cys Val Gly Thr Thr Glu Ile Arg Lys
50 55 60
Pro Phe Lys Cys Leu Ser His Cys Ser Glu Phe Gln Gly Phe Glu Leu
65 70 75 80
Val Thr Thr Trp Asn Thr Gly Pro Phe Leu Ser Asp Ser Cys Gly Tyr
85 90 95
Val Thr Leu Ser His Glu Pro Ser Pro Lys Arg Ile Ile Val Ala Phe
100 105 110
Arg Gly Thr Tyr Ser Ile Ala Asn Thr Ile Ile Asp Leu Ser Ala Tyr
115 120 125
Pro Gln Ala Tyr Val Pro Tyr His Pro Glu Asp Gly Lys Val Ser Asp
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His Leu Gln Cys Leu Asn Cys Thr Val His Ala Gly Phe Leu Ala Ser
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Trp Ser Asn Ala Arg Ala Ile Val Leu Glu His Val Ala Val Ala Arg
165 170 175
Ala Arg Tyr Pro Asp Tyr Ser Leu Val Leu Thr Gly His Ser Leu Gly
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Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Gly Val Glu Met Gln Leu Arg Gly Trp
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Glu Pro Gln Val Thr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Ile Gly Asn Lys Ala
210 215 220
Phe Val Glu Phe Leu Asp Arg Ile Phe Asp Leu Asp Gly Leu Gly Ala
225 230 235 240
Asp Ala Gln Asp Thr Arg Phe Arg Arg Val Thr His Ile Asn Asp Pro
245 250 255
Val Pro Leu Leu Pro Leu Ser Glu Trp Gly Tyr Glu Met His Ala Gly
260 265 270
Glu Ile Phe Ile Ala Lys Glu Glu Leu Ser Pro Leu Pro His Asp Ile
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Arg Leu Cys Gln Gly Asp Asn Asp Ala Arg Cys Ile Ala Gly Thr Asp
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Gly Ala Val Thr Arg Met Leu Asn Glu Leu Asp Asp Thr Val Leu Pro
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Lys Gln Pro Leu Ala Lys Arg Val Gln Ser Pro His Gln Ala Val Leu
325 330 335
Ala Asp Val Asp Pro His Ser Ser Ala Asp Val Asp Glu Gln Val Gln
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Thr Pro Phe Ser Leu Pro Trp His Leu Ile Pro Ser Arg Tyr Arg Leu
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Trp Glu Leu Phe Phe Ala His Arg Asp Tyr Phe Trp Arg Leu Gly Leu
370 375 380
Cys Val Pro Gly Gly Asp Pro Thr Gly Lys Ile Ile
385 390 395
<210>3
<211>947
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>3
atgtttcacc cagatatttc ggctgggctt ctagccaatc taacactatt ttctgaatat 60
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gggtatgatt ccatcaacag ggcatgaact gaaaagctaa cgccaagtat acatcatccg240
ggtaacgtca ctggcttcgt ggcaattgac aacacaaatc aattgatcgt tctgtcattc300
cgcggtagcc ggaccctagg caactatatc actgattcea aataccagca ggtgcctgct360
atttgcccag gttgccaagt gcataaaggc tattactggg cctggggaaa cttttcagca420
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actggccaca gttttggagg tgcactagct acgcttgggg cagcacttga gggaggaaat540
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gcattaatca gatacagtac acttttggat gtccccaact gggcaatcat gattttgctg660
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<210>4
<211>283
<212>PRT
<213>煙曲霉
<400>4
Met Phe His Pro Asp Ile Ser Ala Gly Leu Leu Ala Asn Leu Thr Leu
1 5 10 15
Phe Ser Glu Tyr Ala Ala Ala Ser Thr Cys Ala Ala Asn Phe Asn Ser
20 25 30
His Thr Leu Ser Lys Val Val Cys Asp Pro Gly Val Cys Pro Thr Leu
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Glu Gln Thr Asp Thr Asn Val Met Val Gly Phe Met Gly Ile His His
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Pro Gly Asn Val Thr Gly Phe Val Ala Ile Asp Asn Thr Asn Gln Leu
65 70 75 80
Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Thr Leu Gly Asn Tyr Ile Thr
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<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>5
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atgtccttca tgggctccaa gtcgtggcag tccttcatga ccgagtaagc aaaacacccc480
acttactcta gatttttttt tatcttgtca tccacatgac tcacatttca cctccaaaca540
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<210>6
