專利名稱：Psod表達(dá)單元的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的核酸序列的用途、新啟動子及其表達(dá)單元、用于改變或影響基因轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的方法、包含該表達(dá)單元的表達(dá)盒、具有改變的或受影響的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的基因修飾微生物及通過培育該基因修飾微生物制備生物合成產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
多種生物合成產(chǎn)物，例如精細(xì)化學(xué)品(尤其例如氨基酸、維生素)及蛋白質(zhì)是通過天然代謝過程在細(xì)胞中產(chǎn)生的，并用于包括化妝品、飼料、食品及醫(yī)藥業(yè)的許多工業(yè)領(lǐng)域中。這些物質(zhì)統(tǒng)稱為精細(xì)化學(xué)品/蛋白質(zhì)，其尤其包含有機酸、生蛋白氨基酸和非生蛋白氨基酸(proteinogenic andnon-proteinogenic amino acid)、核苷酸和核苷、類脂類和脂肪酸、二醇、糖類、芳香化合物、維生素和輔因子以及蛋白質(zhì)和酶。通過培養(yǎng)為了產(chǎn)生及分泌大量特定目的物質(zhì)而開發(fā)出的細(xì)菌，這些物質(zhì)的生產(chǎn)以工業(yè)規(guī)模上最有利的方式進行。特別適于該目的的生物為棒桿菌(coryneformbacteria)，其為革蘭氏陽性非病原菌。
已知通過棒桿菌菌株的發(fā)酵，尤其是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株的發(fā)酵來制備氨基酸。由于其重要性，在其生產(chǎn)過程的改良上進行了不懈的努力。該過程改良可與以下事宜相關(guān)發(fā)酵技術(shù)的手段，例如攪拌與供氧；或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成，例如發(fā)酵中的糖濃度；或用于獲得產(chǎn)物的處理，例如通過離子交換層析或噴霧干燥；或微生物自身的內(nèi)在性能特性。
通過擴增個別基因并研究其對精細(xì)化學(xué)品/蛋白質(zhì)的生產(chǎn)的作用，重組DNA技術(shù)已在產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品/蛋白質(zhì)的棒桿菌菌株的菌株改良中應(yīng)用了許多年。
用于發(fā)展生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品、氨基酸或蛋白質(zhì)的方法，或用于增加或提高已存在的生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品、氨基酸或蛋白質(zhì)的方法的生產(chǎn)率的其他方式是增加或改變一種或多種基因的表達(dá)，和/或用合適的多核苷酸序列影響mRNA的翻譯。就此而言，影響可包括基因表達(dá)的增加、減少或其他限制因素，例如時序表達(dá)模式(chronological expression pattern)。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，細(xì)菌調(diào)節(jié)序列的各種組分是已知。對于以下結(jié)合位點已作出了區(qū)分調(diào)節(jié)物結(jié)合位點，也稱為操縱基因；RNA聚合酶全酶結(jié)合位點，也稱為-35與-10區(qū)及核糖體16S RNA結(jié)合位點，也稱為核糖體結(jié)合位點或Shine-Dalgarno序列。
基于本發(fā)明的目的，也稱為Shine-Dalgarno序列的核糖體結(jié)合位點序列是指位于翻譯起始密碼子上游高達(dá)20個堿基處的多核苷酸序列。
據(jù)文獻(xiàn)(E.coli和S.typhimurium，Neidhardt E.C.1995ASM Press)報導(dǎo)，Shine-Dalgarno序列的多核苷酸序列的組成和堿基序列串及存在于Shine-Dalgarno序列中的多核苷酸序列的距離均對翻譯起始速率具有顯著影響。
具有啟動子活性的核酸序列可以多種方式影響mRNA的形成。其活性不依賴于生物的生理生長期的啟動子稱為組成型。而其他啟動子響應(yīng)外部的化學(xué)及物理刺激，例如氧、代謝物、熱、pH等。而其他啟動子在不同生長期中顯示出對其活性的強依賴性。例如，文獻(xiàn)中描述的在微生物的指數(shù)生長期中或恰好在微生物生長的穩(wěn)定期中顯示特別顯著的活性的啟動子。根據(jù)代謝途徑，啟動子的兩種特征可對精細(xì)化學(xué)品及蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率具有有益的作用。
例如，在生長過程中關(guān)閉基因表達(dá)，但在最佳生長后又啟動基因表達(dá)的啟動子可用于調(diào)節(jié)控制代謝物產(chǎn)生的基因。于是，修飾的菌株顯示與起始菌株相同的生長參數(shù)，但每個細(xì)胞產(chǎn)生更多產(chǎn)物。該種類型的修飾可增加滴度(產(chǎn)物的克數(shù)/升)及C產(chǎn)率(產(chǎn)物的克數(shù)/C源的克數(shù))。
已經(jīng)可以從棒桿菌菌種中分離出那些可用于增強或減弱基因表達(dá)的核苷酸序列。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)部和/或外部條件，這些受調(diào)節(jié)的啟動子可提高或降低基因轉(zhuǎn)錄的速率。在某些情況下，被稱為誘導(dǎo)物的特定因子的存在可刺激從啟動子的轉(zhuǎn)錄速率。誘導(dǎo)物可直接或間接影響從啟動子的轉(zhuǎn)錄。被稱為抑制物的另一類因子能夠降低或抑制從啟動子的轉(zhuǎn)錄。類似于誘導(dǎo)物，該抑制物也可直接或間接地起作用。另一方面，溫度調(diào)節(jié)型啟動子也為已知的。因此，例如，可通過將生長溫度增至高于細(xì)胞的正常生長溫度來增強或減弱這類啟動子的轉(zhuǎn)錄水平。
至今已描述了少量源自谷氨酸棒桿菌的啟動子。DE 4440118中描述了源自谷氨酸棒桿菌的蘋果酸合酶基因的啟動子。該啟動子被插入到編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的上游。這種構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進入棒桿菌之后，對該啟動子下游的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進行調(diào)節(jié)。一旦在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物，就誘導(dǎo)該結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
Reinscheid等人在Microbiology 145503(1999)中描述了源自谷氨酸棒桿菌的pta-ack啟動子與報道基因(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)之間的轉(zhuǎn)錄融合作用。包含這種轉(zhuǎn)錄融合作用的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞在含有乙酸的培養(yǎng)基上生長時，呈現(xiàn)報道基因的增強表達(dá)。與此相比，在葡萄糖上生長的轉(zhuǎn)化細(xì)胞未顯示該報道基因的增強表達(dá)。
Pa’tek等人在Microbiology 1421297(1996)中描述了能夠增強報道基因在谷氨酸棒桿菌細(xì)胞中表達(dá)的某些源自谷氨酸棒桿菌的DNA序列。將這些序列在一起進行比較以便確定谷氨酸棒桿菌啟動子的共有序列。
專利WO 02/40679中已經(jīng)描述了可用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的其他源自谷氨酸棒桿菌的DNA序列。這些分離的多核苷酸表現(xiàn)為可用于增加或降低基因表達(dá)的源自谷氨酸棒桿菌的表達(dá)單元。該專利還描述了重組質(zhì)粒，在這些重組質(zhì)粒上源自谷氨酸棒桿菌的表達(dá)單元與異源基因連接在一起。本文所描述的將源自谷氨酸棒桿菌的啟動子與異源基因融合的方法，尤其可用于調(diào)節(jié)氨基酸生物合成的基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供具有利特性的其他啟動子和/或表達(dá)單元。
發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過使用具有啟動子活性的核酸可實現(xiàn)該目的，該核酸包含以下用于基因轉(zhuǎn)錄的序列A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段(functionally equivalentfragment)。
根據(jù)本發(fā)明，“轉(zhuǎn)錄”是指從DNA模板開始產(chǎn)生互補RNA分子的過程。該過程涉及例如RNA聚合酶、所謂的σ因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的蛋白質(zhì)。接著，合成的RNA用作翻譯過程中的模板，其隨后產(chǎn)生生物合成活性蛋白質(zhì)。
產(chǎn)生生物合成活性蛋白質(zhì)的形成速率是轉(zhuǎn)錄速率與翻譯速率的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，兩種速率均可改變，且因此改變微生物中產(chǎn)物的形成速率。
根據(jù)本發(fā)明，“啟動子”或“具有啟動子活性的核酸”是指以與待轉(zhuǎn)錄的核酸功能性連接的方式調(diào)節(jié)該核酸轉(zhuǎn)錄的核酸。
就此而言，“功能性連接”是指，例如一種具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸和待轉(zhuǎn)錄的核酸序列以及適當(dāng)條件下的其他調(diào)節(jié)元件(例如，確保核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列及終止子)的順序排列，這種方式使得各調(diào)節(jié)元件均可在該核酸序列的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮其功能。因此，化學(xué)意義上的直接連接并非絕對必要。例如增強子序列的遺傳控制序列能夠?qū)ι踔凛^遠(yuǎn)位置，或甚至其他DNA分子的靶序列執(zhí)行其功能。優(yōu)選待轉(zhuǎn)錄的核酸序列位于本發(fā)明的啟動子序列之后(即，在3’末端)的排列，以便兩個序列共價連接在一起。就此而言，啟動子序列與待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列之間的距離優(yōu)選小于200個堿基對，特別優(yōu)選小于100個堿基對，進一步優(yōu)選小于50個堿基對。
根據(jù)本發(fā)明，“啟動子活性”是指在特定時間內(nèi)由啟動子形成的RNA量，即指轉(zhuǎn)錄速率。
根據(jù)本發(fā)明，“特異啟動子活性”是指各啟動子在特定時間內(nèi)由啟動子形成的RNA的量。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“野生型”是指合適的起始微生物。
視上下文而定，術(shù)語“微生物”是指起始微生物(野生型)或本發(fā)明的遺傳修飾微生物或其兩者。
優(yōu)選地，尤其是在不能明確歸類微生物或野生型的情狀下，“野生型”是指在為了改變或影響啟動子活性或轉(zhuǎn)錄速率、為了改變或影響表達(dá)活性或表達(dá)速率及為了增加生物合成產(chǎn)物的含量的各個情況下的參考生物。
在一個優(yōu)選實施方案中，該參考生物為谷氨酸棒桿菌ATCC 13032。
在一個優(yōu)選實施方案中，所用的起始微生物已能夠產(chǎn)生所要精細(xì)化學(xué)品。就棒桿菌屬細(xì)菌的特別優(yōu)選微生物及特別優(yōu)選的精細(xì)化學(xué)品L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸而言，特別優(yōu)選那些已能夠產(chǎn)生L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸的起始微生物通常。這些起始微生物特別優(yōu)選為其中(例如)編碼天冬氨酸激酶的基因(ask基因)已去調(diào)節(jié)或反饋抑制作用已消除或降低的棒桿菌。這類細(xì)菌具有，例如在ask基因中導(dǎo)致反饋抑制作用降低或消除的突變，例如T311I突變。
因此，在與野生型相比，基因相關(guān)的“影響啟動子活性”或轉(zhuǎn)錄速率的情況下，導(dǎo)致與野生型相比在野生型中不以該方式存在的RNA的形成。
因此，在與野生型相比，基因相關(guān)的改變的啟動子活性或轉(zhuǎn)錄速率的情況下，與野生型相比特定時間內(nèi)產(chǎn)生的RNA的量改變。
就此而言，“改變”優(yōu)選指增加或降低。
例如，這可通過增加或降低本發(fā)明的內(nèi)源啟動子的特異啟動子活性進行，例如通過使該啟動子突變，或通過刺激或抑制該啟動子。
實現(xiàn)啟動子活性或轉(zhuǎn)錄速率增加的另一種可能性是，例如通過具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸或具有增加的特異啟動子活性的核酸調(diào)節(jié)來微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中這些基因相對于這些具有啟動子活性的核酸是異源的。
通過具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸或具有增加的特異啟動子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄優(yōu)選是通過以下方式實現(xiàn)
將一種或多種具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸的控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄；或?qū)⒁环N或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸的控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄；或?qū)⒁环N或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸及與功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。
具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.1代表源自谷氨酸棒桿菌的超氧化物歧化酶(Psod)的啟動子序列。SEQ.ID.NO.1對應(yīng)于野生型的啟動子序列。
本發(fā)明還涉及具有啟動子活性的核酸，其包含通過核苷酸的取代、插入或缺失從SEQ.ID.NO.1序列衍生的，且在核酸水平上與SEQ.ID.NO.1序列具有至少90％同一性的序列。
通過來自數(shù)據(jù)庫的核酸序列與上述序列SEQ ID NO1的同一性比較，本發(fā)明的啟動子的本發(fā)明的其他天然實例可容易地從例如基因組序列已知的多種生物中發(fā)現(xiàn)。
從序列SEQ ID NO1開始通過人工變異及突變(例如，通過核苷酸的取代、插入或缺失)可容易地得到本發(fā)明的人工啟動子序列。
本文中術(shù)語“取代”是指由一種或多種核苷酸置換一種或多種核苷酸?！叭笔А笔侵竿ㄟ^直接連接來置換核苷酸?！安迦搿笔侵笇⒑塑账岵迦牒怂嵝蛄兄?，伴隨一種或多種核苷酸對直接連接的形式置換。
兩種核酸間的同一性是指在各情況下核酸完整長度上的核苷酸同一性，具體地，同一性通過借助Informax(美國)的Vector NTI Suite 7.1軟件，使用Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitive multiplesequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989年4月；5(2)151-1)進行比較計算出來的，其中參數(shù)設(shè)定如下多序列比對參數(shù)缺口開放罰分 10缺口拓展罰分 10缺口分離罰分范圍 8缺口分離罰分 關(guān)比對延遲同一性％ 40殘基特定缺口 關(guān)親水性殘基缺口 關(guān)過渡權(quán)重(transition weighing) 0雙序列比對參數(shù)FAST算法 開K-數(shù)組尺寸(tuplesize) 1缺口罰分 3窗口尺寸 5最佳對角線數(shù)目(Number of best diagonal)5因此，與序列SEQ ID NO1具有至少90％同一性的核酸序列是指當(dāng)其序列與序列SEQ ID NO1比對時顯示至少90％同一性的核酸序列，所述比對具體指根據(jù)具有以上參數(shù)設(shè)定的上述程序設(shè)計的算法。
特別優(yōu)選的啟動子顯示與核酸序列SEQ.ID.NO.1的91％同一性，進一步優(yōu)選為92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一性，特別優(yōu)選為99％同一性。
此外，以本身已知方式，通過雜交技術(shù)可容易地發(fā)現(xiàn)啟動子的其他天然實例來源于上述核酸序列，尤其是來源于來自基因組序列未知的多種生物的序列SEQ.ID NO1。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及具有啟動子活性的核酸，其包含在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.No.1雜交的核酸序列。該核酸序列包含至少10個核苷酸，更優(yōu)選多于12、15、30、50個核苷酸或特別優(yōu)選多于150個核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，在嚴(yán)格條件下進行雜交。這種雜交條件描述于例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.E.，Maniatis，T.在Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第9.31-9.57頁或者Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
嚴(yán)格雜交條件具體是指在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖及20g/ml已變性、剪切的蛙精DNA組成的溶液中于42℃孵育過夜，隨后在65℃下用0.1×SSC洗滌濾膜。
“功能等效片段”是指具有與起始序列大體相同或更高的特異啟動子活性的啟動子活性片段的核酸序列。
“基本上一致”是指呈現(xiàn)起始序列的特異啟動子活性的至少50％、優(yōu)選60％、更優(yōu)選70％、更優(yōu)選80％、更優(yōu)選90％、特別優(yōu)選95％的特異啟動子活性。
“片段”是指實施方案A)、B)或C)描述的具有啟動子活性的核酸的部分序列。這些片段優(yōu)選具有多于10個、更優(yōu)選多于12、15、30、50個或特別優(yōu)選多于150個核酸序列SEQ.ID.NO.1中的相連核苷酸。
特別優(yōu)選使用核酸序列SEQ.ID.NO.1作為啟動子，即用于基因的轉(zhuǎn)錄。
Genbank條目AP005283已在未說明功能的情況下描述了SEQ.ID.NO.1。因此，本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的新的具有啟動子活性的核酸序列。
具體地，本發(fā)明涉及具有啟動子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
另外，可以本身已知方式，通過從核苷酸結(jié)構(gòu)單位進行化學(xué)合成來制備上述具有啟動子活性的所有核酸，例如通過雙螺旋的單個重疊互補核酸結(jié)構(gòu)單位的片段縮合。例如，通過亞磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，WileyPress New York，第896-897頁)由已知方式進行寡核苷酸的化學(xué)合成。Sambrook等人(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段和連接反應(yīng)以及通用克隆方法加入合成的寡核苷酸及補平缺口。
本發(fā)明進一步涉及表達(dá)單元的用途，該表達(dá)單元包含一種具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸及另外功能性連接的核酸序列，該核酸序列確保用以基因表達(dá)的核糖核酸的翻譯。
根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)單元是指具有表達(dá)活性的核酸，即以與待表達(dá)核酸功能性連接的方式調(diào)節(jié)表達(dá)的核酸或基因，其中所述表達(dá)即指該核酸或該基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯。
就此而言，“以功能性連接”是指，例如一種本發(fā)明的表達(dá)單元與待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列以及適當(dāng)條件下的其他調(diào)節(jié)元件(如終止子)的順序排列，這種方式使得各調(diào)節(jié)元件均可在該核酸序列的轉(zhuǎn)基因表達(dá)中發(fā)揮其功能?；瘜W(xué)意義上的直接連接對此而言并非絕對必要。例如增強子序列的遺傳控制序列能夠?qū)^遠(yuǎn)位置，或甚至不同DNA分子的目標(biāo)序列執(zhí)行其功能。優(yōu)選待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列位于本發(fā)明的表達(dá)單元序列后(即，在3’末端)的排列，以便這兩個序列共價連接在一起。在這種情況下，表達(dá)單元序列與待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列之間的距離優(yōu)選小于200個堿基對，特別優(yōu)選小于100個堿基對，進一步優(yōu)選小于50個堿基對。
根據(jù)本發(fā)明，“表達(dá)活性”是指在特定時間內(nèi)由表達(dá)單元產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量，即表達(dá)速率。
根據(jù)本發(fā)明，“特異表達(dá)活性”是指各表達(dá)單元在特定時間內(nèi)由表達(dá)單元產(chǎn)生的的蛋白質(zhì)的量。
因此，在與野生型相比，基因相關(guān)的“影響表達(dá)活性”或表達(dá)速率的情況下，導(dǎo)致與野生型相比在野生型中不以該方式存在的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
因此，在與野生型相比，基因相關(guān)的“改變的表達(dá)活性”或表達(dá)速率的情況下，與野生型相比特定時間內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量改變。
就此而言，“改變”優(yōu)選指增加或降低。
例如，這可通過增加或降低內(nèi)源表達(dá)單元的特異活性進行，例如通過使該表達(dá)單元突變或通過刺激或抑制該表達(dá)單元。
另外，例如通過本發(fā)明的表達(dá)單元或具有增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)可以實現(xiàn)增加表達(dá)活性或表達(dá)速率，其中這些基因相對于這些表達(dá)單元是異源的。
通過本發(fā)明的表達(dá)單元或具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)優(yōu)選是通過以下方式實現(xiàn)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)；或?qū)⒁环N或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)；或?qū)⒁环N或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
本發(fā)明的表達(dá)單元包含具有啟動子活性的上述本發(fā)明的核酸及另外功能性連接的核酸序列，該核酸序列確保核糖核酸的翻譯。
確保核糖核酸翻譯的該核酸序列優(yōu)選包含核酸序列SEQ.ID.NO.42作為核糖體結(jié)合位點。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的表達(dá)單元包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.2表示源自谷氨酸棒桿菌的超氧化物歧化酶(Psod)的表達(dá)單元的核酸序列。SEQ.ID.NO.2對應(yīng)于野生型的表達(dá)單元的序列。
本發(fā)明還涉及表達(dá)單元，其包含通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列。
通過來自數(shù)據(jù)庫的該核酸序列與上述序列SEQ ID NO2的同一性比較，本發(fā)明的表達(dá)單元的本發(fā)明的其他天然實例可容易地從例如基因組序列已知的各種生物中發(fā)現(xiàn)。
可容易地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的表達(dá)單元的人工序列是通過人工變異及突變(例如，通過核苷酸的取代、插入或缺失)來源于序列SEQ ID NO2。
因此，與序列SEQ ID NO2具有至少90％同一性的核酸序列是指當(dāng)其序列與序列SEQ ID NO2比對時顯示至少90％同一性的核酸序列，所述的比對具體指根據(jù)具有以上參數(shù)設(shè)定的上述程序設(shè)計的算法。
特別優(yōu)選的表達(dá)單元顯示與核酸序列SEQ.ID.NO.2的91％同一性，進一步優(yōu)選為92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一性，特別優(yōu)選為99％同一性。
此外，以本身已知方式，通過雜交技術(shù)可容易地發(fā)現(xiàn)表達(dá)單元的其他天然實例來源于上述核酸序列，尤其是來源于來自基因組序列未知的各種生物的序列SEQ.ID NO2。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及包含在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核酸序列的表達(dá)單元。該核酸序列包含至少10個核苷酸，更優(yōu)選多于12、15、30、50個核苷酸或特別優(yōu)選多于150個核苷酸。
“雜交作用”是指在嚴(yán)格條件下多核苷酸或寡核苷酸結(jié)合至實際互補序列，同時在這種條件下不進行非互補配對之間的非特異性結(jié)合的能力。就此而言，序列應(yīng)當(dāng)優(yōu)選為90-100％互補。例如，在Northern或Southern印跡技術(shù)或在PCR或RT-PCR引物結(jié)合中使用這種互補序列能夠彼此特異結(jié)合的特性。
根據(jù)本發(fā)明，在嚴(yán)格條件下進行雜交。此種雜交條件描述于例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.E.，Maniatis，T.在Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第9.31-9.57頁或者Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
嚴(yán)格雜交條件具體是指在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖及20g/ml已變性、剪切的蛙精DNA組成的溶液中于42℃孵育過夜，隨后在65℃下用0.1×SSC洗滌濾膜。
本發(fā)明的核苷酸序列還可能產(chǎn)生可用于識別和/或克隆其他細(xì)胞類型及微生物中的同源序列的探針及引物。這類探針及引物通常包含在嚴(yán)格條件下，與本發(fā)明的核酸序列的有義鏈或?qū)?yīng)反義鏈上至少約12個、優(yōu)選至少約25個(例如約45、50或75個)連續(xù)核苷酸雜交的核酸序列區(qū)域。
根據(jù)本發(fā)明，包含所謂的沉默突變的核酸序列，或與具體涉及的序列相比，根據(jù)具體起始生物或宿主生物的密碼子選擇進行修飾的核酸序列及其天然存在的變體，如其剪接變體或等位變體也包含在本發(fā)明中。
“功能等效片段”是指具有與起始序列大體相同或更高的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元片段。
“基本上一致”是指呈現(xiàn)起始序列的特異表達(dá)活性的至少50％、優(yōu)選60％、更優(yōu)選70％、更優(yōu)選80％、更優(yōu)選90％、特別優(yōu)選95％的特異表達(dá)活性。
“片段”是指實施方案E)、F)或G)描述的表達(dá)單元的部分序列。這些片段優(yōu)選具有多于10個、更優(yōu)選多于12、15、30、50個或特別優(yōu)選多于150個核酸序列SEQ.ID.NO.1中的相連核苷酸。
特別優(yōu)選使用核酸序列SEQ.ID.NO.2作為表達(dá)單元，即用于基因的表達(dá)。
Genbank條目AP005283已在未說明功能的情況下描述了SEQ.ID.NO.2。因此，本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的新的表達(dá)單元。
具體地，本發(fā)明涉及表達(dá)單元，其包含具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸及另外功能性連接的核酸序列，該核酸序列確保核糖核酸的翻譯。
本發(fā)明特別優(yōu)選涉及表達(dá)單元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
本發(fā)明的表達(dá)單元包含一種或多種以下遺傳元件負(fù)10(“-10”)序列、負(fù)35(“-35”)序列、轉(zhuǎn)錄序列起點、增強子區(qū)域及操縱基因區(qū)域。
這些遺傳元件優(yōu)選是棒桿菌種特異的，尤其是谷氨酸棒桿菌特異的。
另外，可以本身已知方式，通過從核苷酸結(jié)構(gòu)單位進行化學(xué)合成來制備上述所有表達(dá)單元，例如通過雙螺旋的單獨重疊互補核酸結(jié)構(gòu)單位的片段縮合。例如，通過亞磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，Wiley Press NewYork，第896-897頁)由已知方式進行寡核苷酸的化學(xué)合成。Sambrook等人(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory Press中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段和連接反應(yīng)以及通用克隆方法加入合成的寡核苷酸及補平缺口。
本申請中用于本發(fā)明的方法及技術(shù)是熟悉微生物及重組DNA技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。用于培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞、將分離的DNA分子插入宿主細(xì)胞中并分離，及分離的核酸分子的克隆及測序等的方法與技術(shù)為這類技術(shù)與方法的實例。許多標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)資料描述了這些方法Davis等人，BasicMethods In Molecular Biology(1986)；J.H.Miller，Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1972)；J.H.Miller，A Short Course in BacterialGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1992)；M.Singer與P.Berg，Genes & Genomes，University ScienceBooks，Mill Valley，California(1991)；J.Sambrook，E.E.Fritsch與T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；P.B.Kaufmann等人，Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biologyand Medicine，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1995)；Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，B.R.Glick與J.E.Thompson編著，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1993)及P.E.Smith-Keary，MolecularGenetics of Escherichia coli，The Guilford Press，New York，NY(1989)。
本發(fā)明所有的核酸分子優(yōu)選為分離的核酸分子的形式?！胺蛛x的”核酸分子是分離自存在于該核酸的天然來源中的其他核酸分子，另外，如果其是由重組技術(shù)制備的，則可基本上不含有其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者如果其是經(jīng)化學(xué)合成的，則可基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物。
另外，本發(fā)明包括與具體描述的核苷酸序列互補的核酸分子或其部分。
例如，如下所述，本發(fā)明的啟動子和/或表達(dá)單元可特別有利地用于通過下述發(fā)酵來制備生物合成產(chǎn)物的改進方法中。
具體地，本發(fā)明的啟動子和/或表達(dá)單元的優(yōu)點在于其是通過應(yīng)激(stress)在微生物中誘導(dǎo)的。可能通過對發(fā)酵過程進行適當(dāng)控制來控制該特別用于增加目的基因的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)速率的應(yīng)激誘導(dǎo)。具體地，在L-賴氨酸產(chǎn)生中，極早達(dá)到該應(yīng)激階段，以便在這種情況下極早達(dá)到目的基因的增加的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)速率。
與野生型相比，具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸可用于改變(即提高或降低)或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率。
與野生型相比，本發(fā)明的表達(dá)單元可用于改變(即提高或降低)或影響微生物中基因的表達(dá)速率。
具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸及本發(fā)明的表達(dá)單元也可用于調(diào)節(jié)及增強微生物中(尤其是在棒桿菌菌種中)例如精細(xì)化學(xué)品、蛋白質(zhì)(尤其為氨基酸)的各種生物合成產(chǎn)物的產(chǎn)生。
因此，與野生型相比，本發(fā)明涉及通過以下方式改變或影響微生物中基因轉(zhuǎn)錄速率的方法a)與野生型相比，改變微生物中具有啟動子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸的特異啟動子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b)以具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸，或以具有實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
根據(jù)實施方案a)，與野生型相比，可通過改變(即增加或降低)微生物中特異啟動子的活性來改變或影響的微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率。例如，這可通過具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸序列的定向突變(即通過核苷酸的定向取代、缺失或插入)來進行。可通過置換RNA聚合酶全酶結(jié)合位點(本領(lǐng)域的技術(shù)人員也稱其為-10區(qū)與-35區(qū))中的核苷酸來達(dá)到增加或降低啟動子的活性。此外，通過缺失核苷酸或插入核苷酸來縮小或擴大所述RNA聚合酶全酶結(jié)合位點彼此之間的距離。另外通過將調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(本領(lǐng)域的技術(shù)人員也稱其為阻抑蛋白及激活蛋白)的結(jié)合位點(本領(lǐng)域的技術(shù)人員也稱其為操縱基因)插入RNA聚合酶全酶的結(jié)合位點的空間相鄰區(qū)域，使得在結(jié)合至啟動子序列后，這些調(diào)節(jié)物減弱或增強RNA聚合酶完全酶的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活性或使其處于新的調(diào)節(jié)影響下。
核酸序列SEQ.ID.NO.44優(yōu)選代表本發(fā)明的表達(dá)單元的核糖體結(jié)合位點，且序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43代表本發(fā)明的表達(dá)單元的-10區(qū)。在這些區(qū)域中核酸序列的改變導(dǎo)致特異表達(dá)活性的改變。
因此，本發(fā)明涉及核酸序列SEQ.ID.NO.44在表達(dá)單元中作為核糖體結(jié)合位點的用途，所述表達(dá)單元能使基因在棒桿菌屬或短桿菌(Brevibacterium)屬細(xì)菌中表達(dá)。
本發(fā)明進一步涉及核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43在表達(dá)單元中作為-10區(qū)的用途，所述表達(dá)單元能使基因在棒桿菌菌或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)。
具體地，本發(fā)明涉及能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.44。在這種情況下，核酸序列SEQ.ID.NO.44優(yōu)選用作核糖體結(jié)合位點。
本發(fā)明進一步涉及能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43。在這種情況下，核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43優(yōu)選用作-10區(qū)。
就“特異啟動子活性”而言，與野生型相比的增加或降低是指與野生型的具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸相比(即，例如與SEQ.ID.NO.1相比)，特異活性的增加或降低。
根據(jù)實施方案b)，微生物中基因轉(zhuǎn)錄速率與野生型相比的改變或影響，可通過以具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸或以具有根據(jù)實施方案a)的改變的特異啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄來進行，其中這些基因與這些具有啟動子活性的核酸是異源的。
此優(yōu)選通過以下方式實現(xiàn)b1)將一種或多種具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸控制下進行一種或多種導(dǎo)入的基因的轉(zhuǎn)錄，或b3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。
因此，可能通過以下方式改變(即提高或降低)野生型內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄速率根據(jù)實施方案b1)，將一種或多種具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或根據(jù)實施方案b2)，將一種或多種內(nèi)源基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸控制下進行一種或多種導(dǎo)入的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或根據(jù)實施方案b3)，將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄內(nèi)源核酸。
因此，另外可能通過以下方式影響與野生型相比的外源基因的轉(zhuǎn)錄速率根據(jù)實施方案b2)，將一種或多種內(nèi)源基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸控制下進行一種或多種導(dǎo)入的外源基因的轉(zhuǎn)錄，或根據(jù)實施方案b3)，將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄外源核酸。
此外，可通過將基因整合至編碼區(qū)或非編碼區(qū)中來進行如實施方案b2)的基因插入。優(yōu)選插入至非編碼區(qū)中。
此外，可在染色體上或染色體外進行如實施方案b3)的核酸構(gòu)建物的插入。優(yōu)選核酸構(gòu)建物的染色體插入?！叭旧w”整合是將外源DNA片段插入至宿主細(xì)胞的染色體中。該術(shù)語也用于外源DNA片段與宿主細(xì)胞染色體上適當(dāng)區(qū)域之間的同源重組。
在實施方案b)中，優(yōu)選也使用具有如實施方案a)的改變的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸。在實施方案b)中，如實施方案a)中所述，這些核酸可在微生物中存在或制備，或?qū)⑵湟苑蛛x的形式導(dǎo)入微生物中。
“內(nèi)源”是指已存在于野生型基因組中的遺傳信息，例如基因。
“外源”是指不存在于野生型基因組中的遺傳信息，例如基因。
與具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸進行的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)的術(shù)語“基因”優(yōu)選是指核酸，其包含待轉(zhuǎn)錄的區(qū)域(即，例如調(diào)節(jié)翻譯的區(qū)域)及編碼區(qū)，且適當(dāng)條件下進一步包含例如終止子的調(diào)節(jié)元件。
如下所述，與本發(fā)明的表達(dá)單元進行的表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)的術(shù)語“基因”優(yōu)選是指核酸，其包含編碼區(qū)，且適當(dāng)條件下進一步包含例如終止子的調(diào)節(jié)元件。
“編碼區(qū)”是指編碼蛋白質(zhì)的核酸序列。
相對于具有啟動子活性的核酸及基因而言的“異源性”是指所用基因在具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸的調(diào)節(jié)下，在野生型中不轉(zhuǎn)錄，但是產(chǎn)生了在野生型中不存在的新的功能性連接及在野生型中不存在的具啟動子活性的本發(fā)明的核酸與特定基因的功能性組合。
