專利名稱：中國葡萄屬野生種麥黃葡萄抗白粉病候選基因序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡萄常規(guī)雜交育種、分子標記輔助育種、基因定位與作圖及基因克隆的方法與技術(shù)，特別涉及抗白粉病候選基因序列及其應(yīng)用的方法與技術(shù)。
背景技術(shù)：
葡萄白粉病(Uncinula necator Schw.Burr.)是危害歐洲葡萄最為嚴重的真菌病害之一，遍布于世界各葡萄產(chǎn)區(qū)。對于白粉病的防治，早期以化學防治為主，但是，化學防治不僅增加生產(chǎn)成本，造成環(huán)境污染，還可能引起葡萄病害生理小種的變異及病原菌的抗藥性，同時降低葡萄及其加工產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)。科學研究和生產(chǎn)實踐證明，利用植物自身抗病性，培育抗病、優(yōu)質(zhì)葡萄新品種是最經(jīng)濟有效的措施之一。歐洲葡萄抗病能力差，美洲葡萄種及其品種抗病性強，但果實的“狐”味及其顯性遺傳的特點，又限制了其進一步應(yīng)用；圓葉葡萄與歐洲葡萄雜交效率低。中國是葡萄屬植物重要的起源地之一，我國的野生葡萄資源不僅抗病，而且和歐洲葡萄雜交親和性好，因而將中國野生葡萄白粉病抗性基因與歐洲葡萄品種優(yōu)良品質(zhì)基因有效結(jié)合，培育抗病優(yōu)良葡萄新品種和創(chuàng)造新型葡萄種質(zhì)是生產(chǎn)實踐中急需解決的實際問題。
植物能對特定的病原微生物進行識別并產(chǎn)生抗性，這是由抗病基因決定的?；?qū)蚣僬f認為，抗病基因是病原微生物致病基因的受體，能與致病因子復合物通過一系列信號傳導起始抗病反應(yīng)，如發(fā)生過敏性反應(yīng)、細胞壁增厚、壞死斑的出現(xiàn)以及防衛(wèi)基因的表達等。抗病基因根據(jù)編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的異同，可以將除Hm1外的其他基因分為4大類，即含有核苷酸結(jié)合位點(NBS)和富含亮氨酸重復(LRR)的胞內(nèi)受體蛋白基因；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STK)基因；含有胞外LRR結(jié)構(gòu)的跨膜受體蛋白基因以及同時含有胞外LRR和胞內(nèi)STK結(jié)構(gòu)的跨膜受體蛋白基因，這些不同植物來源的抗病基因在結(jié)構(gòu)上的保守性暗示了利用同源序列法分離抗病基因的潛在可能性。而基于同源序列的基因分離方法目前已逐漸受到重視，其中小麥抗葉銹病基因Lr10的分離是利用同源序列法進行抗病基因分離的首次成功報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供中國葡萄屬野生種麥黃葡萄抗白粉病候選基因基因序列及其應(yīng)用。
本發(fā)明是在對中國葡萄屬野生種進行抗病性鑒定，獲得麥黃葡萄(V.bashanica P.C.He)旬陽-8抗病種質(zhì)的基礎(chǔ)上，采用同源序列克隆法分離葡萄抗白粉病候選基因片段，進行序列同源性分析，為進一步利用cDNA末端快速擴增技術(shù)獲得抗病基因全長序列奠定基礎(chǔ)。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首次采用抗病基因同源序列技術(shù)進行中國葡萄屬野生種抗白粉病候選基因克隆，獲得了抗白粉病候選基因DNA片段8個，其大小介于510bp～525bp之間。以該核苷酸序列為基礎(chǔ)，可以進行抗白粉病基因標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗白粉病基因的探針；可以根據(jù)這些片段在中國野生葡萄與歐洲葡萄雜種后代中的分離情況，進行中國野生葡萄抗白粉病基因定位與作圖；可以采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)(Frohman et al，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆中國葡萄野生種抗白粉病基因，為通過基因工程改良葡萄品種的抗病性奠定基礎(chǔ)。


圖1中國葡萄屬野生種麥黃葡萄抗白粉病特異DNA片段的獲得圖譜，其中M1，M2.100bp DNA ladder，1、7、13引物為F1R1，2、8、14引物為F1R2，3、9、15引物為F1R3，4、10、16引物為F2R1，5、11、17引物為F2R2，6、12、18引物為F2R3；1-6.旬陽-8，7-12.白河-41，13-18.白河-42；圖2～圖9是本發(fā)明獲得的中國葡萄屬野生種麥黃葡萄(V.bashanicaP.C.He)旬陽-8(1)、旬陽-8(13)、旬陽-8(15)、旬陽-8(2)、旬陽-8(3)、旬陽-8(5)、旬陽-8(7)、旬陽-8(8)的抗白粉病候選基因序列；圖10是特異DNA片段在麥黃葡萄旬陽-8X歐洲葡萄紅地球雜交后代中的分離情況圖譜，其中，M.DNA Marker DGL 2000，1.旬陽-8，2-19.旬陽-8X紅地球雜交后代。
