專利名稱：用于基于酶電化學(xué)的傳感器的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及傳感器，尤其涉及基于酶電化學(xué)的傳感器。
2.相關(guān)技術(shù)的說明近年來，將采用氧化還原介體(如二茂鐵)、氧化還原酶(如葡萄糖氧化酶)和電極的基于酶電化學(xué)的傳感器用于液體樣品中被分析物的檢測逐漸引起了人們的高度興趣。據(jù)信，這樣的基于酶電化學(xué)的傳感器尤其適合連續(xù)或半連續(xù)監(jiān)測體液樣品(如血液或組織液)中的被分析物(如葡萄糖)。例如，采用氧化還原介體、氧化還原酶和工作電極的基于酶電化學(xué)的葡萄糖傳感器可采用相對低的電勢(如，小于0.4V對于SCE)來確定(如測量)葡萄糖的濃度，由此限制了對于工作電極的干擾反應(yīng)。基于酶電化學(xué)的傳感器的進一步描述參見例如US專利No.5,089112和6,284,478。所有的文獻在此引作參考。
在氧化還原酶的氧化還原中心周圍的蛋白質(zhì)可以阻止電子從基于酶電化學(xué)的傳感器的氧化還原酶直接轉(zhuǎn)移到電極。因此，在典型的基于酶電化學(xué)的傳感器中，氧化還原介體用于促使電子在基于酶電化學(xué)的傳感器的氧化還原酶和電極之間進行轉(zhuǎn)移。在這種情況下，氧化還原酶在被氧化和被還原狀態(tài)之間進行循環(huán)，所述的循環(huán)受被分析物的存在、氧化還原介體和電極表面驅(qū)使。如此循環(huán)的凈結(jié)果為在電極表面電子要么被接受要么被供給，而氧化還原酶基本上保持其原有的氧化狀態(tài)和催化特性。
作為需要長期穩(wěn)定性的基于酶電化學(xué)的傳感器，例如連續(xù)或半連續(xù)的基于電化學(xué)的葡萄糖傳感器，不使氧化還原介體和氧化還原酶從電極附近浸出是必要的。因此，在基于酶電化學(xué)的傳感器中，使用易浸出的氧化還原介體(例如易浸出的鐵氰化物、苯醌和低分子量的醌衍生物、二茂鐵、低分子量的二茂鐵衍生物、釕絡(luò)合物和鋨絡(luò)合物)是不理想的。此外，如果氧化還原介體是一種對人體或其他對象有害的物質(zhì)，則氧化還原介體浸出而進入人體或其他對象體內(nèi)，這是不希望的，因而需要避免。
進一步地，基于酶電化學(xué)的傳感器的氧化還原酶和介體必須能夠便于彼此相互作用，并且氧化還原介體必須能夠與基于酶的電傳感器的電極交換電子。換言之，既應(yīng)當(dāng)保持氧化還原酶和氧化還原介體的活性，又要防止其不慎浸出的發(fā)生。
為了防止氧化還原介體的浸出，有人提出了用于基于電化學(xué)的傳感器的化學(xué)組合物，其中氧化還原介體通過化學(xué)方式結(jié)合到氧化還原酶上。但是，所述化學(xué)組合物的氧化還原酶仍然具有酶活性降低的不利的缺點。
另一方面，氧化還原介體已被附著到水不溶性的合成的聚合物鏈上，例如聚硅氧烷上，以防止浸出。但是，由于所述的化學(xué)組合物疏水性質(zhì)，導(dǎo)致其柔韌性差，因而引起介體活性降低。此外，將氧化還原介質(zhì)附著到水不溶性合成的聚合物鏈上并未直接提出需要防止用于基于酶電化學(xué)的傳感器中的氧化還原酶的浸出。
因此，用于能夠防止氧化還原介質(zhì)和氧化還原酶從電化學(xué)傳感器的電極附近浸出，而同時保持氧化還原介質(zhì)和氧化還原酶的足夠的活性的基于酶電化學(xué)的傳感器的化學(xué)組合物，在本領(lǐng)域中仍然是非常需要的。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的實施方式，離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物可以防止氧化還原介體和氧化還原酶不慎從基于電化學(xué)的傳感器的附近浸出，而同時保持氧化還原介體和氧化還原酶的足夠的活性。
根據(jù)本發(fā)明的實施方式，用于基于酶電化學(xué)傳感器的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物包括具有離子部分(例如并入到親水性聚合物骨架的離子單體)的親水性聚合物和大量附著的氧化還原介體。氧化還原介體可以，例如，以懸置(pendant)方式共價地結(jié)合在親水性聚合物上。
離子性親水性的氧化還原介體的分子量足夠高，使氧化還原聚合物具有很強的親和性，易于固定，易于結(jié)合，和/或易于位于基于酶電化學(xué)的傳感器的電極(如碳工作電極)附近。因此，本發(fā)明的離子性親水性的氧化還原聚合物典型的分子量大于16Kg/mol。
根據(jù)本發(fā)明的實施方式，離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物的離子特性促進其與帶電的氧化還原酶(例如葡萄糖氧化酶)牢固締合。這種牢固的締合最大程度地減少了氧化還原酶的浸出，提高了氧化還原酶和氧化還原介體之間的活性。
