專(zhuān)利名稱(chēng)：：Hiv－依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明之特征為包括可表現(xiàn)序列之核酸分子，其包含報(bào)導(dǎo)基因及治療基因，其表現(xiàn)系依賴(lài)HIVTat及Rev蛋白質(zhì)之存在。其它特征為偵測(cè)HIV之方法、鑒別該可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物之方法、殺死經(jīng)HIV感染之細(xì)胞之方法、以及治療經(jīng)HIV感染之對(duì)象之方法。
背景技術(shù)：
：由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染造成之后天免疫不全癥(AIDS)為美國(guó)及世界各地之疾病及死亡之主要原因。由于內(nèi)生性或后天之抗性使得以現(xiàn)有藥物治療AIDS經(jīng)常失效。因?yàn)镠IV感染之早期診斷為現(xiàn)存療法之成功關(guān)鍵，故發(fā)展出更敏感且更準(zhǔn)確之HIV感染之診斷測(cè)試極為重要。于美國(guó)，自1981年起已報(bào)導(dǎo)688,000件以上之AIDS案例，且新感染案例之速度仍為無(wú)法接受高達(dá)每年40,000件。所有新感染之個(gè)體中半數(shù)為25歲以下者，且少數(shù)族群受到特別大的影響。全球，15至49歲之成人中每100人中約有1人感染HIV。1999年估計(jì)全球有5.6百萬(wàn)新的HIV感染案例，每日約有15,000件感染案例。此等新感染案例中95％以上系于開(kāi)發(fā)中國(guó)家。2003年，估計(jì)全球幾乎有40百萬(wàn)人感染HIV(參見(jiàn)NIAID網(wǎng)站)。于AIDS之治療中發(fā)展有助于診斷HIV感染之方法，提供殺死經(jīng)HIV感染之細(xì)胞之手段，以及鑒別治療HIV之新的治療劑將極為重要。因此，于該領(lǐng)域中迫切需要此等方法。反轉(zhuǎn)錄病毒，例如HIV，系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄作用以形成雙股DNA，然后與宿主之染色質(zhì)(chromatin)整合。該經(jīng)整合之前病毒會(huì)轉(zhuǎn)錄出新的基因體及訊息RNA以產(chǎn)生病毒體。HIV于9千萬(wàn)堿基(9-kilo-base)基因體中具有三種典型之反轉(zhuǎn)錄病毒基因，gag、pol、及env。該病毒基因體亦可編碼出6種輔助或調(diào)節(jié)基因。此非常多數(shù)之基因產(chǎn)物之表現(xiàn)系利用多重閱讀架(readingframe)及多重剪接位置(splicingsite)而達(dá)成。始于前病毒之轉(zhuǎn)錄作用系由于該DNA之5’端發(fā)現(xiàn)之末端長(zhǎng)重復(fù)(LTR)，HIV激活子之活性來(lái)調(diào)節(jié)。該LTR具有多種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子之結(jié)合位置，包含Spl、NFkB、AP-1、及NF-AT(Garcia，J.A.等人(1987)EMBOJ.63761-70；Kawakami，K等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA854700-4；Leonard，J.等人(1989)J.Virol.634919-24；Li，C.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA887739-43；Nabel，G.及Baltimore，D.(1987)Nature326711-3[于Nature(1990)344(6262)178中出現(xiàn)公告之錯(cuò)誤更正]；Ross，E.K.等人(1991)J.Virol.654350-8)。已知此等因子系負(fù)責(zé)T細(xì)胞活性，T細(xì)胞活化作用會(huì)促進(jìn)病毒表現(xiàn)并不令人意外(Siekevitz，M.等人(1987)Science2381575-8[于Science(1988)239(4839)451中出現(xiàn)公告之錯(cuò)誤更正]；Stevenson，M.等人(1990)EMBOJ.91551-60；Tong-Starksen，S.E.等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA846845-9)。缺乏未成熟終止作用時(shí)，前病毒之表現(xiàn)會(huì)造成單一「完整」RNA之產(chǎn)生。此未經(jīng)-剪接之轉(zhuǎn)錄物可作為數(shù)種HIV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(gag-pol基因)，以及該合并至新合成之HIV粒子之RNA基因體之訊息。然而，于正常之HIV感染中，有些事件系早于新基因體RNA之累積。通常為宿主及反轉(zhuǎn)錄病毒基因表現(xiàn)所共通，以各種蛋白質(zhì)包含剪接酵素形成訊息之共轉(zhuǎn)錄結(jié)合作用，造成內(nèi)子(intron)之移除及將成熟訊息有效遞送至細(xì)胞質(zhì)。該完整之HIV轉(zhuǎn)錄物亦包含各種剪接供給及接受位置。HIV之此特征允許于重迭基因(于DNA之相同片段內(nèi))中編碼出各種蛋白質(zhì)，以及允許基因表現(xiàn)之暫時(shí)性分離。經(jīng)由改變使用及非-使用之剪接位置，由經(jīng)整合之DNA所產(chǎn)生之單一RNA具有近40種不同的轉(zhuǎn)錄物其總共可編碼9種不同的蛋白質(zhì)(Purcell，D.F.及Martin，M.A.(1993)J.Virol.676365-78)。于經(jīng)感染之細(xì)胞中，所產(chǎn)生之最早的RNA經(jīng)由細(xì)胞剪接機(jī)制而完全地受到剪接。經(jīng)完全剪接之HIV轉(zhuǎn)錄物可編碼三種蛋白質(zhì)負(fù)因子Nef、轉(zhuǎn)錄作用之反式活化子Tat、以及病毒基因表現(xiàn)之調(diào)控子Rev。此三種基因產(chǎn)物為調(diào)控性蛋白質(zhì)其可影響細(xì)胞及病毒功能而造成有效之病毒復(fù)制，更具體地，此三種蛋白質(zhì)可改變病毒之轉(zhuǎn)錄作用產(chǎn)量。Tat及Rev結(jié)合HIVRNA新轉(zhuǎn)錄之區(qū)域。Tat以共轉(zhuǎn)錄作用方式(與多種細(xì)胞蛋白質(zhì)因子一起，包含RNA聚合II-修飾激)與5′莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)TAR結(jié)合(Rana，T.M.及Jeang，K.T.(1999)Arch.Biochem.Biophys.365175-185)。Tat與該結(jié)合之蛋白質(zhì)藉促進(jìn)起始之轉(zhuǎn)錄活性之完成(持續(xù)性或抗-終止)發(fā)生作用。Rev蛋白質(zhì)系負(fù)責(zé)將新感染之細(xì)胞中早期之HIV基因表現(xiàn)轉(zhuǎn)換為晚期之基因表現(xiàn)。