以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
具體實施例方式
本發(fā)明獲得的中國葡萄屬野生種麥黃葡萄(V.bashanica P.C.He)旬陽-8抗白粉病候選基因序列具體操作步驟如下A.采用改進的CTAB法(西北植物學報，王西平等，2003，23(3)473-476)提取中國葡萄屬野生種麥黃葡萄旬陽-8、白河-41、白河-42葉片基因組DNA。
B.根據(jù)抗病基因N、L6及RPS2位于P-環(huán)(P-loop)上的GVGKTT，及位于基因弱疏水區(qū)上的GLPLAL保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計簡并PCR引物F1.5‘GGD GTD GGN AAR ACW AC 3’，F(xiàn)2.5‘GGT GGG GTT GGGAAG ACA AAG 3’與R1.5‘GAG GGC TAA AGG AAG GCC 3’，R2.5‘AGNGCY AAN GGY AAN CC 3’，R3.5‘CAA CGC TAG TGG CAA TCC 3’，共組成6對PCR引物進行擴增，這些引物由大連Takara公司合成。
在25μl PCR反應(yīng)體積中加入PCR buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP 0.5μl，模板DNA 100ng，引物1 1.5μl，引物2 1.5μl，Taq DNA聚合酶1U(5U/μl)，用雙蒸水補被齊體積至25μl，加入25.0μl礦物油。PCR擴增程序為94℃ 2min，94℃ 1min；50℃ 1min，72℃ 2min共35個循環(huán)；72℃，10min。取反應(yīng)產(chǎn)物6.0μl跑1.5％瓊脂糖凝膠電泳(5V·cm-1)約40min，6對引物都獲得了擴增產(chǎn)物，其中引物對F1R3獲得了一條長度約為500bp的DNA特異帶(圖1)。
C.用DNA膠回收試劑盒將旬陽-8獲得的這一條約500bp左右的DNA條帶回收，連接pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有Amp(100μg·ml-1)和X-gal/IPTG的LB平板上培養(yǎng)，藍、白斑篩選鑒定挑選白色菌落培養(yǎng)。用UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒回收質(zhì)粒，用EcoRI酶切鑒定有外源DNA片段插入的陽性克隆。將陽性克隆送大連寶生生物公司測序，測序結(jié)果表明獲得麥黃葡萄DNA特異片段8個(圖2-圖9)，大小介于510bp～525bp之間。
本發(fā)明的實施例1以保存于西北農(nóng)林科技大學葡萄種質(zhì)資源圃已進行抗白粉病鑒定的中國野生葡萄麥黃葡萄旬陽-8(賀普超等，中國農(nóng)業(yè)科學，1991；Wang Y et al，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)與歐洲葡萄紅地球的種間雜交后代155株為試材，采用改良的CTAB法提取基因組DNA，根據(jù)獲得的抗白粉病候選基因序列設(shè)計特異引物，進行PCR擴增，據(jù)特異DNA片段在雜種材料中的表現(xiàn)情況(圖10)，對照上述葡萄材料的抗白粉病田間鑒定結(jié)果，獲得與葡萄抗白粉病基因緊密連鎖的DNA片段和抗白粉病基因DNA片段。
本發(fā)明的實施例2用保存于西北農(nóng)林科技大學葡萄種質(zhì)資源圃的中國葡萄屬野生種麥黃葡萄旬陽-8、白河-41、白河-42等(賀普超等，中國農(nóng)業(yè)科學，1991；Wang Y etal，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)與歐洲葡萄優(yōu)良品種黑大粒、無核白雜交，獲得抗白粉病雜種植株。采用改良的CTAB法提取上述葡萄材料基因組DNA，根據(jù)實施例1獲得的與抗白粉病基因緊密連鎖的DNA片段設(shè)計引物，對上述葡萄材料基因組DNA進行PCR擴增，凡擴增產(chǎn)物出現(xiàn)DNA特異片段的雜種材料，為抗白粉病雜種植株，或者是抗白粉病基因的攜帶者，這些可以用做進一步抗病品種選育的材料和育種種質(zhì)。