根據(jù)本發(fā)明的實施方式，離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物可以通過例如，含介體的單體(例如乙烯基二茂鐵(VFc))、親水性單體和離子單體的自由基共聚合而合成。在所述合成中，親水性單體可用于合成氧化還原聚合物中親水性聚合物骨架的主要部分。制得的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物的親水特性提供了離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物在水溶液(例如水質(zhì)體液)中的膨脹和/或溶解性質(zhì)。
應(yīng)用離子單體致使離子部分(例如帶電荷的官能度)并入到離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物上，而應(yīng)用含介體的單體致使介體并入到離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物上。
附圖簡述通過參考下列提出了例舉性的實施方式的詳細說明，將會對本發(fā)明的特征以及優(yōu)勢有更好的理解，所述實施方式利用了本發(fā)明的原理以及下列附圖

圖1表示在基于酶電化學(xué)的傳感器的氧化還原酶和電極附近，根據(jù)本發(fā)明的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物的實施例的簡單示意圖。
圖2表示用于合成根據(jù)本發(fā)明實施例的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物的反應(yīng)順序的簡單示意圖。
圖3A代表采用順序刺破的葡萄糖藥包測試的根據(jù)本發(fā)明實施例的包括陽離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物的基于酶電化學(xué)的葡萄糖傳感器的瞬變電流反應(yīng)。
圖3B表示對應(yīng)于圖3A的瞬變電流反應(yīng)的校正曲線。
發(fā)明詳述為了保持本發(fā)明的整個說明書的一致性以及為了清楚地理解本發(fā)明，將提到的術(shù)語作如下定義術(shù)語“氧化還原介體”是指具有電極表面和氧化還原酶的能進行還原(接受電子)或氧化(供給電子)的化學(xué)部分。
術(shù)語“氧化還原酶”是指能特異性地催化底物分子的氧化或還原的生化試劑。
術(shù)語“親水性”是指對水或水質(zhì)溶液具有高度親和性的化學(xué)物質(zhì)或亞基。因此，親水化合物易于被吸引、溶解或吸收在水或水質(zhì)溶液中。
術(shù)語“氧化還原聚合物”指被合成或改性(例如衍化)的包括至少一個氧化還原介體的聚合物。
圖1表示用于基于酶電化學(xué)的傳感器的陽離子性親水性高分子量氧化還原聚合物100的簡單示意圖。圖1描述了在基于酶電化學(xué)的傳感器的電極(E)和帶負電荷的氧化還原酶(RE)附近的陽離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物100。在圖1中氧化還原酶RE的負電荷用“-”表示，而氧化還原酶RE的氧化還原中心用大寫“A”表示。
陽離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物100包括具有離子部分120(在圖1中用“+”表示)和大量附著的氧化還原介體130(在圖1中用“M”表示)的親水性聚合物骨架110。本領(lǐng)域技術(shù)人員一旦獲悉本發(fā)明的公開內(nèi)容，將會認(rèn)識到盡管作為一個整體考慮，陽離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物100和親水性聚合物骨架110是親水的，但是離子部分120和氧化還原介體不需要必須是親水的。
陽離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物100的分子量典型地高于16Kg/mol。在這一點上，應(yīng)當(dāng)注意到相對高分子量并不必然導(dǎo)致在陽離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物和電極之間具有永久的高親和力。但是，如果陽離子性親水性高分子量氧化還原聚合物不位于電極附近，則高分子量與相對低的溶解速率及有益地緩慢浸出相關(guān)聯(lián)。
親水性聚合物骨架110可以通過本領(lǐng)域公知的任何適宜的親水性聚合物形成。例如，親水性聚合物骨架110可以通過親水性的丙烯酰胺單體(AAM)形成。用于本發(fā)明實施方式的可替代的親水性單體包括，但不限于，具有可聚合的丙烯酸酯或乙烯基基團的親水單體，例如甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸甘油酯、N-乙烯基吡咯烷酮和N-異丙基丙烯酰胺。
