專利名稱：一株產(chǎn)生抗生素的海南小單孢菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株產(chǎn)生抗生素的海南小單孢菌，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗生素是醫(yī)院臨床中應(yīng)用最廣泛的藥物，對(duì)控制、預(yù)防和治療各種感染性疾病具有重要作用。近年來耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus arueus，MRSA)的分離率不斷升高，同時(shí)臨床上可供選擇的藥物極少，MRSA已成為難以治療的“超級(jí)細(xì)菌”，極大地危害著人類健康，人們必須不斷尋找新的藥源。
占地球生物資源80％的海洋生物，擁有豐富的代謝途徑，可產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)特殊、作用獨(dú)特的代謝產(chǎn)物，是新型活性物質(zhì)的重要來源。獨(dú)特的海洋環(huán)境使海洋微生物在物種、基因組成和生態(tài)功能上呈現(xiàn)較高的多樣性，被譽(yù)為天然藥物的資源“寶庫”，是當(dāng)前倍受重視的天然藥物的新資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一株能夠產(chǎn)生抗生素的小單孢菌屬新種。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一株能夠產(chǎn)生抗生素的海南小單孢菌(Micromonospora hainanensis sp.nov.)AM105，保藏號(hào)為CGMCC No.1551。
海南小單孢菌CGMCC No.1551是由南海海底沉積物中分離得到的野生放線菌，經(jīng)菌種選育后得到。
海南小單孢菌CGMCC No.1551具有以下微生物特性(1)形態(tài)與培養(yǎng)特性該菌種在多種培養(yǎng)基上，都能形成發(fā)育良好的基內(nèi)菌絲，基絲橙色(表1)。在燕麥汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，有一個(gè)或多個(gè)孢子形成的孢子鏈，孢子梗長短不一，孢子表面光滑，形狀不規(guī)則(圖1和圖2)。
表1海南小單孢菌的培養(yǎng)特征


(2)生理生化特征常用的9種碳源中，只利用葡萄糖，不利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-甘露醇、蔗糖、棉子糖和肌醇。不液化明膠，不產(chǎn)生H2S和類黑色素，淀粉水解陽性，能利用纖維素，硝酸鹽還原陽性，牛奶不凝固，不胨化。
(3)細(xì)胞壁化學(xué)組分分析全細(xì)胞水解液含meso-DAP(meso-二氨基庚二酸，Diaminopimelic acid)和甘氨酸，胞壁II型；含木糖、阿拉伯糖，糖型D。
(4)本發(fā)明所述的海南小單孢菌，其16S rDNA序列如下AGAGTTTGATCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTAGGCTTTGGGATAACCCTCGGAAACGGGGGCTAATACCGGATATGACCTTCTTCCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGTTTTTCGGCCTGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGGGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTCCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGACCGTGAAAACTTGGGGCTCAACCCCAAGCCTGCGGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGACATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGGCCTCTCCGGTTTCCTGTGCCCGCACTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAA
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本發(fā)明涉及的海南小單孢菌CGMCC No.1551，經(jīng)多項(xiàng)分類鑒定，確定為小單孢菌屬的一個(gè)新種，命名為海南小單孢菌(Micromonospora hainanensis sp.nov)，已于2005年12月5日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了菌種保藏，并證明存活，其保藏登記號(hào)為CGMCC No.1551。保存地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該海南小單孢菌產(chǎn)生的抗生素對(duì)多種G+、G-細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，尤其對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和結(jié)核分支桿菌有明顯抑制作用。
下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1為本發(fā)明所述菌株的菌絲和孢子絲形態(tài)，1500×。
圖2為本發(fā)明所述菌株的菌絲和孢子絲形態(tài)，10000×。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1海南小單孢菌CGMCC No.1551的選育將自然分離的海南小單孢菌，通過自然選育得到一株菌落大而飽滿的菌株，顏色為橙色。以此菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變10～60s，取得了較好的誘變效果，得到一株CGMCC No.1551，其發(fā)酵液對(duì)MRSA的抑菌圈直徑由19mm增加到40mm，是出發(fā)菌株的2.1倍。
實(shí)施例2海南小單孢菌CGMCC No.1551的培養(yǎng)培養(yǎng)條件(1)斜面培養(yǎng)培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基酵母粉O.4％，麥芽粉1％，葡萄糖0.4％，瓊脂2％，pH7.2，培養(yǎng)溫度28℃。
(2)種子培養(yǎng)從斜面挑取經(jīng)活化的單菌落接入種子液中，28℃200rpm搖瓶培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)基葡萄糖1％，大豆粉1％，酵母膏1％，可溶性淀粉O.5％，KH2PO40.05％，天然陳海水配制，pH7.2。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)按10％的接種量接入種子培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基葡萄糖0.5％，淀粉1.5％，大豆粉1％，酵母膏0.5％，K2HPO40.025％，用50％天然陳海水(新鮮海水靜置一周后)與50％蒸餾水配制，初始pH值7.2，28℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
實(shí)施例3海南小單孢菌CGMCC No.1551的培養(yǎng)將活化的CGMCC No.1551置于搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，相應(yīng)培養(yǎng)基同實(shí)施例2，條件是溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)45h。以8％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基使用天然純海水配制，28℃200rpm培養(yǎng)7天。
實(shí)施例4.藥效學(xué)驗(yàn)證一.抗生素的獲得按實(shí)施例3的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液進(jìn)行如下處理1.收集在第6天終止發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物，8000r/min離心10min，收集上清液。
2.采用適量乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行4～5次萃取，合并萃取液減壓濃縮得抗生素粗品。
3.采用硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯6∶1→3∶1→1∶1→100％乙酸乙酯梯度洗脫，分部收集洗脫液。
4.減壓濃縮，收集活性峰，經(jīng)Sephadex LH20柱層析，得到較純的抗生素粗品。
二.抗菌試驗(yàn)采用平皿二倍稀釋法測(cè)定得到的抗生素樣品對(duì)多個(gè)檢測(cè)菌株的最小抑制濃度MIC，結(jié)果見表2。可以看出，該海南小單孢菌產(chǎn)生的抗生素對(duì)多種G+細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，尤其對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和結(jié)核分支桿菌有明顯抑制作用，對(duì)G-細(xì)菌也存在一定的抑制。
表2海南小單孢菌產(chǎn)生抗生素的抑菌活性測(cè)定

注MRSA1耐甲氧西林、紅霉素、環(huán)丙沙星、丁胺卡那；MRSA2耐甲氧西林、紅霉素、四環(huán)素；MRSA3耐甲氧西林、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、丁胺卡那；MRSA4耐甲氧西林、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、紅霉素；MRSA5耐甲氧西林、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星；MRSA6耐甲氧西林、紅霉素、四環(huán)素；MRSA7耐甲氧西林、紅霉素、四環(huán)素；MRSA8耐甲氧西林、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、丁胺卡那。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)生抗生素的海南小單孢菌，保藏號(hào)為CGMCC No.1551。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)生抗生素的海南小單孢菌，保藏號(hào)為CGMCC No.1551。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所述的海南小單孢菌產(chǎn)生的抗生素對(duì)多種G
文檔編號(hào)C12R1/29GK1818056SQ20051013559
公開日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者黃惠琴, 鮑時(shí)翔, 胡永華, 吳碧文, 孫前光, 方哲 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所