專利名稱：一種消除皮膚皺紋生物制劑的配制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬組織工程領(lǐng)域，涉及皮膚膠原蛋白形成細(xì)胞的分離和規(guī)模體外培養(yǎng)的方法，以及和肉毒毒素A的組合配方，可用于人皮膚動(dòng)力性皺紋的治療。
背景技術(shù)：
皺紋的發(fā)生歸結(jié)起來有4個(gè)原因自然老化、地心引力作用、陽光中紫外線照射使皮膚發(fā)生光老化與光損傷和面部表情肌過多的收縮。其中面部表情肌過多的收縮產(chǎn)生的皺紋稱動(dòng)力性皺紋。主要表現(xiàn)為眶外側(cè)的魚尾紋，額頭紋和眉間紋、鼻唇溝紋和唇上紋和頸闊肌紋。除皺有許許多多的辦法，局部外用各種各樣的除皺霜、抗皺霜、防曬霜只能改善外觀，它對(duì)皺紋的消除不會(huì)有較大的作用。醫(yī)用膠原注射充填術(shù)有效，但因?yàn)槭欠亲陨砦镔|(zhì)，只能存在幾個(gè)月就會(huì)被機(jī)體清除，同時(shí)注射后會(huì)有一定的過敏反應(yīng)。整形外科醫(yī)生們常采用化學(xué)剝皮術(shù)、皮膚磨削術(shù)、激光重塑術(shù)和面部整形拉皮除皺術(shù)等。病人都需要住院，需要麻醉，手術(shù)煩瑣，常常需要經(jīng)受巨大的痛苦，還需要經(jīng)過一段皮膚恢復(fù)創(chuàng)傷愈合的過程，價(jià)格又非常昂貴，做得不好既有遺憾的色素沉著，又發(fā)生令人不愉快的副作用、并發(fā)癥和后遺癥。近年來美容醫(yī)學(xué)界有兩項(xiàng)技術(shù)令人矚目，一種是A型肉毒毒素注射除皺，另一種是采用自體膠原蛋白形成細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后注射美容除皺，此技術(shù)已取得了極大的成功。肉毒毒素注射除皺技術(shù)是通過阻斷神經(jīng)肌肉的傳導(dǎo)沖動(dòng)使肌肉麻痹松弛而起作用。有以下特點(diǎn)1.療效快、療效高。2.副作用少又輕，且為一過性，無全身系統(tǒng)性副作用，故安全、可靠。3.操作方便，在門診條件下即可進(jìn)行，不需要住院，不需要麻醉。4.病人痛苦小，屬于非創(chuàng)傷性治療。5.治療費(fèi)用少，價(jià)格低廉。6.病人易于接受。7.操作簡(jiǎn)單，易于推廣普及。不足之處沒有根本消除皺紋，可影響面部表情肌引起的表情的不自然，此外維持時(shí)間較短，一次注射后可維持平均4個(gè)月；顯效3個(gè)月后會(huì)由于新的神經(jīng)形成會(huì)逐漸恢復(fù)肌肉的收縮功能，動(dòng)力性皺紋重新出現(xiàn)。雖然可重復(fù)注射治療，但由于肉毒毒素也是一種抗原，反復(fù)注射會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生抗體而失去作用。因此需要和一種能夠長期起效，不會(huì)產(chǎn)生抗體的生物材料聯(lián)合作用方能珠聯(lián)璧合。自體膠原蛋白形成細(xì)胞美容除皺技術(shù)是近幾年國際上突破的另一項(xiàng)重要生物技術(shù)。其原理是采用受術(shù)者自體的皮膚組織，通過組織工程技術(shù)，從中分離出膠原蛋白形成細(xì)胞，放到無菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分化后再回輸?shù)绞苄g(shù)者臉部皺紋、凹陷性疤痕的真皮層下，使真皮層膠原蛋白密度和厚度增加，恢復(fù)皮膚彈性，填平皺紋和疤痕。這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞取自受術(shù)者自身，無任何排異反應(yīng)；細(xì)胞輸入自體的生長環(huán)境，在自體的調(diào)控下既不過度生長，又可以長期存活、擴(kuò)充，源源不斷產(chǎn)生膠原蛋白，這種美容除皺形態(tài)自然、作用長久。唯一不足之處是起效時(shí)間長，需時(shí)2-3個(gè)月這些新輸入的細(xì)胞分泌的膠原蛋白才能積累到開始顯效的程度。