Rev調(diào)節(jié)單一且未經(jīng)-剪接之訊息之細(xì)胞質(zhì)遞送，因此其表現(xiàn)可協(xié)調(diào)占多數(shù)之Nef、Tat、及Rev(多重剪接之轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)物)轉(zhuǎn)換為表現(xiàn)單一且未剪接之HIV轉(zhuǎn)錄物，例如病毒體(virion)之結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)之轉(zhuǎn)錄物(Pollard，V.W.及Malim，M.H.(1998)Annu.Rev.Microbiol.52491-532)。此事件之發(fā)生系經(jīng)由Rev與未剪接或單一剪接之轉(zhuǎn)錄物及與負(fù)責(zé)將訊息自細(xì)胞核運(yùn)送出來(lái)之細(xì)胞成分之物理性交互作用。供Rev結(jié)合之RNA區(qū)域，Rev-反應(yīng)組件(RRE)，系位于env基因中HIVRNA之3’半段。Rev之多重復(fù)制份系組裝在RRE且Rev之不同區(qū)域與CRM1細(xì)胞核輸出蛋白質(zhì)結(jié)合。此結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)中未與RNA結(jié)合之Rev可與輸入子-β(importin-β)結(jié)合而將Rev蛋白質(zhì)運(yùn)回細(xì)胞核中。Tat或Rev之存在系HIV感染之指針，以及該兩者HIV蛋白質(zhì)可自經(jīng)整合之HIV前病毒影響表現(xiàn)作用。由于Tat可由LTR-驅(qū)動(dòng)之基因增強(qiáng)表現(xiàn)作用，故經(jīng)常采用與報(bào)導(dǎo)基因偶合之LTR以證實(shí)HIV之存在，例如于HIV-指針細(xì)胞。此等細(xì)胞于報(bào)導(dǎo)子上游具有經(jīng)整合之LTR，該報(bào)導(dǎo)子例如β-半乳糖(Kimpton，J.及Emerman，M.(1992)J.Virol.662232-2239；Vodicka，M.A.等人(1997)Virology233193-198)、螢光素(luciferase)(Aguilar-Cordova，E.等人(1994)AIDSRes.Hum.Retroviruses10295-301)、氯霉素乙醯轉(zhuǎn)移(Ciminale，V.等人(1990)AIDSRes.Hum.Retroviruses61281-1287；Schwartz，S.等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA867200-7203)、或綠色螢光蛋白質(zhì)(Gervaix，A.等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA944653-4658)。的確，于HIV及SIV(包含上述者)之NIHNIAIDResearchandReferenceReagentProgram中所列之所有指示方法系利用Tat表現(xiàn)之LTR敏感性。然而，Tat-依賴(lài)型指針細(xì)胞在許多方面不盡理想，包含HIVLTR對(duì)其他細(xì)胞因子具有反應(yīng)性之事實(shí)。此會(huì)造成非所欲程度之背景值活化作用。因此，此領(lǐng)域中需要更專(zhuān)一之方法以測(cè)試HIV感染。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明系基于，至少部分系基于，發(fā)現(xiàn)新穎之DNA構(gòu)筑體，本文中稱(chēng)為「HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體」、「HDEC」、或簡(jiǎn)稱(chēng)為「表現(xiàn)構(gòu)筑體」核酸分子，其包括可表現(xiàn)之序列，其表現(xiàn)系依賴(lài)HIVTat與Rev蛋白質(zhì)兩者之存在。HIVTat調(diào)控該可表現(xiàn)序列mRNA之轉(zhuǎn)錄作用。然而，因?yàn)樵摽杀憩F(xiàn)序列系包含于，至少部分系包含于內(nèi)子中，除非Rev存在，其系藉由細(xì)胞剪接機(jī)制而剪接出來(lái)。因此，此新穎之表現(xiàn)構(gòu)筑體可專(zhuān)一且敏感地偵測(cè)HIV感染及/或基因表現(xiàn)。其亦可用于可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物之篩選試驗(yàn)。其亦可經(jīng)由利用胞毒性可表現(xiàn)序列以用于殺死經(jīng)HIV感染之細(xì)胞。因此，一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供經(jīng)單離之核酸分子其包括激活子，其中該激活子之活性系依賴(lài)人類(lèi)免疫缺乏病毒(HIV)Tat蛋白質(zhì)(例如，HIV5’LTR)之存在；至少一個(gè)剪接供給位置(例如，HIVD1剪接供給位置)及至少一個(gè)剪接接受位置(例如，HIVA7剪接供給位置)；可表現(xiàn)序列，其非為野生型HIV序列，其中至少部分之報(bào)導(dǎo)子基因系位于剪接接受位置及剪接供給位置間之內(nèi)子中；以及人類(lèi)免疫缺乏病毒(HIV)之Rev反應(yīng)組件(RRE)。另一較佳具體實(shí)施例中，本發(fā)明之核酸分子進(jìn)一步包括人類(lèi)HIV3’LTR。一具體實(shí)施例中，該剪接接受位置系包含于RRE內(nèi)。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之核酸分子進(jìn)一步包括至少一第二剪接供給位置(例如，HIVD4剪接接受位置)以及至少一第二剪接接受位置(例如，HIVA5剪接接受位置)。又另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之核酸分子包括psi()位置，及/或核糖體內(nèi)入位置(IRES)。一具體實(shí)施例中，該可表現(xiàn)序列包括報(bào)導(dǎo)子基因，例如，編碼螢光蛋白質(zhì)(綠色螢光蛋白質(zhì)(GFP)、增強(qiáng)性綠色螢光蛋白質(zhì)(EGFP)、紅色螢光蛋白質(zhì)(RFP)、黃色螢光蛋白質(zhì)(YFP)、增強(qiáng)性黃色螢光蛋白質(zhì)(EYFP)、藍(lán)色螢光蛋白質(zhì)(BFP)、或青綠色螢光蛋白質(zhì)(CFP))之報(bào)導(dǎo)子基因。另一具體實(shí)施例中，該報(bào)導(dǎo)子基因編碼螢光素(例如，螢火蟲(chóng)螢光素或水母螢光素)、β-半乳糖、胸激(TK)、或氯霉素乙醯轉(zhuǎn)移(CAT)。另一具體實(shí)施例中，該報(bào)導(dǎo)子基因包括治療基因(例如，胞毒性蛋白質(zhì))。于較佳之具體實(shí)施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包含SEQIDNO1、2、或3所述之核酸序列，或包含于以ATCC存取編號(hào)寄存之質(zhì)體中之插入物，或其互補(bǔ)物(complement)。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括與SEQIDNO1、2、或3之核酸序列，或與包含于以ATCC存取編號(hào)寄存之質(zhì)體中之插入物具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.25％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％之相似性之核酸序列，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系依賴(lài)HIVTat及Rev蛋白質(zhì)之存在。