專利名稱：殼聚糖內(nèi)切酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖內(nèi)切酶的制備方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖(chitosan)是由氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接成的具有生物活性的高分子聚合物，化學(xué)名為聚2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖。它主要是以被廢棄的蝦殼、蟹殼為原料，經(jīng)脫鈣、去除蛋白和脫乙?；然瘜W(xué)過程而得到的。其分子結(jié)構(gòu)式如下圖所示。
殼聚糖具有許多獨(dú)特的生物活性。1991年的國(guó)際甲殼素大會(huì)把殼聚糖確定為除了糖、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)之外的第六大生命要素，對(duì)它們?cè)卺t(yī)療保健方面的作用給予了很高的評(píng)價(jià)。殼聚糖的許多生物活性需要以低分子量或者殼寡聚糖的形式才能體現(xiàn)出來，如抗腫瘤、免疫激活、用作基因載體等。但是由于人體內(nèi)殼聚糖酶和胃酸的含量很少，殼聚糖的作用效果受到了很大的限制。
低聚糖的制備主要有化學(xué)法、氧化法、超聲波法和酶降解法。同其他方法相比較，酶法降解制備殼低聚糖具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物殼低聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量容易控制、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)。
目前用于殼聚糖降解的酶有專一性殼聚糖酶，也有非專一性酶如纖維素酶、脂肪酶、溶菌酶等，市售非專一性酶的純度和活力都不大高，而成本較高，不適用于制備相對(duì)分子質(zhì)量分布較窄的高純度殼低聚糖產(chǎn)品。因此，制備高純度殼聚糖內(nèi)切酶是本領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)問題。本發(fā)明公開了一種制備高純度殼聚糖內(nèi)切酶的方法。從青霉菌發(fā)酵粗酶液中分離純化得到一種殼聚糖內(nèi)切酶，適用于制備相對(duì)分子質(zhì)量分布較窄的高純度殼低聚糖產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種制備殼聚糖內(nèi)切酶的方法。
方法的步驟如下1)將保藏號(hào)為CGMCC No.0851的高產(chǎn)殼聚糖酶生產(chǎn)菌(Penicillium sp)接種在5L的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基裝液量3-4L，接種量為10％-20％，培養(yǎng)溫度為26-32℃、攪拌速度為200-500r·min-1、通氣量為1.5-5L·min-1，發(fā)酵50-80小時(shí)后，過濾除去懸浮菌體得到殼聚糖粗酶液；2)截留相對(duì)分子質(zhì)量為2-20kDa的超濾膜對(duì)粗酶液進(jìn)行超濾，然后，用3-5倍的冰乙醇沉淀或者用20％-80％硫酸銨分級(jí)沉淀得到殼聚糖粗酶沉淀物；3)用pH4.4-5.5，10-50mmol乙酸緩沖液溶解殼聚糖粗酶沉淀物，再上HiPrep 16/10 SP XL陽離子交換柱，用含0.5-2mol氯化鈉、10-50mmol乙酸緩沖液0-100％線形梯度洗脫，得到殼聚糖內(nèi)切酶溶液；4)用Sephadex G50凝膠過濾柱過濾，乙酸緩沖液洗脫，濃縮、冷凍、真空干燥得到殼聚糖內(nèi)切酶。
培養(yǎng)基為殼聚糖5-40g/L、尿素0.5-3g/L、磷酸二氫鉀0.2-1g/L、；硫酸銨0.5-3g/L、硫酸鎂0.1本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是酶法降解制備殼低聚糖和殼寡糖具有反應(yīng)條件溫和，可以控制降解反應(yīng)速率和產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量，不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)。特別是使用分離純化后的內(nèi)切殼聚糖酶降解殼聚糖，可以得到相對(duì)分子質(zhì)量分布較窄的高純度殼低聚糖產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式