如果將上述兩種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，可以相互取長補(bǔ)短，相得益彰。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一，利用肉毒毒素注射技術(shù)顯效快的特點(diǎn)，克服了自體細(xì)胞注射除皺美容起效慢的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的之二，利用自體細(xì)胞的自然特性，克服了肉毒毒素除皺技術(shù)不能持久，表情不自然以及可能有的過敏反應(yīng)的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的之三，利用這兩種技術(shù)的組合，治療額頭紋、眉間紋、眼角魚尾紋鼻唇溝紋和唇上紋等人體皮膚動(dòng)力性皺紋；同時(shí)克服其它幾種除皺技術(shù)不能消除頸闊肌橫紋的缺陷。
具體實(shí)施例方式
(一)皮膚膠原蛋白形成細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，其特征在于以下步驟首先無菌從耳后或前臂內(nèi)側(cè)皮膚細(xì)嫩處取一塊約0.5cm寬，2cm長的皮膚，放入特制的保存液(100u/ml青、鏈霉素的M199培養(yǎng)液)中，放入預(yù)凍有冰的冰壺內(nèi)，迅速(通常8小時(shí)內(nèi))送交專業(yè)實(shí)驗(yàn)室分離。
將皮膚取出，放入50mm無菌塑料平皿內(nèi)，用無菌眼科剪除去多余的皮下組織和脂肪；然后用含青、鏈霉素(100u/ml)的磷酸鹽緩沖液洗液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗數(shù)次，洗去皮膚表面的血污和毛發(fā)。
將皮膚轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板，用2ml預(yù)冷的pH7-9Hank’s液配制的0.1-1％的胰酶4-16C消化6-24小時(shí)。
輕吸棄消化液，加入預(yù)冷的2ml含10％胎牛血清的M199培養(yǎng)液，終止消化反應(yīng)，用力吹打分散細(xì)胞，靜置10分鐘，取中間無明顯組織塊的懸液于新孔，37C，5％CO2，(SANYO公司)靜置培養(yǎng)。
培養(yǎng)3-7天，待膠原蛋白形成細(xì)胞生長鋪滿50-70％孔時(shí)，吸棄生長液，磷酸鹽緩沖液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的消化液，37C，消化10分鐘。吸棄消化液，換7ml新生長液重新懸浮細(xì)胞并傳入T25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Nunc公司)，37C，5％CO2，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。
視情況3-4天換液一次，一周傳代，每次傳2-3瓶。
待細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)至108，0.85％的生理鹽水漂洗1次后，加入2～5ml消化液，37C，消化10分鐘，吸棄消化液，0.85％的生理鹽水吹打重懸并離心漂洗4次，最終重懸于2-4ml生理鹽水中備用。
(二)與肉毒毒素A配伍根據(jù)所治療的皺紋大小深淺及數(shù)量的多少，用生理鹽水溶解稀釋，最終取2.5-55單位的肉毒毒素A(蘭州生物制品所生產(chǎn))用已制備的細(xì)胞懸液稀釋備用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明由于采用兩種最新除皺技術(shù)的有機(jī)組合，保持了兩種原技術(shù)簡(jiǎn)便易行、無明顯痛苦、無副作用或作用小的優(yōu)點(diǎn)。充分利用了肉毒毒素注射技術(shù)顯效快的特點(diǎn)，避免了自體膠原蛋白形成細(xì)胞注射除皺美容起效慢的缺點(diǎn)。利用自體膠原蛋白形成細(xì)胞的自體、自然特性，克服了外來肉毒毒素除皺技術(shù)作用不能持久、因表情肌麻痹引起的表情不自然、反復(fù)注射產(chǎn)生抗體失去功效以及可能有的其它副作用的缺點(diǎn)。此外還基本克服了其它幾種除皺技術(shù)治療頸闊肌紋效果不佳的缺陷。