本發(fā)明的實施例3采用田間自然鑒定、田間接種鑒定對實施例2的葡萄雜種材料進行抗白粉病鑒定，獲得抗病雜種與感病雜種。據(jù)實施例2獲得的與抗白粉病基因緊密連鎖的DNA片段設(shè)計的引物，對上述葡萄雜種材料進行PCR擴增，據(jù)DNA片段在雜種中的擴增與分離情況，結(jié)合田間鑒定結(jié)果，利用MAPMAKER軟件進行抗白粉病基因定位與作圖，獲得抗病基因連鎖圖譜，為進一步通過圖譜克隆分離抗白粉病基因鑒定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的實施例4將實施例1獲得的中國葡萄屬野生種麥黃葡萄抗白粉病基因部分DNA片段序列，用DNASTAR軟件設(shè)計特異5’RACE引物GSP1與3’RACE引物GSP2，用改進的SDS/酚法(果樹學報，張今今等，2003，20(3)178-181)提取中國葡萄屬野生種麥黃葡萄旬陽-8、白河-41、白河-42葉片總RNA，逆轉(zhuǎn)錄分別合成5’RACE與3’RACE cDNA第一鏈。用5’RACE引物GSP1與3’RACE引物GSP2分別進行5’RACE與3’RACE PCR擴增。分別回收5’RACE與3’RACE全長序列并連接T載體?？寺?、測序后，進行序列同源性分析，據(jù)5’RACE與3’RACE序列重疊區(qū)域合并成完整的cDNA全長序列，從而克隆了中國葡萄屬野生種麥黃葡萄抗白粉病基因，獲得抗白粉病基因序列，為通過基因工程提高歐洲葡萄品種的抗病性提供基因資源。
基因序列中國葡萄屬野生種麥黃葡萄(V.bashanica P.C.He)旬陽-8抗白粉病候選基因序列麥黃葡萄 旬陽-8(1)1GGGGTGGGTA AGACAACTCT GGCCAAAAAA GTTTACGACA ACCAGAGAGT GGTGGGACAC61 TTCGATTGCC ATGCTTGGGT CACTGTGTCT CAATCATTCA AGATGGAGGA GCTACTACGG121 AACATGACAA AGAAATTCTA TCAGGGAAGA AAGGAAGCAG TTCCTGAGGG TATCGATACA181 ATAGACGAGA TGTCACTGAT TTCCTTAATC AGGCAGTATT TACAAGATAA AAGGTATGTG241 GTTGTTTTTG ATGATGTATG GAAACTAGAT TTCTGGGGAT TTATTAAATA TGTTTTACCA301 GAAAATGGAA ACGGCAGTAG GATAATAATC ACTACACGTA ATGATGAGGT AGCCTCTTCC361 TGCAAAGAGT CGTCATTTGA TTACATCCAC AAGCTGCAAC CCCTGTCCCC AAAGAGTTCC421 TGGGAACTCT TTTGCAAGAA GACATTCCAG GGTGGATGTC CTCCAGAATT GGAGAAACTG481 TCTCTTCATA TTGTCAAAAG ATGTGGAGGA TTGCCACTAG CGTTG麥黃葡萄 旬陽-8(13)1GGGGTAGGCA AGACTACTCT CGCACGGCAG GTTTACAAGT ATGATTTGGC CAAAATTTTG61 AACTAAAAGC GTGGGTTTGT GTGACTGATG TGTTTGATGT GGAGAATATA ACAAAAGCAA121 TTCTCAATTC GGTATTAGAG TCTGATGCAA GTGGCTCTTT GGACTTCCAA CAAGTTCAAA181 AGAAATTGAC AGACACGTTA GCAGGGAAAA CTTTTTTACT CGTTATAGAC GACGTGTGGA241 ACGAAAATTG TGGTCATTGG GATCTTTTGC GGGCTCCTTT TAGTGTAGGG TCCAAAGGAA301 GCAAAGTCAT AGTTACAACA CGCAATAAAA ATGTCGCATT GATGATGGGA GCTGCCAAGA361 ATGTTCATGA ACTAAACCCT TTATCTGAAG ATGCTTGTTG GTCTGTGTTT CAGAAGCATG421 CATTTGAACA TAGAAATATC AATGATCATC CGAACCTGGT GTCCATTGGC AGGAAAATTG481 TTGGCAAATG TGGTGGATTG CCACTAGCGT TG麥黃葡萄 旬陽-8(15)1GGGGTTGGGA AGACAACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG麥黃葡萄 旬陽-8(2)1GGTGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA
301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AAATAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG麥黃葡萄 旬陽-8(3)1GGGGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241 AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361 AATGTTCATG AAATAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG麥黃葡萄 旬陽-8(5)1GGTGTTGGTA AGACAACTCT CGCACGGCAG GTTTACAAGT ATGATTTGGC CAAAATTTTG61 AACTAAAAGC GTGGGTTTGT GTGACTGATG TGTTTGATGT GGAGAATATA ACAAAAGCAA121 TTCTCAATTC GGTATTAGAG TCTGATGCAA GTGGCTCTTT GGACTTCCAA CAAGTTCAAA181 AGAAATTGAC AGACACGTTA GCAGGGAAAA CTTTTTTACT CGTTATAGAC GACGTGTGGA241 ACGAAAATTG TGGTCATTGG GATCTTTTGC GGGCTCCTTT TAGTGTAGGG TCCAAAGGAA301 GCAAAGTCAT AGTTACAACA CGCAATAAAA ATGTCGCATT GATGATGGGA GCTGCCAAGA361 ATGTTCATGA ACTAAACCCT TTATCTGAAG ATGCTTGTTG GTCTGTGTTT CAGAAGCATG421 CATTTGAACA TAGAAATATC AATGATCATC CGAACCTGGT GTCCATTGGC AGGAAAATTG481 TTGGCAAATG TGGTGGATTG CCACTAGCGT TG麥黃葡萄 旬陽-8(7)1GGGGTTGGGA AGACTACTCT GGCCAAAAAA GTTTACGACA ACCAGAGAGT GGTGGGACAC61 TTCGATTGCC ATGCTTGGGT CACTGTGTCT CAATCATTCA AGATGGAGGA GCTACTACGG121 AACATGACAA AGAAATTCTA TCAGGGAAGA AAGGAAGCAG TTCCTGAGGG TATCGATACA181 ATAGACGAGA TGTCACTGAT TTCCTTAATC AGGCAGTATT TACAAGATAA AAGGTATGTG241 GTTGTTTTTG ATGATGTATG GAAACTAGAT TTCTGGGGAT TTATTAAATA TGTTTTACCA301 GAAAATGGAA ACGGCAGTAG GATAATAATC ACTACACGTA ATGATGAGGT AGCCTCTTCC361 TGCAAAGAGT CGTCATTTGA TTACATCCAC AAGCTGCAAC CCCTGTCCCC AAAGAGTTCC421 TGGGAACTCT TTTGCAAGAA GACATTCCAG GGTGGATGTC CTCCAGAATT GGAGAAACTG481 TCTCTTCATA TTGTCAAAAG ATGTGGAGGA TTGCCACTAG CGTTG麥黃葡萄 旬陽-8(8)1GGGGTGGGGA AGACAACCCT TTTGACCCAA ATCAACAATG AGTTCCTCAA AACAACTCAT61 GATTTTGATG TTGTGATCTG GGCTGTGGTG TCACGAGATC CAGACTTTCC CAAGGTTCAA121 GATGAAATTG GGAAAAAGGT TGGGTTTTGT GATGGTATAT GGAGAAATAA AAGCAAGGAT181 GAAAAAGCCA TAGACATCTT TAGAGCCTTG CGCAAAAAGA GGTTTGTGTT GTTGTTAGAT241 GACGTATGGG AGCCGGTAAA TCTATCAGTC TTGGGAGTTC CAGTTCCAAA TGAAGAAAAT301 AAGTCCAAGC TAGTATTCAC AACCCGATCC GAGGATGTAT GCCGACAAAT GGAAGCTCAA
361 AAGAATATCA AAGTGGAGTG CTTGGCATGG CAGGAATCCT GGGATTTGTT TCAGAAGAAG421 GTTGGACAAG ACACACTAGA CTCCCATGCA GAAATCCCCA TGCTAGCTGA AATGGTTGCC481 AAAGAATGTT GCGGATTGCC ACTAGCGTTG
權(quán)利要求
1.中國葡萄屬野生種麥黃葡萄抗白粉病候選基因序列，其特征在于，包括中國葡萄屬野生種麥黃葡萄旬陽-8的8個抗白粉病候選基因序列；這些抗白粉病候選基因序列是麥黃葡萄旬陽-8(1)1 GGGGTGGGTA AGACAACTCT GGCCAAAAAA GTTTACGACA ACCAGAGAGT GGTGGGACAC61 TTCGATTGCC ATGCTTGGGT CACTGTGTCT CAATCATTCA AGATGGAGGA GCTACTACGG121AACATGACAA AGAAATTCTA TCAGGGAAGA AAGGAAGCAG TTCCTGAGGG TATCGATACA181ATAGACGAGA TGTCACTGAT TTCCTTAATC AGGCAGTATT