離子部分120可以是本領(lǐng)域公知的任何適宜的離子部分，包括例如，并入到親水性聚合物骨架110中的陽離子單元(例如單體)。適宜的陽離子單體包括，但不限于，[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨(AETMAC)。適宜用于本發(fā)明的可替代的陽離子單體包括季銨陽離子單體和叔銨陽離子單體，例如(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化銨、[3-(甲基丙烯?；被?丙基]三甲基氯化銨、[(2-甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨、乙烯基芐基三甲基氯化銨、甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙基酯和甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙基酯。
如果需要，本發(fā)明的陰離子性親水性高分子量氧化還原聚合物的實施方式可以通過將適合的陰離子部分并入到親水性聚合物骨架上而形成。適合的陰離子部分包括，例如，羧酸單體(例如丙烯酸、甲基丙烯酸和馬來酐單體)。陰離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物可以有利地與陽離子氧化還原酶一起應(yīng)用。例如，葡萄糖脫氫酶(GDH)在pH為7時具有弱陽離子性。
氧化還原介體130可以，例如，以懸置方式共價地結(jié)合到親水性聚合物骨架110上。氧化還原介體130可以是本領(lǐng)域公知的任何適合的氧化還原介質(zhì)，包括但不限于二茂鐵(Fc)、鋨絡(luò)合物、醌、鐵氰化物、亞甲基藍8、2，6-二氯靛酚、硫堇、花青和靛酚。
在測量水溶液(如血液和ISF)中的被分析物(如葡萄糖)時，陽離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物100的親水性促進了氧化還原介體130和氧化還原酶RE之間的有益的相互作用以進行電子交換，也促進了氧化還原介體130和電極E之間的有益的相互作用以進行電子交換。此外，陽離子性的高分子量氧化還原聚合物100的陽離子特性加強了與帶負電荷(如陰離子)的氧化還原酶RE的相互作用。
根據(jù)本發(fā)明的實施方式，離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物的相對高的分子量有助于它們以一定的方式用于基于酶電化學(xué)的傳感器，這種方式防止氧化還原介體和/或氧化還原酶的不慎浸出。例如，高分子量可有助于加強與基于酶電化學(xué)的傳感器的電極的親和性。
圖2表示按照本發(fā)明的具體實施方式
合成離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物200的一步反應(yīng)順序的簡單示意圖。所述反應(yīng)順序涉及丙烯酰胺(AAM)、乙烯基二茂鐵(VFc)和[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨(AETMAC)的共聚合反應(yīng)，如圖2所示。圖2的反應(yīng)順序是在70℃下使用2-2’-偶氮二異丁腈作引發(fā)劑進行的。
從圖2的反應(yīng)順序得到的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物200可以具有例如大約110Kg/mol(通過凝膠滲透色譜法(GPC)測定的重均分子量)的高分子量。
應(yīng)當(dāng)注意的是AAM被用于圖2的反應(yīng)順序中是由于AAM具有相對高的鏈增長率系數(shù)，這有助于相對高分子量的氧化還原聚合物的形成。
在圖2中，AAM、VFc和AETMAC的相對摩爾份數(shù)分別由m、n和p表示。在這方面，m可以例如在約84至約99的范圍內(nèi)，n可以例如在約1至約6的范圍內(nèi)，p可以例如在將近0至約10的范圍內(nèi)。
離子性親水性高分子量氧化還原聚合物200的物理構(gòu)象具有高柔韌性，以至其部分可以在氧化還原酶的氧化還原中心與基于酶電化學(xué)的傳感器之間進行分段式擴散(segmentally diffuse)以實現(xiàn)快速的電子交換。在此，術(shù)語“分段式擴散”是指能溶劑化并在周圍運動同時仍然附著(栓)(tethered)在離子性高分子量氧化還原聚合物的部分(例如含氧化還原介體的部分)。
離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物200的陽離子部分促進了與帶負電荷的氧化還原酶(例如，葡萄糖氧化酶)的親和性。在這方面，已觀察到當(dāng)離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物200和葡萄糖氧化酶在水質(zhì)溶液中進行混合時，它們之間的親和性是以絮凝形式存在的。這樣的親和力使電子在氧化還原介體和氧化還原酶之間快速交換，因為離子電荷提供了與氧化還原酶的氧化還原中心(也稱為氧化還原酶活性中心)的密切接觸。