從高產(chǎn)殼聚糖酶菌株(國(guó)家發(fā)明專利號(hào)ZL 02159880.0，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.0851)發(fā)酵粗酶液，先后采用超濾濃縮、有機(jī)溶劑或硫酸銨沉淀、陽離子交換和凝膠過濾的方法分離純化得到一種殼聚糖內(nèi)切酶。
本發(fā)明提供了利用青霉菌發(fā)酵制備殼聚糖粗酶液的方法。在5L的發(fā)酵罐中，裝入培養(yǎng)基量為3-4L，接種量為10％-20％，培養(yǎng)溫度為26-32℃、攪拌速度為200-450r·min-1、通氣量為1.5-5L·min-1，培養(yǎng)時(shí)間50-80小時(shí)后，過濾除去懸浮菌體得到殼聚糖粗酶液。
本發(fā)明還提供了從殼聚糖粗酶液中分離純化得到殼聚糖內(nèi)切酶的方法。分別采用超濾濃縮、有機(jī)溶劑或者硫酸銨沉淀、陽離子交換和凝膠過濾、冷凍真空干燥等分離純化的方法，從粗酶液中分離純化得到殼聚糖內(nèi)切酶。
實(shí)施例11、粗酶液的制備取試管斜面保藏菌種8支，活化5小時(shí)之后，分別加入無菌水15ml，洗下孢子。將獲得的孢子懸液直接接入5L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度28℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速300r·min-1，通氣量為4.5L·min-1，發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成如下初始pH值為5。

發(fā)酵罐培養(yǎng)75小時(shí)后，在冰箱中4℃下保存發(fā)酵液2小時(shí)，然后在6000r·min-1離心后取上清液作為粗酶液，備用。
2、殼聚糖內(nèi)切酶的分離純化(1)殼聚糖粗酶液的濃縮取上述殼聚糖酶粗酶液，采用超濾方法濃縮，超濾膜面積0.1m2，截留相對(duì)分子質(zhì)量2kDa，操作壓力0.4MPa，截留部分為濃縮的粗酶液。
(2)殼聚糖酶的提取取100ml上述粗酶液，按照冰乙醇和殼聚糖粗酶液3∶1的比例，加入冰乙醇，在4℃條件下靜置，沉淀得到殼聚糖粗酶，用50ml、20mmol的乙酸緩沖液(pH 4.4)溶解。
(3)殼聚糖酶的粗分離采用陽離子交換柱HiPrep 16/10 SP XL，平衡緩沖液為30mmol乙酸緩沖液(pH4.4)，洗脫緩沖液為含1mol氯化鈉的30mmol乙酸緩沖液，0-100％線形梯度洗脫，分步收集。此過程可以將殼聚糖內(nèi)切酶同外切酶、雜質(zhì)蛋白質(zhì)分開，收集殼聚糖內(nèi)切酶溶液。
(4)殼聚糖內(nèi)切酶的精制根據(jù)殼聚糖內(nèi)切酶和雜質(zhì)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的差異，采用凝膠過濾柱Sephadex G-50，緩沖液為20mmol乙酸緩沖液(pH4.4)，精制得到殼聚糖內(nèi)切酶溶液，比活力478U/mg，冷凍真空干燥后得到殼聚糖內(nèi)切酶產(chǎn)品。
實(shí)施例21、粗酶液的制備取試管斜面保藏菌種10支，活化5小時(shí)之后，分別加入無菌水15ml，洗下孢子。將獲得的孢子懸液直接接入5L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度30℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速400r·min-1，通氣量為3.5L·min-1，發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成如下初始pH值為5。

發(fā)酵罐培養(yǎng)70小時(shí)后，在冰箱中4℃下保存發(fā)酵液2小時(shí)，然后在6000r·min-1離心后取上清液作為粗酶液，備用。
2、殼聚糖內(nèi)切酶的分離純化(1)殼聚糖粗酶液的濃縮取上述殼聚糖酶粗酶液，采用超濾方法濃縮，超濾膜面積0.1m2，截留相對(duì)分子質(zhì)量10kDa，操作壓力0.4MPa，截留部分為濃縮的粗酶液。