相對于表達(dá)單元及基因而言的“異源性”是指所用基因在具有啟動子活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的調(diào)節(jié)下，在野生型中不表達(dá)，但是產(chǎn)生了在野生型中不存在的新的功能性連接及在野生型中不存在的本發(fā)明的表達(dá)單元與特定基因的功能性組合。
在一個優(yōu)選實施方案中，與野生型相比，本發(fā)明進一步涉及通過以下方式提高或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率的方法ah)與野生型相比，增加具有啟動子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh)以具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸，或以具有實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中的基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因相對于具有啟動子活性的核酸而言是異源的。
以具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸，或以增加根據(jù)實施方案ah)的具有的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸進行的微生物中基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)優(yōu)選是通過以下方式實現(xiàn)bh1)將一種或多種具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸控制下進行一種或多種導(dǎo)入的基因的轉(zhuǎn)錄，或bh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的本發(fā)明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。
在一個優(yōu)選實施方案中，與野生型相比，本發(fā)明進一步涉及通過以下方式降低微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率的方法ar)與野生型相比，降低具有啟動子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將具有實施方案a)所述的降低的特異啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有降低的啟動子活性的核酸的控制下進行內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。
與野生型相比，本發(fā)明進一步涉及通過以下方式改變或影響微生物中基因表達(dá)速率的方法c)與野生型相比，改變本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或d)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實施方案c)所述的改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對于所述表達(dá)單元而言是異源的。
根據(jù)實施方案c)，與野生型相比，可通過改變(即增加或降低)微生物中的特異表達(dá)活性來改變或影響微生物中基因的表達(dá)速率。例如，這可通過具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸序列的定向突變(即，通過核苷酸的定向取代、缺失或插入)來進行。例如，延長Shine-Dalgarno序列與翻譯起始密碼子之間的距離通常導(dǎo)致變化，該變化為特異表達(dá)活性的減弱或增強。也可通過缺失或插入核苷酸來縮短或延長Shine-Dalgarno區(qū)(核糖體結(jié)合位點)的序列與翻譯起始密碼子之間的距離，從而實現(xiàn)特異表達(dá)活性的改變。但是，還可通過使其與互補的3’端16S rRNA的同源性增強或減弱方式改變Shine-Dalgarno區(qū)的序列來實現(xiàn)。
就“特異表達(dá)活性”而言，與野生型相比的增加或降低是指與野生型的本發(fā)明的表達(dá)單元相比(即，例如與SEQ.ID.NO.2相比)，特異活性的增加或降低。
根據(jù)實施方案d)，可通過本發(fā)明的表達(dá)單元，或具有根據(jù)實施方案c)的改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，從而改變或影響微生物中與野生型相比的基因的表達(dá)速率，其中這些基因相對于這些表達(dá)單元而言是異源的。
該優(yōu)選通過以下方式達(dá)到d1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組中，以便在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锏幕蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進行一種或多種導(dǎo)入的基因的表達(dá)，或d3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
因此，可能通過以下方式改變(提高或降低)野生型內(nèi)源基因的表達(dá)速率根據(jù)實施方案d1)，將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組中，以便在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或根據(jù)實施方案d2)，將一種或多種基因?qū)胛⑸锏幕蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進行一種或多種導(dǎo)入的基因的表達(dá)，或根據(jù)實施方案d3)，將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
因此，另外可能通過以下方式影響與野生型相比的內(nèi)源基因的表達(dá)速率根據(jù)實施方案d2)，將一種或多種基因?qū)胛⑸锏幕蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進行一種或多種導(dǎo)入的基因的表達(dá)，或根據(jù)實施方案d3)，將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)外源核酸。
此外，可通過將基因整合至編碼區(qū)或非編碼區(qū)中來進行根據(jù)實施方案d2)的基因插入。優(yōu)選插入至非編碼區(qū)中。
此外，可在染色體上或染色體外進行如實施方案d3)的核酸構(gòu)建物的插入。優(yōu)選核酸構(gòu)建物的染色體插入。
在下文中，核酸構(gòu)建物也稱作表達(dá)盒。
在實施方案d)中，優(yōu)選也使用具有根據(jù)實施方案c)的改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元。在實施方案d)中，如實施方案c)中所述，這些表達(dá)單元可在微生物中存在或制備，或以分離的形式導(dǎo)入微生物中。
在一個優(yōu)選實施方案中，與野生型相比，本發(fā)明進一步涉及通過以下方式提高或影響微生物中基因表達(dá)速率的方法ch)與野生型相比，增加本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性，所述表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元來調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對于所述表達(dá)單元而言是異源的。
以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實施方案c)所述的增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元進行的微生物中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)優(yōu)選是通過以下方式實現(xiàn)dh1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的，適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
與野生型相比，本發(fā)明進一步涉及通過以下方式降低微生物中基因表達(dá)速率的方法cr)與野生型相比，降低本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dr)將實施方案cr)所述的具有降低的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有降低的表達(dá)活性的表達(dá)單元的控制下進行內(nèi)源基因的表達(dá)。
在用于改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的上述本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，這些基因選自編碼來自精細(xì)化學(xué)品的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中這些基因任選包含其他調(diào)節(jié)元件。
在用于改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的上述本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的實施方案中，這些基因選自核酸編碼來自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中這些基因任選包含其他調(diào)節(jié)元件。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，來自氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體(exporter carrier)、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白(efflux protein)、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
優(yōu)選的蛋白質(zhì)及編碼源自氨基酸生物合成途徑的上述這些蛋白質(zhì)的優(yōu)選蛋白質(zhì)的核酸分別為微生物來源的蛋白質(zhì)序列及核酸序列，優(yōu)選源自棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌，優(yōu)選源自棒桿菌，特別優(yōu)選源自谷氨酸棒桿菌。
來自氨基酸生物合成途徑的這些蛋白質(zhì)的特別優(yōu)選蛋白質(zhì)序列及編碼這些蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸序列的實例、其參考文獻(xiàn)及其在參考文獻(xiàn)中的編號列于表1中
表1





特別優(yōu)選的來自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)序列及編碼該蛋白質(zhì)對應(yīng)的核酸序列的其他實例為果糖-1，6-二磷酸酶2(也稱作fbr2)的序列(SEQ.ID.NO.41)及對應(yīng)的編碼果糖-1，6-二磷酸酶2(SEQ.ID.NO.40)的核酸序列。
特別優(yōu)選的來自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)序列及編碼該蛋白質(zhì)的對應(yīng)核酸序列的其他實例為硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)(也稱作RXA077)的序列(SEQ.ID.NO.4)及對應(yīng)的編碼硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)的核酸序列(SEQ.ID.NO.3)。
其他特別優(yōu)選的來自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)序列在各種情況下均具有該蛋白質(zhì)在表1中所示的氨基酸序列，其中表2/第2列中所示的每個蛋白質(zhì)的氨基酸序列的氨基酸位置中的至少一個上具有與表2/第3列同一行中所示的各氨基酸不同的生蛋白氨基酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，表2/第2列中所示的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的氨基酸位置中的至少一個上具有表2/第4列同一行中所示的氨基酸。表2中所示的蛋白質(zhì)是氨基酸生物合成途徑的突變蛋白，其具有特別有益的特性并因此特別適合通過本發(fā)明的啟動子表達(dá)對應(yīng)的核酸，并產(chǎn)生氨基酸。例如，T311I突變導(dǎo)致ask的反饋抑制被中止。
編碼表2中的上述突變蛋白的對應(yīng)核酸可以通過常規(guī)方法制備。
用于制備編碼突變蛋白的核酸序列的適合出發(fā)點是，例如以保藏號ATCC 13032獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心的谷氨酸棒桿菌菌株的基因組，或表1中提及的核酸序列。為了將突變蛋白的氨基酸序列逆翻譯成編碼這些蛋白質(zhì)的核酸序列，最好使用該核酸序列將被導(dǎo)入的生物的密碼子選擇，或該核酸序列存在于其中的生物的密碼子選擇。例如，就谷氨酸棒桿菌而言，最好使用谷氨酸棒桿菌的密碼子選擇?？梢员旧硪阎姆绞綇臄?shù)據(jù)庫或?qū)＠暾堉写_定具體生物的密碼子選擇，所述專利申請描述了目的生物中的至少一種蛋白質(zhì)及一種編碼這種蛋白質(zhì)的基因。
以如下方式理解表2中的信息第1列“符號”中指明與表1有關(guān)的各序列的明確名稱。
第2列“AA位置”中，各數(shù)字是指來自表1的對應(yīng)多肽序列的氨基酸位置。因此，“AA位置”列中“26”是指對應(yīng)的所示多肽序列的氨基酸的第26位。位置的編號是由N末端+1起始。
第3列“AA野生型”中各個字母表示表1中相應(yīng)野生型菌株序列上在第2列所示位置上的氨基酸，其以單字母代碼表示。
第4列“AA突變型”中各字母表示對應(yīng)突變型菌株中第2列中所示位置上的氨基酸，其以單字母代碼表示。
第5列“功能”中指明對應(yīng)多肽序列的生理功能。
就具有特定功能(第5列)及特定起始氨基酸序列(表1)的突變蛋白而言，第2、3及4列描述了至少一個突變及某些序列的多個突變。該多個突變始終是指在各情況下最接近的上述起始氨基酸序列(表1)。術(shù)語特定氨基酸序列的“氨基酸位置中的至少一個”優(yōu)選是指該氨基酸序列在第2、3及4列中所述的至少一個突變。
生蛋白氨基酸的單字母代碼A 丙氨酸C 半胱氨酸D 天冬氨酸E 谷氨酸F 苯丙氨酸G 甘氨酸H 組氨酸I 異亮氨酸K 賴氨酸L 亮氨酸M 甲硫氨酸N 天冬酰胺P 脯氨酸Q 谷氨酰胺R 精氨酸S 絲氨酸T 蘇氨酸V 纈氨酸W 色氨酸Y 酪氨酸表2




在用于改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的上述本發(fā)明方法及用于產(chǎn)生基因修飾微生物(下面稱為基因修飾微生物)的下述方法及用于產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的下述方法中，優(yōu)選以SacB方法將具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的表達(dá)單元、上述基因及上述核酸構(gòu)建物或表達(dá)盒導(dǎo)入微生物中，具體地，將它們導(dǎo)入棒桿菌中。
SacB方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的，且描述于，例如Schfer A，Tauch A，Jger W，Kalinowski J，Thierbach G，Piihler A.；Smallmobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichiacoli plasmids pK18 and pK19selection of defined deletions in thechromosome of Corynebacterium glutamicum，Gene.1994年7月22日；145(1)69-73及Blomfield IC，Vaughn V，Rest RE，Eisenstein BL.；Allelicexchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and atemperature-sensitive pSC101 replicon；Mol Microbiol.1991年6月；5(6)1447-57中。
在上述本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，通過將具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物中來改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率。
在上述本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案中，通過將上述核酸構(gòu)建物或表達(dá)盒導(dǎo)入微生物中來改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率。
因此，本發(fā)明也涉及表達(dá)盒，其包含至少一種本發(fā)明的表達(dá)單元，至少一種其他待表達(dá)核酸序列，即待表達(dá)基因，及適當(dāng)條件下的其他遺傳控制元件，例如終止子。
其中至少一種表達(dá)單元與其他待表達(dá)核酸序列功能性連接在一起，且所述的其他待表達(dá)核酸序列相對于該表達(dá)單元而言是異源的。
待表達(dá)核酸序列優(yōu)選為編碼來自精細(xì)化學(xué)品生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸中的至少一種。
待表達(dá)核酸序列特別優(yōu)選選自編碼來自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸。
來自氨基酸的生物合成途徑的優(yōu)選蛋白質(zhì)描述如上，且其實例描述于表1與2中。
選擇本發(fā)明的表達(dá)盒中表達(dá)單元相對于待表達(dá)基因的物理位置，以便表達(dá)單元調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，并優(yōu)選也調(diào)節(jié)待表達(dá)基因的翻譯，且因此能夠產(chǎn)生一種或多種蛋白質(zhì)。就此而言，“能夠產(chǎn)生”包括產(chǎn)生過程中的組成型增加、在特定條件下產(chǎn)生的減少或阻斷和/或在特定條件下產(chǎn)生的增加。就此而言，“條件”包含(1)向培養(yǎng)基中添加組分，(2)從培養(yǎng)基移除組分，(3)以另一種成份置換培養(yǎng)基中的一種組分，(4)提高培養(yǎng)基的溫度，(5)降低培養(yǎng)基的溫度及(6)調(diào)節(jié)大氣條件，例如，培養(yǎng)基所處的氧或氮濃度。
本發(fā)明進一步涉及包含上述本發(fā)明的表達(dá)盒的表達(dá)載體。
載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且可在“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人，編者，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中發(fā)現(xiàn)。除質(zhì)粒以外，載體也指本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的所有其他載體，例如噬菌體、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、粘粒及線性或環(huán)狀DNA。這些載體可在宿主生物中自主復(fù)制或進行染色體復(fù)制。
適合且特別優(yōu)選的質(zhì)粒為那些在棒桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒。例如pZ1(Menkel等人，Applied and Environmental Microbiology(1989)64549-554)、pEKEx1(Eikmanns等人，Gene 10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等人，Gene 10769-74(1991))的眾多已知質(zhì)粒載體基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519、pBL1或pGA1?？捎孟嗤绞绞褂闷渌|(zhì)粒載體，例如pCLiK5MCS或那些基于pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的質(zhì)粒載體。
借助于染色體整合的基因擴增方法的那些質(zhì)粒載體也同樣適合用于復(fù)制及擴增hom-thrB操縱子，所述質(zhì)粒載體，例如Reinscheid等人(Appliedand Environmental Microbiology 60，126-132(1994))所述。在該方法中，完整基因克隆至質(zhì)粒載體中，該質(zhì)粒載體能在宿主(通常為大腸桿菌(E.coli))中復(fù)制而不能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制。合適載體的實例為pSUP301(Sirnon等人，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schfer等人，Gene 145，69-73(1994)，Bernard等人，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等人，1991，Journal of Bacteriology1734510-4516)或pBGS8(Spratt等人，1986，Gene 41337-342)。隨后通過轉(zhuǎn)化，將包含待擴增基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入目的谷氨酸棒桿菌菌株中。用于轉(zhuǎn)化的方法是，例如Thierbach等人(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988))、Dunican與Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))及Tauch等人(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))中描述的方法。
本發(fā)明進一步涉及基因修飾微生物，其中該基因修飾作用導(dǎo)致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的轉(zhuǎn)錄速率，且其取決于a)改變至少一種第1項所述的具有啟動子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動子活性，該內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b)以第1項所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的第1項所述的具有啟動子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中這些基因相對于這些具有啟動子活性的核酸而言是異源的。
就上述方法而言，以第1項所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的第1項所述的具有啟動子活性的核酸進行的微生物中基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)通過以下方式實現(xiàn)b1)將一種或多種第1項所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的第1項所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸的控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在第1項所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的內(nèi)源核酸的控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或b3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含第1項所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。
本發(fā)明進一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的轉(zhuǎn)錄速率已提高或影響的基因修飾微生物，其中ah)與野生型相比，第1項所述的具有啟動子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動子活性是增加的，這些內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄，或bh)以第1項所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有實施方案ah)所述的增加的特異啟動子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中這些基因相對于這些具有啟動子活性的核酸而言是異源的。
就上述方法而言，以第1項所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的第1項所述的具有啟動子活性的核酸進行的微生物中基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)通過以下方式實現(xiàn)bh1)將一種或多種第1項所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸的控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在第1項所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的內(nèi)源核酸的控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或bh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含第1項所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。
本發(fā)明進一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的轉(zhuǎn)錄速率已降低的基因修飾微生物，其中ar)與野生型相比，至少一種第1項所述的具有啟動子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動子活性是降低的，該內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將一種或多種實施方案a)所述的具有已降低的啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有已降低的啟動子活性的核酸的控制下進行至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明進一步涉及基因修飾微生物，其中該基因修飾導(dǎo)致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的表達(dá)速率，且其取決于c)與野生型相比，改變至少一種第2或3項所述的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d)以第2或3項所述的表達(dá)單元，或以具有實施方案a)所述的改變的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中這些基因相對于這些表達(dá)單元而言是異源的。
就上述方法而言，以第2或3項所述的表達(dá)單元，或以如實施方案a)的具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元進行的微生物中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)通過以下方式實現(xiàn)d1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元的控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或d3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
本發(fā)明進一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率已提高或受影響的基因修飾微生物，其中ch)與野生型相比，至少一種第2或3項所述的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，或dh)以第2或3項所述的表達(dá)單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中這些基因相對于這些表達(dá)單元而言是異源的。
就上述方法而言，以第2或3項所述的表達(dá)單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元進行的微生物中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)通過以下方式實現(xiàn)dh1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
本發(fā)明進一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率已降低的基因修飾微生物，其中cr)與野生型相比，至少一種第2或3項所述的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是降低的，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dr)將一種或多種具有已降低的表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有已降低的表達(dá)活性的第2或3項所述的表達(dá)單元的控制下進行至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)。
本發(fā)明進一步涉及基因修飾微生物，其包含第2或3項所述的表達(dá)單元及功能性連接的待表達(dá)基因，其中該基因相對于表達(dá)單元而言是異源的。
該基因修飾微生物特別優(yōu)選包含本發(fā)明的表達(dá)盒。
本發(fā)明特別優(yōu)選涉及包含載體的基因修飾微生物，具體地是包含載體的棒桿菌，所述載體具體地是穿梭載體或質(zhì)粒載體，該載體錨定至少一種如本發(fā)明所定義的重組核酸構(gòu)建物。
在基因修飾微生物的一個優(yōu)選實施方案中，上述基因為編碼來自精細(xì)化學(xué)品的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸中的至少一種。
在基因修飾微生物的一個特別優(yōu)選的實施方案中，上述基因選自編碼來自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中這些基因可任選包含其他調(diào)節(jié)元件。
來自氨基酸的生物合成途徑的優(yōu)選蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
來自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)及基因的特別優(yōu)選實例如上描述于表1及表2中。
優(yōu)選的微生物或基因修飾微生物為細(xì)菌、藻類、真菌或酵母菌。
具體地，特別優(yōu)選的微生物為棒桿菌。
優(yōu)選的棒桿菌為棒桿菌屬細(xì)菌，尤其為谷氨酸棒桿菌菌種、乙酰谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)菌種、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)菌種、熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)菌種、棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)菌種及有效棒桿菌(Corynebacteriumefficiens)菌種；或短桿菌屬細(xì)菌，尤其為黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)菌種、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)菌種及叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatum)菌種。
特別優(yōu)選的棒桿菌屬與短桿菌屬細(xì)菌選自谷氨酸棒桿菌ATCC13032、乙酰谷氨酸棒桿菌ATCC 15806、嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870、熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539、棲糖蜜棒桿菌ATCC 17965、有效棒桿菌DSM 44547、有效棒桿菌DSM 44548、有效棒桿菌DSM 44549、黃色短桿菌ATCC 14067、乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC 13869、叉開短桿菌ATCC 14020、谷氨酸棒桿菌KFCC 10065及谷氨酸棒桿菌ATCC 21608。
縮寫KFCC是指韓國聯(lián)邦菌物保藏中心(Korean Federation ofCulture Collection)，縮寫ATCC是指美國典型培養(yǎng)物保藏中心及縮寫DSM是指德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikrorganismen)。
其他特別優(yōu)選的棒桿菌屬與短桿菌屬細(xì)菌列于表3中









這些縮寫具有以下含義ATCC美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD，美國FERM發(fā)酵研究所，Chiba，日本NRRLARS保藏中心，北方農(nóng)業(yè)研究所(Northern Regional ResearchLaboratory)，Peoria，IL，美國CECT西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(Coleccion Espanola de CultivosTipo)，Valencia，西班牙NCIMB國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen，英國CBS真菌菌種保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures)，Baarn，荷蘭NCTC國立典型培養(yǎng)物保藏中心，London，英國DSMZ德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)，Braunschweig，德國。
通過具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸及本發(fā)明的表達(dá)單元，可能借助于上述本發(fā)明的方法調(diào)節(jié)上述本發(fā)明的基因修飾微生物中的特定生物合成產(chǎn)物的代謝路徑。
基于此目的，例如通過影響或提高某生物合成途徑的基因轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率來增強產(chǎn)生特定生物合成產(chǎn)物的這個代謝路徑，其中增加的蛋白質(zhì)的量導(dǎo)致目的生物合成途徑的這些蛋白質(zhì)的總活性增加，且因此導(dǎo)致通向目的生物合成產(chǎn)物的代謝通量增加。
此外，可通過降低某分支生物合成途徑的基因轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率來減弱從特定生物合成產(chǎn)物分支的代謝路徑，其中降低的蛋白質(zhì)的量導(dǎo)致非目的生物合成途徑的那些蛋白質(zhì)的總活性降低，且因此額外導(dǎo)致通向目的生物合成產(chǎn)物的增加。
本發(fā)明基因修飾微生物能夠產(chǎn)生，例如來自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素的生物合成產(chǎn)物或來自甘油與乙醇的生物合成產(chǎn)物。
因此，本發(fā)明涉及通過培育本發(fā)明的基因修飾微生物來產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的方法。
基于目的生物合成產(chǎn)物，必須提高或降低多種基因的轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率。通常，最好改變多個基因的轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率，即，提高基因組合的轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率和/或降低基因組合的轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率。
在本發(fā)明的基因修飾微生物中，至少一種基因的改變的(即提高的或降低的)轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率是歸因于具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的表達(dá)單元。
另外，基因修飾微生物中其他基因的額外改變的(即額外提高的或額外降低的)轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率可(但不是必需)來自具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的表達(dá)單元。
因此，本發(fā)明進一步涉及通過培育本發(fā)明的基因修飾微生物來產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的方法。
優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物為精細(xì)化學(xué)品。
術(shù)語“精細(xì)化學(xué)品”為本領(lǐng)域所知并且包括由生物產(chǎn)生且用于多種工業(yè)領(lǐng)域中的化合物，所述工業(yè)領(lǐng)域例如(但不限于)醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、化妝品業(yè)、食品業(yè)及飼料業(yè)。這些化合物包括例如酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸的有機酸及蛋白型與非生蛋白氨基酸、嘌呤堿與嘧啶堿、核苷與核苷酸(例如，Kuninaka，A.(1996)在Nucleotides and related compounds，第561-612頁，Biotechnology第6卷，Rehm等人，編者，VCHWeinheim中及其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)中所述的)、類脂類、飽和與不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二醇(例如丙二醇及丁二醇)、糖類(例如透明質(zhì)酸及海藻糖)、芳香化合物(例如芳香胺、香草醛及靛藍(lán))、維生素與輔因子(如Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，第A27卷，“Vitamins”，第443-613頁(1996)VCHWeinheim及其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)中及Ong，A.S.，Niki，E.及Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health and Disease”Proceedingsof the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associationsin Malaysia and the Society for Free Radical Research-Asia，1994年9月1-3日于馬來西亞檳城舉行，AOCS Press(1995)中所述的)、由Gutcho(1983)在Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086及其中所述的參考文獻(xiàn)中所述的酶及所有其他化學(xué)品。某些精細(xì)化學(xué)品的代謝及用途進一步解釋如下。
I.氨基酸的代謝及用途氨基酸包含所有蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位且因此是正常細(xì)胞功能所必需的。術(shù)語“氨基酸”在本領(lǐng)域中是已知的。作為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位的生蛋白氨基酸有20種，其中它們通過肽鍵連接在一起，而非生蛋白氨基酸(其中數(shù)百種是已知的)通常不在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)(參閱Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第A2卷，第57-97頁VCHWeinheim(1985))。雖然L-氨基酸通常是天然存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的僅有類型，但是氨基酸可以是D或L型。20種生蛋白氨基酸中每一種的生物合成和降解途徑已經(jīng)在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中進行了很好表征(例如參閱Stryer，L.Biochemistry，第三版，第578-590頁(1988))。由于其生物合成的復(fù)雜性，因此所謂的“必需”氨基酸(組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸及纈氨酸)必須由飲食攝取，它們通過簡單生物合成途徑轉(zhuǎn)化為其他11種“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸及酪氨酸)。高等動物具有合成這些氨基酸中的一些氨基酸的能力，然而必需氨基酸必須與食物一起攝入來進行正常的蛋白質(zhì)合成。