TACAAGATAA AAGGTATGTG241GTTGTTTTTG ATGATGTATG GAAACTAGAT TTCTGGGGAT TTATTAAATA TGTTTTACCA301GAAAATGGAA ACGGCAGTAG GATAATAATC ACTACACGTA ATGATGAGGT AGCCTCTTCC361TGCAAAGAGT CGTCATTTGA TTACATCCAC AAGCTGCAAC CCCTGTCCCC AAAGAGTTCC421TGGGAACTCT TTTGCAAGAA GACATTCCAG GGTGGATGTC CTCCAGAATT GGAGAAACTG481TCTCTTCATA TTGTCAAAAG ATGTGGAGGA TTGCCACTAG CGTTG麥黃葡萄旬陽-8(13)1 GGGGTAGGCA AGACTACTCT CGCACGGCAG GTTTACAAGT ATGATTTGGC CAAAATTTTG61 AACTAAAAGC GTGGGTTTGT GTGACTGATG TGTTTGATGT GGAGAATATA ACAAAAGCAA121TTCTCAATTC GGTATTAGAG TCTGATGCAA GTGGCTCTTT GGACTTCCAA CAAGTTCAAA181AGAAATTGAC AGACACGTTA GCAGGGAAAA CTTTTTTACT CGTTATAGAC GACGTGTGGA241ACGAAAATTG TGGTCATTGG GATCTTTTGC GGGCTCCTTT TAGTGTAGGG TCCAAAGGAA301GCAAAGTCAT AGTTACAACA CGCAATAAAA ATGTCGCATT GATGATGGGA GCTGCCAAGA361ATGTTCATGA ACTAAACCCT TTATCTGAAG ATGCTTGTTG GTCTGTGTTT CAGAAGCATG421CATTTGAACA TAGAAATATC AATGATCATC CGAACCTGGT GTCCATTGGC AGGAAAATTG481TTGGCAAATG TGGTGGATTG CCACTAGCGT TG麥黃葡萄旬陽-8(15)1 GGGGTTGGGA AGACAACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG麥黃葡萄旬陽-8(2)1 GGTGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361AATGTTCATG AAATAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG麥黃葡萄旬陽-8(3)1 GGGGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTG GTTTACAATG ATGATTTGGC CCAAAATTTT61 GACCTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATC TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGGTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGTGG241AACGGAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTGGT GGCAAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTCCCCAG361AATGTTCATG AAATAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TCAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAACCTGG AGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGCCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG麥黃葡萄旬陽-8(5)1 GGTGTTGGTA AGACAACTCT CGCACGGCAG GTTTACAAGT ATGATTTGGC CAAAATTTTG61 AACTAAAAGC GTGGGTTTGT GTGACTGATG TGTTTGATGT GGAGAATATA ACAAAAGCAA121TTCTCAATTC GGTATTAGAG TCTGATGCAA GTGGCTCTTT GGACTTCCAA CAAGTTCAAA181AGAAATTGAC AGACACGTTA GCAGGGAAAA CTTTTTTACT CGTTATAGAC GACGTGTGGA241ACGAAAATTG TGGTCATTGG GATCTTTTGC GGGCTCCTTT TAGTGTAGGG TCCAAAGGAA301GCAAAGTCAT AGTTACAACA