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供經(jīng)單離之核酸分子其包括本文所述之核酸分子之互補(bǔ)物(例如，完整之互補(bǔ)物)。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供含有本發(fā)明之核酸分子之載體(例如，質(zhì)體及重組反轉(zhuǎn)錄病毒)及宿主細(xì)胞(例如，T細(xì)胞，或以ATCC存取編號(hào)＿＿寄存之宿主細(xì)胞)。又另一具體實(shí)施例中本發(fā)明提供一種測(cè)定樣本中是否存在HIV之方法，其包括將含有本發(fā)明之核酸分子之宿主細(xì)胞與樣本接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表樣本中存在HIV。較佳之具體實(shí)施例中，該生物樣本系單離自對(duì)象(例如，人類(lèi)對(duì)象)。又較佳之具體實(shí)施例中，該生物樣本系由生物液體樣本(例如，血液、血清、血漿、唾液、尿液、糞便、精液、陰道液、脊髓液、淋巴液、羊水、淚液、鼻腔分泌物、汗、乳汁、粘液、或組織液)、組織樣本(例如，淋巴結(jié)樣本、皮膚樣本、或絨毛膜樣本)、及細(xì)胞樣本(例如，血液細(xì)胞樣本如T細(xì)胞樣本)所組成之群組中選出者。又一具體實(shí)施例中，該樣本可經(jīng)純化。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種測(cè)定細(xì)胞是否感染HIV之方法，其包括將該細(xì)胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉(zhuǎn)錄病毒接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表該細(xì)胞感染HIV。又另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種測(cè)定對(duì)象(例如，人類(lèi)對(duì)象)是否感染HIV之方法，其包括將該對(duì)象之細(xì)胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉(zhuǎn)錄病毒接觸，以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表感染HIV。又另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種殺死經(jīng)HIV感染之細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)之方法，其包括與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉(zhuǎn)錄病毒接觸，其中該反轉(zhuǎn)錄病毒含有編碼出胞毒性蛋白質(zhì)之可表現(xiàn)序列。較佳之具體實(shí)施例中，該細(xì)胞系包含于人類(lèi)對(duì)象中。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種治療經(jīng)HIV感染之對(duì)象(例如，人類(lèi)對(duì)象)之方法，其包括對(duì)該對(duì)象投予含有本發(fā)明之核酸分子之反轉(zhuǎn)錄病毒，其中該反轉(zhuǎn)錄病毒含有編碼出胞毒性蛋白質(zhì)之可表現(xiàn)序列。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種鑒別可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物之方法，其包括將含有本發(fā)明之核酸分子之宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；將該細(xì)胞與HIV接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)，其中可抑制該可表現(xiàn)序列表現(xiàn)之化合物系鑒定為可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物。又另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種鑒別可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物之方法，其包括將細(xì)胞與HIV接觸；將該細(xì)胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉(zhuǎn)錄病毒接觸；將該細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)，其中可抑制該可表現(xiàn)序列表現(xiàn)之化合物系鑒定為可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物。又本發(fā)明之另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種鑒別可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物之方法，其包括將經(jīng)HIV感染之細(xì)胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉(zhuǎn)錄病毒接觸；將該細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)，其中可抑制該可表現(xiàn)序列表現(xiàn)之化合物系鑒定為可抑制HIV感染或基因表現(xiàn)之化合物。本發(fā)明之其它特征及優(yōu)點(diǎn)可藉由下列詳細(xì)說(shuō)明及申請(qǐng)專(zhuān)利范圍而明了。第1圖說(shuō)明SEQIDNO1之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之核酸序列，其包含GFP報(bào)導(dǎo)基因及單一個(gè)剪接接受/剪接供給位置配對(duì)。第2圖說(shuō)明SEQIDNO2之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之核酸序列，其包含GFP報(bào)導(dǎo)基因及兩個(gè)剪接接受/剪接供給位置配對(duì)。第3A及3B圖說(shuō)明SEQIDNO3之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之核酸序列，其包含GFP報(bào)導(dǎo)基因、β-半乳糖報(bào)導(dǎo)基因、及兩個(gè)剪接接受/剪接供給位置配對(duì)。第4圖概要式說(shuō)明示范性HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體，其含有單一個(gè)剪接接受/剪接供給位置配對(duì)。