除了它們在蛋白質(zhì)生物合成中的作用以外，這些氨基酸本身是令人感興趣的化合物，且已發(fā)現(xiàn)它們在食品、飼料、化學(xué)品、化妝品、農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥業(yè)中的多種用途。賴氨酸不僅是人類營養(yǎng)的重要氨基酸，也是例如家禽及豬的單胃物種的重要氨基酸。谷氨酸最常用作調(diào)味添加劑(谷氨酸單鈉，MSG)并且廣泛用于食品業(yè)，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸及半胱氨酸同樣如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸及色氨酸皆用于醫(yī)藥業(yè)中。谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸及丙氨酸用于醫(yī)藥業(yè)及化妝品工業(yè)中。蘇氨酸、色氨酸及D/L-甲硫氨酸廣泛用作飼料添加劑(Leuchtenberger，W.(1996)Amino acids-technical production anduse，第466-502頁，Rehm等人，(編者)Biotechnology第6卷，第14a章，VCHWeinheim)。已發(fā)現(xiàn)這些氨基酸也適用于作為合成以下合成氨基酸及蛋白質(zhì)的前體例如，N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥色氨酸及Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第57-97頁，VCH，Weinheim，1985中所述的其他物質(zhì)。
已經(jīng)很好地表征了這些天然氨基酸在能夠產(chǎn)生它們的生物(例如細(xì)菌)中的生物合成(回顧細(xì)菌氨基酸的生物合成及其調(diào)節(jié)，參閱Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。通過α-酮戊二酸(檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物)的還原性胺化作用合成谷氨酸。由谷氨酸相繼分別產(chǎn)生谷氨酰胺、脯氨酸及精氨酸。絲氨酸的生物合成是由一個3個步驟的方法進行，起始于3-磷酸甘油酸(糖酵解的中間產(chǎn)物)，且在氧化、轉(zhuǎn)氨基及水解步驟之后得到該氨基酸。由絲氨酸分別產(chǎn)生半胱氨酸及甘氨酸，前者通過高胱氨酸與絲氨酸的縮合得到，且后者通過在由絲氨酸轉(zhuǎn)羥甲基酶催化的反應(yīng)中將側(cè)鏈β-碳原子轉(zhuǎn)移至四氫葉酸得到。苯丙氨酸及酪氨酸是在9個步驟的生物合成途徑中，由糖酵解及戊糖磷酸途徑的前體(赤蘚糖4-磷酸及磷酸烯醇丙酮酸)合成，兩者僅在預(yù)苯酸合成后的最后兩個步驟不同。色氨酸同樣是由這兩種起始分子產(chǎn)生，然而其合成在11個步驟的途徑中進行。也可在由苯丙氨酸羥化酶催化的反應(yīng)反應(yīng)中，由苯丙氨酸產(chǎn)生酪氨酸。丙氨酸、纈氨酸及亮氨酸分別為丙酮酸(糖酵解的最終產(chǎn)物)的生物合成產(chǎn)物。天冬氨酸由草酰乙酸(檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物)形成。通過天冬氨酸的轉(zhuǎn)化分別產(chǎn)生天冬酰胺、甲硫氨酸、蘇氨酸及賴氨酸。異亮氨酸由蘇氨酸形成。組氨酸在復(fù)雜的9個步驟的途徑中由5-磷酸核糖1-焦磷酸(活化糖)形成。
超過細(xì)胞中蛋白質(zhì)生物合成所需量的氨基酸無法被儲存，而是被分解，以便提供細(xì)胞的主要代謝路徑的中間產(chǎn)物(回顧，參閱Stryer，L.，Biochemistry，第三版，第21章，“Amino Acid Degradation and the UreaCycle”；第495-516頁(1988))。雖然細(xì)胞能夠?qū)⒉恍枰陌被徂D(zhuǎn)化為有用的代謝中間產(chǎn)物，然而就其合成所需的能量、前體分子及酶而言，氨基酸產(chǎn)生作用成本很高。因此，通過反饋抑制調(diào)節(jié)氨基酸的生物合成并不令人驚訝，其中具體氨基酸的出現(xiàn)減慢或完全終止其自身的產(chǎn)生(回顧氨基酸生物合成途徑中的反饋機制，參閱Stryer，L.，Biochemistry，第三版，第24章，“Biosynthesis of Amino Acids and Heme”，第575-600頁(1988))。因此，具體氨基酸的產(chǎn)量受細(xì)胞中該氨基酸量的限制。
II.維生素、輔因子及營養(yǎng)補充品(Nutraceutical)的代謝及用途維生素、輔因子及營養(yǎng)補充品包含另一類分子。雖然它們易于由其他生物(如細(xì)菌)合成，高等動物已喪失了合成它們的能力，因此需要攝取它們。這些分子本身為生物活性分子或在眾種代謝路徑中作為電子載體或中間產(chǎn)物的生物活性物質(zhì)的前體。除了其營養(yǎng)價值外，這些化合物還具有作為著色劑、抗氧化劑及催化劑或其他加工助劑的明顯工業(yè)價值。(回顧這些化合物的結(jié)構(gòu)、活性及工業(yè)應(yīng)用，例如參閱Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，“Vitamins”，第A27卷，第443-613頁，VCHWeinheim，1996)。術(shù)語“維生素”為本領(lǐng)域所知并且包括生物體正常機能所必需的營養(yǎng)物，然而其不能由生物體自身合成。維生素類可包括輔因子及營養(yǎng)補充品化合物。術(shù)語“輔因子”包括正常酶活性的出現(xiàn)必需的非蛋白質(zhì)化合物。這些化合物可以是有機或無機的；本發(fā)明的輔因子分子優(yōu)選為有機的。術(shù)語“營養(yǎng)補充品”包括在植物和動物、特別是人中具有健康促進作用的食物添加劑。這些分子的實例為維生素、抗氧化劑及某些類脂類(例如多不飽和脂肪酸)。
這些分子在能夠生產(chǎn)它們的生物(如細(xì)菌)中的生物合成已被詳細(xì)地表征(“Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”，第A27卷，第443-613頁，VCHWeinheim，1996，Michal，G.(1999)BiochemicalPathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley &Sons；Ong，A.S.，Niki，E.與Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health andDisease”Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific andTechnological Associations in Malaysia and the Society for free RadicalResearch-亞洲，1994年9月1-3日于馬來西亞檳城舉行，AOCS Press，Champaign，IL X，374S)。
通過嘧啶與噻唑單元的化學(xué)偶合形成硫胺素(維生素B1)。核黃素(維生素B2)是由5’-三磷酸鳥苷(GTP)與5-磷酸核糖合成。核黃素接著用于合成黃素單核苷酸(FMN)與黃素-腺嘌呤二核苷酸(FAD)。此化合物家族統(tǒng)稱為“維生素B6”(例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛5’-磷酸和商業(yè)使用的鹽酸吡哆醇)，其皆為共同結(jié)構(gòu)單元5-羥基-6-甲基吡啶的衍生物。可通過化學(xué)合成或通過發(fā)酵來產(chǎn)生泛酸(Pantothenate)(泛酸(pantothenic acid)，R-(+)-N-(2，4-二羥基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)。泛酸生物合成中的最后步驟由ATP-驅(qū)動的β-丙氨酸與泛解酸縮合組成。在轉(zhuǎn)化成泛解酸、轉(zhuǎn)化成β-丙氨酸及縮合成泛酸的生物合成步驟中發(fā)揮作用的酶是已知的。泛酸的代謝活性形式為輔酶A，其生物合成通過5個酶促步驟進行。泛酸、5-磷酸吡哆醛、半胱氨酸及ATP為輔酶A的前體。這些酶不僅催化泛酸的形成，而且也催化(R)-泛解酸、(R)-泛解酸內(nèi)酯、(R)-泛醇(維生素原B5)、泛酰巰基乙胺(及其衍生物)及輔酶A的產(chǎn)生。
已詳細(xì)研究了微生物中自前體分子庚二酰-輔酶A進行的生物素的生物合成，且已經(jīng)確定了幾個有關(guān)基因。已發(fā)現(xiàn)許多對應(yīng)的蛋白質(zhì)參與Fe簇(Fe cluster)合成中且屬于nifS蛋白質(zhì)類。硫辛酸源自辛酸并且作為能量代謝中的輔酶，它成為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的組成成分。葉酸類為全部衍生自葉酸的一類物質(zhì)，而葉酸依次從L-谷氨酸、對氨基苯甲酸和6-甲基喋呤(methylpterin)衍生而來。已在某些微生物中詳細(xì)研究了起始自代謝中間產(chǎn)物5’-三磷酸鳥苷(GTP)、L-谷氨酸及對氨基苯甲酸的葉酸及其衍生物的生物合成。
類咕啉(例如鈷胺素，特別是維生素B12)及卟啉屬于以四吡咯環(huán)系統(tǒng)為特征的一類化學(xué)品。維生素B12的生物合成是太過復(fù)雜以至于尚未完全了解，然而其涉及的大多數(shù)酶及底物如今是已知的。煙酸(nicotinic acid)(煙酸(nicotinate))及煙酰胺為吡啶衍生物，也將其稱作“尼克酸(niacin)”。尼克酸是重要的輔酶NAD(煙堿酰氨-腺嘌呤二核苷酸)及NADP(煙堿酰氨-腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其還原形式的前體。
雖然這些化合物中的一些已通過大規(guī)模培養(yǎng)微生物來生產(chǎn)，例如核黃素、維生素B6、泛酸及生物素，但是這些化合物在工業(yè)規(guī)模上的生產(chǎn)主要基于無細(xì)胞的化學(xué)合成。只有維生素B12由于其合成的復(fù)雜性而只能通過發(fā)酵生產(chǎn)。體外方法需要相當(dāng)大的材料花費和時間，并且成本常常很高。III.嘌呤、嘧啶、核苷與核苷酸的代謝及用途嘌呤與嘧啶代謝的基因及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)是腫瘤疾病及病毒感染治療的重要目標(biāo)。術(shù)語“嘌呤”或“嘧啶”包含含氮堿基，其是核酸、輔酶及核苷酸的組分。術(shù)語“核苷酸”包含核酸分子的基本結(jié)構(gòu)單位，其包括含氮堿基、戊糖(RNA中該糖為核糖，且DNA中該糖為D-脫氧核糖)及磷酸。術(shù)語“核苷”包含作為核苷酸前體的分子，但與核苷酸相比，其不具有磷酸單元。通過抑制用于形成核酸分子的這些分子的生物合成或其活動來抑制RNA與DNA的合成是可能的；該活動在致癌細(xì)胞中的靶向抑制則能夠抑制腫瘤細(xì)胞分裂和復(fù)制的能力。
還存在不形成核酸分子但作為能量儲存物(AMP)或作為輔酶(即FAD與NAD)的核苷酸。
許多出版物已描述了這些化學(xué)品在那些嘌呤和/或嘧啶代謝受影響的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥中的用途(例如，Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)“Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis aschemotherapeutic agents”，Med.Res.Reviews 10505-548)。嘌呤及嘧啶代謝中涉及的酶的研究集中于新藥的開發(fā)中，例如可用作免疫抑制劑或抗增殖劑(Smith，J.L.“Enzymes in Nucleotide Synthesis”Curr.Opin.Struct.Biol.5(1995)752-757；Biochem.Soc.Transact.23(1995)877-902)。然而，嘌呤堿基及嘧啶堿基、核苷及核苷酸也具有其他可能的用途作為各種精細(xì)化學(xué)品的生物合成的中間產(chǎn)物(例如硫胺素、S-腺苷甲硫氨酸、葉酸或核黃素)；作為細(xì)胞的能量載體(例如ATP或GTP)及作為化學(xué)品本身，其通常用作調(diào)味增強劑(例如IMP或GMP)，或用于許多醫(yī)學(xué)用途中(例如參閱Kuninaka，A.，(1996)“Nucleotides and Related Compounds”inBiotechnology，第6卷，Rehm等人，編者，VCHWeinheim，第561-612頁)。嘌呤、吡啶、核苷或核苷酸代謝中所涉及的酶也日益成為開發(fā)用于保護莊稼的化學(xué)品的目標(biāo)，這些化學(xué)品包括殺真菌劑、除草劑及殺蟲劑。
這些化合物在細(xì)菌中的代謝已被表征(回顧，例如參閱Zalkin，H.與Dixon，J.E.(1992)“De novo purine nucleotide biosynthesis”in Progress inNucleic Acids Research and Molecular biology，第42卷，Academic Press。第259-287頁和Michal，G.(1999)“Nucleotides and Nucleosides”；第8章，Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，Wiley，New York)。作為大量研究的主題的嘌呤代謝是細(xì)胞正常機能所必需的。高等動物中損嘌呤代謝受損可引起例如痛風(fēng)的嚴(yán)重疾病。通過許多步驟從核糖5-磷酸經(jīng)由中間化合物肌苷5’-磷酸(IMP)合成嘌呤核苷酸，，從而導(dǎo)致5’-單磷酸鳥苷(GMP)或5’-單磷酸腺苷(AMP)的產(chǎn)生，自此可易于制備作為核苷酸使用的其三磷酸鹽形式。這些化合物也用作能量儲存物，以便它們的降解作用為在細(xì)胞中許多不同生物化學(xué)過程提供能量。通過從5-磷酸核糖形成5’-單磷酸尿苷(UMP)來進行嘧啶的生物合成。接著UMP轉(zhuǎn)化為5’-三磷酸胞苷(CTP)。所有核苷酸的脫氧形式皆由核苷酸的二磷酸核糖形式在一步還原反應(yīng)中制備而產(chǎn)生核苷酸的二磷酸脫氧核糖形式。在磷酸化作用之后，這些分子能夠參于DNA的合成。
IV.海藻糖的代謝及用途海藻糖由兩個通過α，α-1，1鍵連接在一起的葡萄糖分子組成。其通常在食品業(yè)中用作甜味劑、在干燥或冷凍食品及飲料中作為添加劑。然而，其也用于醫(yī)藥業(yè)、化妝品業(yè)及生物工程業(yè)中(例如參閱Nishimoto等人，(1998)美國專利第5 759 610號；Singer，M.A.與Lindquist，S.Trends Biotech.16(1998)460-467；Paiva，C.L.A.與Panek，A.D.Biotech Ann.Rev.2(1996)293-314及Shiosaka，M.FFIJ.Japan 172(1997)97-102)。海藻糖由多種微生物的酶產(chǎn)生且以天然方式釋放至周圍的介基中，可通過本領(lǐng)域已知的方法將其從中分離。
特別優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物選自有機酸、蛋白質(zhì)、核苷酸與核苷、蛋白型與非生蛋白氨基酸、類脂類與脂肪酸、二醇、糖類、芳香化合物、維生素與輔因子、酶及蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的有機酸為酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸。
優(yōu)選的核苷與核苷酸描述于，例如Kuninaka，A.(1996)Nucleotidesand related compounds，第561-612頁，Biotechnology，第6卷，Rehm等人，編者，VCHWeinheim及其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)中。
其他優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物是的類脂類、飽和及不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸)、例如丙二醇及丁二醇的二醇、例如透明質(zhì)酸及海藻糖的糖類、例如芳香胺、香草醛及靛藍(lán)的芳香化合物、例如Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第A27卷，“Vitamins”，第443-613頁(1996)VCHWeinheim與其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)及Ong，A.S.，Niki，E.與Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health and Disease”Proceedings of theUNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia and the Society for Free Radical Research-Asia，1994年9月1-3日于馬來西亞檳城舉行，AOCS Press(1995))中描述的維生素及輔因子、酶、聚酮化合物(Cane等人(1998)Science 28263-68)及所有其他由Gutcho(1983)描述于Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086及其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)中的化學(xué)品。
特別優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物為氨基酸，特別優(yōu)選必需氨基酸，具體地為L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸及L-蘇氨酸、L-高絲氨酸，尤其為L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸。例如賴氨酸、甲硫氨酸及蘇氨酸的氨基酸在下文的各種情況下均是指氨基酸的L及D型，優(yōu)選為L型，即例如L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸。
具體地，本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率是提高的或受影響的基因修飾微生物來產(chǎn)生賴氨酸的方法，其中ch)與野生型相比，至少一種本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中的基因的表達(dá)，其中這些等基因相對于這些表達(dá)單元而言是異源的，且其中這些基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR1的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼精氨酰-tRNA合成酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼蛋白質(zhì)OpcA的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸及編碼6-磷酸果糖激酶的核酸。
就上述方法而言，以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實施方案ch)所述的增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元進行的微生物中這些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是通過以下方式實現(xiàn)
dh1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將這些基因中的一種或多種導(dǎo)入微生物基因組中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
用于制備賴氨酸的上述方法的另一個優(yōu)選實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，該活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫羧酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR1的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2的活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、賴氨酸輸出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素連接酶活性。
用于制備賴氨酸的上述方法的另一個特別優(yōu)選的實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，該活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高絲氨酸激酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、蘇氨酸輸出子活性、蘇氨酸排出蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性及蘇氨酸合酶活性。
可用(但不是必需)具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸和/或本發(fā)明的表達(dá)單元引起上述這些額外增加或降低的活性中的至少一種。
本發(fā)明進一步涉及通過培養(yǎng)與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率已提高的或受影響的基因修飾微生物來產(chǎn)生甲硫氨酸的方法，其中ch)與野生型相比，至少一種本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，該內(nèi)源表達(dá)單元可調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中這些基因相對于這些表達(dá)單元而言是異源的，且其中這些基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼胱硫醚γ合酶的核酸、編碼胱硫醚β裂合酶的核酸、編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的核酸、編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的核酸、編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼半胱氨酸合酶I的核酸、編碼半胱氨酸合酶II的核酸、編碼輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白NADPH-還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247的核酸、編碼RXA0655調(diào)節(jié)物的核酸及編碼RXN2910調(diào)節(jié)物的核酸。
就上述方法而言，以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實施方案ch)所述的增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元進行的微生物中這些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是通過以下方式實現(xiàn)dh1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的控制下進行這些內(nèi)源基因中的一種或多種的表達(dá)，或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
用于制備甲硫氨酸的上述方法的另一個優(yōu)選實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，該活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、胱硫醚γ合酶活性、胱硫醚β裂合酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、亞甲基四氫葉酸還原酶活性、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸絲氨酸磷酸酶活性、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶活性、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶活性、鐵氧還蛋白NADPH-還原酶活性、鐵氧還蛋白活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247的活性、RXA655調(diào)節(jié)物的活性及RXN2910調(diào)節(jié)物的活性。
上述用于制備甲硫氨酸的方法的另一個特別優(yōu)選的實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，該活性選自高絲氨酸激酶活性、蘇氨酸脫水酶活性、蘇氨酸合酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性及二氨基吡啶甲酸脫羧酶活性。
可用(但不是必需)具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸和/或本發(fā)明的表達(dá)單元引起上述這些額外增加或降低的活性中的至少一種。
本發(fā)明進一步涉及通過培養(yǎng)與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率已提高或影響的基因修飾微生物來制備蘇氨酸的方法，其中ch)與野生型相比，至少一種本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中這些基因相對于這些表達(dá)單元而言是異源的，且其中這些基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸激酶的核酸、編碼蘇氨酸合酶的核酸、編碼蘇氨酸輸出子載體的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼蘇氨酸排出蛋白的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼OpcA蛋白質(zhì)的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸、編碼6-磷酸果糖激酶的核酸及編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸。
就上述方法而言，以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實施方案ch)所述的增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中這些基因的表達(dá)通過以下方式實現(xiàn)dh1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的控制下進行這些內(nèi)源基因中一種或多種的表達(dá)，或dh2)將這些基因中的一種或多種導(dǎo)入微生物基因組中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
上述用于制備蘇氨酸的方法的另一個優(yōu)選實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，該活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、蘇氨酸合酶活性、蘇氨酸輸出子載體活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、高絲氨酸激酶活性、生物素連接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、蘇氨酸排出蛋白活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性及高絲氨酸脫氫酶活性。
上述用于制備蘇氨酸的方法的另一個特別優(yōu)選的實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，該活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性、賴氨酸輸出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸還原異構(gòu)酶活性、支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、二羥基-酸脫水酶活性及二氨基吡啶甲酸脫羧酶活性。
可用(但不是必需)具有啟動子活性的本發(fā)明的核酸和/或本發(fā)明的表達(dá)單元引起上述這些額外增加或降低的活性中的至少一種。
術(shù)語蛋白質(zhì)的“活性”在酶的情況下是指對應(yīng)蛋白質(zhì)的酶活性，且在其他蛋白質(zhì)，如結(jié)構(gòu)蛋白或轉(zhuǎn)運蛋白的情況下是指蛋白質(zhì)的生理活性。
酶通常能將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，或催化該轉(zhuǎn)化步驟。
因此，酶的“活性”是指在特定時間內(nèi)由酶轉(zhuǎn)化的底物的量，或所形成的產(chǎn)物的量。
因此，當(dāng)與野生型相比活性增加時，在特定時間內(nèi)由酶所轉(zhuǎn)化的底物的量或所形成的產(chǎn)物的量與野生型相比是增加的。
就本文中所述的所有活性而言，“活性”的增加優(yōu)選達(dá)到“野生型活性”的至少5％、進一步優(yōu)選為“野生型活性”的至少20％、進一步優(yōu)選為“野生型活性”的至少50％、進一步優(yōu)選為“野生型活性”的至少100％、更優(yōu)選為“野生型活性”的至少300％、更進一步優(yōu)選為“野生型活性”的至少500％、特別優(yōu)選為“野生型活性”的至少600％。
因此，當(dāng)與野生型相比活性降低時，在特定時間內(nèi)由酶轉(zhuǎn)化的底物的量或形成的產(chǎn)物的量與野生型相比是減少的。
降低的活性優(yōu)選是指微生物中此酶功能性會基于多種細(xì)胞生物學(xué)機制而部分或基本上完全抑制或阻斷。
活性的降低包含酶數(shù)量的減少至酶基本上完全沒有(即，缺乏對應(yīng)活性的可檢測性或缺乏酶的免疫可檢測性)。與野生型相比，微生物中活性優(yōu)選降低至少5％，進一步優(yōu)選降低至少20％，進一步優(yōu)選降低至少50％，進一步優(yōu)選降低100％。具體地，“降低”也是指對應(yīng)的活性的完全失去。
通過已知的方法，例如酶分析法可測定基因修飾微生物及野生型中特定酶的活性，且由此測定酶活性的增加或降低。
例如，丙酮酸羧化酶是指表現(xiàn)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此，丙酮酸羧化酶活性是指在特定時間內(nèi)由丙酮酸羧化酶蛋白轉(zhuǎn)化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量。
因此，當(dāng)與野生型相比丙酮酸羧化酶活性增加時，在特定時間內(nèi)由丙酮酸羧化酶蛋白轉(zhuǎn)化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量與野生型相比是增加的。
丙酮酸羧化酶活性的這種增加優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少5％、進一步優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少20％、進一步優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少50％、進一步優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少100％、更優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少300％、更進一步優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少500％、特別優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少600％。
此外，例如烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的酶活性。
烯醇丙酮酸磷酸羧激酶是指表現(xiàn)將草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指在特定時間內(nèi)由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白轉(zhuǎn)化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量。
因此，當(dāng)與野生型相比烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性降低時，在特定時間內(nèi)由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白轉(zhuǎn)化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量與野生型相比是降低的。
烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的降低包含烯醇丙酮酸磷酸羧激酶數(shù)量的降低至烯醇丙酮酸磷酸羧激酶基本上完全沒有(即，缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的可檢測性或缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的免疫可檢測性)。與野生型相比，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性優(yōu)選降低至少5％、進一步優(yōu)選降低至少20％、進一步優(yōu)選降低至少50％、進一步優(yōu)選降低100％。具體地，“降低”也是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的完全失去。
可以多種方式額外增加活性，例如通過在表達(dá)及蛋白質(zhì)水平上關(guān)閉抑制調(diào)節(jié)機制，或通過增加與野生型相比的編碼上述蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá)。
同樣地，可以多種方式增加與野生型相比的編碼上述蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá)，例如通過激活物誘導(dǎo)該基因，或如上所述，通過增加啟動子活性或增加表達(dá)活性或通過將一種或多種基因拷貝導(dǎo)入微生物中。
根據(jù)本發(fā)明，增加編碼蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá)也是指操縱微生物內(nèi)在的內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)。
如上所述，這可通過例如改變啟動子和/或基因的表達(dá)單元序列來實現(xiàn)。例如，可通過缺失或插入DNA序列來進行這種改變，這種改變導(dǎo)致基因表達(dá)速率提高。
如上所述，通過施加外源刺激來改變內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)是可能的。這可通過特定的生理條件進行，即通過外源物質(zhì)的使用。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可借助于其他不同的方法(單獨或組合)來實現(xiàn)基因表達(dá)的增加。因此，例如可增加合適基因的拷貝數(shù)，或可使啟動子及調(diào)節(jié)區(qū)或位于結(jié)構(gòu)基因上游的核糖體結(jié)合位點突變。另外，可能通過誘導(dǎo)型啟動子在發(fā)酵生產(chǎn)過程中增加表達(dá)。延長mRNA存在時間的方法可同樣增加表達(dá)。通過防止酶蛋白的降解同樣也可增強酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建物可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或整合到染色體中并擴增?；蛘?，也可通過改變培養(yǎng)基的組成及對培養(yǎng)的管理來達(dá)到相關(guān)基因的過表達(dá)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可尤其在Martin等人(Biotechnology 5，137-146(1987))、Guerrero等人(Gene 138，35-41(1994))、Tsuchiya與Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))、Eikmanns等人(Gene 102，93-98(1991))、歐洲專利第0472869號、美國專利第4,601,893號、Schwarzer與Piihler(Biotechnology 9，84-87(1991))、Reinscheid等人(Applied andEnvironmental Microbiology 60，126-132(1994))、LaBarre等人(Journal ofBacteriology 175，1001-1007(1993))、專利申請WO 96/15246、Malumbres等人(Gene 134，15-24(1993))、日本公開的說明書JP-A-10-229891、Jensen與Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58，191-195(1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60512-538(1996))及眾所周知的遺傳與分子生物學(xué)教科書中發(fā)現(xiàn)對此的指導(dǎo)。
此外，除了基因的表達(dá)或增強作用，消除有害的副反應(yīng)對產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物，尤其是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸是有利的(Nakayama“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”，Overproduction ofMicrobial Products，Krumph anzl，Sikyta，Vanek(編者)，Academic Press，London，英國，1982)。
在一個優(yōu)選實施方案中，通過將至少一種編碼對應(yīng)蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入微生物中來增加編碼上述蛋白質(zhì)之一的核酸的基因表達(dá)?？稍谌旧w上或染色體外進行核酸導(dǎo)入，即通過增加染色體上的拷貝數(shù)和/或增加在宿主微生物中復(fù)制的質(zhì)粒上的基因的拷貝。
核酸的導(dǎo)入(例如，以包含該核酸的表達(dá)盒形式)優(yōu)選在染色體上進行，具體地，通過上述SacB方法進行。
原則上，為了這個目的可能使用任何編碼上述蛋白質(zhì)之一的基因。
在真核來源的包含內(nèi)含子的基因組核酸序列的情況下，若宿主微生物不能表達(dá)對應(yīng)蛋白質(zhì)或不能使其表達(dá)對應(yīng)蛋白質(zhì)，則優(yōu)選使用已經(jīng)處理過的核酸序列，例如對應(yīng)的cDNA。
對應(yīng)基因的實例列于表1及表2中。
優(yōu)選通過以下方法中的至少一種降低微生物中的上述活性·導(dǎo)入至少一種用于誘導(dǎo)共抑制的有義核糖核酸序列或確保其表達(dá)的表達(dá)盒·導(dǎo)入至少一種針對對應(yīng)基因、RNA或蛋白質(zhì)的DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合因子或確保其表達(dá)的表達(dá)盒·導(dǎo)入至少一種引起RNA降解的病毒核酸序列或確保其表達(dá)的表達(dá)盒·導(dǎo)入至少一種產(chǎn)生功能缺失的構(gòu)建物，所述功能缺失是例如通過在基因中產(chǎn)生插入、缺失、倒置或突變在閱讀框內(nèi)產(chǎn)生例如終止密碼子或移位?？赡懿?yōu)選通過同源重組來靶向插入至目的靶基因中，或?qū)脶槍Π谢虻男蛄刑禺愋院怂崦竵懋a(chǎn)生敲除突變體。
·導(dǎo)入具有降低的啟動子活性的啟動子或?qū)刖哂薪档偷谋磉_(dá)活性的表達(dá)單元。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道在本發(fā)明的范疇內(nèi)還可使用其他方法來降低其活性或功能。例如，導(dǎo)入蛋白質(zhì)的顯性失活變體或確保其表達(dá)的表達(dá)盒也可是可行的。
此外，這些方法中的每一個均可能引起蛋白質(zhì)的量、mRNA的量和/或蛋白質(zhì)的活性降低。也可以想到這些方法的組合使用。其他方法對為本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的，其包含阻止或抑制蛋白質(zhì)的加工、蛋白質(zhì)或其mRNA的轉(zhuǎn)運、抑制染色體附著、抑制RNA剪接、誘導(dǎo)降解RNA的酶和/或抑制翻譯延伸或終止。
在用于產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的本發(fā)明方法中，優(yōu)選在培養(yǎng)基因修飾微生物的步驟之后從微生物和/或自發(fā)酵肉湯中分離生物合成產(chǎn)物。這些步驟可同時和/或優(yōu)選在培育步驟之后進行。
可用分批法(分批培育)或補料分批法或重復(fù)補料分批法培養(yǎng)本發(fā)明的基因修飾微生物，連續(xù)或間斷地產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物，特別是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸。已知培育方法的概述可在Chmiel(BioprozeBtechnik1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))的教科書或Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))的教科書中發(fā)現(xiàn)。
待使用的培養(yǎng)基必須以適當(dāng)?shù)胤绞綕M足每個菌株的要求。在“Manualof Methods for General Bacteriology”of the American Society forBacteriology(Washington D.C.，美國，1981)手冊中描述了用于各種微生物的培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明，這些可使用的培養(yǎng)基通常包含一種或多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和/或微量元素。
優(yōu)選的碳源為例如單糖、二糖或多糖的糖。非常好的碳源的實例為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。也可以例如糖蜜的復(fù)合化合物或糖精制的其他副產(chǎn)物將糖置于培養(yǎng)基中。添加各種碳源的混合物也是有益的。其他可能的碳源為油及脂肪，例如大豆油、葵花子油、花生油及椰子脂肪；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸或亞油酸；醇，例如甘油、甲醇或乙醇以及有機酸，例如乙酸或乳酸。
氮源通常為有機或無機氮化合物或含有這些化合物的物質(zhì)。氮源的實例包括氨氣或例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨的銨鹽、硝酸鹽、尿素、氨基酸或例如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其他物質(zhì)的復(fù)合氮源。氮源可單獨使用或作為混合物使用。