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<212>PRT
<213>Magnaporthe grisea
<400>6
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Arg Ala Gln Trp Pro Ser Tyr Gln Val Val Ala Thr Gly His Ser Ile
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Gly Ala Gly Val Ala Thr Val Ala Ala Ala Arg Leu Arg Asn Arg Leu
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Asn Val Asp Ile Gln Leu Tyr Thr Phe Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn
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Asp Ala Phe Ala Thr Phe Val Thr Asn Gln Asn Arg Gly Arg Asn Tyr
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Arg Ile Thr His Tyr Asp Asp Val Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Trp
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Ala Gly Phe Ala His Val Ser Pro Glu Tyr Trp Leu Arg Arg Lys Asp
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Ala Ser Asp Phe Asn Tyr Pro Leu Ser Glu Val Val Vai Cys Glu Gly
275 280 285
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<210>7
<211>1047
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>7
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aagctgcaca cgggctttgc cacagcctgg tcccaggtgc aggccgatgt tctggccgcc480
atcgccgacg ccaaggccca gaaccccgac tacaccgtcg tcgtgacggg ccactccctc540
ggcggcgccg tcgccaccgt cgcgggagtc tacctccgcc agctgggcta ccccgtcgag600
gtttacacgt acggcagccc gcgcatcggc aatcaggagt ttgtgcagtg ggtttccacg660
caggccggca acgtcgagta ccgcgtcacg cacatcgacg accccgtccc ccgcctgccg720
cccatcttcc tcggctacag gcacgtcacc cccgagtact ggctcaactc tggcacctcc780
aacacggtca actacaccgt cgccgacatc aaggtctgcg agggcttcgc caacatcaac840
tgcaacggcg gcagcctcgg cctcgacaca aacgcccacc tctactacct caccgacatg900
atcgcctgcg gctccaacaa gttcgtcttc cgccgcgacg acgccaacgc catcagtgac960
gccgagctcg agcagaggct gaccatgtac gctcaaatgg atcgcgagtt tgttgctgcg 1020
cttgaagcca acaagaccgt ggcttaa1047
<210>8
<211>348
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<213>Magnaporthe grisea
<400>8
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35 40 45
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100 105 110
Ala Leu Arg Gly Ser Thr Ser Leu Arg Asn Trp Ile Thr Asn Leu Thr
115 120 125
Phe Leu Trp Thr Arg Cys Asp Phe Val Gln Asp Cys Lys Leu His Thr
130 135 140
Gly Phe Ala Thr Ala Trp Ser Gln Val Gln Ala Asp Val Leu Ala Ala
145 150 155 160
Ile Ala Asp Ala Lys Ala Gln Asn Pro Asp Tyr Thr Val Val Val Thr
165 170 175
Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Val Ala Gly Val Tyr Leu
180 185 190
Arg Gln Leu Gly Tyr Pro Val Glu Val Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg
195 200 205
Ile Gly Asn Gln Glu Phe Val Gln Trp Val Ser Thr Gln Ala Gly Asn
210 215 220
Val Glu Tyr Arg Val Thr His Ile Asp Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro
225 230 235 240
Pro Ile Phe Leu Gly Tyr Arg His Val Thr Pro Glu Tyr Trp Leu Asn
245 250 255
Ser Gly Thr Ser Asn Thr Val Asn Tyr Thr Val Ala Asp Ile Lys Val
260 265 270
Cys Glu Gly Phe Ala Asn Ile Asn Cys Asn Gly Gly Ser Leu Gly Leu
275 280 285
Asp Thr Asn Ala His Leu Tyr Tyr Leu Thr Asp Met Ile Ala Cys Gly
290 295 300
Ser Asn Lys Phe Val Phe Arg Arg Asp Asp Ala Asn Ala Ile Ser Asp
305 310 315 320
Ala Glu Leu Glu Gln Arg Leu Thr Met Tyr Ala Gln Met Asp Arg Glu
325 330 335
Phe Val Ala Ala Leu Glu Ala Asn Lys Thr Val Ala
340 345
<210>9
<211>1182
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>9
atgttgtggc gtcgggcggg tggcctctgt ctgttgctgt gttgggcctg ggcaacaccg 60
gcacaagctg cagcatttag tcatgacatc acccagctga gctacacgga tgtcgactcg120
cctctccaaa aacacctaca atcacaacaa caacaaaaac aagaacacaa acaaaaacct180
atcaccacca caaccatttc ttcaatactc ttcacgtctc tagagcgcct ggcccgcctc240
gtagacatag cctactgcgt gggaagtctg cccggcatct cgcggccctt cacctgcgcc300