其中標(biāo)示出5’LTR、剪接供給位置(D1)、可表現(xiàn)序列(ORF)、Rev反應(yīng)組件(RRE)、剪接接受位置(A7)、及3’LTR的相對(duì)位置。其亦顯示于Rev不存在(經(jīng)剪接)及存在(未經(jīng)剪接)時(shí)所得之mRNA轉(zhuǎn)錄物。第5圖概要式說(shuō)明示范性HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體，其含有兩個(gè)剪接接受/剪接供給位置配對(duì)。其中標(biāo)示出5’LTR、剪接供給位置(D1及D4)、可表現(xiàn)序列(ORF)、Rev反應(yīng)組件(RRE)、剪接接受位置(A4及A7)、及3’LTR的相對(duì)位置。其亦顯示于Rev不存在(經(jīng)剪接)及存在(未經(jīng)剪接)時(shí)所得之mRNA轉(zhuǎn)錄物。第6圖說(shuō)明顯示RNA之凝膠，該RNA系萃取自經(jīng)感染HIV及感染含有SEQIDNO2之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體(HDEC)之反轉(zhuǎn)錄病毒之CEMT細(xì)胞。第1欄對(duì)照組(-HDEC，-HIV)；第2欄對(duì)照組(+HDEC，-HIV)；第3欄對(duì)照組(-HDEC，+HIV)；第4欄+HDEC，+HIV。第7圖說(shuō)明在經(jīng)HIV感染(下圖)或未感染(上圖)時(shí)，經(jīng)含有SEQIDNO2之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體(HDEC)之反轉(zhuǎn)錄病毒感染之CEMT細(xì)胞的GFP螢光反應(yīng)。第8圖說(shuō)明于經(jīng)HIV感染亦經(jīng)SEQIDNO2之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體(HDEC)(與VSV糖蛋白一起包裝成慢病毒偽型)感染之細(xì)胞中，藉由流式細(xì)胞術(shù)偵測(cè)GFP-陽(yáng)性之CEM細(xì)胞。上圖僅經(jīng)HDEC報(bào)導(dǎo)病毒感染之CEM細(xì)胞。中圖僅經(jīng)HIV感染之CEM細(xì)胞此處Nef基因系以鼠CD24取代。下圖經(jīng)HIV及HDEC報(bào)導(dǎo)病毒兩者感染之CEM細(xì)胞。具體實(shí)施例方式本發(fā)明系基于，至少部分系基于，發(fā)現(xiàn)新穎之DNA構(gòu)筑體，本文中稱(chēng)為「HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體」、「HDEC」、或簡(jiǎn)稱(chēng)為「表現(xiàn)構(gòu)筑體」核酸分子，其包括可表現(xiàn)之序列，其表現(xiàn)系依賴(lài)HIVTat與Rev蛋白質(zhì)兩者之存在。HIVTat調(diào)控該可表現(xiàn)序列mRNA之轉(zhuǎn)錄作用。然而，因?yàn)樵搱?bào)導(dǎo)子系包含于，至少部分系包含于內(nèi)子中，除非Rev存在，其系藉由細(xì)胞剪接機(jī)制而剪接出來(lái)。因此，此新穎之表現(xiàn)構(gòu)筑體可專(zhuān)一且敏感地偵測(cè)HIV感染及/或基因表現(xiàn)。其亦可用于可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物之篩選試驗(yàn)。其亦可經(jīng)由利用胞毒性可表現(xiàn)序列以用于殺死經(jīng)HIV感染之細(xì)胞。本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體包括可表現(xiàn)序列，其表現(xiàn)系受控于(亦即，操作性連接至)HIV-依賴(lài)型激活子，例如，HIV5’LTR。該構(gòu)筑體進(jìn)一步包含至少一個(gè)剪接接受-供給位置配對(duì)以及Rev反應(yīng)組件(RRE)。當(dāng)該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體引入至細(xì)胞時(shí)，若Rev不存在，自可表現(xiàn)序列轉(zhuǎn)錄出之任何mRNA將剪接出來(lái)。然而，當(dāng)Rev存在時(shí)(例如，當(dāng)該細(xì)胞感染HIV時(shí))，其會(huì)經(jīng)由RRE作用以防止該可表現(xiàn)序列之剪接。然后藉由直接偵測(cè)該mRNA或經(jīng)編碼之蛋白質(zhì)，或者藉由偵測(cè)該經(jīng)編碼之蛋白質(zhì)之活性，而偵測(cè)該可表現(xiàn)序列。第4及5圖顯示本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之兩種非-限制示范性具體實(shí)施例之概要圖。該構(gòu)筑體之兩端等同于線(xiàn)形HIV基因體之末端。中心區(qū)域系由可表現(xiàn)序列組成。該構(gòu)筑體整合至宿主細(xì)胞基因體后此可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)作用系依賴(lài)另一來(lái)源(例如，感染之HIV)之Tat及Rev的表現(xiàn)。如本文所使用，「可表現(xiàn)序列」，包含任何核酸序列，較佳為DNA序列，當(dāng)經(jīng)操作性連接至激活子時(shí)，可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生互補(bǔ)RNA。如本文所述，較佳之具體實(shí)施例中，可表現(xiàn)序列為報(bào)導(dǎo)子基因及/或治療基因。某些具體實(shí)施例中，本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)載體可包括可表現(xiàn)序列，其本身具有多個(gè)報(bào)導(dǎo)子及/或治療基因，該報(bào)導(dǎo)子及/或治療基因間可彼此連接，或由該構(gòu)筑體中之其它核酸序列分隔。如本文所使用，「操作性連接」系指該可表現(xiàn)序列系連接至該激活子，某種程度上其可使該可表現(xiàn)序列表現(xiàn)(例如，試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄作用/轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)或于宿主細(xì)胞內(nèi))。此外，如本文所述，「操作性連接」欲包含該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之各種組件的連接順序，使該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體根據(jù)其預(yù)期之功能進(jìn)行，如本文所述。如本文所使用，「報(bào)導(dǎo)子」或「報(bào)導(dǎo)子基因」系指當(dāng)操作性連接至激活子(例如，HIV-驅(qū)動(dòng)之激活子如HIV5’LTR)后可轉(zhuǎn)錄成mRNA之核酸分子，但本文所使用之「報(bào)導(dǎo)基因」不包含野生型HIV序列。較佳之報(bào)導(dǎo)子基因包含螢光素(例如，螢火蟲(chóng)螢光素或水母螢光素)、β-半乳糖、氯霉素乙醯轉(zhuǎn)移(CAT)、胸激(TK)、及螢光蛋白質(zhì)(綠色螢光蛋白質(zhì)、紅色螢光蛋白質(zhì)、黃色螢光蛋白質(zhì)、藍(lán)色螢光蛋白質(zhì)、青綠色螢光蛋白質(zhì)、或其變異物，包含增強(qiáng)性變異物)。