可存在于培養(yǎng)基中的無機鹽化合物包含鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅及鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽。
為了產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，尤其是甲硫氨酸，可能使用以下物質(zhì)作為硫源例如硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物的無機化合物及例如硫醇及某硫醇(thiol)的有機硫化合物。
可能使用以下物質(zhì)作為磷源磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或?qū)?yīng)的含鈉鹽。
為了使溶液中存在金屬離子，可將螯合劑添加到培養(yǎng)基中。尤其適合的螯合劑包含例如兒茶酚或原兒茶酸鹽的二羥基酚類(dihydroxyphenol)，或例如檸檬酸的有機酸。
根據(jù)本發(fā)明，所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基通常也包含例如維生素或生長促進劑的其他生長因子，其包括，例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸及吡哆醇。生長因子及鹽常常來自例如酵母提取物、糖蜜、玉米漿及其類似物的培養(yǎng)基的復(fù)合成份。也可將合適的前體添加至培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中化合物的精確組成很大程度上視具體實驗而定，且將由各具體狀況分別確定。最優(yōu)化的培養(yǎng)基的信息獲自教科書“Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach”(編者為P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73頁，ISBN 0 19 963577 3)。也可從例如Standard 1(Merck)或BHI(腦心浸出液，DIFCO)等商業(yè)供應(yīng)商購得生長培養(yǎng)基。
將培養(yǎng)基的所有成分通過加熱(1.5巴和121℃下20分鐘)或無菌過濾滅菌。可將成分一起滅菌或視需要分開滅菌。所有培養(yǎng)基成分可在培養(yǎng)開始即存在或任選連續(xù)或分批加入。
培養(yǎng)物的溫度通常在15℃與45℃之間，優(yōu)選在25℃至40℃，且在實驗過程中可保持恒定或變化。培養(yǎng)基的pH值應(yīng)處于5至8.5的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約7.0。在培養(yǎng)期間可通過添加例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水的堿性化合物或例如磷酸或硫酸的酸性化合物來控制培養(yǎng)需要的pH值?？赏ㄟ^使用例如脂肪酸聚二乙醇酯的防泡劑來控制泡沫的形成?？赏ㄟ^向培養(yǎng)基中添加具有選擇作用的合適物質(zhì)，例如抗生素來維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過向培養(yǎng)基中導(dǎo)入氧或含氧氣體混合物(例如周圍的空氣)來維持需氧條件。培養(yǎng)物的溫度通常為20℃至45℃。培養(yǎng)持續(xù)進行到目的產(chǎn)物的形成達(dá)到最大量。通常在10小時至160小時內(nèi)達(dá)到該目標(biāo)。
以該方式得到的發(fā)酵肉湯的干物質(zhì)含量通常為7.5至25重量％。
此外，最好至少還在發(fā)酵末期進行糖限制(sugar limitation)，但具體地，在超過經(jīng)發(fā)酵時間的至少30％時進行。這是指在這段時間內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基中可利用的糖濃度保持在0至3g/l或是降低的。
根據(jù)目的生物合成產(chǎn)物及該生物合成的副產(chǎn)物的物理/化學(xué)特性，以本身已知方式從發(fā)酵肉湯和/或微生物中分離生物合成產(chǎn)物。
例如，可接著進一步處理發(fā)酵肉湯。視需要而定，可用分離方法(例如離心、過濾、傾析或這些方法的組合)從發(fā)酵肉湯中全部或部分移除生物質(zhì)或?qū)⑵淙勘Ａ粲谄渲小?br> 接著可用已知方法濃縮發(fā)酵肉湯，例如借助于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器、降膜式蒸發(fā)器濃縮發(fā)酵肉湯通過逆滲透或納米過濾，。然后通過冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧造粒或其他方法來處理該濃縮的發(fā)酵肉湯。
另外，也可能進一步純化生物合成產(chǎn)物，尤其是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸?；诖四康模诔ド镔|(zhì)之后，使用適合的樹脂對含有產(chǎn)物的肉湯進行層析，目的產(chǎn)物或雜質(zhì)全部或部分地保留于層析樹脂上。若需要，則可使用相同或不同層析樹脂重復(fù)進行這些層析步驟。本領(lǐng)域的技術(shù)人員精通于選擇適合的層析樹脂及其最有效的使用方法。純化的產(chǎn)物可通過過濾或超濾來濃縮，并保存于產(chǎn)物的穩(wěn)定性最大的溫度下。
生物合成產(chǎn)物可以各種形式得到，例如以其鹽或酯的形式。
可用現(xiàn)有技術(shù)測定分離的化合物的特性及純度。這些現(xiàn)有技術(shù)包含高效液相層析法(HPLC)、光譜法、染色法、薄層層析法、NIRS、酶測定或微生物測定。這些分析方法概述于Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya 11 27-32及Schmidt等人(1998)Bioprocess Engineer.1967-70.Ulmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry(1996)第A27卷，VCHWeinheim，第89-90頁、第521-540頁、第540-547頁、第559-566頁、575-581頁及第581-587頁；Michal，G(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and MolecularBiology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等人(1987)Applications of HPLCin Biochemistry inLaboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，第17卷中。
實施方案現(xiàn)通過以下非限定性實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明實施例1質(zhì)粒pCIS lysC的構(gòu)建在菌株構(gòu)建的第一個步驟中，在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中進行l(wèi)ysC野生型基因的等位基因交換。在這種狀況下，在lysC基因中進行核苷酸交換以便在所得到的蛋白質(zhì)中位置311上的氨基酸Thr被Ile替換。從作為PCR反應(yīng)模板的來自ATCC 13032的染色體DNA起始，按照產(chǎn)品說明書借助于Pfu-Turbo PCR系統(tǒng)(Stratagene USA)并使用寡核苷酸引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6擴增lysC。
SEQ ID NO55’-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3’SEQ ID NO65’-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3’如Tauch等人(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 1401817-1828所述從谷氨酸棒桿菌ATCC 13032制備染色體DNA。在擴增片段的5’端為SalI限制性位點且其3’端為MluI限制性位點?？寺≈埃赃@兩種限制性酶消化所擴增的片段并使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)純化。
通過SalI和MluI限制性位點將所得的多核苷酸克隆至下文中稱為pCIS的pCLIK5MCS整合型SacB(SEQ ID NO7)并轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌XL-1blue中。通過涂布于含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上對含有質(zhì)粒的細(xì)胞進行篩選。分離質(zhì)粒且通過測序來證實預(yù)期核苷酸序列。通過多種方法并使用來自Qiagen的材料制備質(zhì)粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy ofSciences USA 745463-5467所述進行測序反應(yīng)。使用ABI prism 377(PEApplied Biosystems，Weiterstadt)對測序反應(yīng)進行分離和測定。將所得到的質(zhì)粒pCIS lysC列為SEQ ID NO8。
實施例2來自谷氨酸棒桿菌的lysC基因的誘變按照產(chǎn)品說明書使用Quickchange試劑盒(kit)(來自Stratagene/美國)將來自谷氨酸棒桿菌的lysC基因定向誘變。在質(zhì)粒pCIS lysC(SEQ IDNO25)中進行誘變。為了通過Quickchange方法(Stratagene)由thr 311交換成311ile，合成以下寡核苷酸引物SEQ ID NO95’-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3’SEQ ID NO105’-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3’這些寡核苷酸引物在Quickchange反應(yīng)中的使用導(dǎo)致在lysC基因SEQ ID NO11中932位上核苷酸的交換(由C交換成T)。在轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌XL1-blue中并制備質(zhì)粒之后，通過測序反應(yīng)證實了lysC基因中發(fā)生氨基酸交換Thr311Ile。所得到的質(zhì)粒命名為pCIS lysC thr311ile并列于SEQ ID NO12。
如Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303所述，通過電穿孔將質(zhì)粒pCIS lysC thr311ile轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中。對該方案的修改描述于DE 10046870中。使用如Sambrook等人(1989)，Molecular cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過Southern印跡及雜交來檢查各個轉(zhuǎn)化體lysC基因座上的染色體排列。此舉確保轉(zhuǎn)化體已通過同源重組在lysC基因座上整合了所轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。此類菌落在不含抗生素的培養(yǎng)基中生長過夜之后，將細(xì)胞涂布于蔗糖CM瓊脂培養(yǎng)基(10g/l蛋白胨、5g/l牛肉膏、5g/l酵母提取物、2.5g/lNaCl、2g/l尿素、1％葡萄糖、10％蔗糖，pH 6.8)上并于30℃下培養(yǎng)24小時。
由于載體pCIS lysC thr311ile中所存在的sacB基因?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為有毒產(chǎn)物，因此能夠生長的菌落僅僅為通過野生型lysC基因與所突變lysCthr311ile基因之間的第二個同源重組步驟而缺失sacB基因的那些菌落。在同源重組過程中，或者是野生型基因或者是突變的基因與sacB基因一起缺失。SacB基因與野生型基因的缺失導(dǎo)致產(chǎn)生突變的轉(zhuǎn)化體。
挑取生長菌落并研究其卡那霉素敏感性表型。缺失SacB基因的菌落必須同時顯示出卡那霉素敏感性生長行為。在搖瓶中研究此類卡那霉素敏感性克隆的賴氨酸生產(chǎn)力(見實施例6)。培養(yǎng)未經(jīng)處理的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032以用于對照。選擇與對照組相比賴氨酸生產(chǎn)提高的菌落，分離染色體DNA，通過PCR反應(yīng)擴增lysC基因的相應(yīng)區(qū)并測序。將具有增加的賴氨酸合成特性且在lysC的932位上具有所證實突變的該克隆稱作ATCC13032lysCfbr。
實施例3用于借助于異源表達(dá)單元Psod(SEQ.ID.2)使lysC基因過表達(dá)整合型質(zhì)粒的制備定義以下寡核苷酸用于擴編碼超氧化物歧化酶的基因的啟動子。
SEQ ID 13sod85′-accctggcggaaaccctgagtcg-3′SEQ ID 14sod15′-tacgaccagggccacgggtaaaaaatcctttcgtaggtttccgcaccgagcatatacatcttttg-3′
該引物與來自谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的染色體DNA一起用于PCR反應(yīng)。使用該方法可以擴增對應(yīng)于預(yù)期大小(約657bp)的DNA片段。
定義以下寡核苷酸用于擴增編碼天冬氨酸激酶的基因。
SEQ ID 15lysC25′-cctacgaaaggattttttacccgtggccctggtcgtacag-3′SEQ ID 16lysC65′-gattagtggaacctcgtcgtc-3′引物與來自谷胺酸棒狀桿菌ATCC 13032lysCfbr的染色體DNA一起用于PCR反應(yīng)中。可能用此方式擴增對應(yīng)于預(yù)期大小(1638bp)的DNA片段。
引物sod1及ask2含有重疊序列且于5′末端彼此同源。
將以上所得的PCR產(chǎn)物用作下一個PCR的模板，在該PCR中使用以下引物。
SEQ ID 17sod45′-gcggcgcaggattttctaa-3′SEQ ID 18lysC45′-tcggttgcctgagtaatgtctt-3′以該方式擴增相當(dāng)于預(yù)期大小(1811bp)的DNA片段是可能的。接著，將該Psod/lysC融合體克隆至載體pCR2.1(獲自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany)中。在接下來的步驟中，來自質(zhì)粒pCR2.1(獲自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany)的該Psod/lysC融合體作為1773bp的EcoRI片段克隆至已經(jīng)過限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI切割的整合載體pK19mob sacB SEQ ID NO 19中。將得到的質(zhì)粒稱作pk19mob sacB Psod/lysC。
為了擴增lysC基因的5’區(qū)域，定義以下寡核苷酸SEQ ID 20lysC235′-caccgcggctttggacatcactgctac-3′SEQ ID 21lysC245′-cctggggctttagcggatgcgtctca-3′該引物與來自谷氨酸棒桿菌的染色體DNA一起用于PCR反應(yīng)中?？梢栽摲绞綌U增相當(dāng)于預(yù)期大小(674bp)的DNA片段。將該DNA片段克隆至載體pCR2.1(獲自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany)中。隨后，接著將787bp的SpeI/XbaI片段克隆至已經(jīng)過限制酶NheI消化的載體pK19mobsacB Psod lysC中。將得到的質(zhì)粒稱作pK19mob sacB Psod lysC+US(SEQ.ID.NO.22)。至該步驟，所有的克隆均在大腸桿菌XL-1Blue(獲自Stratagene，Amsterdam，Netherlands)中進行。
接著，如Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303所述，使用轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pK19mob sacB Psod lysC+US與質(zhì)粒pTc15AcglM一起轉(zhuǎn)化大腸桿菌Mn522(獲自Stratagene，Amsterdam，Netherlands)。根據(jù)谷氨酸棒桿菌的甲基化模式(DE 10046870)，質(zhì)粒pTc15AcglM使得DNA能夠甲基化。隨后該步驟使谷氨酸棒桿菌與整合質(zhì)粒pK19mob sacB Psod lysC+US一起經(jīng)受電穿孔。該電穿孔及隨后在含有卡那霉素(25μg/ml)的CM平板上的選擇產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)接合子。
為了對導(dǎo)致載體與lysC啟動子及l(fā)ysC基因缺失的第二個同源重組步驟進行選擇，將這些轉(zhuǎn)接合子在不含卡那霉素的CM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，接著涂布在含有10％蔗糖的CM平板上進行選擇。載體pK19mob sacB中所存在的sacB基因編碼酶levansucrase，并導(dǎo)致生長在蔗糖上的微生物合成果聚糖。由于果聚糖對谷氨酸棒桿菌有毒，因此能夠生長在含蔗糖的培養(yǎng)基上的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞僅僅是那些通過第二個同源重組步驟缺失整合質(zhì)粒的細(xì)胞(Jger等人，Journal of Bacteriology 174(1992)5462-5466)。檢查100個抗蔗糖克隆的卡那霉素敏感性?？梢宰C明57個所檢測的克隆不僅對蔗糖具有抗性且對卡那霉素具有敏感性。使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢查Psod表達(dá)單元置換天然表達(dá)單元的期望置換是否發(fā)生。從起始菌株及用于該分析的20個克隆中分離染色體DNA。基于此目的，以牙簽將各個克隆自瓊脂平板上移出，懸浮于100μl H2O中，并于95℃下煮沸10分鐘。10μl所得溶液在PCR中用作模板。所用引物是與Psod表達(dá)單元及l(fā)ysC基因同源的寡核苷酸。
PCR條件選擇如下95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒；55℃雜交30秒；72℃擴增2分鐘；30個循環(huán)；72℃最終延伸5分鐘。在具有起始菌株的DNA的混合物中，由于寡核苷酸的選擇不可能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。只有其中第二個同源重組步驟影響Psod對天然啟動子(PlysC)的置換的克隆出現(xiàn)期望的340bp大小的條帶。所測試的20個克隆中總共有2個為陽性。
實施例4天冬氨酸激酶(lysC)測定法在30℃下將包含帶有天然啟動子的lysCfbr基因的染色體拷貝或PeftulysCfbr構(gòu)建物的染色體拷貝的谷氨酸棒桿菌株于CM培養(yǎng)基(10g/l蛋白胨、5g/l牛肉膏、5g/l酵母提取物、2.5g/l NaCl、2g/l尿素、1％葡萄糖，pH 6.8)中培養(yǎng)直至OD600為8。將細(xì)胞于4℃下旋轉(zhuǎn)離心，然后用冷的Tris-HCl緩沖液(0.1％，pH 8.0)將細(xì)胞洗滌兩次。重新離心之后，將細(xì)胞溶解于冷的Tris-HCl緩沖液(0.1％，pH 8.0)中并調(diào)整至OD600為160。為了使細(xì)胞破裂，將1ml該細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至來自Hybaid的2ml Ribolyser管中，以6.0的旋轉(zhuǎn)設(shè)定值在來自Hybaid的Ribolyser中裂解三次，每次30秒。通過在4℃下以15,000轉(zhuǎn)/分于Eppendorf離心機中離心30分鐘使裂解物澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf杯中。如Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72248-254中所述測定蛋白質(zhì)含量。
天冬氨酸激酶的酶活性測定如下。在30℃下，將1ml反應(yīng)混合物(含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、600mM羥胺HCl(用10NKOH調(diào)至pH 7.0)、4mM ATP、200mM天冬氨酸鹽(鈉鹽))與額外1mlH2O孵育10分鐘，通過加入個別蛋白質(zhì)裂解物開始分析并且在30℃下孵育30分鐘。通過向反應(yīng)混合物中加入1ml終止溶液(10％氯化鐵、3.3％三氯乙酸、0.7N NaCl)以終止反應(yīng)。離心步驟之后，測量上清液的OD540。在該狀況下，1單位相當(dāng)于每分鐘每mg蛋白質(zhì)形成1nmol天冬氨酸異羥肟酸。
結(jié)果示于表1a。
表1a


可以通過將Psod lysC構(gòu)建物整合入染色體中使天冬氨酸激酶活性加倍。
實施例5賴氨酸的生產(chǎn)為了研究Psod lysC構(gòu)建物對賴氨酸生產(chǎn)的作用，在30℃下將菌株ATCC13032、ATCC13032lysCfbr或ATCC13032Psod lysCfbr于CM平板(10.0g/l D-葡萄糖、2.5g/l NaCl、2.0g/l尿素、10.0g/l細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco)、5.0g/l酵母提取物(Difco)、5.0g/l牛肉膏(Difco)、22.0g/l瓊脂(Difco)，經(jīng)高壓滅菌(121℃下20分鐘))上培養(yǎng)2天。接著將細(xì)胞從平板上刮下并懸浮于鹽水中。就主要培養(yǎng)物而言，將10ml培養(yǎng)基I及0.5g經(jīng)高壓滅菌的CaCO3(Riedel de Haen)置于100ml Erlenmeyer燒瓶中，用細(xì)胞懸浮液接種直至OD600為1.5，在Infors AJ118(來自Infors，Bottmingen，瑞士)型搖床上于220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)39小時。然后確定分泌至培養(yǎng)基中的賴氨酸濃度。
培養(yǎng)基I40g/l 蔗糖60g/l 糖蜜(以100％糖含量計算)10g/l(NH4)2SO40.4g/l MgSO4·7H2O0.6g/l KH2PO40.3mg/l 硫胺素·HCl1mg/l 生物素(來自1mg/ml儲存溶液，該儲存溶液已通過過濾除菌并用NH4OH調(diào)整至pH 8.0)2mg/lFeSO4
2mg/lMnSO4用NH4OH調(diào)整至pH 7.8，高壓滅菌(121℃，20分鐘)。
此外，加入維生素B12(羥鈷胺素，Sigma Chemicals)儲存溶液(200μg/ml，通過過濾除菌)直至維生素B12終濃度為100μg/l。
在Agilent 1100系列LC系統(tǒng)HPLC上通過Agilent高壓液相層析測定氨基酸濃度。用鄰苯二甲醛進行柱前衍生化作用允許對所形成的氨基酸進行定量，并且在Hypersil AA柱(Agilent)上將氨基酸混合物分級分離。
研究結(jié)果示于表2a。
表2a

實施例6制備載體pCLiK5MCS首先，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO23與SEQ ID NO24，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴增氨芐青霉素(ampicillin)抗性及載體pBR322的復(fù)制起點。
SEQ ID NO235’-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3’SEQ ID NO245’-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3’除了pBR322的互補序列外，寡核苷酸引物SEQ ID NO23沿5’-3’方向含有限制性內(nèi)切核酸酶SmaI、BamHI、NheI及AscI的酶切位點，寡核苷酸引物SEQ ID NO24沿5’-3’方向含有限制性內(nèi)切核酸酶XbaI、XhoI、NotI及DraI的酶切位點。通過例如Innis等人(PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press(1990))的標(biāo)準(zhǔn)方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，美國)進行PCR反應(yīng)。根據(jù)產(chǎn)品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Gel Band purificationkit)(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)純化得到的約2.1kb大小的DNA片段。根據(jù)產(chǎn)品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該DNA片段的平末端連接在一起，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過涂布在含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。
根據(jù)產(chǎn)品說明書使用Qiaprep離心式小量制備試劑盒(Qiaprep spinmniprep kit)(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質(zhì)粒DNA，且通過限制性內(nèi)切酶消化來檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiK1。
從作為PCR反應(yīng)模板的質(zhì)粒pWLT1(Liebl等人，1992)開始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO25與SEQ ID NO26擴增卡那霉素抗性盒。
SEQ ID NO255’-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3’SEQ ID NO265’-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3’除了pWLT1的互補序列外，寡核苷酸引物SEQ ID NO25沿5’-3’方向含有限制性內(nèi)切核酸酶XbaI、SmaI、BamHI、NheI的酶切位點，寡核苷酸引物SEQ ID NO26沿5’-3’方向含有限制性內(nèi)切核酸酶AscI及NheI的酶切位點。通過例如Innis等人(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，Academic Press(1990))的標(biāo)準(zhǔn)方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，美國)進行PCR反應(yīng)。根據(jù)產(chǎn)品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)純化得到的約1.3kb大小的DNA片段。根據(jù)產(chǎn)品說明書以限制性內(nèi)切核酸酶XbaI及AscI(New England Biolabs，Beverly，美國)切割DNA片段，且隨后使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)再次進行純化。同樣地，根據(jù)產(chǎn)品說明書以限制性內(nèi)切核酸酶XbaI及AscI切割載體pCLiK1，且用堿性磷酸酶(I(Roche Diagnostics，Mannheim))去磷酸化。在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳之后，根據(jù)產(chǎn)品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)分離線性化的載體(約2.1kb)。根據(jù)產(chǎn)品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該載體片段與經(jīng)切割的PCR片段連接，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過涂布在含有氨芐青霉素(50μg/ml)及卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。
根據(jù)產(chǎn)品說明書使用Qiaprep離心式小量制備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質(zhì)粒DNA，且通過限制性內(nèi)切酶消化來檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiK2。
以限制性內(nèi)切核酸酶DraI(New England Biolabs，Beverly，美國)切割載體pCLiK2。在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳之后，根據(jù)產(chǎn)品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)分離約2.3kb大小的載體片段。根據(jù)產(chǎn)品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)再連接該載體片段，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。
根據(jù)產(chǎn)品說明書使用Qiaprep離心式小量制備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質(zhì)粒DNA，且通過限制性內(nèi)切酶消化來檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiK3。
從作為PCR反應(yīng)模板的質(zhì)粒pWLQ2(Liebl等人，1992)開始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO27與SEQ ID NO28擴增復(fù)制起點pHM1519。
SEQ ID NO275’-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3’SEQ ID NO285’-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3’除了pWLQ2的互補序列外，寡核苷酸引物SEQ ID NO27及SEQ IDNO28含有限制性內(nèi)切核酸酶NotI的酶切位點。通過例如Innis等人(PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press(1990))的標(biāo)準(zhǔn)方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，美國)進行PCR反應(yīng)。根據(jù)產(chǎn)品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)純化得到的約2.7kb大小的DNA片段。根據(jù)產(chǎn)品說明書以限制性內(nèi)切核酸酶NotI(New England Biolabs，Beverly，美國)切割該DNA片段，且以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)再次進行純化。同樣地，根據(jù)產(chǎn)品說明書以限制性內(nèi)切核酸酶NotI切割載體pCLiK3，且用堿性磷酸酶(I(Roche Diagnostics，Mannheim))去磷酸化。在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳之后，根據(jù)產(chǎn)品說明書以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)分離線性化的載體(約2.3kb)。根據(jù)產(chǎn)品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該載體片段與經(jīng)切割的PCR片段連接，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。
根據(jù)產(chǎn)品說明書使用Qiaprep離心式小量制備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質(zhì)粒DNA，且通過限制性內(nèi)切酶消化來檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiK5。
為了以多克隆位點(MCS)延伸pCLiK5，將合成的基本上互補的寡核苷酸SEQ ID NO21與SEQ ID NO22在95℃下一起加熱并緩慢冷卻來結(jié)合，得到雙鏈DNA片段，所述寡核苷酸SEQ ID NO29與SEQ ID NO30含有限制性內(nèi)切核酸酶SwaI、XhoI、AatI、ApaI、Asp718、MluI、NdeI、SpeI、EcoRV、SalI、ClaI、BamHI、XbaI及SmaI的酶切位點。
SEQ ID NO295’-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3’SEQ ID NO305’-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3’根據(jù)產(chǎn)品說明書以限制性內(nèi)切核酸酶XhoI及BamHI(New EnglandBiolabs，Beverly，美國)切割載體pCLiK5，并用堿性磷酸酶(I(RocheDiagnostics，Mannheim))去磷酸化。在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳之后，根據(jù)產(chǎn)品說明書以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg)分離線性化的載體(約5.0kb)。根據(jù)產(chǎn)品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該載體片段與合成的雙鏈DNA片段連接，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。
根據(jù)產(chǎn)品說明書使用Qiaprep離心式小量制備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質(zhì)粒DNA，且通過限制性內(nèi)切酶消化來檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiK5MCS。
如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美國745463-5467的描述進行測序反應(yīng)。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems，Weiterstadt)對測序反應(yīng)進行分離及測定。
將得到的質(zhì)粒pCLiK5MCS列為SEQ ID NO31。
實施例7制備質(zhì)粒PmetA metA如Tauch等人(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 1401817-1828所述，從谷氨酸棒桿菌ATCC 13032制備染色體DNA。使用寡核苷酸引物SEQ ID NO32及SEQ ID NO33、作為模板的染色體DNA及Pfu Turbo聚合酶(獲自Stratagene)，通過如Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Meth ods and Applications，AcademicPress描述的標(biāo)準(zhǔn)方法以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增包括5’非編碼區(qū)的metA基因。
SEQ ID NO325’-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3’及SEQ ID NO335’-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3’根據(jù)產(chǎn)品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)純化得到的約1.3kb大小的DNA片段。接著以限制酶Asp718及SpeI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割該DNA片段，并以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒純化。
以限制酶Asp718及SpeI切割載體pClik5MCS SEQ ID NO31，電泳分離之后，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒分離得到5kb大小的片段。
根據(jù)產(chǎn)品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將載體片段與PCR片段連接在一起，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。
以多種方法及使用來自Qiagen的材料制備質(zhì)粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美國745463-5467的描述進行測序反應(yīng)。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems，Weiterstadt)對測序反應(yīng)進行分離及測定。
將得到的質(zhì)粒pCLiK5MCS PmetA metA列為SEQ ID NO34。
實施例8制備質(zhì)粒pCLiK5MCS Psod metA如Tauch等人(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 1401817-1828所述，從谷氨酸棒桿菌ATCC 13032制備染色體DNA。使用寡核苷酸引物SEQ ID NO35與SEQ ID NO36、作為模板的染色體DNA及Pfu Turbo聚合酶(獲自Stratagene)，通過例如Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，AcademicPress的標(biāo)準(zhǔn)方法以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增超氧化物歧化酶(Psod)的5’非編碼區(qū)(表達(dá)單元區(qū))的約200個堿基對的DNA片段。
SEQ ID NO355’-GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG-3’及SEQ ID NO365’-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTCG-3’
根據(jù)產(chǎn)品說明書以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)純化得到的DNA片段。
從作為PCR反應(yīng)模板的質(zhì)粒PmetA metA SEQ ID NO34開始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO37與SEQ ID NO38擴增一部分metA。
SEQ ID NO375’-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3’與SEQ ID NO385’-CTGGGTACATTGCGGCCC-3’根據(jù)產(chǎn)品說明書以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒純化得到的約470個堿基對的DNA片段。
在接下來的PCR反應(yīng)中，將以上得到的兩個片段一起用作模板。由于與寡核苷酸引物SEQ ID NO36一起導(dǎo)入的序列及其與metA的同源性，因此在PCR反應(yīng)中兩個片段彼此連接，且通過所用的聚合酶延伸得到連續(xù)的DNA鏈。通過在第二個循環(huán)開始時才向反應(yīng)混合物中加入所用的SEQ IDNO35及SEQ ID NO38寡核苷酸引物來改良標(biāo)準(zhǔn)方法。
根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒純化約675個堿基對的擴增的DNA片段。接著，以限制酶XhoI及NcoI(RocheDiagnostics，Mannheim)切割該DNA片段且用凝膠電泳進行分離。隨后，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg)，從瓊脂糖純化約620個堿基對大小的DNA片段。以限制酶NcoI及SpeI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割質(zhì)粒PmetA metA SEQ ID NO34。在通過凝膠電泳進行分離之后，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒從瓊脂糖中純化約0.7kb大小的metA片段。
以限制酶XhoI及SpeI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割載體pClik5MCS SEQ ID NO31，且在通過電泳進行分離之后，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒分離得到5kb大小的片段。
根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該載體片段與PCR片段及metA片段連接在一起，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)的E.coliXL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過涂布在含有卡那霉素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。
以多種方法及使用來自Qiagen的材料制備質(zhì)粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美國745463-5467的描述進行測序反應(yīng)。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems，Weiterstadt)對測序反應(yīng)進行分離及測定。
將得到的質(zhì)粒pCLiK5MCS PSODmetA列為SEQ ID NO39。