tcgcgctgcg ccgatttccc ccacgtttca ctcgtcaaca cctgggacac gggcccactc360
ctgacagaca gctgcggcta cgtcgccatc gaccacgccg atgaagccat agtggtcgcc420
tttcggggca cctacagcat cgccaacacc gtgattgacc tcagcacggt gccgcaggag480
tacgtgccct atccggagcc cgacgacgat ggcgacaggg agcgctgcga caactgcacc540
gtgcacctag gattcctagc cagctggaag gtcgccagga atctggtcct gcccgccatc600
gaggaggcga ggcagaagca ccccggcttc agcatcaacc tcgtcggcca cagcctcggc660
ggtgccgtcg ctgcgctggc ggcgctcgag ctgaagctca tcagcggcta cgatgtcgta720
gtcacgactt ttggtgagcc gagggttggc aacagcgggc tggcaaagtt cattgatcgc780
gtgttcggct tagaccagga agcaaaagag gacatggcgt accgcagggt cacgcacgcc840
gaggatccgg taccgttgct gccgctcgag gagtggggat acaggtcaca cgccggcgag900
attcacattg agaagccggc gctaccacca gcaccgactg acataaagtt gtgcaaaggc960
gaaagggatc ccgattgcag caacgggaac tctgacgcgg cgctgactac cttgctgctt 1020
ggagaggaac attatctaaa gaaacagcat ctgaagctgt ggcagctgtt ctttgcccat 1080
cgagactact tttggaggct tgggctttgc gttcccggtg gtgatccggc tgattggggt 1140
agagacaagt atgatgtggc tcctggccag gatgagctct aa 1182
<210>10
<211>393
<212>PRT
<213>Magnaporthe grisea
<400>10
Met Leu Trp Arg Arg Ala Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Cys Trp Ala
1 5 10 15
Trp Ala Thr Pro Ala Gln Ala Ala Ala Phe Ser His Asp Ile Thr Gln
20 25 30
Leu Ser Tyr Thr Asp Val Asp Ser Pro Leu Gln Lys His Leu Gln Ser
35 40 45
Gln Gln Gln Gln Lys Gln Glu His Lys Gln Lys Pro Ile Thr Thr Thr
50 55 60
Thr Ile Ser Ser Ile Leu Phe Thr Ser Leu Glu Arg Leu Ala Arg Leu
65 70 75 80
Val Asp Ile Ala Tyr Cys Val Gly Ser Leu Pro Gly Ile Ser Arg Pro
85 90 95
Phe Thr Cys Ala Ser Arg Cys Ala Asp Phe Pro His Val Ser Leu Val
100 105 110
Asn Thr Trp Asp Thr Gly Pro Leu Leu Thr Asp Ser Cys Gly Tyr Val
115 120 125
Ala Ile Asp His Ala Asp Glu Ala Ile Val Val Ala Phe Arg Gly Thr
130 135 140
Tyr Ser Ile Ala Asn Thr Val Ile Asp Leu Ser Thr Val Pro Gln Glu
145 150 155 160
Tyr Val Pro Tyr Pro Glu Pro Asp Asp Asp Gly Asp Arg Glu Arg Cys
165 170 175
Asp Asn Cys Thr Val His Leu Gly Phe Leu Ala Ser Trp Lys Val Ala
180 185 190
Arg Asn Leu Val Leu Pro Ala Ile Glu Glu Ala Arg Gln Lys His Pro
195 200 205
Gly Phe Ser Ile Asn Leu Val Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala
210 215 220
Ala Leu Ala Ala Leu Glu Leu Lys Leu Ile Ser Gly Tyr Asp Val Val
225 230 235 240
Val Thr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Val Gly Asn Ser Gly Leu Ala Lys
245 250 255
Phe Ile Asp Arg Val Phe Gly Leu Asp Gln Glu Ala Lys Glu Asp Met
260 265 270
Ala Tyr Arg Arg Val Thr His Ala Glu Asp Pro Val Pro Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Glu Glu Trp Gly Tyr Arg Ser His Ala Gly Glu Ile His Ile Glu
290 295 300
Lys Pro Ala Leu Pro Pro Ala Pro Thr Asp Ile Lys Leu Cys Lys Gly
305 310 315 320
Glu Arg Asp Pro Asp Cys Ser Asn Gly Asn Ser Asp Ala Ala Leu Thr
325 330 335
Thr Leu Leu Leu Gly Glu Glu His Tyr Leu Lys Lys Gln His Leu Lys
340 345 350
Leu Trp Gln Leu Phe Phe Ala His Arg Asp Tyr Phe Trp Arg Leu Gly
355 360 365
Leu Cys Val Pro Gly Gly Asp Pro Ala Asp Trp Gly Arg Asp Lys Tyr
370 375 380
Asp Val Ala Pro Gly Gln Asp Glu Leu
385 390
<210>11
<211>1041
<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)
<400>11
atgatccgtt tggggtattc tgccatcttc gtagcccttg ctgggttagc cgttgccgct 60
ccagcgccgc tgaatcgtcg tggtatgtca ccttgcatgg ggatatggta caggactaac120
gttgtgtaga cgtttcgacg gaggccctaa atcaactgac cctgttcgcg gagtattctg180
cggcatcgta ctgcacaccc aatattgggt cagtcgggga caagctgact tgcgcatctg240
gaaactgccc gacagttgag gcagcagaca cgacaacgct ggctgaattc tatcagtgcg300
ttaagccctg cattcggggt tccaaacaga tccaactagt ctgacgagtc acagggagaa360
cgaatacggg gatgtagcag gcttccttgc cgcagataca accaacgagt tactcgtctt420
gtccttccgt gggagccgga cgattgacac gtggattgca aacctcgact ttggcctgga480
gtcggtcgag gagatctgta gcggatgcaa agcccacggc gggttctgga aggcatggca540