只要其可藉由報(bào)導(dǎo)子基因分析試驗(yàn)予以偵測(cè)，任何報(bào)導(dǎo)核酸序列皆可作為報(bào)導(dǎo)子基因。報(bào)導(dǎo)子基因分析試驗(yàn)包含任何已知之直接或間接偵測(cè)核酸序列或其編碼之蛋白質(zhì)產(chǎn)物之方法。例如，報(bào)導(dǎo)子基因分析試驗(yàn)可藉由測(cè)量報(bào)導(dǎo)子mRNA之程度、報(bào)導(dǎo)子蛋白質(zhì)之程度、或報(bào)導(dǎo)子蛋白質(zhì)之活性量而測(cè)量報(bào)導(dǎo)子基因之表現(xiàn)或活性的程度?？蓽y(cè)量報(bào)導(dǎo)子mRNA之程度，例如，利用溴化乙錠(ethidiumbromide)將標(biāo)準(zhǔn)之RNA凝膠染色、RNA雜交印跡法、引物延伸、或核酸保護(hù)試驗(yàn)?？蓽y(cè)量報(bào)導(dǎo)子蛋白質(zhì)之程度，例如，利用考馬斯(Coomassie)將SDS-PAGE凝膠染色、蛋白印跡法、點(diǎn)式墨點(diǎn)法、狹線(xiàn)墨點(diǎn)法、ELISA、或RIA?？衫脤?duì)所使用之報(bào)導(dǎo)子具有專(zhuān)一性之試驗(yàn)以測(cè)量報(bào)導(dǎo)子蛋白質(zhì)之活性。例如，螢光素、CAT、β-半乳糖、胸激(TK)試驗(yàn)(包含全身掃描；參見(jiàn)Yu，Y.等人(2000)NatureMedicine6933-937以及Blasberg，R.(2002)J.Cereb.BloodFlowMetab.221157-1164)之標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，及螢光蛋白質(zhì)皆為此技藝中已知者。亦應(yīng)了解「報(bào)導(dǎo)子基因」及「報(bào)導(dǎo)子」系包含治療基因，包含胞毒性蛋白質(zhì)。如本文所使用，「治療基因」或「治療性蛋白質(zhì)」包含任何基因或蛋白質(zhì)(例如，勝肽或多肽)，當(dāng)其于細(xì)胞中表現(xiàn)時(shí)，對(duì)該細(xì)胞之功能具有影響。較佳之具體實(shí)施例中，治療性蛋白質(zhì)為對(duì)細(xì)胞有毒(亦即，胞毒性)之蛋白質(zhì)。較佳之胞毒性蛋白質(zhì)包含，但非限于蓖麻毒素(ricin)、商陸毒素(pokeweedtoxin)、白喉毒素A(diphtheriatoxinA)、肥皂草毒素(saporin)、白樹(shù)素(gelonin)、假單胞菌外毒素A(PesudomonasexotoxinA)。治療基因亦包含可編碼反義RNA(例如，其可用于使細(xì)胞中之其它mRNA失活)及酵素性RNA(如核糖)之核酸序列。治療基因進(jìn)一步包含核糖體-失活性蛋白質(zhì)(Peumans，W.J.等人(2001)FasebJ.151493-1506)。如本文所使用，「激活子」通常系指基因體DNA之一區(qū)，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于mRNA轉(zhuǎn)錄起始位置之5’端。激活子系涉及調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄之時(shí)間及程度且包含，例如，細(xì)胞蛋白質(zhì)(例如RNA聚合及其它轉(zhuǎn)錄因子)之結(jié)合位置。關(guān)于激活子之進(jìn)一步說(shuō)明可參見(jiàn)，例如，Goeddel(1990)MethodsEnzymol.1853-7。本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體中所使用之激活子較佳系依據(jù)存在之HIVTat蛋白質(zhì)。本發(fā)明之構(gòu)筑體中所使用之較佳激活子為HIV5’LTR。一具體實(shí)施例中，該激活子包含完整之HIV5’LTR。另一具體實(shí)施例中，該激活子包含HIV5’LTR之片段。為對(duì)HIVTat蛋白質(zhì)反應(yīng)，此片段必須至少包含為起始mRNA轉(zhuǎn)錄作用所需之最短序列。參見(jiàn)，Wu.Y.及Marsh，J.W.(2003)MicrobesandInfection51023-1027；Pereira，L.A.等人(2000)NucleicAcids.Res.28663-668。此外，若欲將該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)載體包含于重組之反轉(zhuǎn)錄病毒中，該5’及3’LTR為反轉(zhuǎn)錄作用(形成DNA)、整合作用(與HIV整合合作)、以及經(jīng)整合之DNA的轉(zhuǎn)錄作用、與產(chǎn)生報(bào)導(dǎo)子基因所需。與5’-LTR相鄰之基因體區(qū)域(稱(chēng)為psi()位置)為使該載體與重組之反轉(zhuǎn)錄病毒合并所需者。剪接位置(供給者及接受者)為移除(及沉默)該可表現(xiàn)序列所需。Rev可防止該剪接作用，因而促進(jìn)該開(kāi)放閱讀架之表現(xiàn)。該單一-剪接之構(gòu)筑體為Rev-依賴(lài)型載體中最低之位置數(shù)。二-剪接之構(gòu)筑體與形成Nef轉(zhuǎn)錄物之位置相似。雙剪接之Nef轉(zhuǎn)錄物為HIV感染中之主要訊息，因此HIV利用人類(lèi)細(xì)胞中有利之剪接位置。Rev反應(yīng)組件(RRE)為Rev結(jié)合及作用所需。為了可感染該目標(biāo)細(xì)胞且整合至該細(xì)胞中，該載體需合并至重組之反轉(zhuǎn)錄病毒中。為了使此事件發(fā)生必須提供許多反式組件之病毒蛋白質(zhì)以完成可單一感染循環(huán)之感染性粒子。先前已詳述為構(gòu)筑似HIV粒子之系統(tǒng)。因此，較佳之具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供經(jīng)單離之核酸分子，其包括激活子，其中該激活子之活性系依賴(lài)人類(lèi)免疫缺乏病毒(HIV)Tat蛋白質(zhì)(例如，HIV5’LTR)之存在；至少一個(gè)剪接供給位置(例如，HIVD1剪接供給位置)及至少一個(gè)剪接接受位置(例如，HIVA7剪接供給位置)；可表現(xiàn)序列，其非為野生型HIV序列，其中至少部分之可表現(xiàn)序列系位于剪接接受位置及剪接供給位置間之內(nèi)子中；以及人類(lèi)免疫缺乏病毒(HIV)之Rev反應(yīng)組件(RRE)。另一較佳具體實(shí)施例中，本發(fā)明之核酸分子進(jìn)一步包括人類(lèi)HIV3’LTR。一具體實(shí)施例中，該剪接接受位置系包含于RRE內(nèi)。一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括SEQIDNO1所示(第1圖)之核酸序列。此核酸分子包括GFP報(bào)導(dǎo)子基因其左右兩邊為單一個(gè)剪接供給位置及單一個(gè)剪接接受位置，以及HIV5’及3’LTR。該剪接接受位置系包含于Rev反應(yīng)組件中。SEQIDNO1之核酸1至634包括HIV5’LTR。SEQIDNO1之核酸686至823包括基因體RNA包裝訊號(hào)。SEQIDNO1之核酸743至744包括剪接供給位置。