實施例9MetA活性以(Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303)描述的方法，用質(zhì)粒pClik5MCS、pClik MCS PmetA metA、pCLiK5MCS PsodmetA中的每一種轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13032。將轉(zhuǎn)化混合物涂布在另外含有20mg/l卡那霉素的CM平板上來篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。挑取且分離得到的卡那霉素抗性克隆。
在30℃下將含有這些質(zhì)粒構(gòu)建物之一的谷氨酸棒桿菌菌株在MMA培養(yǎng)基(40g/l蔗糖、20g/l(NH4)2SO4、1g/l KH2PO4、1g/l K2HPO4、0.25g/lMgSO4×7H2O、54g Aces、1ml CaCl2(10g/l)、1ml原兒茶酸鹽(300mg/10ml)、1ml微量元素溶液(10g/l FeSO4×7H2O、10g/l MnSO4×H2O、2g/lZnSO4×7H2O、0.2g/l CuSO4、0.02g/l NiCl2×6H2O)、100μg/l維生素B12、0.3mg/l硫胺素、1mM亮氨酸、1mg/l吡哆醛HCl、1ml生物素(100mg/l)，pH 7.0)中培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞在4℃下離心，接著用冷的Tris-HCl緩沖液(0.1％，pH 8.0)洗滌兩次。重新離心之后，將細(xì)胞溶解在冷的Tris-HCl緩沖液(0.1％，pH 8.0)中，并調(diào)節(jié)至OD600為160。為了使細(xì)胞破裂，將1ml該細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至獲自Hybaid的2ml Ribolyser管中，且以6.0的旋轉(zhuǎn)設(shè)定值在獲自Hybaid的Ribolyser中裂解三次，每次30秒。通過4℃下在Eppendorf離心機中15,000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘來使裂解產(chǎn)物澄清，且將上清液轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf杯中。如Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72248-254中所述，測定蛋白質(zhì)的含量。
以如下方式測定metA的酶活性。1ml反應(yīng)混合物含有100mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)、5mM MgCl2、100μM乙酰輔酶A、5mM L-高絲氨酸、500μM DTNB(Ellman’s試劑)及細(xì)胞提取物。通過加入每個蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物啟始測定，并在室溫下孵育。接著在412nm處記錄動力學(xué)10分鐘。
這些結(jié)果顯示于表3a中。
表3a

可能通過使用異源表達(dá)單元來顯著增加MetA的活性。
序列表<110>巴斯福股份公司(BASF AKTIENGESELLSCHAFT)<120>Psod表達(dá)單元<130>PF 55185/Mec<140>20030320<141>
<160>44<210>1<211>173<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<220>
<223>超氧化物歧化酶RXA03119<400>1gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt 60cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga 120agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac 173<210>2<211>191<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>超氧化物歧化酶RXA03119<400>2agctgccaat tattccgggc ttgtgacccg ctacccgata aataggtcgg ctgaaaaatt 60tcgttgcaat atcaacaaaa aggcctatca ttgggaggtg tcgcaccaag tacttttgcg 120aagcgccatc tgacggattt tcaaaagatg tatatgctcg gtgcggaaac ctacgaaagg 180attttttacc c191<210>3<211>1365<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>RXA00077<400>3atgaatgatg agaatattca aagctccaac tatcagccat tcccgagttt tgacgattgg 60aaacagatcg aggtgtcgct cttagatgtc atcgaatcct cacgccattt ttctgatttg 120
aaagatagca ctgatcgttc tgcgttagat gctgcgctag agagagcaaa aagagctgcc 180gcagttgata ccaatgccat agaaggaatc ttccaaactg atcgcggttt tacccataca 240gttgcaacgc aggtaggggc ttgggagcaa caaatggcga tgaaaggcaa acatgttaag 300cctgcgtttg acgatactct agaaggcttt gagtatgttc tcgatgcagt aactggtaga 360actccaatct ctcagcaatg gattagaaat ttgcacgccg tcattctgcg gagccaagaa 420agccacgagg tttttacagc cgttggagtc caaaatcagg cgcttcagaa aggcgagtat 480aaaactcagc caaatagtcc acagcgctca gatggatctg tacatgcata cgccccagtt 540gaagatactc ctgctgaaat ggctagattt atttcagaac ttgaatctaa ggaattctta 600gcagccgaga aggttattca agctgcctat gcccactatg ctttcgtatg tattcatcct 660tttgcagatg ggaatggacg agttgcacga gccttggcta gtgtttttct atacaaagat 720cctggtgtcc ctctcgtaat ctaccaagat caacgcagag attacatcca tgctctagaa 780gcagcggaca agaataaccc gctcctgctg attagattct ttgctgaacg agtgaccgat 840actattaact ctattatcgt tgatctcact accccgatcg cgggtaaatc tggttcggct 900aagctttcgg atgcgctacg ccccactcgc gtattaccag aattacatga tgctgcacat 960aggctccaag aaagtttatt tacagaaatc cgatctcgat tggatgaaga aggaaaaagg 1020aatgggttgg agtttctact tcaacggatt tttatcggtt ccccattcaa tctgccagag 1080ggctataacg ctttccctga tagctattgt ctgaccttag ctttcaatag caactctcca 1140aaacaaatct tccacccgct atccatagta atagcagctc gagatgggaa aagagcgagc 1200agcgacctcg tggcagctac ttctattgga tacaactttc acgcttacgg acgtgaagtc 1260gagcctgttg ttactgaaag ctttcgagaa cgtgtgaaaa tttacgccga cgggattgta 1320gatcacttct taaccgaact ggctaaaaag tttcaacaga attaa 1365<210>4<211>454<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>4Met Asn Asp Glu Asn Ile Gln Ser Ser Asn Tyr Gln Pro Phe Pro Ser1 5 10 15Phe Asp Asp Trp Lys Gln Ile Glu Val Ser Leu Leu Asp Val Ile Glu20 25 30Ser Ser Arg His Phe Ser Asp Leu Lys Asp Ser Thr Asp Arg Ser Ala35 40 45
Leu Asp Ala Ala Leu Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Ala Val Asp Thr50 55 60Asn Ala Ile Glu Gly Ile Phe Gln Thr Asp Arg Gly Phe Thr His Thr65 70 75 80Val Ala Thr Gln Val Gly Ala Trp Glu Gln Gln Met Ala Met Lys Gly85 90 95Lys His Val Lys Pro Ala Phe Asp Asp Thr Leu Glu Gly Phe Glu Tyr100 105 110Val Leu Asp Ala Val Thr Gly Arg Thr Pro Ile Ser Gln Gln Trp Ile115 120 125Arg Asn Leu His Ala Val Ile Leu Arg Ser Gln Glu Ser His Glu Val130 135 140Phe Thr Ala Val Gly Val Gln Asn Gln Ala Leu Gln Lys Gly Glu Tyr145 150 155 160Lys Thr Gln Pro Asn Ser Pro Gln Arg Ser Asp Gly Ser Val His Ala165 170 175Tyr Ala Pro Val Glu Asp Thr Pro Ala Glu Met Ala Arg Phe Ile Ser180 185 190Glu Leu Glu Ser Lys Glu Phe Leu Ala Ala Glu Lys Val Ile Gln Ala195 200 205Ala Tyr Ala His Tyr Ala Phe Val Cys Ile His Pro Phe Ala Asp Gly210 215 220Asn Gly Arg Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser Val Phe Leu Tyr Lys Asp225 230 235 240Pro Gly Val Pro Leu Val Ile Tyr Gln Asp Gln Arg Arg Asp Tyr Ile245 250 255His Ala Leu Glu Ala Ala Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Leu Ile Arg260 265 270Phe Phe Ala Glu Arg Val Thr Asp Thr Ile Asn Ser Ile Ile Val Asp275 280 285Leu Thr Thr Pro Ile Ala Gly Lys Ser Gly Ser Ala Lys Leu Ser Asp290 295 300Ala Leu Arg Pro Thr Arg Val Leu Pro Glu Leu His Asp Ala Ala His305 310 315 320Arg Leu Gln Glu Ser Leu Phe Thr Glu Ile Arg Ser Arg Leu Asp Glu325 330 335Glu Gly Lys Arg Asn Gly Leu Glu Phe Leu Leu Gln Arg Ile Phe Ile340 345 350Gly Ser Pro Phe Asn Leu Pro Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Pro Asp Ser
355 360 365Tyr Cys Leu Thr Leu Ala Phe Asn Ser Asn Ser Pro Lys Gln Ile Phe370 375 380His Pro Leu Ser Ile Val Ile Ala Ala Arg Asp Gly Lys Arg Ala Ser385 390 395 400Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr405 410 415Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val420 425 430Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala435 440 445Lys Lys Phe Gln Gln Asn450<210>5<211>35<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID5<400>5gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc35<210>6<211>34<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_6<400>6ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg 34<210>7<211>4323<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_7<220>
<221>misc_feature<222>(457)..(1248)<223>KanR<220>
<221>misc_feature<222>(1515)..(2375)<223>Ori-EC (pMB)<220>
<221>misc_feature<222>(1515)..(2375)<223>Ori-EC (pMB)complement<220>
<221>misc_feature<222>(2418)..(3839)<223>SacB complement<220>
<221>misc_feature<222>(3840)..(4302)<223>PsacB complement<400>7tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 540atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 780cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 840gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 900gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 960gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 1020ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1080tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1140gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1200
cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 1260tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 1320ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 1380tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg 1440gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 1500gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1560cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1620tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1680cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1740aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 1800cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 1860gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 1920ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 1980cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2040aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2100tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2160ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2220tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2280ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgccatcgg 2400cattttcttt tgcgttttta tttgttaact gttaattgtc cttgttcaag gatgctgtct 2460ttgacaacag atgttttctt gcctttgatg ttcagcagga agctcggcgc aaacgttgat 2520tgtttgtctg cgtagaatcc tctgtttgtc atatagcttg taatcacgac attgtttcct 2580ttcgcttgag gtacagcgaa gtgtgagtaa gtaaaggtta catcgttagg atcaagatcc 2640atttttaaca caaggccagt tttgttcagc ggcttgtatg ggccagttaa agaattagaa 2700acataaccaa gcatgtaaat atcgttagac gtaatgccgt caatcgtcat ttttgatccg 2760cgggagtcag tgaacaggta ccatttgccg ttcattttaa agacgttcgc gcgttcaatt 2820tcatctgtta ctgtgttaga tgcaatcagc ggtttcatca cttttttcag tgtgtaatca 2880tcgtttagct caatcatacc gagagcgccg tttgctaact cagccgtgcg ttttttatcg 2940
ctttgcagaa gtttttgact ttcttgacgg aagaatgatg tgcttttgcc atagtatgct 3000ttgttaaata aagattcttc gccttggtag ccatcttcag ttccagtgtt tgcttcaaat 3060actaagtatt tgtggccttt atcttctacg tagtgaggat ctctcagcgt atggttgtcg 3120cctgagctgt agttgccttc atcgatgaac tgctgtacat tttgatacgt ttttccgtca 3180ccgtcaaaga ttgatttata atcctctaca ccgttgatgt tcaaagagct gtctgatgct 3240gatacgttaa cttgtgcagt tgtcagtgtt tgtttgccgt aatgtttacc ggagaaatca 3300gtgtagaata aacggatttt tccgtcagat gtaaatgtgg ctgaacctga ccattcttgt 3360gtttggtctt ttaggataga atcatttgca tcgaatttgt cgctgtcttt aaagacgcgg 3420ccagcgtttt tccagctgtc aatagaagtt tcgccgactt tttgatagaa catgtaaatc 3480gatgtgtcat ccgcattttt aggatctccg gctaatgcaa agacgatgtg gtagccgtga 3540tagtttgcga cagtgccgtc agcgttttgt aatggccagc tgtcccaaac gtccaggcct 3600tttgcagaag agatattttt aattgtggac gaatcaaatt cagaaacttg atatttttca 3660tttttttgct gttcagggat ttgcagcata tcatggcgtg taatatggga aatgccgtat 3720gtttccttat atggcttttg gttcgtttct ttcgcaaacg cttgagttgc gcctcctgcc 3780agcagtgcgg tagtaaaggt taatactgtt gcttgttttg caaacttttt gatgttcatc 3840gttcatgtct ccttttttat gtactgtgtt agcggtctgc ttcttccagc cctcctgttt 3900gaagatggca agttagttac gcacaataaa aaaagaccta aaatatgtaa ggggtgacgc 3960caaagtatac actttgccct ttacacattt taggtcttgc ctgctttatc agtaacaaac 4020ccgcgcgatt tacttttcga cctcattcta ttagactctc gtttggattg caactggtct 4080attttcctct tttgtttgat agaaaatcat aaaaggattt gcagactacg ggcctaaaga 4140actaaaaaat ctatctgttt cttttcattc tctgtatttt ttatagtttc tgttgcatgg 4200gcataaagtt gcctttttaa tcacaattca gaaaatatca taatatctca tttcactaaa 4260taatagtgaa cggcaggtat atgtgatggg ttaaaaagga tcggcggccg ctcgatttaa 4320atc 4323<210>8<211>5860<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>PCIS\LYSC<220>
<221>misc_feature
<222>(155)..(1420)<223>lysC<220>
<221>misc_feature<222>(1974)..(2765)<223>KanR<220>
<221>misc_feature<222>(3032)..(3892)<223>Ori-EC complement<220>
<221>misc_feature<222>(3913)..(3934)<223>sacB downstream complement<220>
<221>misc_feature<222>(3935)..(5356)<223>sacB(枯草芽胞桿菌(Bacillus Subtilis))complement<220>
<221>misc_feature<222>(5357)..(5819)<223>Promotor sacB complement<400>8cccggtacca cgcgtcccag tggctgagac gcatccgcta aagccccagg aaccctgtgc 60agaaagaaaa cactcctctg gctaggtaga cacagtttat aaaggtagag ttgagcgggt 120aactgtcagc acgtagatcg aaaggtgcac aaaggtggcc ctggtcgtac agaaatatgg 180cggttcctcg cttgagagtg cggaacgcat tagaaacgtc gctgaacgga tcgttgccac 240caagaaggct ggaaatgatg tcgtggttgt ctgctccgca atgggagaca ccacggatga 300acttctagaa cttgcagcgg cagtgaatcc cgttccgcca gctcgtgaaa tggatatgct 360cctgactgct ggtgagcgta tttctaacgc tctcgtcgcc atggctattg agtcccttgg 420cgcagaagcc caatctttca cgggctctca ggctggtgtg ctcaccaccg agcgccacgg 480aaacgcacgc attgttgatg tcactccagg tcgtgtgcgt gaagcactcg atgagggcaa 540gatctgcatt gttgctggtt tccagggtgt taataaagaa acccgcgatg tcaccacgtt 600gggtcgtggt ggttctgaca ccactgcagt tgcgttggca gctgctttga acgctgatgt 660gtgtgagatt tactcggacg ttgacggtgt gtataccgct gacccgcgca tcgttcctaa 720tgcacagaag ctggaaaagc tcagcttcga agaaatgctg gaacttgctg ctgttggctc 780caagattttg gtgctgcgca gtgttgaata cgctcgtgca ttcaatgtgc cacttcgcgt 840acgctcgtct tatagtaatg atcccggcac tttgattgcc ggctctatgg aggatattcc 900
tgtggaagaa gcagtcctta ccggtgtcgc aaccgacaag tccgaagcca aagtaaccgt 960tctgggtatt tccgataagc caggcgaggc tgcgaaggtt ttccgtgcgt tggctgatgc 1020agaaatcaac attgacatgg ttctgcagaa cgtctcttct gtagaagacg gcaccaccga 1080catcaccttc acctgccctc gttccgacgg ccgccgcgcg atggagatct tgaagaagct 1140tcaggttcag ggcaactgga ccaatgtgct ttacgacgac caggtcggca aagtctccct 1200cgtgggtgct ggcatgaagt ctcacccagg tgttaccgca gagttcatgg aagctctgcg 1260cgatgtcaac gtgaacatcg aattgatttc cacctctgag attcgtattt ccgtgctgat 1320ccgtgaagat gatctggatg ctgctgcacg tgcattgcat gagcagttcc agctgggcgg 1380cgaagacgaa gccgtcgttt atgcaggcac cggacgctaa agttttaaag gagtagtttt 1440acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg tcggccaggt tatgcgcacc 1500cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt tctttgcttc cccacgttcc 1560gcaggccgta agattgaatt cgtcgacatc gatgctcttc tgcgttaatt aacaattggg 1620atcctctaga cccgggattt aaatcgctag cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 1680aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 1740caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 1800agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 1860ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct 1920gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 1980aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 2040actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 2100ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 2160aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 2220ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 2280tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 2340tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 2400gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 2460aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 2520atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 2580tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 2640tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 2700
tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 2760tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 2820acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 2880ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc 2940tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 3000gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3060ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 3120acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3180cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3240caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 3300gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 3360tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 3420aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 3480ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 3540cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 3600tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3660tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 3720ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 3780aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 3840aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaaggccg 3900gccgcggccg ccatcggcat tttcttttgc gtttttattt gttaactgtt aattgtcctt 3960gttcaaggat gctgtctttg acaacagatg ttttcttgcc tttgatgttc agcaggaagc 4020tcggcgcaaa cgttgattgt ttgtctgcgt agaatcctct gtttgtcata tagcttgtaa 4080tcacgacatt gtttcctttc gcttgaggta cagcgaagtg tgagtaagta aaggttacat 4140cgttaggatc aagatccatt tttaacacaa ggccagtttt gttcagcggc ttgtatgggc 4200cagttaaaga attagaaaca taaccaagca tgtaaatatc gttagacgta atgccgtcaa 4260tcgtcatttt tgatccgcgg gagtcagtga acaggtacca tttgccgttc attttaaaga 4320cgttcgcgcg ttcaatttca tctgttactg tgttagatgc aatcagcggt ttcatcactt 4380ttttcagtgt gtaatcatcg tttagctcaa tcataccgag agcgccgttt gctaactcag 4440
ccgtgcgttt tttatcgctt tgcagaagtt tttgactttc ttgacggaag aatgatgtgc 4500ttttgccata gtatgctttg ttaaataaag attcttcgcc ttggtagcca tcttcagttc 4560cagtgtttgc ttcaaatact aagtatttgt ggcctttatc ttctacgtag tgaggatctc 4620tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt tgccttcatc gatgaactgc tgtacatttt 4680gatacgtttt tccgtcaccg tcaaagattg atttataatc ctctacaccg ttgatgttca 4740aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt gtgcagttgt cagtgtttgt ttgccgtaat 4800gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac ggatttttcc gtcagatgta aatgtggctg 4860aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta ggatagaatc atttgcatcg aatttgtcgc 4920tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc agctgtcaat agaagtttcg ccgacttttt 4980gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg catttttagg atctccggct aatgcaaaga 5040cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag tgccgtcagc gttttgtaat ggccagctgt 5100cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga tatttttaat tgtggacgaa tcaaattcag 5160aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa 5220tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg gcttttggtt cgtttctttc gcaaacgctt 5280gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag taaaggttaa tactgttgct tgttttgcaa 5340actttttgat gttcatcgtt catgtctcct tttttatgta ctgtgttagc ggtctgcttc 5400ttccagccct cctgtttgaa gatggcaagt tagttacgca caataaaaaa agacctaaaa 5460tatgtaaggg gtgacgccaa agtatacact ttgcccttta cacattttag gtcttgcctg 5520ctttatcagt aacaaacccg cgcgatttac ttttcgacct cattctatta gactctcgtt 5580tggattgcaa ctggtctatt ttcctctttt gtttgataga aaatcataaa aggatttgca 5640gactacgggc ctaaagaact aaaaaatcta tctgtttctt ttcattctct gtatttttta 5700tagtttctgt tgcatgggca taaagttgcc tttttaatca caattcagaa aatatcataa 5760tatctcattt cactaaataa tagtgaacgg caggtatatg tgatgggtta aaaaggatcg 5820gcggccgctc gatttaaatc tcgagaggcc tgacgtcggg 5860<210>9<211>38<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_9<400>9cggcaccacc gacatcatct tcacctgccc tcgttccg 38
<210>10<211>38<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_10<400>10cggaacgagg gcaggtgaag atgatgtcgg tggtgccg 38<210>11<211>1263<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>LYSC-GEN<400>11gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260cgc 1263<210>12<211>5860<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>PCIS\LYSC\THR311ILE<220>
<221>misc_feature<222>(155)..(1420)<223>LysC<220>
<221>misc_feature<222>(1974)..(2765)<223>KanR<220>
<221>misc_feature<222>(3032)..(3892)<223>Ori-EC(pMB)<220>
<221>misc_feature<222>(3913)..(3934)<223>C_區(qū)sacB下游(complement)<220>
<221>misc_feature<222>(3935)..(5356)<223>sacB枯草芽胞桿菌(complement)<220>
<221>misc_feature<222>(5357)..(5819)<223>Promotor sacB(complement)<400>12cccggtacca cgcgtcccag tggctgagac gcatccgcta aagccccagg aaccctgtgc 60agaaagaaaa cactcctctg gctaggtaga cacagtttat aaaggtagag ttgagcgggt 120aactgtcagc acgtagatcg aaaggtgcac aaaggtggcc ctggtcgtac agaaatatgg 180cggttcctcg cttgagagtg cggaacgcat tagaaacgtc gctgaacgga tcgttgccac 240caagaaggct ggaaatgatg tcgtggttgt ctgctccgca atgggagaca ccacggatga 300acttctagaa cttgcagcgg cagtgaatcc cgttccgcca gctcgtgaaa tggatatgct 360
cctgactgct ggtgagcgta tttctaacgc tctcgtcgcc atggctattg agtcccttgg 420cgcagaagcc caatctttca cgggctctca ggctggtgtg ctcaccaccg agcgccacgg 480aaacgcacgc attgttgatg tcactccagg tcgtgtgcgt gaagcactcg atgagggcaa 540gatctgcatt gttgctggtt tccagggtgt taataaagaa acccgcgatg tcaccacgtt 600gggtcgtggt ggttctgaca ccactgcagt tgcgttggca gctgctttga acgctgatgt 660gtgtgagatt tactcggacg ttgacggtgt gtataccgct gacccgcgca tcgttcctaa 720tgcacagaag ctggaaaagc tcagcttcga agaaatgctg gaacttgctg ctgttggctc 780caagattttg gtgctgcgca gtgttgaata cgctcgtgca ttcaatgtgc cacttcgcgt 840acgctcgtct tatagtaatg atcccggcac tttgattgcc ggctctatgg aggatattcc 900tgtggaagaa gcagtcctta ccggtgtcgc aaccgacaag tccgaagcca aagtaaccgt 960tctgggtatt tccgataagc caggcgaggc tgcgaaggtt ttccgtgcgt tggctgatgc 1020agaaatcaac attgacatgg ttctgcagaa cgtctcttct gtagaagacg gcaccaccga 1080catcatcttc acctgccctc gttccgacgg ccgccgcgcg atggagatct tgaagaagct 1140tcaggttcag ggcaactgga ccaatgtgct ttacgacgac caggtcggca aagtctccct 1200cgtgggtgct ggcatgaagt ctcacccagg tgttaccgca gagttcatgg aagctctgcg 1260cgatgtcaac gtgaacatcg aattgatttc cacctctgag attcgtattt ccgtgctgat 1320ccgtgaagat gatctggatg ctgctgcacg tgcattgcat gagcagttcc agctgggcgg 1380cgaagacgaa gccgtcgttt atgcaggcac cggacgctaa agttttaaag gagtagtttt 1440acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg tcggccaggt tatgcgcacc 1500cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt tctttgcttc cccacgttcc 1560gcaggccgta agattgaatt cgtcgacatc gatgctcttc tgcgttaatt aacaattggg 1620atcctctaga cccgggattt aaatcgctag cgggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 1680aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 1740caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 1800agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct 1860ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct 1920gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 1980aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 2040actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 2100
ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 2160aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 2220ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 2280tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 2340tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 2400gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 2460aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 2520atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 2580tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 2640tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 2700tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 2760tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 2820acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 2880ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccacgc 2940tagcggcgcg ccggccggcc cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 3000gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3060ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 3120acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3180cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3240caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 3300gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 3360tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 3420aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 3480ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 3540cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 3600tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3660tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 3720ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 3780aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 3840aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaaggccg 3900
gccgcggccg ccatcggcat tttcttttgc gtttttattt gttaactgtt aattgtcctt 3960gttcaaggat gctgtctttg acaacagatg ttttcttgcc tttgatgttc agcaggaagc 4020tcggcgcaaa cgttgattgt ttgtctgcgt agaatcctct gtttgtcata tagcttgtaa 4080tcacgacatt gtttcctttc gcttgaggta cagcgaagtg tgagtaagta aaggttacat 4140cgttaggatc aagatccatt tttaacacaa ggccagtttt gttcagcggc ttgtatgggc 4200cagttaaaga attagaaaca taaccaagca tgtaaatatc gttagacgta atgccgtcaa 4260tcgtcatttt tgatccgcgg gagtcagtga acaggtacca tttgccgttc attttaaaga 4320cgttcgcgcg ttcaatttca tctgttactg tgttagatgc aatcagcggt ttcatcactt 4380ttttcagtgt gtaatcatcg tttagctcaa tcataccgag agcgccgttt gctaactcag 4440ccgtgcgttt tttatcgctt tgcagaagtt tttgactttc ttgacggaag aatgatgtgc 4500ttttgccata gtatgctttg ttaaataaag attcttcgcc ttggtagcca tcttcagttc 4560cagtgtttgc ttcaaatact aagtatttgt ggcctttatc ttctacgtag tgaggatctc 4620tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt tgccttcatc gatgaactgc tgtacatttt 4680gatacgtttt tccgtcaccg tcaaagattg atttataatc ctctacaccg ttgatgttca 4740aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt gtgcagttgt cagtgtttgt ttgccgtaat 4800gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac ggatttttcc gtcagatgta aatgtggctg 4860aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta ggatagaatc atttgcatcg aatttgtcgc 4920tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc agctgtcaat agaagtttcg ccgacttttt 4980gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg catttttagg atctccggct aatgcaaaga 5040cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag tgccgtcagc gttttgtaat ggccagctgt 5100cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga tatttttaat tgtggacgaa tcaaattcag 5160aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa 5220tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg gcttttggtt cgtttctttc gcaaacgctt 5280gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag taaaggttaa tactgttgct tgttttgcaa 5340actttttgat gttcatcgtt catgtctcct tttttatgta ctgtgttagc ggtctgcttc 5400ttccagccct cctgtttgaa gatggcaagt tagttacgca caataaaaaa agacctaaaa 5460tatgtaaggg gtgacgccaa agtatacact ttgcccttta cacattttag gtcttgcctg 5520ctttatcagt aacaaacccg cgcgatttac ttttcgacct cattctatta gactctcgtt 5580tggattgcaa ctggtctatt ttcctctttt gtttgataga aaatcataaa aggatttgca 5640
gactacgggc ctaaagaact aaaaaatcta tctgtttctt ttcattctct gtatttttta 5700tagtttctgt tgcatgggca taaagttgcc tttttaatca caattcagaa aatatcataa 5760tatctcattt cactaaataa tagtgaacgg caggtatatg tgatgggtta aaaaggatcg 5820gcggccgctc gatttaaatc tcgagaggcc tgacgtcggg 5860<210>13<211>23<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SOD8<400>13accctggcgg aaaccctgag tcg 23<210>14<211>65<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SOD1<400>14tacgaccagg gccacgggta aaaaatcctt tcgtaggttt ccgcaccgag catatacatc 60ttttg 65<210>15<211>40<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>LYSC2<400>15cctacgaaag gattttttac ccgtggccct ggtcgtacag 40<210>16<211>21<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>LYSC6<400>16gattagtgga acctcgtcgt c 21
<210>17<211>19<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SOD4<400>17gcggcgcagg attttctaa19<210>18<211>22<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>LYSC4<400>18tcggttgcct gagtaatgtc tt22<210>19<211>5720<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>PK19<220>
<221>misc_feature<222>(2706)..(3968)<223>lysC complement<220>
<221>misc_feature<222>(3969)..(4166)<223>Psod complement<220>
<221>misc_feature<222>(4538)..(5236)<223>5’lysC complement<220>
<221>misc_feature<222>(5626)..(6420)<223>KanR<220>
<221>misc_feature<222>(6449)..(6911)<223>PsacB<220>
<221>misc_feature
<222>(6912)..(6)<223>sacB<400>19ggtcgactct agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc actggccgtc gttttacaac 60gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 120tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 180gcctgaatgg cgaatggcga taagctagct tcacgctgcc gcaagcactc agggcgcaag 240ggctgctaaa ggaagcggaa cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg 300atgaatgtca gctactgggc tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag 360gtagcttgca gtgggcttac atggcgatag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc 420gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac 480tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag 540acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 600gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat 660gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg 720tccggtgccc tgaatgaact ccaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 780ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 840ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 900tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc 960gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc 1020gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg 1080ctcaaggcgc ggatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg 1140ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt 1200gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc 1260ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc 1320atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgctagag 1380gatcgatcct ttttaaccca tcacatatac ctgccgttca ctattattta gtgaaatgag 1440atattatgat attttctgaa ttgtgattaa aaaggcaact ttatgcccat gcaacagaaa 1500ctataaaaaa tacagagaat gaaaagaaac agatagattt tttagttctt taggcccgta 1560gtctgcaaat ccttttatga ttttctatca aacaaaagag gaaaatagac cagttgcaat 1620ccaaacgaga gtctaataga atgaggtcga aaagtaaatc gcgcgggttt gttactgata 1680
aagcaggcaa gacctaaaat gtgtaaaggg caaagtgtat actttggcgt caccccttac 1740atattttagg tcttttttta ttgtgcgtaa ctaacttgcc atcttcaaac aggagggctg 1800gaagaagcag accgctaaca cagtacataa aaaaggagac atgaacgatg aacatcaaaa 1860agtttgcaaa acaagcaaca gtattaacct ttactaccgc actgctggca ggaggcgcaa 1920ctcaagcgtt tgcgaaagaa acgaaccaaa agccatataa ggaaacatac ggcatttccc 1980atattacacg ccatgatatg ctgcaaatcc ctgaacagca aaaaaatgaa aaatatcaag 2040tttctgaatt tgattcgtcc acaattaaaa atatctcttc tgcaaaaggc ctggacgttt 2100gggacagctg gccattacaa aacgctgacg gcactgtcgc aaactatcac ggctaccaca 2160tcgtctttgc attagccgga gatcctaaaa atgcggatga cacatcgatt tacatgttct 2220atcaaaaagt cggcgaaact tctattgaca gctggaaaaa cgctggccgc gtctttaaag 2280acagcgacaa attcgatgca aatgattcta tcctaaaaga ccaaacacaa gaatggtcag 2340gttcagccac atttacatct gacggaaaaa tccgtttatt ctacactgat ttctccggta 2400aacattacgg caaacaaaca ctgacaactg cacaagttaa cgtatcagca tcagacagct 2460ctttgaacat caacggtgta gaggattata aatcaatctt tgacggtgac ggaaaaacgt 2520atcaaaatgt acagcagttc atcgatgaag gcaactacag ctcaggcgac aaccatacgc 2580tgagagatcc tcactacgta gaagataaag gccacaaata cttagtattt gaagcaaaca 2640ctggaactga agatggctac caaggcgaag aatctttatt taacaaagca tactatggca 2700aaagcacatc attcttccgt caagaaagtc aaaaacttct gcaaagcgat aaaaaacgca 2760cggctgagtt agcaaacggc gctctcggta tgattgagct aaacgatgat tacacactga 2820aaaaagtgat gaaaccgctg attgcatcta acacagtaac agatgaaatt gaacgcgcga 2880acgtctttaa aatgaacggc aaatggtacc tgttcactga ctcccgcgga tcaaaaatga 2940cgattgacgg cattacgtct aacgatattt acatgcttgg ttatgtttct aattctttaa 3000ctggcccata caagccgctg aacaaaactg gccttgtgtt aaaaatggat cttgatccta 3060acgatgtaac ctttacttac tcacacttcg ctgtacctca agcgaaagga aacaatgtcg 3120tgattacaag ctatatgaca aacagaggat tctacgcaga caaacaatca acgtttgcgc 3180cgagcttcct gctgaacatc aaaggcaaga aaacatctgt tgtcaaagac agcatccttg 3240aacaaggaca attaacagtt aacaaataaa aacgcaaaag aaaatgccga tgggtaccga 3300gcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg 3360ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccctcgcg gacgtgctca 3420
tagtccacga cgcccgtgat tttgtagccc tggccgacgg ccagcaggta ggccgacagg 3480ctcatgccgg ccgccgccgc cttttcctca atcgctcttc gttcgtctgg aaggcagtac 3540accttgatag gtgggctgcc cttcctggtt ggcttggttt catcagccat ccgcttgccc 3600tcatctgtta cgccggcggt agccggccag cctcgcagag caggattccc gttgagcacc 3660gccaggtgcg aataagggac agtgaagaag gaacacccgc tcgcgggtgg gcctacttca 3720cctatcctgc ccggctgacg ccgttggata caccaaggaa agtctacacg aaccctttgg 3780caaaatcctg tatatcgtgc gaaaaaggat ggatataccg aaaaaatcgc tataatgacc 3840ccgaagcagg gttatgcagc ggaaaagcgc tgcttccctg ctgttttgtg gaatatctac 3900cgactggaaa caggcaaatg caggaaatta ctgaactgag gggacaggcg agagacgatg 3960ccaaagagct cctgaaaatc tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc 4020attatggtga aagttggaac ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt 4080ggcccagggc ttcccggtat caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc 4140ttccgtcaca ggtatttatt cggcgcaaag tgcgtcgggt gatgctgcca acttactgat 4200ttagtgtatg atggtgtttt tgaggtgctc cagtggcttc tgtttctatc agctcctgaa 4260aatctcgata actcaaaaaa tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg 4320gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg 4380gtatcaacag ggacaccagg atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt 4440tattcggcgc aaagtgcgtc gggtgatgct gccaacttac tgatttagtg tatgatggtg 4500tttttgaggt gctccagtgg cttctgtttc tatcagggct ggatgatcct ccagcgcggg 4560gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 4620aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 4680gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 4740acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 4800tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 4860ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 4920atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 4980agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 5040cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 5100agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 5160acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 5220
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 5280ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 5340gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 5400gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 5460gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 5520tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 5580gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 5640ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 5700gccaagcttg catgcctgca 5720<210>20<211>27<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>LYSC23<400>20caccgcggct ttggacatca ctgctac 27<210>21<211>26<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>LYSC24<400>21cctggggctt tagcggatgc gtctca26<210>22<211>8324<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>PK19<220>
<221>misc_feature<222>(2706)..(3968)<223>lysC complement<220>
<221>misc_feature
<222>(3969)..(4166)<223>Psod complement<220>
<221>misc_feature<222>(4538)..(5236)<223>5’lysC complement<220>
<221>misc_feature<222>(5626)..(6420)<223>KanR<220>
<221>misc_feature<222>(6449)..(6911)<223>PsacB<220>
<221>misc_feature<222>(6912)..(6)<223>sacB<400>22aaacgcaaaa gaaaatgccg atgggtaccg agcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac 60ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc 120gttttccggg acgccctcgc ggacgtgctc atagtccacg acgcccgtga ttttgtagcc 180ctggccgacg gccagcaggt aggccgacag gctcatgccg gccgccgccg ccttttcctc 240aatcgctctt cgttcgtctg gaaggcagta caccttgata ggtgggctgc ccttcctggt 300tggcttggtt tcatcagcca tccgcttgcc ctcatctgtt acgccggcgg tagccggcca 360gcctcgcaga gcaggattcc cgttgagcac cgccaggtgc gaataaggga cagtgaagaa 420ggaacacccg ctcgcgggtg ggcctacttc acctatcctg cccggctgac gccgttggat 480acaccaagga aagtctacac gaaccctttg gcaaaatcct gtatatcgtg cgaaaaagga 540tggatatacc gaaaaaatcg ctataatgac cccgaagcag ggttatgcag cggaaaagcg 600ctgcttccct gctgttttgt ggaatatcta ccgactggaa acaggcaaat gcaggaaatt 660actgaactga ggggacaggc gagagacgat gccaaagagc tcctgaaaat ctcgataact 720caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt 780gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga 840caccaggatt tatttattct gcgaagtgat cttccgtcac aggtatttat tcggcgcaaa 900gtgcgtcggg tgatgctgcc aacttactga tttagtgtat gatggtgttt ttgaggtgct 960ccagtggctt ctgtttctat cagctcctga aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg 1020tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca 1080
ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc ggtatcaaca gggacaccag gatttattta 1140ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc 1200tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt 1260ctatcagggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc 1320caaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 1380gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 1440tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 1500ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 1560gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 1620tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 1680cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 1740gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 1800actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 1860ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 1920gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 1980atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 2040tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 2100tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 2160aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 2220gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 2280gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca 2340ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 2400tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc 2460tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt cgccctttcg gttgcctgag taatgtcttc 2520tacctcgatt tccgtgccac ggaattcaat cttacggcct gcggaacgtg gggaagcaaa 2580gaaacgaaca gtgtcagctg ggaaattgcg ctcttccaaa agggtgcgca taacctggcc 2640gacctggccg gttgcaccaa caactgcgat ggtggtcatt gtaaaactac tcctttaaaa 2700ctttagcgtc cggtgcctgc ataaacgacg gcttcgtctt cgccgcccag ctggaactgc 2760tcatgcaatg cacgtgcagc agcatccaga tcatcttcac ggatcagcac ggaaatacga 2820
atctcagagg tggaaatcaa ttcgatgttc acgttgacat cgcgcagagc ttccatgaac 2880tctgcggtaa cacctgggtg agacttcatg ccagcaccca cgagggagac tttgccgacc 2940tggtcgtcgt aaagcacatt ggtccagttg ccctgaacct gaagcttctt caagatctcc 3000atcgcgcggc ggccgtcgga acgagggcag gtgaagatga tgtcggtggt gccgtcttct 3060acagaagaga cgttctgcag aaccatgtca atgttgattt ctgcatcagc caacgcacgg 3120aaaaccttcg cagcctcgcc tggcttatcg gaaataccca gaacggttac tttggcttcg 3180gacttgtcgg ttgcgacacc ggtaaggact gcttcttcca caggaatatc ctccatagag 3240ccggcaatca aagtgccggg atcattacta taagacgagc gtacgcgaag tggcacattg 3300aatgcacgag cgtattcaac actgcgcagc accaaaatct tggagccaac agcagcaagt 3360tccagcattt cttcgaagct gagcttttcc agcttctgtg cattaggaac gatgcgcggg 3420tcagcggtat acacaccgtc aacgtccgag taaatctcac acacatcagc gttcaaagca 3480gctgccaacg caactgcagt ggtgtcagaa ccaccacgac ccaacgtggt gacatcgcgg 3540gtttctttat taacaccctg gaaaccagca acaatgcaga tcttgccctc atcgagtgct 3600tcacgcacac gacctggagt gacatcaaca atgcgtgcgt ttccgtggcg ctcggtggtg 3660agcacaccag cctgagagcc cgtgaaagat tgggcttctg cgccaaggga ctcaatagcc 3720atggcgacga gagcgttaga aatacgctca ccagcagtca ggagcatatc catttcacga 3780gctggcggaa cgggattcac tgccgctgca agttctagaa gttcatccgt ggtgtctccc 3840attgcggagc agacaaccac gacatcattt ccagccttct tggtggcaac gatccgttca 3900gcgacgtttc taatgcgttc cgcactctca agcgaggaac cgccatattt ctgtacgacc 3960agggccacgg gtaaaaaatc ctttcgtagg tttccgcacc gagcatatac atcttttgaa 4020aatccgtcag atggcgcttc gcaaaagtac ttggtgcgac acctcccaat gataggcctt 4080tttgttgata ttgcaacgaa atttttcagc cgacctattt atcgggtagc gggtcacaag 4140cccggaataa ttggcagcta agtagggttg aagggcataa ggcttcctca attttcgaaa 4200ggaacattcc tgttatggca tggtttttcg cacccgaacc cgtgatggtt accgctgatg 4260aggcgcttaa aggtggcagg catcctgttt tagaaaatcc tgcgccgcaa gggcgaattc 4320actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 4380ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 4440cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcga taagctagat gcatgctcga 4500gcggccgcca gtgtgatgga tatctgcaga attcgccctt ggggctttag cggatgcgtc 4560tcagccactg ggacgcgttc caataaacag accatatatt gatattcgat ttaatatttg 4620
agacaaaagt gacaggtgct acttcgcgag caactcttta gtcaactacc ctgaatcaag 4680tgcaaagcaa tctgctcgcc gtgcttttcg ccctagcatc ggcattaaca atcgcatggg 4740gcaccgtggt cagacaccgg atcgcgctcc gcaccccaaa agatggctcc ctaaggagct 4800cacctttact caatgctctg atgacaccga tgtggtgggc aggcatgagt accgcgatgc 4860tggcatattt cttacaaaca gtagcacttg gtttcggcac cctcttggta gtgcaaccag 4920tgcttgtcct gtcgctgatg ttcacgctgc cgctctcagc acgattcaat ggctaccgac 4980tacgccgaac tgaaatcttc tgggctaccc tcctcaccgt agccgtgggc atcatgatcg 5040ttttgggacg cccccttccc ggaaaccccc acccccactc gatcgatgga ttccagtact 5100tttagtcggc gttgcagtaa tgggtggaat gtggctgctt gcggaatacg tattaaagaa 5160ggacaaagcc ctcatccttg gtcttgtgac gggtgcattg tttggctacg tagcagtgat 5220gtccaaagcc gcggtgaagg gcgaattcca gcacactggc ggccgttact agcttcacgc 5280tgccgcaagc actcagggcg caagggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt 5340ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa 5400aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac 5460tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 5520gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 5580aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 5640ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 5700caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 5760gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactccaaga cgaggcagcg 5820cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 5880gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 5940caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 6000cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 6060actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 6120gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcggatgc ccgacggcga ggatctcgtc 6180gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 6240ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 6300cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 6360
atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 6420gcgggactct ggggttcgct agaggatcga tcctttttaa cccatcacat atacctgccg 6480ttcactatta tttagtgaaa tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc 6540aactttatgc ccatgcaaca gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag 6600attttttagt tctttaggcc cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa 6660agaggaaaat agaccagttg caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta 6720aatcgcgcgg gtttgttact gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt 6780gtatactttg gcgtcacccc ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact 6840tgccatcttc aaacaggagg gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg 6900agacatgaac gatgaacatc aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta 6960ccgcactgct ggcaggaggc gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat 7020ataaggaaac atacggcatt tcccatatta cacgccatga tatgctgcaa atccctgaac 7080agcaaaaaaa tgaaaaatat caagttcctg aatttgattc gtccacaatt aaaaatatct 7140cttctgcaaa aggcctggac gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg 7200tcgcaaacta tcacggctac cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg 7260atgacacatc gatttacatg ttctatcaaa aagtcggcga aacttctatt gacagctgga 7320aaaacgctgg ccgcgtcttt aaagacagcg acaaattcga tgcaaatgat tctatcctaa 7380aagaccaaac acaagaatgg tcaggttcag ccacatttac atctgacgga aaaatccgtt 7440tattctacac tgatttctcc ggtaaacatt acggcaaaca aacactgaca actgcacaag 7500ttaacgtatc agcatcagac agctctttga acatcaacgg tgtagaggat tataaatcaa 7560tctttgacgg tgacggaaaa acgtatcaaa atgtacagca gttcatcgat gaaggcaact 7620acagctcagg cgacaaccat acgctgagag atcctcacta cgtagaagat aaaggccaca 7680aatacttagt atttgaagca aacactggaa ctgaagatgg ctaccaaggc gaagaatctt 7740tatttaacaa agcatactat ggcaaaagca catcattctt ccgtcaagaa agtcaaaaac 7800ttctgcaaag cgataaaaaa cgcacggctg agttagcaaa cggcgctctc ggtatgattg 7860agctaaacga tgattacaca ctgaaaaaag tgatgaaacc gctgattgca tctaacacag 7920taacagatga aattgaacgc gcgaacgtct ttaaaatgaa cggcaaatgg tacctgttca 7980ctgactcccg cggatcaaaa atgacgattg acggcattac gtctaacgat atttacatgc 8040ttggttatgt ttctaattct ttaactggcc catacaagcc gctgaacaaa actggccttg 8100tgttaaaaat ggatcttgat cctaacgatg taacctttac ttactcacac ttcgctgtac 8160
ctcaagcgaa aggaaacaat gtcgtgatta caagctatat gacaaacaga ggattctacg 8220cagacaaaca atcaacgttt gcgccgagct tcctgctgaa catcaaaggc aagaaaacat 8280ctgttgtcaa agacagcatc cttgaacaag gacaattaac agtt8324<210>23<211>52<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_23<400>23cccgggatcc gctagcggcg cgccggccgg cccggtgtga aataccgcac ag 52<210>24<211>53<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_24<400>24tctagactcg agcggccgcg gccggccttt aaattgaaga cgaaagggcc tcg 53<210>25<211>47<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_25<400>25gagatctaga cccggggatc cgctagcggg ctgctaaagg aagcgga 47<210>26<211>38<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_26<400>26gagaggcgcg ccgctagcgt gggcgaagaa ctccagca 38<210>27<211>34<212>DNA
<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_27<400>27gagagggcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaa 34<210>28<211>34<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_28<400>28gagagggcgg ccgctcaagt cggtcaagcc acgc 34<210>29<211>140<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_29<400>29tcgaatttaa atctcgagag gcctgacgtc gggcccggta ccacgcgtca tatgactagt 60tcggacctag ggatatcgtc gacatcgatg ctcttctgcg ttaattaaca attgggatcc 120tctagacccg ggatttaaat 140<210>30<211>140<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_30<400>30gatcatttaa atcccgggtc tagaggatcc caattgttaa ttaacgcaga agagcatcga 60tgtcgacgat atccctaggt ccgaactagt catatgacgc gtggtaccgg gcccgacgtc 120aggcctctcg agatttaaat 140<210>31<211>5091<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>PCLIK5MCS<220>
<221>misc_feature<222>(469)..(1260)<223>KanR<220>
<221>misc_feature<222>(1527)..(2387)<223>Ori EC pMB(complement)<220>
<221>misc_feature<222>(2533)..(3207)<223>Orf1<220>
<221>misc_feature<222>(3541)..(4662)<223>Rep蛋白<400>31tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac cacgcgtcat atgactagtt 60cggacctagg gatatcgtcg acatcgatgc tcttctgcgt taattaacaa ttgggatcct 120ctagacccgg gatttaaatc gctagcgggc tgctaaagga agcggaacac gtagaaagcc 180agtccgcaga aacggtgctg accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg 240gaaaacgcaa gcgcaaagag aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta 300gactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt 360aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg 420cgcaggggat caagatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 480gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 540gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 600ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 660gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 720actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 780tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 840acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 900cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 960ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc 1020gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 1080
ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 1140acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 1200ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 1260tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 1320atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 1380ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc cacgctagcg 1440gcgcgccggc cggcccggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 1500aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 1560gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 1620ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 1680ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 1740cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 1800ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 1860tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 1920gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 1980tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 2040gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 2100tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 2160ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 2220agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 2280gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 2340attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ggccggccgc 2400ggccgcgcaa agtcccgctt cgtgaaaatt ttcgtgccgc gtgattttcc gccaaaaact 2460ttaacgaacg ttcgttataa tggtgtcatg accttcacga cgaagtacta aaattggccc 2520gaatcatcag ctatggatct ctctgatgtc gcgctggagt ccgacgcgct cgatgctgcc 2580gtcgatttaa aaacggtgat cggatttttc cgagctctcg atacgacgga cgcgccagca 2640tcacgagact gggccagtgc cgcgagcgac ctagaaactc tcgtggcgga tcttgaggag 2700ctggctgacg agctgcgtgc tcggccagcg ccaggaggac gcacagtagt ggaggatgca 2760atcagttgcg cctactgcgg tggcctgatt cctccccggc ctgacccgcg aggacggcgc 2820gcaaaatatt gctcagatgc gtgtcgtgcc gcagccagcc gcgagcgcgc caacaaacgc 2880
cacgccgagg agctggaggc ggctaggtcg caaatggcgc tggaagtgcg tcccccgagc 2940gaaattttgg ccatggtcgt cacagagctg gaagcggcag cgagaattat cgcgatcgtg 3000gcggtgcccg caggcatgac aaacatcgta aatgccgcgt ttcgtgtgcc gtggccgccc 3060aggacgtgtc agcgccgcca ccacctgcac cgaatcggca gcagcgtcgc gcgtcgaaaa 3120agcgcacagg cggcaagaag cgataagctg cacgaatacc tgaaaaatgt tgaacgcccc 3180gtgagcggta actcacaggg cgtcggctaa cccccagtcc aaacctggga gaaagcgctc 3240aaaaatgact ctagcggatt cacgagacat tgacacaccg gcctggaaat tttccgctga 3300tctgttcgac acccatcccg agctcgcgct gcgatcacgt ggctggacga gcgaagaccg 3360ccgcgaattc ctcgctcacc tgggcagaga aaatttccag ggcagcaaga cccgcgactt 3420cgccagcgct tggatcaaag acccggacac ggagaaacac agccgaagtt ataccgagtt 3480ggttcaaaat cgcttgcccg gtgccagtat gttgctctga cgcacgcgca gcacgcagcc 3540gtgcttgtcc tggacattga tgtgccgagc caccaggccg gcgggaaaat cgagcacgta 3600aaccccgagg tctacgcgat tttggagcgc tgggcacgcc tggaaaaagc gccagcttgg 3660atcggcgtga atccactgag cgggaaatgc cagctcatct ggctcattga tccggtgtat 3720gccgcagcag gcatgagcag cccgaatatg cgcctgctgg ctgcaacgac cgaggaaatg 3780acccgcgttt tcggcgctga ccaggctttt tcacataggc tgagccgtgg ccactgcact 3840ctccgacgat cccagccgta ccgctggcat gcccagcaca atcgcgtgga tcgcctagct 3900gatcttatgg aggttgctcg catgatctca ggcacagaaa aacctaaaaa acgctatgag 3960caggagtttt ctagcggacg ggcacgtatc gaagcggcaa gaaaagccac tgcggaagca 4020aaagcacttg ccacgcttga agcaagcctg ccgagcgccg ctgaagcgtc tggagagctg 4080atcgacggcg tccgtgtcct ctggactgct ccagggcgtg ccgcccgtga tgagacggct 4140tttcgccacg ctttgactgt gggataccag ttaaaagcgg ctggtgagcg cctaaaagac 4200accaagggtc atcgagccta cgagcgtgcc tacaccgtcg ctcaggcggt cggaggaggc 4260cgtgagcctg atctgccgcc ggactgtgac cgccagacgg attggccgcg acgtgtgcgc 4320ggctacgtcg ctaaaggcca gccagtcgtc cctgctcgtc agacagagac gcagagccag 4380ccgaggcgaa aagctctggc cactatggga agacgtggcg gtaaaaaggc cgcagaacgc 4440tggaaagacc caaacagtga gtacgcccga gcacagcgag aaaaactagc taagtccagt 4500caacgacaag ctaggaaagc taaaggaaat cgcttgacca ttgcaggttg gtttatgact 4560gttgagggag agactggctc gtggccgaca atcaatgaag ctatgtctga atttagcgtg 4620
tcacgtcaga ccgtgaatag agcacttaag gtctgcgggc attgaacttc cacgaggacg 4680ccgaaagctt cccagtaaat gtgccatctc gtaggcagaa aacggttccc ccgtagggtc 4740tctctcttgg cctcctttct aggtcgggct gattgctctt gaagctctct aggggggctc 4800acaccatagg cagataacgt tccccaccgg ctcgcctcgt aagcgcacaa ggactgctcc 4860caaagatctt caaagccact gccgcgactg ccttcgcgaa gccttgcccc gcggaaattt 4920cctccaccga gttcgtgcac acccctatgc caagcttctt tcaccctaaa ttcgagagat 4980tggattctta ccgtggaaat tcttcgcaaa aatcgtcccc tgatcgccct tgcgacgttg 5040gcgtcggtgc cgctggttgc gcttggcttg accgacttga tcagcggccg c5091<210>32<211>28<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_32<400>32gcgcggtacc tagactcacc ccagtgct 28<210>33<211>30<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_33<400>33ctctactagt ttagatgtag aactcgatgt30<210>34<211>6349<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>PCLIK5MCS<220>
<221>misc_feature<222>(42)..(177)<223>PmetA<220>
<221>misc_feature<222>(178)..(1311)<223>metA
<220>
<221>misc_feature<222>(1727)..(2518)<223>KanR<220>
<221>misc_feature<222>(2785)..(3645)<223>Orf1<220>
<221>misc_feature<222>(3791)..(4465)<223>Ori-EC complement<220>
<221>misc_feature<222>(4799)..(5920)<223>Rep蛋白<400>34tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac ctagactcac cccagtgctt 60aaagcgctgg gtttttcttt ttcagactcg tgagaatgca aactagacta gacagagctg 120tccatataca ctggacgaag ttttagtctt gtccacccag aacaggcggt tattttcatg 180cccaccctcg cgccttcagg tcaacttgaa atccaagcga tcggtgatgt ctccaccgaa 240gccggagcaa tcattacaaa cgctgaaatc gcctatcacc gctggggtga ataccgcgta 300gataaagaag gacgcagcaa tgtcgttctc atcgaacacg ccctcactgg agattccaac 360gcagccgatt ggtgggctga cttgctcggt cccggcaaag ccatcaacac tgatatttac 420tgcgtgatct gtaccaacgt catcggtggt tgcaacggtt ccaccggacc tggctccatg 480catccagatg gaaatttctg gggtaatcgc ttccccgcca cgtccattcg tgatcaggta 540aacgccgaaa aacaattcct cgacgcactc ggcatcacca cggtcgccgc agtacttggt 600ggttccatgg gtggtgcccg caccctagag tgggccgcaa tgtacccaga aactgttggc 660gcagctgctg ttcttgcagt ttctgcacgc gccagcgcct ggcaaatcgg cattcaatcc 720gcccaaatta aggcgattga aaacgaccac cactggcacg aaggcaacta ctacgaatcc 780ggctgcaacc cagccaccgg actcggcgcc gcccgacgca tcgcccacct cacctaccgt 840ggcgaactag aaatcgacga acgcttcggc accaaagccc aaaagaacga aaacccactc 900ggtccctacc gcaagcccga ccagcgcttc gccgtggaat cctacttgga ctaccaagca 960gacaagctag tacagcgttt cgacgccggc tcctacgtct tgctcaccga cgccctcaac 1020cgccacgaca ttggtcgcga ccgcggaggc ctcaacaagg cactcgaatc catcaaagtt 1080ccagtccttg tcgcaggcgt agataccgat attttgtacc cctaccacca gcaagaacac 1140
ctctccagaa acctgggaaa tctactggca atggcaaaaa tcgtatcccc tgtcggccac 1200gatgctttcc tcaccgaaag ccgccaaatg gatcgcatcg tgaggaactt cttcagcctc 1260atctccccag acgaagacaa cccttcgacc tacatcgagt tctacatcta aactagttcg 1320gacctaggga tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct 1380agacccggga tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag 1440tccgcagaaa cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga 1500aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga 1560ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa 1620ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg 1680caggggatca agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 1740tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 1800acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 1860ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 1920gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 1980tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 2040tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 2100gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 2160tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 2220cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 2280cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 2340attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 2400ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 2460tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 2520agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat 2580ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc 2640ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc 2700gcgccggccg gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 2760gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 2820ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 2880aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 2940
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 3000gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 3060cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 3120gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 3180tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 3240cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 3300cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 3360gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 3420agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 3480cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 3540tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 3600tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg 3660ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaaaatttt cgtgccgcgt gattttccgc caaaaacttt 3720aacgaacgtt cgttataatg gtgtcatgac cttcacgacg aagtactaaa attggcccga 3780atcatcagct atggatctct ctgatgtcgc gctggagtcc gacgcgctcg atgctgccgt 3840cgatttaaaa acggtgatcg gatttttccg agctctcgat acgacggacg cgccagcatc 3900acgagactgg gccagtgccg cgagcgacct agaaactctc gtggcggatc ttgaggagct 3960ggctgacgag ctgcgtgctc ggccagcgcc aggaggacgc acagtagtgg aggatgcaat 4020cagttgcgcc tactgcggtg gcctgattcc tccccggcct gacccgcgag gacggcgcgc 4080aaaatattgc tcagatgcgt gtcgtgccgc agccagccgc gagcgcgcca acaaacgcca 4140cgccgaggag ctggaggcgg ctaggtcgca aatggcgctg gaagtgcgtc ccccgagcga 4200aattttggcc atggtcgtca cagagctgga agcggcagcg agaattatcg cgatcgtggc 4260ggtgcccgca ggcatgacaa acatcgtaaa tgccgcgttt cgtgtgccgt ggccgcccag 4320gacgtgtcag cgccgccacc acctgcaccg aatcggcagc agcgtcgcgc gtcgaaaaag 4380cgcacaggcg gcaagaagcg ataagctgca cgaatacctg aaaaatgttg aacgccccgt 4440gagcggtaac tcacagggcg tcggctaacc cccagtccaa acctgggaga aagcgctcaa 4500aaatgactct agcggattca cgagacattg acacaccggc ctggaaattt tccgctgatc 4560tgttcgacac ccatcccgag ctcgcgctgc gatcacgtgg ctggacgagc gaagaccgcc 4620gcgaattcct cgctcacctg ggcagagaaa atttccaggg cagcaagacc cgcgacttcg 4680
ccagcgcttg gatcaaagac ccggacacgg agaaacacag ccgaagttat accgagttgg 4740ttcaaaatcg cttgcccggt gccagtatgt tgctctgacg cacgcgcagc acgcagccgt 4800gcttgtcctg gacattgatg tgccgagcca ccaggccggc gggaaaatcg agcacgtaaa 4860ccccgaggtc tacgcgattt tggagcgctg ggcacgcctg gaaaaagcgc cagcttggat 4920cggcgtgaat ccactgagcg ggaaatgcca gctcatctgg ctcattgatc cggtgtatgc 4980cgcagcaggc atgagcagcc cgaatatgcg cctgctggct gcaacgaccg aggaaatgac 5040ccgcgttttc ggcgctgacc aggctttttc acataggctg agccgtggcc actgcactct 5100ccgacgatcc cagccgtacc gctggcatgc ccagcacaat cgcgtggatc gcctagctga 5160tcttatggag gttgctcgca tgatctcagg cacagaaaaa cctaaaaaac gctatgagca 5220ggagttttct agcggacggg cacgtatcga agcggcaaga aaagccactg cggaagcaaa 5280agcacttgcc acgcttgaag caagcctgcc gagcgccgct gaagcgtctg gagagctgat 5340cgacggcgtc cgtgtcctct ggactgctcc agggcgtgcc gcccgtgatg agacggcttt 5400tcgccacgct ttgactgtgg gataccagtt aaaagcggct ggtgagcgcc taaaagacac 5460caagggtcat cgagcctacg agcgtgccta caccgtcgct caggcggtcg gaggaggccg 5520tgagcctgat ctgccgccgg actgtgaccg ccagacggat tggccgcgac gtgtgcgcgg 5580ctacgtcgct aaaggccagc cagtcgtccc tgctcgtcag acagagacgc agagccagcc 5640gaggcgaaaa gctctggcca ctatgggaag acgtggcggt aaaaaggccg cagaacgctg 5700gaaagaccca aacagtgagt acgcccgagc acagcgagaa aaactagcta agtccagtca 5760acgacaagct aggaaagcta aaggaaatcg cttgaccatt gcaggttggt ttatgactgt 5820tgagggagag actggctcgt ggccgacaat caatgaagct atgtctgaat ttagcgtgtc 5880acgtcagacc gtgaatagag cacttaaggt ctgcgggcat tgaacttcca cgaggacgcc 5940gaaagcttcc cagtaaatgt gccatctcgt aggcagaaaa cggttccccc gtagggtctc 6000tctcttggcc tcctttctag gtcgggctga ttgctcttga agctctctag gggggctcac 6060accataggca gataacgttc cccaccggct cgcctcgtaa gcgcacaagg actgctccca 6120aagatcttca aagccactgc cgcgactgcc ttcgcgaagc cttgccccgc ggaaatttcc 6180tccaccgagt tcgtgcacac ccctatgcca agcttctttc accctaaatt cgagagattg 6240gattcttacc gtggaaattc ttcgcaaaaa tcgtcccctg atcgcccttg cgacgttggc 6300gtcggtgccg ctggttgcgc ttggcttgac cgacttgatc agcggccgc 6349<210>35<211>29
<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_35<400>35gagactcgag agctgccaat tattccggg29<210>36<211>41<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_36<400>36cctgaaggcg cgagggtggg catgggtaaa aaatcctttc g 41<210>37<211>19<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_37<400>37cccaccctcg cgccttcag 19<210>38<211>18<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>SEQ_ID_38<400>38ctgggtacat tgcggccc18<210>39<211>6386<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>PCLIK5MCS<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(196)<223>Psod
<220>
<221>misc_feature<222>(197)..(1330)<223>metA<220>
<221>misc_feature<222>(1752)..(2543)<223>KanR<220>
<221>misc_feature<222>(2810)..(3670)<223>Ori-Ec(pMB)complement<220>
<221>misc_feature<222>(3816)..(4490)<223>Orf1<220>
<221>misc_feature<222>(4824)..(5945)<223>Rep蛋白<400>39tcgagagctg ccaattattc cgggcttgtg acccgctacc cgataaatag gtcggctgaa 60aaatttcgtt gcaatatcaa caaaaaggcc tatcattggg aggtgtcgca ccaagtactt 120ttgcgaagcg ccatctgacg gattttcaaa agatgtatat gctcggtgcg gaaacctacg 180aaaggatttt ttacccatgc ccaccctcgc gccttcaggt caacttgaaa tccaagcgat 240cggtgatgtc tccaccgaag ccggagcaat cattacaaac gctgaaatcg cctatcaccg 300ctggggtgaa taccgcgtag ataaagaagg acgcagcaat gtcgttctca tcgaacacgc 360cctcactgga gattccaacg cagccgattg gtgggctgac ttgctcggtc ccggcaaagc 420catcaacact gatatttact gcgtgatctg taccaacgtc atcggtggtt gcaacggttc 480caccggacct ggctccatgc atccagatgg aaatttctgg ggtaatcgct tccccgccac 540gtccattcgt gatcaggtaa acgccgaaaa acaattcctc gacgcactcg gcatcaccac 600ggtcgccgca gtacttggtg gttccatggg tggtgcccgc accctagagt gggccgcaat 660gtacccagaa actgttggcg cagctgctgt tcttgcagtt tctgcacgcg ccagcgcctg 720gcaaatcggc attcaatccg cccaaattaa ggcgattgaa aacgaccacc actggcacga 780aggcaactac tacgaatccg gctgcaaccc agccaccgga ctcggcgccg cccgacgcat 840cgcccacctc acctaccgtg gcgaactaga aatcgacgaa cgcttcggca ccaaagccca 900aaagaacgaa aacccactcg gtccctaccg caagcccgac cagcgcttcg ccgtggaatc 960ctacttggac taccaagcag acaagctagt acagcgtttc gacgccggct cctacgtctt 1020