ggttgttgca gactcgttga cctcagcaat tgagtctgct actgccacat atcccggcta600
cgccattgtc ttcacaggcc acagctttgg aggagcattg gctactctag gcgcagcgca660
gctgcgaaaa gcaggttatg ccatcgaact tgtaagaatc cagtgtccag ctggtggcta720
gctgtctgct gacgagcgta gtacccctat ggtagcccgc gtgttggcaa cgaagctttg780
gcgcaataca tcacagacca gggggcaaac tatcgagtga cgcacactaa cgatatcgtt840
cccagacttc ctcccatgtt gttgggcttc agccacttga gccctgagta ttggattacc900
agcgacaatg aggttacccc gacgacgaca gatatccagg tgattgaagg cgttgggtcg960
agggacggaa atgcgggtga ggctgcccag tcagtggagg cacacagttg gtatctgata 1020
gatatcactg cctgccagta a 1041
<210>12
<211>294
<212>PRT
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>12
Met Ile Arg Leu Gly Tyr Ser Ala Ile Phe Val Ala Leu Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Val Ala Ala Pro Ala Pro Leu Asn Arg Arg Asp Val Ser Thr Glu
20 25 30
Ala Leu Asn Gln Leu Thr Leu Phe Ala Glu Tyr Ser Ala Ala Ser Tyr
35 40 45
Cys Thr Pro Asn Ile Gly Ser Val Gly Asp Lys Leu Thr Cys Ala Ser
50 55 60
Gly Asn Cys Pro Thr Val Glu Ala Ala Asp Thr Thr Thr Leu Ala Glu
65 70 75 80
Phe Tyr Gln Glu Asn Glu Tyr Gly Asp Val Ala Gly Phe Leu Ala Ala
85 90 95
Asp Thr Thr Asn Glu Leu Leu Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Thr
100 105 110
Ile Asp Thr Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Gly Leu Glu Ser Val Glu
115 120 125
Glu Ile Cys Ser Gly Cys Lys Ala His Gly Gly Phe Trp Lys Ala Trp
130 135 140
Gln Val Val Ala Asp Ser Leu Thr Ser Ala Ile Glu Ser Ala Thr Ala
145 150 155 160
Thr Tyr Pro Gly Tyr Ala Ile Val Phe Thr Gly His Ser Phe Gly Gly
165 170 175
Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Ala Gln Leu Arg Lys Ala Gly Tyr Ala
180 185 190
Ile Glu Leu Tyr Pro Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Glu Ala Leu
195 200 205
Ala Gln Tyr Ile Thr Asp Gln Gly Ala Asn Tyr Arg Val Thr His Thr
210 215 220
Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro Met Leu Leu Gly Phe Ser His
225 230 235 240
Leu Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Asp Asn Glu Val Thr Pro Thr
245 250 255
Thr Thr Asp Ile Gln Val Ile Glu Gly Val Gly Ser Arg Asp Gly Asn
260 265 270
Ala Gly Glu Ala Ala Gln Ser Val Glu Ala His Ser Trp Tyr Leu Ile
275 280 285
Asp Ile Thr Ala Cys Gln
290
<210>13
<211>1119
<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>13
atgtatttcc ttctctccgt catcttccac tttcctgtct tctgtgccgg ctttccacct 60
gccgtatcca gaggtacgtg attcaatgtg ctcagtaatc cggcttgaac caaccgcaat120
agaaatatcc acaactctcc tcaccaaact caccctcatg tctcaatact ctgctgcttc180
aggttgcagc gaaaacaata actcttctgt agggagttct gtttattgcg gggctgaaat240
gtgtccgctt atcgacagtg ccaatacaga actcctttat gcattctcag agtattcccc300
tttcgatatc tcattggatt accatactca atagacgcta actctttact ttctcattac360
acaggattta ccccggcgat acggctggct acattgccgc cgaccacaca aacgcccttc420
tgatcatctc gtttcgcaat agcgtgaccc ccacaaactt catcaccgat tgggcattcc480
ttcaagtcag cgcgcctacc gcgtgctccg gatgccgagc acataaaggg ttctggtcgg540
cggccgtggc cgccgacaag gctttagatg gttccatcag ggaggcaaag gccagatacc600
cagagtacga actgacgttg actgggcata gtttgggagg tgcacttgca acgcttcatg660
caattttcct gaggaataga ggagttgctg ttgattctgt aagttgaggc tttgccgcaa720
tgacgacccg agcaacttga tggctgctga tgctgactgg actgctagta taccttcggc780
gcgccatcgg ttggtgacta cgcaatggcc gattacatca cgaacgggcc cggtagcgac840
aatgggagga actatcgcgt tacgcacctg aatgacgtct ttccaaaaat gctctaccgt900
gcgtctagga tgccggttgc agatcggctg gtacaagagt acagccagtc cgggccagag960
tactggatta cgtctggctt cggcgagcct gttacaactg cggatgtgca catccttgag 1020
ggcgtggata atgagcaggg caatctggga agagaacctg gcagtctgag ggaccatatg 1080
tggtatttgg gggcgacaga tgcttgccca ctaggctga 1119
<210>14
<211>308
<212>PRT
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>14
Met Tyr Phe Leu Leu Ser Val Ile Phe His Phe Pro Val Phe Cys Ala