SEQIDNO1之核酸1143至1191包括多重選殖位置。SEQIDNO1之核酸1299至1873包括IRES。SEQIDNO1之核酸1883至2559包括可編碼綠色螢光蛋白質(zhì)(GFP)之開(kāi)放閱讀架。SEQIDNO1之核酸2638至3495包括HIVRRE。SEQIDNO1之核酸3394至3395包括剪接接受位置。SEQIDNO1之核酸3784至4418包括HIV3’LTR。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括SEQIDNO2所示(第2圖)之核酸序列。此核酸分子包括GFP報(bào)導(dǎo)子基因，以及兩個(gè)剪接供給位置及兩個(gè)剪接接受位置，以及HIV5’及3’LTR。其中一個(gè)剪接接受位置系包含于Rev反應(yīng)組件中。SEQIDNO2之核酸1至634包括HIV5’LTR。SEQIDNO2之核酸686至823包括基因體RNA包裝訊號(hào)。SEQIDNO2之核酸743至744包括剪接供給位置。SEQIDNO2之核酸1164至1165包括剪接接受位置。SEQIDNO2之核酸1233至1234包括剪接供給位置。SEQIDNO2之核酸1292至1327包括多重選殖位置。SEQIDNO2之核酸1435至2009包括IRES。SEQIDNO2之核酸2019至2735包括可編碼綠色螢光蛋白質(zhì)(GFP)之開(kāi)放閱讀架。SEQIDNO2之核酸2774至3631包括HIVRRE。SEQIDNO2之核酸3530至3531包括剪接接受位置。SEQIDNO2之核酸3921至4554包括HIV3’LTR。又另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括SEQIDNO3所示(第3A及3B圖)之核酸序列。此核酸分子包括GFP報(bào)導(dǎo)子基因與β-半乳糖報(bào)導(dǎo)子基因，以及兩個(gè)剪接供給位置及兩個(gè)剪接接受位置以及HIV5’及3’LTR。其中一個(gè)剪接接受位置系包含于Rev反應(yīng)組件中。SEQIDNO3之核酸1至634包括HIV5’LTR。SEQIDNO3之核酸686至823包括基因體RNA包裝訊號(hào)。SEQIDNO3之核酸1至634包括HIV5’LTR。SEQIDNO3之核酸686至823包括基因體RNA包裝訊號(hào)。SEQIDNO3之核酸743至744包括剪接供給位置。SEQIDNO3之核酸1164至1165包括剪接接受位置。SEQIDNO3之核酸1233至1234包括剪接供給位置。SEQIDNO3之核酸1314至4463包括可編碼β-半乳糖(lacZ)之開(kāi)放閱讀架。SEQIDNO3之核酸4600至5174包括IRES。SEQIDNO3之核酸5184至5900包括可編碼綠色螢光蛋白質(zhì)(GFP)之開(kāi)放閱讀架。SEQIDNO3之核酸5939至6796包括HIVRRE。SEQIDNO3之核酸6695至6696包括剪接接受位置。SEQIDNO3之核酸7086至7719包括HIV3’LTR。具有SEQIDNO1(核酸1至4418)之核酸序列之質(zhì)體系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO1(核酸1至4418)之核酸序列之宿主細(xì)胞系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO1(核酸1至4418)之核酸序列之質(zhì)體系寄存于美國(guó)菌種中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO1(核酸1至4418)之核酸序列之宿主細(xì)胞系寄存于美國(guó)菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO2(核酸1至4554)之核酸序列之質(zhì)體系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO2(核酸1至4554)之核酸序列之宿主細(xì)胞系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO2(核酸1至4554)之核酸序列之質(zhì)體系寄存于美國(guó)菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO2(核酸1至4554)之核酸序列之宿主細(xì)胞系寄存于美國(guó)菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO3(核酸1至7719)之核酸序列之質(zhì)體系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO3(核酸1至7719)之核酸序列之宿主細(xì)胞系寄存于NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，McKessonBioServicesCorporation，621LofstrandLane，Rockville，MD20850，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO3(核酸1至7719)之核酸序列之質(zhì)體系寄存于美國(guó)菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。具有SEQIDNO3(核酸1至7719)之核酸序列之宿主細(xì)胞系寄存于美國(guó)菌種中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209，于＿＿，及其指定之編號(hào)為＿＿。依據(jù)布達(dá)佩斯條約上述提及之寄存物將保存于國(guó)際認(rèn)可之微生物寄存機(jī)構(gòu)以符合專(zhuān)利程序。此等寄存物僅為熟于此技藝者之方便而制作而基于35U.S.C.§112并不認(rèn)為需要寄存。I.經(jīng)單離之核酸分子本發(fā)明之一方面系關(guān)于經(jīng)單離之核酸分子，其包括HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體。如本文所使用，「核酸分子」一般系包含DNA分子(例如，cDNA或基因體DNA)以及RNA分子(例如，mRNA)及利用核酸類(lèi)似物產(chǎn)生之DNA或RNA類(lèi)似物。該核酸分子可為單股或雙股，但較佳為雙股DNA。通常，本發(fā)明之最佳實(shí)施方式可藉由利用經(jīng)認(rèn)可之操作方式達(dá)成。例如，單離mRNA之技術(shù)、制造及篩選cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)之方法、純化及分析核酸、制造重組載體DNA之方法、以限制酵素切割DNA、接合DNA、藉由穩(wěn)定及瞬間方式將DNA引入至宿主細(xì)胞、培養(yǎng)該宿主細(xì)胞、單離及純化多肽與制造抗體之方法皆為此領(lǐng)域中已知者。一般可參見(jiàn)Sambrook等人，MolecularCloning(2ded.1989)，及Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，(1989)JohnWiley&Sons，NewYork.「經(jīng)單離之核酸分子」包含自其它存在于核酸自然來(lái)源之核酸分子分離出之核酸分子。