gctcaccgac gccctcaacc gccacgacat tggtcgcgac cgcggaggcc tcaacaaggc 1080actcgaatcc atcaaagttc cagtccttgt cgcaggcgta gataccgata ttttgtaccc 1140ctaccaccag caagaacacc tctccagaaa cctgggaaat ctactggcaa tggcaaaaat 1200cgtatcccct gtcggccacg atgctttcct caccgaaagc cgccaaatgg atcgcatcgt 1260gaggaacttc ttcagcctca tctccccaga cgaagacaac ccttcgacct acatcgagtt 1320ctacatctaa catatgacta gttcggacct agggatatcg tcgacatcga tgctcttctg 1380cgttaattaa caattgggat cctctagacc cgggatttaa atcgctagcg ggctgctaaa 1440ggaagcggaa cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg atgaatgtca 1500gctactgggc tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag gtagcttgca 1560gtgggcttac atggcgatag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc gaaccggaat 1620tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac tggatggctt 1680tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag acaggatgag 1740gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg 1800agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt 1860tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc 1920tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt 1980gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag 2040tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg 2100ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag 2160cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg 2220atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc 2280gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca 2340tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc 2400gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg 2460ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct 2520atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc 2580gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg 2640cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct 2700ggagttcttc gcccacgcta gcggcgcgcc ggccggcccg gtgtgaaata ccgcacagat 2760
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 2820gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 2880ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 2940ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 3000atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 3060aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 3120gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 3180ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 3240ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 3300acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 3360gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 3420ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 3480ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 3540gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 3600ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 3660agatcctttt aaaggccggc cgcggccgcg caaagtcccg cttcgtgaaa attttcgtgc 3720cgcgtgattt tccgccaaaa actttaacga acgttcgtta taatggtgtc atgaccttca 3780cgacgaagta ctaaaattgg cccgaatcat cagctatgga tctctctgat gtcgcgctgg 3840agtccgacgc gctcgatgct gccgtcgatt taaaaacggt gatcggattt ttccgagctc 3900tcgatacgac ggacgcgcca gcatcacgag actgggccag tgccgcgagc gacctagaaa 3960ctctcgtggc ggatcttgag gagctggctg acgagctgcg tgctcggcca gcgccaggag 4020gacgcacagt agtggaggat gcaatcagtt gcgcctactg cggtggcctg attcctcccc 4080ggcctgaccc gcgaggacgg cgcgcaaaat attgctcaga tgcgtgtcgt gccgcagcca 4140gccgcgagcg cgccaacaaa cgccacgccg aggagctgga ggcggctagg tcgcaaatgg 4200cgctggaagt gcgtcccccg agcgaaattt tggccatggt cgtcacagag ctggaagcgg 4260cagcgagaat tatcgcgatc gtggcggtgc ccgcaggcat gacaaacatc gtaaatgccg 4320cgtttcgtgt gccgtggccg cccaggacgt gtcagcgccg ccaccacctg caccgaatcg 4380gcagcagcgt cgcgcgtcga aaaagcgcac aggcggcaag aagcgataag ctgcacgaat 4440acctgaaaaa tgttgaacgc cccgtgagcg gtaactcaca gggcgtcggc taacccccag 4500tccaaacctg ggagaaagcg ctcaaaaatg actctagcgg attcacgaga cattgacaca 4560
ccggcctgga aattttccgc tgatctgttc gacacccatc ccgagctcgc gctgcgatca 4620cgtggctgga cgagcgaaga ccgccgcgaa ttcctcgctc acctgggcag agaaaatttc 4680cagggcagca agacccgcga cttcgccagc gcttggatca aagacccgga cacggagaaa 4740cacagccgaa gttataccga gttggttcaa aatcgcttgc ccggtgccag tatgttgctc 4800tgacgcacgc gcagcacgca gccgtgcttg tcctggacat tgatgtgccg agccaccagg 4860ccggcgggaa aatcgagcac gtaaaccccg aggtctacgc gattttggag cgctgggcac 4920gcctggaaaa agcgccagct tggatcggcg tgaatccact gagcgggaaa tgccagctca 4980tctggctcat tgatccggtg tatgccgcag caggcatgag cagcccgaat atgcgcctgc 5040tggctgcaac gaccgaggaa atgacccgcg ttttcggcgc tgaccaggct ttttcacata 5100ggctgagccg tggccactgc actctccgac gatcccagcc gtaccgctgg catgcccagc 5160acaatcgcgt ggatcgccta gctgatctta tggaggttgc tcgcatgatc tcaggcacag 5220aaaaacctaa aaaacgctat gagcaggagt tttctagcgg acgggcacgt atcgaagcgg 5280caagaaaagc cactgcggaa gcaaaagcac ttgccacgct tgaagcaagc ctgccgagcg 5340ccgctgaagc gtctggagag ctgatcgacg gcgtccgtgt cctctggact gctccagggc 5400gtgccgcccg tgatgagacg gcttttcgcc acgctttgac tgtgggatac cagttaaaag 5460cggctggtga gcgcctaaaa gacaccaagg gtcatcgagc ctacgagcgt gcctacaccg 5520tcgctcaggc ggtcggagga ggccgtgagc ctgatctgcc gccggactgt gaccgccaga 5580cggattggcc gcgacgtgtg cgcggctacg tcgctaaagg ccagccagtc gtccctgctc 5640gtcagacaga gacgcagagc cagccgaggc gaaaagctct ggccactatg ggaagacgtg 5700gcggtaaaaa ggccgcagaa cgctggaaag acccaaacag tgagtacgcc cgagcacagc 5760gagaaaaact agctaagtcc agtcaacgac aagctaggaa agctaaagga aatcgcttga 5820ccattgcagg ttggtttatg actgttgagg gagagactgg ctcgtggccg acaatcaatg 5880aagctatgtc tgaatttagc gtgtcacgtc agaccgtgaa tagagcactt aaggtctgcg 5940ggcattgaac ttccacgagg acgccgaaag cttcccagta aatgtgccat ctcgtaggca 6000gaaaacggtt cccccgtagg gtctctctct tggcctcctt tctaggtcgg gctgattgct 6060cttgaagctc tctagggggg ctcacaccat aggcagataa cgttccccac cggctcgcct 6120cgtaagcgca caaggactgc tcccaaagat cttcaaagcc actgccgcga ctgccttcgc 6180gaagccttgc cccgcggaaa tttcctccac cgagttcgtg cacaccccta tgccaagctt 6240ctttcaccct aaattcgaga gattggattc ttaccgtgga aattcttcgc aaaaatcgtc 6300
ccctgatcgc ccttgcgacg ttggcgtcgg tgccgctggt tgcgcttggc ttgaccgact 6360tgatcagcgg ccgctcgatt taaatc6386<210>40<211>1005<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>果糖-1，6-二磷酸酶<400>40atgaacctaa agaaccccga aacgccagac cgtaaccttg ctatggagct ggtgcgagtt 60acggaagcag ctgcactggc ttctggacgt tgggttggac gtggcatgaa gaatgaaggc 120gacggtgccg ctgttgacgc catgcgccag ctcatcaact cagtgaccat gaagggcgtc 180gttgttatcg gcgagggcga aaaagacgaa gctccaatgc tgtacaacgg cgaagaggtc 240ggaaccggct ttggacctga ggttgatatc gcagttgacc cagttgacgg caccaccctg 300atggctgagg gtcgccccaa cgcaatttcc attctcgcag ctgcagagcg tggcaccatg 360tacgatccat cctccgtctt ctacatgaag aagatcgccg tgggacctga ggccgcaggc 420aagatcgaca tcgaagctcc agttgcccac aacatcaacg cggtggcaaa gtccaaggga 480atcaaccctt ccgacgtcac cgttgtcgtg cttgaccgtc ctcgccacat cgaactgatc 540gcagacattc gtcgtgcagg cgcaaaggtt cgtctcatct ccgacggcga cgttgcaggt 600gcagttgcag cagctcagga ttccaactcc gtggacatca tgatgggcac cggcggaacc 660ccagaaggca tcatcactgc gtgcgccatg aagtgcatgg gtggcgaaat ccagggcatc 720ctggccccaa tgaacgattt cgagcgccag aaggcacacg acgctggtct ggttcttgat 780caggttctgc acaccaacga tctggtgagc tccgacaact gctacttcgt ggcaaccggt 840gtgaccaacg gtgacatgct ccgtggcgtt tcctaccgcg caaacggcgc aaccacccgt 900tccctggtta tgcgcgcaaa gtcaggcacc atccgccaca tcgagtctgt ccaccagctg 960tccaagctgc aggaatactc cgtggttgac tacaccaccg cgacc 1005<210>41<211>335<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>41Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg Asn Leu Ala Met Glu1 5 10 15
Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ser Gly Arg Trp Val20 25 30Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala Ala Val Asp Ala Met35 40 45Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly Val Val Val Ile Gly50 55 60Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Val65 70 75 80Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala Val Asp Pro Val Asp85 90 95Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Ser Ile Leu100 105 110Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr115 120 125Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile130 135 140Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly145 150 155 160Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His165 170 175Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu180 185 190Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser195 200 205Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile210 215 220Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile225 230 235 240Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly245 250 255Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp260 265 270Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn Gly Asp Met Leu Arg275 280 285Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Ser Leu Val Met290 295 300Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu Ser Val His Gln Leu305 310 315 320Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr Thr Thr Ala Thr325 330 335
<210>42<211>6<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>POTENTIELLE_-10-區(qū)_1<400>42tgcaat 6<210>43<211>7<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>POTENTIELLE_-10-區(qū)_2<400>43tatcatt7<210>44<211>7<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<223>RIBOSOMALE_BINDUNGSSTELLE\SHINE-DALGARNO<400>44gaaagga權(quán)利要求
1.一種具有啟動子活性的核酸在基因轉(zhuǎn)錄中的用途，所述核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，并在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段。
2.一種表達(dá)單元在基因表達(dá)中的用途，所述表達(dá)單元包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸及額外的功能性連接的核酸序列，所述核酸序列確保核糖核酸的翻譯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述表達(dá)單元包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，并在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中所述表達(dá)單元由核酸序列SEQ.ID.NO.2組成。
5.一種具有啟動子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，并在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
6.一種表達(dá)單元，其包含根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有啟動子活性的核酸及額外的功能性連接的核酸序列，所述核酸序列確保核糖核酸的翻譯。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)單元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，并在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
8.一種與野生型相比，改變或影響微生物中基因轉(zhuǎn)錄速率的方法，其通過a)與野生型相比，改變微生物中根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的內(nèi)源核酸的特異啟動子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b)以根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中以根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄通過以下方式達(dá)到b1)將一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的內(nèi)源核酸控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或b3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中與野生型相比，為了提高或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率，ah)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動子活性是增加的，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh)以根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中以根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄通過以下方式達(dá)到bh1)將一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的內(nèi)源核酸控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或bh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中與野生型相比，為了降低微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率，ar)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動子活性是降低的，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將具有根據(jù)實施方案a)所述的降低的特異啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在所述導(dǎo)入的具有降低的啟動子活性的核酸控制下進行內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。
13.一種與野生型相比，改變或影響微生物中基因表達(dá)速率的方法，其通過c)與野生型相比，改變微生物中根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或d)以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實施方案c)所述的改變的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因與所述表達(dá)單元是異源的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的改變的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來調(diào)節(jié)微生物中基因表達(dá)通過以下方式達(dá)到d1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或d3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中與野生型相比，為了提高或影響微生物中基因的表達(dá)速率，ch)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)所述內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來調(diào)節(jié)微生物中基因表達(dá)，其中所述基因與所述表達(dá)單元是異源的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來調(diào)節(jié)微生物中基因表達(dá)通過以下方式達(dá)到dh1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中與野生型相比，為了降低微生物中基因的表達(dá)速率，cr)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是降低的，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)所述內(nèi)源基因的表達(dá)，或dr)將根據(jù)實施方案cr)所述的具有降低的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在所述導(dǎo)入的具有降低的表達(dá)活性的表達(dá)單元控制下進行內(nèi)源基因的表達(dá)。
18.根據(jù)權(quán)利要求8-17中任一項所述的方法，其中所述基因選自編碼來自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中所述基因任選包含其他調(diào)節(jié)元件。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述來自氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰-轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
20.一種表達(dá)盒，其包含a)至少一種根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，及b)至少一種其他待表達(dá)核酸，及c)適當(dāng)條件下其他遺傳控制元件，其中至少一種表達(dá)單元與其他待表達(dá)核酸序列功能性連接在一起，且所述其他待表達(dá)核酸序列與所述表達(dá)單元是異源的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的表達(dá)盒，其中所述其他待表達(dá)核酸序列選自編碼來自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的表達(dá)盒，其中所述來自氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰-轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
23.一種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項所述的表達(dá)盒。
24.一種基因修飾微生物，其中所述基因修飾導(dǎo)致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的轉(zhuǎn)錄速率，并取決于a)改變微生物中至少一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的內(nèi)源核酸的特異啟動子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b)以根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因轉(zhuǎn)錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾微生物，其中以根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄通過以下方式達(dá)到b1)將一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的內(nèi)源核酸控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或b3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有提高或影響的轉(zhuǎn)錄速率，其中ah)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動子活性是增加的，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh)以根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據(jù)實施方案ah)的增加的特異啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的基因修飾微生物，其中以根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄通過以下方式達(dá)到bh1)將一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的內(nèi)源核酸控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或bh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有降低的轉(zhuǎn)錄速率，其中ar)與野生型相比，至少一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動子活性是降低的，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將一種或多種具有根據(jù)實施方案a)所述的降低的啟動子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在所述導(dǎo)入的具有降低的啟動子活性的核酸控制下進行至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。
29.一種基因修飾微生物，其中所述基因修飾導(dǎo)致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的表達(dá)速率，并取決于c)與野生型相比，改變微生物中根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的至少一種內(nèi)源表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d)以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的改變的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因與所述表達(dá)單元是異源的。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的基因修飾微生物，其中以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的改變的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來調(diào)節(jié)微生物中基因表達(dá)通過以下方式達(dá)到d1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在所述導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在所述適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或d3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有提高或影響的表達(dá)速率，其中ch)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的至少一種內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因與所述表達(dá)單元是異源的。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的基因修飾微生物，其中以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)通過以下方式達(dá)到dh1)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元控制下進行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有降低的表達(dá)速率，其中cr)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的至少一種內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是降低的，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dr)將一種或多種具有降低的表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有降低的表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元控制下進行至少一種基因的表達(dá)。
34.一種基因修飾微生物，其包含根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元及以功能性連接的待表達(dá)基因，其中所述基因與所述表達(dá)單元是異源的。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的基因修飾微生物，其包含根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項所述的表達(dá)盒。
36.根據(jù)權(quán)利要求24-35中任一項所述的基因修飾微生物，其中所述基因選自編碼來自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中所述基因任選包含其他調(diào)節(jié)元件。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的基因修飾微生物，其中所述來自氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
38.一種通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24至37中任一項所述的基因修飾微生物來制備生物合成產(chǎn)物的方法。
39.一種通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24、25、31或32中任一項所述的基因修飾微生物來制備賴氨酸的方法，其中所述基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR1的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼精氨酰-tRNA合成酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼蛋白質(zhì)OpcA的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸及編碼6-磷酸果糖激酶的核酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，所述活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫羧酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR1的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2的活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、賴氨酸輸出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素連接酶活性。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，所述活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰-高絲氨酸硫化氫解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高絲氨酸激酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、蘇氨酸輸出子活性、蘇氨酸排出蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性及蘇氨酸合酶活性。
42.一種通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24、25、31或32中任一項所述的基因修飾微生物來制備甲硫氨酸的方法，其中所述基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼胱硫醚γ合酶的核酸、編碼胱硫醚β裂合酶的核酸、編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的核酸、編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的核酸、編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼半胱氨酸合酶I的核酸、編碼半胱氨酸合酶II的核酸、編碼輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白NADPH-還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247的核酸、編碼RXA0655調(diào)節(jié)物的核酸及編碼RXN2910調(diào)節(jié)物的核酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，所述活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、胱硫醚γ合酶活性、胱硫醚β裂合酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、亞甲基四氫葉酸還原酶活性、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸絲氨酸磷酸酶活性、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶活性、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶活性、鐵氧還蛋白NADPH-還原酶活性、鐵氧還蛋白活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247的活性、RXA655調(diào)節(jié)物的活性及RXN2910調(diào)節(jié)物的活性。
44.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，所述活性選自高絲氨酸激酶活性、蘇氨酸脫水酶活性、蘇氨酸合酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性及二氨基吡啶甲酸脫羧酶活性。
45.一種通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24、25、31或32中任一項所述的基因修飾微生物來制備蘇氨酸的方法，其中所述基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸激酶的核酸、編碼蘇氨酸合酶的核酸、編碼蘇氨酸輸出子載體的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼蘇氨酸排出蛋白的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼OpcA蛋白質(zhì)的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸、編碼6-磷酸果糖激酶的核酸及編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，所述活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、蘇氨酸合酶活性、蘇氨酸輸出子載體活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、高絲氨酸激酶活性、生物素連接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、蘇氨酸排出蛋白活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性及高絲氨酸脫氫酶活性。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，所述活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性、賴氨酸輸出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸還原異構(gòu)酶活性、支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、二羥基-酸脫水酶活性及二氨基吡啶甲酸脫羧酶活性。
48.根據(jù)權(quán)利要求38-47中任一項所述的方法，其中所述生物合成產(chǎn)物在培養(yǎng)步驟后和/或培養(yǎng)步驟期間中從培養(yǎng)基中分離，且在適當(dāng)條件下純化。
49.核酸序列SEQ.ID.NO.44作為能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元中核糖體結(jié)合位點的用途。
50.核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43作為能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元中-10區(qū)的用途。
51.一種能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.44。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的表達(dá)單元，其中所述核酸序列SEQ.ID.NO.44作為核糖體結(jié)合位點。
53.一種能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43中的至少一種。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的表達(dá)單元，其中所述核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43之一作為-10區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的核酸序列的用途、新啟動子及表達(dá)單元、用于改變或影響基因轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的方法、包含所述表達(dá)單元的表達(dá)盒、具有改變的或受影響的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的基因修飾微生物及通過培育所述基因修飾微生物制備生物合成產(chǎn)物的方法。
文檔編號C12N1/21GK1894411SQ200480037881
公開日2007年1月10日 申請日期2004年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者B·克勒格爾, O·策爾德爾, C·克洛普羅格, H·施羅德, S·哈夫納 申請人:巴斯福股份公司