1 5 10 15
Gly Phe Pro Pro Ala yal Ser Arg Glu Ile Ser Thr Thr Leu Leu Thr
20 25 30
Lys Leu Thr Leu Met Ser Gln Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Cys Ser Glu
35 40 45
Asn Asn Asn Ser Ser Val Gly Ser Ser Val Tyr Cys Gly Ala Glu Met
50 55 60
Cys Pro Leu Ile Asp Ser Ala Asn Thr Glu Leu Leu Tyr Ala Phe Ser
65 70 75 80
Glu Ile Tyr Pro Gly Asp Thr Ala Gly Tyr Ile Ala Ala Asp His Thr
85 90 95
Asn Ala Leu Leu Ile Ile Ser Phe Arg Asn Ser Val Thr Pro Thr Asn
100 105 110
Phe Ile Thr Asp Trp Ala Phe Leu Gln Val Ser Ala Pro Thr Ala Cys
115 120 125
Ser Gly Cys Arg Ala His Lys Gly Phe Trp Ser Ala Ala Val Ala Ala
130 135 140
Asp Lys Ala Leu Asp Gly Ser Ile Arg Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Pro
145 150 155 160
Glu Tyr Glu Leu Thr Leu Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala
165 170 175
Thr Leu His Ala Ile Phe Leu Arg Asn Arg Gly Val Ala Val Asp Ser
180 185 190
Tyr Thr Phe Gly Ala Pro Ser Val Gly Asp Tyr Ala Met Ala Asp Tyr
195 200 205
Ile Thr Asn Gly Pro Gly Ser Asp Asn Gly Arg Asn Tyr Arg Val Thr
210 215 220
His Leu Asn Asp Val Phe Pro Lys Met Leu Tyr Arg Ala Ser Arg Met
225 230 235 240
Pro Val Ala Asp Arg Leu Val Gln Glu Tyr Ser Gln Ser Gly Pro Glu
245 250 255
Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Phe Gly Glu Pro Val Thr Thr Ala Asp Val
260 265 270
His Ile Leu Glu Gly Val Asp Asn Glu Gln Gly Asn Leu Gly Arg Glu
275 280 285
Pro Gly Ser Leu Arg Asp His Met Trp Tyr Leu Gly Ala Thr Asp Ala
290 295 300
Cys Pro Leu Gly
305
<210>15
<211>1283
<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>15
atgacggtgt ctcttgacag tttattcctt acacttatta tattcctcac gaggctatgc 60
agcgtctcga ccgctcacgt ggtacccctt gaggccagca aggatcccga aaatatcacg120
ccagggaggc aaatctccca ggaactattt gactctattg aggagctggc tcatattgtc180
gatatcgcct actgcattgg gactactggc attagaaagc cgttccaatg cctcagtcac240
tgtgatgagc taaaagggtt tgaactaatc aacgtgcgct tttccacaga cgatctaccc300
gagccgtttg agagatagta gctgactaga tagaaactca gacatggcat acaggtccct360
ttctctctga ttcctgcggc tacatcgccc tctcgcatcc cccctcaccg aagcgaatca420
tagtcgcttt ccgcggtaca tactcaatcc cgaacgcaat agttgacctt tccatgtatc480
cccaggaata cataccgttt tccccaggca acgatactga cggcgatgca ccgaagtgcg540
aggactgttg ggtccattta ggcttcatga acgcatggcg tttaacccgc gcaacaatcc600
tagacaccat ctccgcagca agagaccaat accctgatta cgctctaacc ctagtaggcc660
actctctcgg cggcgcagtt gccgctctcg caggaacaga aatgcagctc cgcggatggg720
aacccgtcgt gacgactttc ggggaaccaa gggtagggaa taaggcgttt gtcgactatc780
tagacaccgt gttccgcctg gaatctggca atgagcgggt gtggaaattc cgccgggtga840
cgcatgtgaa tgaccctgta cccctaatcc cgcttacaga atggggctac gagatgcaca900
gcggagagat ttatattgac cgcgttgagc ttccattttc tgttgacgat gtcaggtact960
gccagggcgg gtccgatcca aactgcattt cagacgcgga ggggaagagc acaactttct 1020
ccccatatag ctcgcagggc tttgatctct ccgaatccaa catggagcag caagtccttt 1080
cgcgctcgcc gcaccagtcg aaggatcagc aacaggagaa tgagaaggga gcttttccat 1140
atctggaatc ccagagtacc tcgtgtctgc catggggtat acttccacct aggtttcgac 1200
tgtgggagct attctactct catcgtgact actttattcg tttggggctt tgcgttccca 1260
agggagattt gtcagggggg tga 1283
<210>16
<211>404
<212>PRT
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>16
Met Thr Val Ser Leu Asp Ser Leu Phe Leu Thr Leu Ile Ile Phe Leu
1 5 10 15
Thr Arg Leu Cys Ser Val Ser Thr Ala His Val Val Pro Leu Glu Ala
20 25 30
Ser Lys Asp Pro Glu Asn Ile Thr Pro Gly Arg Gln Ile Ser Gln Glu
35 40 45
Leu Phe Asp Ser Ile Glu Glu Leu Ala His Ile Val Asp Ile Ala Tyr
50 55 60
Cys Ile Gly Thr Thr Gly Ile Arg Lys Pro Phe Gln Cys Leu Ser His
65 70 75 80
Cys Asp Glu Leu Lys Gly Phe Glu Leu Ile Asn Thr Trp His Thr Gly
85 90 95
Pro Phe Leu Ser Asp Ser Cys Gly Tyr Ile Ala Leu Ser His Pro Pro
100 105 110
Ser Pro Lys Arg Ile Ile Val Ala Phe Arg Gly Thr Tyr Ser Ile Pro