例如，關(guān)于基因體DNA，「經(jīng)單離」包含自病毒DNA或染色體(其通常與天然之基因體DNA有關(guān))分離之核酸分子。較佳地，「經(jīng)單離」之核酸并無(wú)于自然情況下取得該核酸之有機(jī)體的基因體DNA中位于該核酸(亦即，序列位于該核酸之5’及3’端)兩側(cè)之序列。例如，各種具體實(shí)施例中，經(jīng)單離之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體核酸分子可包含小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb之核酸序列，該核酸序列系于自然情況下取得該核酸之HIV病毒基因體DNA中位于該核酸分子兩側(cè)之序列。再者，「經(jīng)單離」之核酸分子當(dāng)由重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，其實(shí)質(zhì)上無(wú)其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)由化學(xué)合成時(shí)，其實(shí)質(zhì)上無(wú)化學(xué)前驅(qū)物或其它化學(xué)物。本發(fā)明之核酸分子，例如，具有SEQIDNO1、2、或3，或其部分之核酸分子，可利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)及本文提供之序列信息加以構(gòu)筑而得。再者，具有完整或部分SEQIDNO1、2、或3之核酸分子可藉由使用針對(duì)SEQIDNO1、2、或3序列所設(shè)計(jì)之合成的寡核酸引子以聚合鏈反應(yīng)(PCR)單離出來(lái)。本發(fā)明之核酸可利用cDNA、mRNA或者，基因體DNA作為模板以及適當(dāng)之寡核酸引子根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR增幅技術(shù)予以增幅。所增幅之核酸可選殖至適當(dāng)載體且以DNA定序分析找出其特征。再者，相應(yīng)于HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體核酸序列之寡核酸可由標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，例如，利用自動(dòng)化DNA合成儀而制備。又另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括核酸分子，其為SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列的互補(bǔ)物。與SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列互補(bǔ)之核酸分子為可充分地與SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列互補(bǔ)者，因此其可與SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列雜交，而形成穩(wěn)定之雙鏈?！富パa(bǔ)」等系指核酸或核酸間，例如，雙股DNA分子的兩股間或寡核酸引子與欲定序或增幅之單股核酸中之引子結(jié)合位置間之雜交作用或堿基配對(duì)。一般互補(bǔ)核酸為A與T(或A與U)，或C與G。當(dāng)一股核酸與另一股核酸進(jìn)行比對(duì)及比較，可具有適當(dāng)之核酸插入或刪除，而產(chǎn)生最理想之配對(duì)時(shí)，至少約95％之核酸與另一股配對(duì)，通常至少約98％，以及更佳為自約99至約100％，可稱(chēng)該兩單股RNA或DNA分子實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)?；パa(bǔ)之聚核酸序列可由各種方法，包含利用已知之計(jì)算機(jī)演算及軟件，予以鑒別。又另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之經(jīng)單離之核酸分子包括核酸序列，其與SEQIDNO1、2、或3所示之核酸序列(例如，完整長(zhǎng)度之核酸序列)，或此等核酸序列之部分或互補(bǔ)物具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或以上之相似性。一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之核酸分子包括核酸序列，該序列包括部分或完整之SEQIDNO1或2，或其互補(bǔ)物，且其長(zhǎng)度至少為(或不大于)25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、1994、2000、2050、2073、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3441、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3841、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、5750、5800、5850、5900、6000、6050、6100、6150、6200、6250、6300、6350、6400、6450、6500、6550、6600、6650、6700、6750、6800、6850、6900、6950、7000、7050、7100、7150、7200、7250、7300、7350、7400、7450、7500、7550、7600、7650、7700或以上之核酸(例如連續(xù)核酸)。為決定兩核酸或胺基酸序列之相似性百分比，將序列以最理想之比較目的進(jìn)行比對(duì)(例如，于第一及第二胺基酸或核酸序列之一或兩者中引入缺口(gap)以達(dá)最理想之比對(duì)以及為了比較之目的可忽略非-同源序列)。較佳之具體實(shí)施例中，為比較之目的而比對(duì)之參考序列的長(zhǎng)度為該參考序列之長(zhǎng)度的至少30％，較佳為至少40％，更佳為至少50％，甚至更佳為至少60％，以及甚至更佳為至少70％、80％、或90％(例如，將第二序列與具有100個(gè)核酸之核酸序列比對(duì)時(shí)，至少有30個(gè)，較佳為至少40個(gè)，更佳為至少50個(gè)，甚至更佳為至少60個(gè)，以及甚至更佳為至少70、80、或90個(gè)核酸比對(duì))。然后于相對(duì)應(yīng)之胺基酸位置或核酸位置比較該胺基酸殘基或核酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄兄骋晃恢玫陌坊釟埢蚝怂崤c第二序列中相對(duì)應(yīng)位置者相同，則該分子于該位置完全相同(如本文所使用，胺基酸或核酸之「相似性」等同于胺基酸或核酸之「同源性」)。兩序列間之相似性百分比為該序列共有之相同位置之函數(shù)，其涉及計(jì)算為達(dá)兩序列最理想之比對(duì)所需引入之缺口數(shù)，及各缺口之長(zhǎng)度。利用數(shù)學(xué)算法可完成兩序列間之比對(duì)且決定相似性百分比。較佳之具體實(shí)施例中，兩胺基酸序列間之相似性百分比系利用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))算法其已合并于GCG軟件套件(于網(wǎng)絡(luò)上可經(jīng)由GeneticsComputerGroup而得)中之GAP程序，利用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及缺口比重(gapweight)16、14、12、10、8、6、或4以及長(zhǎng)度比重(lengthwright)1、2、3、4、5、或6決定。