CGCAATAAAA ATGTCGCATT GATGATGGGA GCTGCCAAGA361ATGTTCATGA ACTAAACCCT TTATCTGAAG ATGCTTGTTG GTCTGTGTTT CAGAAGCATG421CATTTGAACA TAGAAATATC AATGATCATC CGAACCTGGT GTCCATTGGC AGGAAAATTG481TTGGCAAATG TGGTGGATTG CCACTAGCGT TG麥黃葡萄旬陽-8(7)1 GGGGTTGGGA AGACTACTCT GGCCAAAAAA GTTTACGACA ACCAGAGAGT GGTGGGACAC61 TTCGATTGCC ATGCTTGGGT CACTGTGTCT CAATCATTCA AGATGGAGGA GCTACTACGG121AACATGACAA AGAAATTCTA TCAGGGAAGA AAGGAAGCAG TTCCTGAGGG TATCGATACA181ATAGACGAGA TGTCACTGAT TTCCTTAATC AGGCAGTATT TACAAGATAA AAGGTATGTG241GTTGTTTTTG ATGATGTATG GAAACTAGAT TTCTGGGGAT TTATTAAATA TGTTTTACCA301GAAAATGGAA ACGGCAGTAG GATAATAATC ACTACACGTA ATGATGAGGT AGCCTCTTCC361TGCAAAGAGT CGTCATTTGA TTACATCCAC AAGCTGCAAC CCCTGTCCCC AAAGAGTTCC421TGGGAACTCT TTTGCAAGAA GACATTCCAG GGTGGATGTC CTCCAGAATT GGAGAAACTG481TCTCTTCATA TTGTCAAAAG ATGTGGAGGA TTGCCACTAG CGTTG麥黃葡萄旬陽-8(8)1 GGGGTGGGGA AGACAACCCT TTTGACCCAA ATCAACAATG AGTTCCTCAA AACAACTCAT61 GATTTTGATG TTGTGATCTG GGCTGTGGTG TCACGAGATC CAGACTTTCC CAAGGTTCAA121GATGAAATTG GGAAAAAGGT TGGGTTTTGT GATGGTATAT GGAGAAATAA AAGCAAGGAT181GAAAAAGCCA TAGACATCTT TAGAGCCTTG CGCAAAAAGA GGTTTGTGTT GTTGTTAGAT241GACGTATGGG AGCCGGTAAA TCTATCAGTC TTGGGAGTTC CAGTTCCAAA TGAAGAAAAT301AAGTCCAAGC TAGTATTCAC AACCCGATCC GAGGATGTAT GCCGACAAAT GGAAGCTCAA361AAGAATATCA AAGTGGAGTG CTTGGCATGG CAGGAATCCT GGGATTTGTT TCAGAAGAAG421GTTGGACAAG ACACACTAGA CTCCCATGCA GAAATCCCCA TGCTAGCTGA AATGGTTGCC481AAAGAATGTT GCGGATTGCC ACTAGCGTTG
2.中國葡萄屬野生種麥黃葡萄抗白粉病候選基因序列在進行抗白粉病標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗白粉病基因的探針，以及抗病基因定位與作圖、克隆中國葡萄屬野生種麥黃葡萄抗白粉病基因的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及葡萄常規(guī)雜交育種、分子標記輔助育種、基因定位與作圖及基因克隆的方法與技術(shù)。本發(fā)明采用抗病基因同源序列法(Resistant geneanalogus，RGAs)獲得中國葡萄屬野生種麥黃葡萄(V.bashanica P.C.He)旬陽－8抗白粉病候選基因DNA片段8個，對這些片段克隆測序后，其大小介于510bp～525bp之間。以這些序列為依據(jù)，可以進行抗白粉病標記輔助育種，用作葡萄育種中檢測葡萄抗白粉病基因的探針；可以進行抗白粉病基因定位與作圖；也可以采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid amplification ofcDNA ends，RACE)(Frohman et al，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆中國野生葡萄麥黃葡萄抗白粉病基因，為通過基因工程改良葡萄品種的抗病性奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/82GK1683537SQ20051004175
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者王躍進, 王西平 申請人:西北農(nóng)林科技大學