115 120 125
Asn Ala Ile Val Asp Leu Ser Met Tyr Pro Gln Glu Tyr Ile Pro Phe
130 135 140
Ser Pro Gly Asn Asp Thr Asp Gly Asp Ala Pro Lys Cys Glu Asp Cys
145 150 155 160
Trp Val His Leu Gly Phe Met Asn Ala Trp Arg Leu Thr Arg Ala Thr
165 170 175
Ile Leu Asp Thr Ile Ser Ala Ala Arg Asp Gln Tyr Pro Asp Tyr Ala
180 185 190
Leu Thr Leu Val Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala
195 200 205
Gly Thr Glu Met Gln Leu Arg Gly Trp Glu Pro Val Val Thr Thr Phe
210 215 220
Gly Glu Pro Arg Val Gly Asn Lys Ala Phe Val Asp Tyr Leu Asp Thr
225 230 235 240
Val Phe Arg Leu Glu Ser Gly Asn Glu Arg Gly Trp Lys Phe Arg Arg
245 250 255
Val Thr His Val Asn Asp Pro Val Pro Leu Ile Pro Leu Thr Glu Trp
260 265 270
Gly Tyr Glu Met His Ser Gly Glu Ile Tyr Ile Asp Arg Val Glu Leu
275 280 285
Pro Phe Ser Val Asp Asp Val Arg Tyr Cys Gln Gly Gly Ser Asp Pro
290 295 300
Asn Cys Ile Ser Asp Ala Glu Gly Lys Ser Thr Thr Phe Ser Pro Tyr
305 310 315 320
Ser Ser Gln Gly Phe Asp Leu Ser Glu Ser Asn Met Glu Gln Gln Val
325 330 335
Leu Ser Arg Ser Pro His Gln Ser Lys Asp Gln Gln Gln Glu Asn Glu
340 345 350
Lys Gly Ala Phe Pro Tyr Leu Glu Ser Gln Ser Thr Ser Cys Leu Pro
355 360 365
Trp Gly Ile Leu Pro Pro Arg Phe Arg Leu Trp Glu Leu Phe Tyr Ser
370 375 380
His Arg Asp Tyr Phe Ile Arg Leu Gly Leu Cys Val Pro Lys Gly Asp
385 390 395 400
Leu Ser Gly Gly
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>17
gagacgcatg cttcacaagt atag 24
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>18
gtcacctcta gttaattaat cagattatct tgc 33
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>19
gtgccccatg atacgcctcc gg 22
<210>20
<211>26
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>20
gagtcgtatt tccaaggctc ctgacc 26
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>21
ggaggccatg aagtggacca acgg 24
<210>22
<211>45
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>22
caccgtgaaa gccatgctct ttccttcgtg tagaagacca gacag45
<210>23
<211>45
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>23
ctggtcttct acacgaagga aagagcatgg ctttcacggt gtctg 45
<210>24
<211>44
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>24
ctatatacac aactggattt accatgggcc cgcggccgca gatc44
<210>25
<211>44
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>25
gatctgcggc cgcgggccca tggtaaatcc agttgtgtat atag44
<210>26
<211>26
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>26
gtcgacatgg tgttttgatc atttta26
<210>27
<211>26
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>27
ccatggccag ttgtgtatat agagga26
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>28
tacacaactg gccatgcttc acaagtatag30
<210>29
<211>33
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>29
gtcacctcta gttaattaat cagattatct tgc 33
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>30
gagacacatg tttcacccag20
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>煙曲霉
<400>31
gtcacctcta gttaattaat cagttagttg agc 33
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>32
ccttgcccac gcctttggtt c 21
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>33
ctcatagcag caggcgaagc c 21
<210>34
<211>36
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>34
acacaactgg ccatgaaggt ctcgttcgtg tcatcg 36
<210>35
<211>35
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>35
agtcacctct agttatcagt agcaagcgct aatgg35
<210>36
<211>33
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>36
ccatggccat gatgaggttc cccagcgtgc tca 33
<210>37
<211>29
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>37
tttaattaag ccacggtctt gttggcttc 29
<210>38
<211>40
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>38
acacaactgg ccatgttgtg gcgtcgggcg ggtggcctct 40
<210>39
<211>47
<212>DNA
<213>Magnaporthe grisea
<400>39