實施例1 離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物的合成圖2中的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物200是通過在40mL的二噁烷和乙醇(1/1v/v)混合物中，由1.8g的丙烯酰胺(AAM)、0.7g的80％的[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨(AETMAC)、0.3g的乙烯二茂鐵(VFc)和0.03g的2，2’-偶氮二異丁腈反應(yīng)液的自由基共聚反應(yīng)合成的。所述反應(yīng)在圓底燒瓶中完成。
在引發(fā)反應(yīng)前，通過用氮氣鼓泡將反應(yīng)液脫氧1小時。隨后在氮氣氛圍中在連續(xù)的磁力攪拌下在油浴中將反應(yīng)液加熱至70℃保持24小時。將制得的聚合物沉淀過濾出來，并反復(fù)用丙酮沖洗，得到純凈的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物200。隨后將純凈的樣品在50℃的爐中干燥。
通過用去離子水滲析將純化干燥的樣品中的相對低分子量部分除去。滲析采用分子量截止值為16Kg/mol的纖維素膜滲析管。
實施例2 采用離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物的基于酶電化學(xué)的葡萄糖傳感器電極的制備基于酶電化學(xué)的葡萄糖傳感器電極是通過在碳電極(大小2.25mm×2.25mm)上施用0.5μL的1％(w/v)的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物200(與上述實施例1的制備方法相同)的水溶液，之后在50℃的爐中干燥5分鐘以形成氧化還原聚合物包覆的電極。然后，在氧化還原聚合物包覆的電極上施用在磷酸緩沖鹽水(PBS)中的1μL的10％(w/v)的葡萄糖氧化酶溶液，然后在50℃爐中干燥10分鐘。
在1mL 2-異丙醇中將含有52mg的聚氮丙啶(PEI)和106mg的聚丙二醇二環(huán)氧甘油醚(PPGDGE)的溶液混合。之后，將0.8μL如上述剛剛制備的PEI/PPGDGE混合物施用到電極上，并且在50℃爐中干燥30分鐘。PEI和PPGDGE形成交聯(lián)的滲析膜，該滲析膜在電極附近截留了離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物200和葡萄糖氧化酶(一種氧化還原酶)，而允許小分子量被分析物，例如葡萄糖透過滲析膜。
實施例3 實施例2的基于酶電化學(xué)的傳感器電極的測試實施例2的電化學(xué)葡萄糖傳感器電極是在PBS中在三電極傳感器系統(tǒng)中作為工作電極，在0mM至15mM的葡萄糖濃度范圍內(nèi)進行測試的。三電極傳感器系統(tǒng)包括工作電極、反電極和參比電極。
對于在室溫下向大氣開放并且處于溫和的磁力攪拌下的三電極傳感器系統(tǒng)，使工作電極相對于Ag/AgCl在300mV的電勢下平衡。周期性地將一定濃縮的葡萄糖溶液藥包加入到PBS中以增加PBS中的葡萄糖濃度。圖3A顯示在添加每個藥包后，三電極傳感器系統(tǒng)的電流快速增加，之后達到平臺。
也在15mM葡萄糖(在圖3A中未顯示)中連續(xù)測試了工作電極10小時，工作電極僅展示了大約17％的電流反應(yīng)下降。與使用于小分子氧化還原介體的基于酶電化學(xué)的傳感器相比，這樣的反應(yīng)在長期測量的穩(wěn)定性方面具有顯著的進步。
圖3B表示對應(yīng)于圖3A的描述電流反應(yīng)對葡萄糖濃度的校正曲線。在2mM和15mM之間范圍內(nèi)的校正曲線近似地呈線性關(guān)系。
根據(jù)本發(fā)明實施方式的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物能夠容易地被合成。此外，可以對分子量、離子特性和物理構(gòu)象進行調(diào)節(jié)以提供高電極親和性和氧化還原活性(例如，與氧化還原酶的快速電子轉(zhuǎn)移)。
應(yīng)當(dāng)理解所述本發(fā)明實施方式的各種替換也可以用于實施本發(fā)明，意味著以下權(quán)利要求限定了本發(fā)明的范圍，并且在這些權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)以及它們的等同物也被包括在該保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于基于酶電化學(xué)的傳感器的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，所述離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物包括含有離子部分的親水性聚合物；和大量附著的氧化還原介體，其中離子性親水性高分子量氧化還原聚合物的分子量大于16Kg/mol。