(2)殼聚糖酶的提取取100ml上述粗酶液，在4℃條件下緩緩加入硫酸銨使其達(dá)到20％飽和度，6000r·min-1離心除去沉淀，繼續(xù)加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到80％，6000r·min-1離心收集沉淀部分，用20ml 20mM的乙酸緩沖液(pH4.8)溶解。使用脫鹽柱進(jìn)行脫鹽處理，備用。
(3)殼聚糖酶的粗分離采用陽離子交換柱HiPrep 16/10 SP XL，平衡緩沖液為20mM乙酸緩沖液(pH4.8)，洗脫緩沖液為含1mol氯化鈉的20mmol乙酸緩沖液，0-100％線形梯度洗脫，分步收集。此過程可以將殼聚糖內(nèi)切酶同外切酶、雜質(zhì)蛋白質(zhì)分開，收集殼聚糖內(nèi)切酶溶液。
(4)殼聚糖內(nèi)切酶的精制根據(jù)殼聚糖內(nèi)切酶和雜質(zhì)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的差異，采用凝膠過濾柱Sephadex G50，緩沖液為20mmol乙酸緩沖液(pH4.8)，精制得到殼聚糖內(nèi)切酶溶液，比活力432U/mg，冷凍真空干燥后得到殼聚糖內(nèi)切酶產(chǎn)品。
實(shí)施例31、粗酶液的制備取試管斜面保藏菌種10支，活化5小時(shí)之后，分別加入無菌水15ml，洗下孢子。將獲得的孢子懸液直接接入5L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度28℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速500r·min-1，通氣量為5L·min-1，發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成如下初始pH值為4.5。


2、殼聚糖內(nèi)切酶的分離純化(1)殼聚糖粗酶液的濃縮取上述殼聚糖酶粗酶液，采用超濾方法濃縮，超濾膜面積0.1m2，截留相對(duì)分子質(zhì)量5kDa，操作壓力0.4MPa，截留部分為濃縮的粗酶液。
(2)殼聚糖酶的提取取100ml上述粗酶液，在4℃條件下緩緩加入硫酸銨使其達(dá)到20％飽和度，6000r·min-1離心除去沉淀，繼續(xù)加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到80％，6000r·min-1離心收集沉淀部分，用20ml 10mmol的乙酸緩沖液(pH5.0)溶解。使用透析帶對(duì)10mmol的乙酸緩沖液在4℃下透析20小時(shí)。
(3)殼聚糖酶的粗分離采用陽離子交換柱HiPrep 16/10 SP XL，平衡緩沖液為50mmol乙酸緩沖液(pH5.0)，洗脫緩沖液為含1mol氯化鈉的50mmol乙酸緩沖液，0-100％線形梯度洗脫，分步收集。此過程可以將殼聚糖內(nèi)切酶同外切酶、雜質(zhì)蛋白質(zhì)分開，收集殼聚糖內(nèi)切酶溶液。
(4)殼聚糖內(nèi)切酶的精制根據(jù)殼聚糖內(nèi)切酶和雜質(zhì)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的差異，采用凝膠過濾柱Sephadex G-50，緩沖液為50mmol乙酸緩沖液(pH5.0)，精制得到殼聚糖內(nèi)切酶溶液，比活力453U/mg，冷凍真空干燥后得到殼聚糖內(nèi)切酶產(chǎn)品。
實(shí)施例41、粗酶液的制備取試管斜面保藏菌種15支，活化5小時(shí)之后，分別加入無菌水15ml，洗下孢子。將獲得的孢子懸液直接接入5L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度32℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速250r·min-1，通氣量為5L·min-1，發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成如下初始pH值為4.5。

2、殼聚糖內(nèi)切酶的分離純化
(1)殼聚糖粗酶液的濃縮取上述殼聚糖酶粗酶液，采用超濾方法濃縮，超濾膜面積0.1m2，截留相對(duì)分子質(zhì)量20kDa，操作壓力0.4MPa，截留部分為濃縮的粗酶液。
(2)殼聚糖酶的提取取100ml上述粗酶液，在4℃條件下緩緩加入硫酸銨使其達(dá)到20％飽和度，6000r·min-1離心除去沉淀，繼續(xù)加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到80％，6000r·min-1離心收集沉淀部分，用20ml 20mM的乙酸緩沖液(pH5.0)溶解。使用脫鹽柱進(jìn)行脫鹽處理，備用。