agtcacctct agttaattaa ttagagctca tcctggccag gagccac 47
<210>40
<211>36
<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>40
acacaactgg ccatgatccg tttggggtat tctgcc 36
<210>41
<211>40
<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>41
agtcacctct agttaattaa ttactggcag gcagtgatat 40
<210>42
<211>36
<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>42
acacaactgg ccatgtattt ccttctctcc gtcatc 36
<210>43
<211>40
<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>43
agtcacctct agttaattaa tcagcctagt gggcaagcat 40
<210>44
<211>40
<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>44
acacaactgg ccatgacggt gtctcttgac agtttattcc 40
<210>45
<211>46
<212>DNA
<213>構(gòu)巢曲霉
<400>45
agtcacctct agttaattaa tcacccccct gacaaatctc ccttgg 4權(quán)利要求
1.具有脂肪酶活性的分離多肽，選自
(a)具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由至少在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽；和
(c)在SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽中包括的一個(gè)或多個(gè)氨基酸保守取代、缺失、和/或插入的變體。
2.權(quán)利要求1的多肽，具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少60％同一性的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的多肽，具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少65％同一性的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的多肽，具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少70％同一性的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4的多肽，具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少75％同一性的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求5的多肽，具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少80％同一性的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的多肽，具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少85％同一性的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求7的多肽，具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少90％同一性的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求8的多肽，具有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽有至少95％同一性的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽，其包括SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQID NO14、或SEQ ID NO16的氨基酸序列；或其具有脂肪酶活性的片段。
11.權(quán)利要求10的多肽，其包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求10或11的多肽，其包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽。
13.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的多肽，其由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ IDNO14、或SEQ ID NO16，或其具有脂肪酶活性的片段組成。
14.權(quán)利要求13的多肽，其由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16組成。
15.權(quán)利要求13或14的多肽，其由SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽組成。
16.權(quán)利要求1的多肽，其由至少在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼。
17.權(quán)利要求16的多肽，其由至少在中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼。
18.權(quán)利要求17的多肽，其由至少在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼。
19.權(quán)利要求1的多肽，其中該多肽是包括SEQ ID NO2的第25至396位氨基酸、SEQ ID NO4的第25至283位氨基酸、SEQ ID NO6的第20至318位氨基酸、SEQ ID NO8的第19至348位氨基酸、SEQ ID NO10的第25至393位氨基酸、SEQ ID NO12的第20至294位氨基酸、SEQ ID NO14的第25至308位氨基酸、或SEQ ID NO16的第26至404位氨基酸中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的變體。
20.權(quán)利要求1的多肽，其由包含于在大腸桿菌NRRL B-30773中的質(zhì)粒pSMO223、大腸桿菌NRRL B-30774中的質(zhì)粒pSMO224、大腸桿菌NRRLB-30772中的質(zhì)粒pHyGe026、大腸桿菌NRRL B-30781中的質(zhì)粒pCrAm138、大腸桿菌NRRL B-30779中的質(zhì)粒pBM135g、大腸桿菌NRRLB-30754中的質(zhì)粒pJLin170、大腸桿菌NRRL B-30755中的pJLin171、或大腸桿菌NRRLB-30780中的質(zhì)粒pBM141中的多核苷酸編碼。
21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的多肽，進(jìn)一步具有磷脂酶和/或半乳糖脂酶活性。
22.權(quán)利要求1-9、12、15、22、或23中任一項(xiàng)的多肽，其中該成熟多肽是SEQ ID NO2的第25至396位氨基酸、SEQ ID NO4的第25至283位氨基酸、SEQ ID NO6的第20至318位氨基酸、SEQ ID NO8的第19至348位氨基酸、SEQ ID NO10的第25至393位氨基酸、SEQ ID NO12的第20至294位氨基酸、SEQ ID NO14的第25至308位氨基酸、或SEQ ID NO16的第26至404位氨基酸。