2.權(quán)利要求1的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，其中所述的親水性聚合物為親水性的聚合物骨架。
3.權(quán)利要求2的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，其中所述的親水性的聚合物骨架至少部分地由親水性的丙烯酰胺(AAM)單體形成。
4.權(quán)利要求2的離子性親水性高分子量氧化還原聚合物，其中所述的親水性的聚合物骨架至少部分地由至少一種具有丙烯酸可聚合基團的親水性單體和具有乙烯基可聚合基團的親水性單體形成。
5.權(quán)利要求2的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，其中離子性部分被并入到親水性的骨架上，并且氧化還原介體以懸置方式共價地結(jié)合到親水性聚合物骨架上。
6.權(quán)利要求1的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，其中離子部分為陽離子部分。
7.權(quán)利要求1的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，其中離子部分是由[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨(AETMAC)形成的。
8.權(quán)利要求1的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，其中離子部分是由季銨陽離子單體和叔銨陽離子單體中的至少一種形成的。
9.權(quán)利要求1的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，其中氧化還原介體為二茂鐵(Fc)。
10.權(quán)利要求1的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，其中親水性聚合物是至少部分地由親水性丙烯酰胺單體(AAM)形成的親水性聚合物骨架；離子部分至少部分地由并入到親水骨架上的[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨(AETMAC)形成；并且氧化還原介體是以乙烯二茂鐵(VFc)形式共價地結(jié)合到親水性聚合物骨架上的二茂鐵(Fc)。
11.權(quán)利要求10的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物，其中所述的分子量為約110Kg/mol。
12.權(quán)利要求10的離子性親水性高分子量氧化還原聚合物，其中AAM的相對摩爾份數(shù)在約84至約99范圍內(nèi)，VFc的相對摩爾份數(shù)在約1至約6范圍內(nèi)，并且AETMAC的相對摩爾份數(shù)在幾乎0至約10范圍內(nèi)。
13.權(quán)利要求1的離子性親水性高分子量氧化還原聚合物，其中離子部分是由羧酸單體形成的。
14.權(quán)利要求1的離子性親水性高分子量氧化還原聚合物，其中離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物為陽離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物。
15.權(quán)利要求1的離子性親水性高分子量氧化還原聚合物，其中離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物為陰離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物。
全文摘要
用于基于酶電化學(xué)的傳感器的離子性親水性的高分子量氧化還原聚合物包括具有離子部分(例如并入到親水性的聚合物骨架上的陽離子單體)的親水性聚合物(例如親水性聚合物骨架)和大量附著的氧化還原介體。該氧化還原介體可以，例如，以懸置(pendant)方式共價結(jié)合到親水性聚合物上。陽離子性親水性高分子量氧化還原聚合物的實例是通過親水性丙烯酰胺單體、[2－(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化銨(AETMAC)和乙烯基二茂鐵共聚反應(yīng)合成的。
文檔編號C12Q1/00GK1754893SQ200510106499
公開日2006年4月5日 申請日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者Z·劉, J·I·羅杰斯, G·利利, M·F·卡多西 申請人:生命掃描有限公司