(3)殼聚糖酶的粗分離采用陽離子交換柱HiPrep 16/10 SP XL，平衡緩沖液為20mM乙酸緩沖液(pH5.0)，洗脫緩沖液為含1mol氯化鈉的20mmol乙酸緩沖液，0-100％線形梯度洗脫，分步收集。此過程可以將殼聚糖內(nèi)切酶同外切酶、雜質(zhì)蛋白質(zhì)分開，收集殼聚糖內(nèi)切酶溶液。
(4)殼聚糖內(nèi)切酶的精制根據(jù)殼聚糖內(nèi)切酶和雜質(zhì)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的差異，采用凝膠過濾柱Sephadex G50，緩沖液為20mmol乙酸緩沖液(pH5.0)，精制得到殼聚糖內(nèi)切酶溶液，比活力496U/mg，冷凍真空干燥后得到殼聚糖內(nèi)切酶產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖內(nèi)切酶的制備方法，其特征在于方法的步驟如下1)將保藏號(hào)為CGMCC No.0851的高產(chǎn)殼聚糖酶生產(chǎn)菌(Penicillium sp)接種在5L的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基裝液量3-4L，接種量為10％-20％，培養(yǎng)溫度為26-32℃、攪拌速度為200-450r·min-1、通氣量為1.5-5L·min-1，發(fā)酵50-80小時(shí)后，過濾除去懸浮菌體得到殼聚糖粗酶液；2)截留相對(duì)分子質(zhì)量為2-20kDa的超濾膜對(duì)粗酶液進(jìn)行超濾，然后，用2-4倍的冰乙醇沉淀或者用20％-80％硫酸銨分級(jí)沉淀得到殼聚糖粗酶沉淀物；3)用pH4.4-5.5，10-50mmol乙酸緩沖液溶解殼聚糖粗酶沉淀物，再上HiPrep 16/10 SP XL陽離子交換柱，用含0.5-2mol氯化鈉、10-50mmol乙酸緩沖液，0-100％線形梯度洗脫，得到殼聚糖內(nèi)切酶溶液；4)用Sephadex G 50凝膠過濾柱過濾，乙酸緩沖液洗脫，濃縮、冷凍、真空干燥得到殼聚糖內(nèi)切酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種殼聚糖內(nèi)切酶的制備方法，，其特征在于所述的培養(yǎng)基為殼聚糖5-40g/L、尿素0.5-3g/L、磷酸二氫鉀0.2-1g/L、；硫酸銨0.5-3g/L、硫酸鎂0.1-0.5g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種殼聚糖內(nèi)切酶的制備方法，，其特征在于所述高產(chǎn)殼聚糖酶生產(chǎn)菌(Penicillium sp)接種是使用斜面培養(yǎng)的菌種直接上發(fā)酵罐培養(yǎng)，接種的種子液制備方法是采用100-300ml無菌水洗下5-15支25ml斜面中培養(yǎng)得到的真菌孢子，直接接種到發(fā)酵罐中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖內(nèi)切酶的制備方法。用高產(chǎn)殼聚糖酶菌株(國(guó)家發(fā)明專利號(hào)ZL 02159880.0，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.0851)，接種到加入適量殼聚糖、氮源和無機(jī)鹽的溶液的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，過濾除去大部分懸浮菌體，得到殼聚糖酶粗酶液，發(fā)酵粗酶液，先后采用超濾濃縮、有機(jī)溶劑或硫酸銨沉淀、陽離子交換和凝膠過濾、冷凍真空干燥等分離純化的方法分離純化得到一種殼聚糖內(nèi)切酶。本發(fā)明的菌種遺傳性穩(wěn)定，發(fā)酵條件常規(guī)化，得到的殼聚糖內(nèi)切酶純度較高，適用于制備相對(duì)分子質(zhì)量分布較窄的高純度殼低聚糖產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N9/24GK1724659SQ20051005007
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2005年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日
發(fā)明者鄭連英, 隋斯光 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)