權(quán)利要求
1.一種消除皮膚皺紋生物制劑的配制，其特征在于以下步驟(1)首先采用無菌技術(shù)從耳后或前臂內(nèi)側(cè)皮膚細(xì)嫩處取一塊約0.5cm寬，2cm長的皮膚，放入特制的保存液(100u/ml青、鏈霉素的M199培養(yǎng)液)中，放入預(yù)凍有冰的冰壺內(nèi)，迅速(通常8小時(shí)內(nèi))送交專業(yè)實(shí)驗(yàn)室分離。(2)將上述皮膚取出，放入50mm無菌塑料平皿內(nèi)，用無菌眼科剪除去多余的皮下組織和脂肪；然后用含青、鏈霉素(100u/ml)的磷酸鹽緩沖液洗液(pH7.40.01M PBS)漂洗數(shù)次，洗去皮膚表面的血污和毛發(fā)。(3)將處理后的皮膚轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板，用2ml預(yù)冷的pH7-9Hank’s液配制的0.1-1％的胰酶4-16C消化6-24小時(shí)。(4)輕吸棄消化液，加入預(yù)冷的2ml含10％胎牛血清的M199培養(yǎng)液，終止消化反應(yīng)，用力吹打分散細(xì)胞，靜置10分鐘，取中間無明顯組織塊的懸液于新的培養(yǎng)孔，37C，5％CO2，(SANYO公司)靜置培養(yǎng)。(5)培養(yǎng)3-7天，待膠原蛋白形成細(xì)胞生長鋪滿50-70％孔時(shí)，吸棄生長液，磷酸鹽緩沖液(pH7.40.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的消化液，37C，消化10分鐘。吸棄消化液，換7ml生長液重新懸浮細(xì)胞并傳入T25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Nunc公司)，37℃，5％CO2，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。(6)視情況3-4天換液一次，一周傳代，每瓶傳2-3瓶。(7)待細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)至108，0.85％的生理鹽水漂洗1次后，再加入2～5ml消化液，37C，消化10分鐘，吸棄消化液，0.85％的生理鹽水吹打重懸并離心漂洗4次，最終重懸于2-4ml生理鹽水中備用。
2.上述細(xì)胞與肉毒毒素A配伍根據(jù)所治療的皺紋大小深淺及數(shù)量的多少，用生理鹽水溶解稀釋，最終取2.5-55單位的肉毒毒素A(蘭州生物制品所生產(chǎn))用已制備好的細(xì)胞懸液稀釋成2-4ml備用。
3.采用以上分離培養(yǎng)的自體細(xì)胞加肉毒毒素配方可用于并不局限于額頭紋、眉間紋、眼角魚尾紋鼻唇溝紋和唇上紋和頸闊肌紋等人體皮膚動(dòng)力性皺紋的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種消除人體皮膚皺紋的生物制劑的配方和制備。包括現(xiàn)行的自體膠原蛋白形成細(xì)胞的制備方法及與肉毒毒素A的聯(lián)合應(yīng)用，屬于組織工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用胰酶消化法成功的從成年人體表皮膚中分離獲得了純凈的膠原蛋白形成細(xì)胞并規(guī)模化培養(yǎng)至上千萬個(gè)活性膠原形成細(xì)胞，可供皮膚美容除皺、疤痕修復(fù)、皮膚組織填充、皮膚損傷后修復(fù)及燒傷后人工復(fù)合皮膚的制備及其它目的所需。本發(fā)明采用上述自體細(xì)胞與商品化的肉毒毒素A聯(lián)合配伍，配成新的美容除皺的針劑可以用于人體表皮膚皺紋尤其是動(dòng)力性皺紋的治療。最終效果自然、持久無嚴(yán)重副作用。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1951497SQ20051011420
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者張永國, 呂偉光 申請(qǐng)人:張永國, 呂偉光