23.權(quán)利要求1和16-18中任一項(xiàng)的多肽，其中該成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO1的第73至1256位核苷酸、SEQ ID NO3的第73至944位核苷酸、SEQ ID NO5的第58至1085位核苷酸、SEQ ID NO7的第55至1044位核苷酸、SEQ ID NO9的第73至1179位核苷酸、SEQ ID NO11的第58至1038位核苷酸、SEQ ID NO13的第73至1116位核苷酸、或SEQ ID NO15的第76至1280位核苷酸。
24.包括編碼權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。
25.權(quán)利要求24的分離多核苷酸，分別在SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ IDNO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中具有的至少一個(gè)突變，其中該突變的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ IDNO16的成熟多肽。
26.核酸構(gòu)建體，其包括與指導(dǎo)多肽在表達(dá)宿主中生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列可操作連接的權(quán)利要求24或25的多核苷酸。
27.包括權(quán)利要求26的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
28.包括權(quán)利要求26的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
29.用于生產(chǎn)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)在其野生型形式時(shí)能夠生產(chǎn)該多肽的細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。
30.用于生產(chǎn)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)包括包含編碼該多肽的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。
31.用于生產(chǎn)親本細(xì)胞突變體的方法，其包括使編碼權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)多肽的核苷酸序列斷裂或缺失，這導(dǎo)致該突變體比所述親本細(xì)胞產(chǎn)生較少的該多肽。
32.通過權(quán)利要求31的方法生產(chǎn)的突變體細(xì)胞。
33.權(quán)利要求32的突變體細(xì)胞，其進(jìn)一步包括編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。
34.用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求33的突變體細(xì)胞；以及(b)回收該蛋白質(zhì)。
35.分離多核苷酸，其通過(a)使DNA群體在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交；以及(b)分離編碼具有脂肪酶活性的多肽的雜交多核苷酸而獲得的。
36.權(quán)利要求35的分離多核苷酸，其通過(a)使DNA群體在中-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交；以及(b)分離編碼具有脂肪酶活性的多肽的雜交多核苷酸而獲得。
37.權(quán)利要求36的分離多核苷酸，其通過(a)使DNA群體在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交；以及(b)分離編碼具有脂肪酶活性的多肽的雜交多核苷酸而獲得。
38.權(quán)利要求35的分離多核苷酸，其中該成熟多肽編碼序列是SEQ IDNO1的第73至1256位核苷酸、SEQ ID NO3的第73至944位核苷酸、SEQ IDNO5的第58至1085位核苷酸、SEQ ID NO7的第55至1044位核苷酸、SEQID NO9的第73至1179位核苷酸、SEQ ID NO11的第58至1038位核苷酸、SEQ ID NO13的第73至1116位核苷酸、或SEQ ID NO15的第76至1280位核苷酸。
39.用于生產(chǎn)具有突變核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括(a)將至少一個(gè)突變導(dǎo)入SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、或SEQ ID NO15的成熟多肽編碼序列，其中該突變的核苷酸序列編碼分別由SEQ ID NO2、SEQID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、或SEQ ID NO16的成熟多肽組成的多肽，以及(b)回收包括該突變的核苷酸序列的多核苷酸。
40.通過權(quán)利要求39的方法生產(chǎn)的突變多核苷酸。
41.用于生產(chǎn)多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)包括編碼該多肽的權(quán)利要求40的突變多核苷酸的細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。
42.包括編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建體，其中該基因可操作地連接至編碼信號肽的核苷酸序列，所述信號肽包括、或由SEQ ID NO1的第1至72位核苷酸、SEQ ID NO3的第1至72位核苷酸、SEQ ID NO5的第1至57位核苷酸、SEQ ID NO7的第1至54位核苷酸、SEQ ID NO9的第1至72位核苷酸、SEQ ID NO11的第1至57位核苷酸、SEQ ID NO13的第1至72位核苷酸、SEQ ID NO15的第1至75位核苷酸組成，其中該基因?qū)τ谠摵塑账嵝蛄惺峭庠吹摹?br> 43.包括權(quán)利要求42的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
44.包括權(quán)利要求42的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
45.用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求44的重組宿主細(xì)胞；以及(b)回收該蛋白質(zhì)。
46.用于生產(chǎn)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)多肽的方法，包括(a)在有助于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)包括編碼具有脂肪酶活性多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；以及(b)回收該多肽。
47.轉(zhuǎn)基因的植物、植物部分或植物細(xì)胞，其已經(jīng)用編碼權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
48.包括權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的多肽和表面活性劑的去污劑組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有脂肪酶活性的分離多肽和編碼該多肽的分離多核苷酸。本發(fā)明也涉及包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法。
文檔編號C12N9/20GK101084307SQ20058004108
公開日2007年12月5日 申請日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者蘇珊娜·奧塔尼, 戴比·亞弗, 戈海燕, 林長慧, 克里斯托弗·阿莫洛, 金·博爾奇, 沙姆坎特·A·帕特卡, 邁克爾·拉姆薩, 芭芭拉·徹里 申請人:諾維信股份有限公司, 諾維信公司