又另一較佳具體實(shí)施例中，兩核酸序列間之相似性百分比系利用GCG軟件套件(于網(wǎng)絡(luò)上可經(jīng)由GeneticsComputerGroup而得)中之GAP程序，利用NWSgapdna.CMP矩陣以及缺口比重40、50、60、70或80以及長(zhǎng)度比重1、2、3、4、5、或6決定。欲與GAP程序一起使用之參數(shù)的較佳非-限制實(shí)例包含Blossum62記分矩陣，其缺口罰分(gappenalty)為12、缺口延長(zhǎng)罰分為4、及閱讀架移動(dòng)缺口罰分為5。另一具體實(shí)施例中，兩胺基酸或核酸序列間之相似性百分比系利用Meyers及Miller算法(Comput.Appl.Biosci.411-17(1988))其已合并于ALIGN程序(2.0版或2.0U版)，利用PAM120比重殘基表(PAM120weightresiduetable)，缺口長(zhǎng)度罰分為12以及缺口罰分為4決定。本發(fā)明之核酸分子可僅包括SEQIDNO1、2、或3之部分核酸序列，例如，可作為探針或引子之片段或可編碼部分HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之片段。該探針/引子(例如寡核酸)典型地包括實(shí)質(zhì)上純之寡核酸。該寡核酸典型地包括一段核酸序列其于嚴(yán)格條件下可與SEQIDNO1、2、或3，或其互補(bǔ)物之至少約12或15個(gè)，較佳約20或25個(gè)，更佳約30、35、40、45、50、55、60、65、或75個(gè)連續(xù)的核酸雜交。示范性之探針或引子之核酸長(zhǎng)度至少為(或不大于)12或15，20或25，30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或以上以及/或包括本文所述之經(jīng)單離之核酸分子之連續(xù)的核酸。具有本文所述之經(jīng)單離之核酸分子之相連或連續(xù)核酸之探針或引子亦包含于本發(fā)明之范疇中，但該探針或引子序列中可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)堿基之差異。根據(jù)該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體核酸序列之探針可用于偵測(cè)(例如，專(zhuān)一性偵測(cè))基因體序列。較佳之具體實(shí)施例中，該探針進(jìn)一步包括附接于其上之標(biāo)記基團(tuán)，例如，該標(biāo)記基團(tuán)可為放射性同位素、螢光化合物、酵素、或酵素輔-因子。另一具體實(shí)施例中系提供一組引子，例如，適用于PCR之引子，其可用于增幅HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體序列中之選定的區(qū)域，例如，域(domain)、區(qū)域、位置或其它本文所述之序列。該引子之長(zhǎng)度至少為5、10、或50個(gè)堿基對(duì)且少于100、或少于200個(gè)堿基對(duì)。當(dāng)與本文所揭示之序列或與自然產(chǎn)生之變異物相比時(shí)，該引子應(yīng)與其相同，或小于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的堿基之差異。此等探針可作為用于鑒別細(xì)胞或組織是否含有表現(xiàn)構(gòu)筑體，或是否表現(xiàn)該可表現(xiàn)序列之測(cè)試套組的一部分。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之核酸分子可包括本文所揭示之序列組件的變異物。核酸變異物(例如，5’或3’LTR、RRE、及/或剪接接受位置變異物)可自然產(chǎn)生，例如等位基因(allelic)變異物(相同位置(locus))、同源物(不同位置)、及異種物(orthologue)(不同有機(jī)體，例如小鼠)，或?yàn)榉?自然產(chǎn)生。非-自然產(chǎn)生之變異物可經(jīng)由突變技術(shù)，包含應(yīng)用于聚核酸、細(xì)胞、或有機(jī)體者，予以制造。該變異物可包含核酸之取代、刪除、倒置及插入。等位基因變異物系由，例如，族群(例如，HIV族群)中之DNA序列多態(tài)性所產(chǎn)生。對(duì)應(yīng)于本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之獨(dú)立組件之自然等位基因變異物及同源物之核酸分子，可根據(jù)其與本文所揭示之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體核酸的同源性，利用本文所揭示之核酸序列或其部分，作為雜交探針且依照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)于嚴(yán)格之雜交條件下予以單離。如本文所使用，「于嚴(yán)格之條件下雜交」，系說(shuō)明雜交作用及于該彼此顯著相同或同源之核酸序列仍彼此雜交時(shí)進(jìn)行洗滌之條件。較佳地，該條件為彼此間至少為約70％，更佳為至少約80％，甚至更佳為至少約85％或90％相似性之序列仍彼此雜交之條件。此嚴(yán)格之條件為熟于此技藝者所知悉且可參見(jiàn)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等人，eds.，JohnWiley&Sons，Inc.(1995)，第2、4、及6節(jié)。其它嚴(yán)格之條件可參見(jiàn)MolecularCloningALaboratoryManual，Sambrook等人，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)，第7、9、及11章。嚴(yán)格的雜交條件之較佳、非-限制實(shí)例包含于4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，約65至70℃下(或于4XSSC加50％甲醯胺于約42至50℃下)接著于約65至70℃下以1XSSC洗滌一次或多次之雜交作用。極嚴(yán)格的雜交條件之較佳、非-限制實(shí)例包含于1XSSC，約65至70℃下(或于1XSSC加50％甲醯胺于約42至50℃下)接著于約65至70℃下以0.3XSSC洗滌一次或多次之雜交作用。較不嚴(yán)格的雜交條件之較佳、非-限制實(shí)例包含于4XSSC，約50至60℃下(或于6XSSC加50％甲醯胺于約40至45℃下)接著于約50至60℃下以2XSSC洗滌一次或多次之雜交作用。上述數(shù)值之中間范圍，例如，于65至70℃或于42至50℃亦欲包含于本發(fā)明。于雜交作用及洗滌緩沖液中SSPE(1XSSPE為0.15MNaCl，10mMNaH2PO4，及1.25mMEDTA，pH7.4)可取代SSC(1XSSC為0.15MNaCl及15mM檸檬酸鈉)；各雜交作用完成后進(jìn)行15分鐘之洗滌。預(yù)期長(zhǎng)度小于50個(gè)堿基對(duì)之雜交物的雜交作用溫度應(yīng)比該雜交物之熔解溫度(Tm)低5至10℃，此處Tm系根據(jù)下列方程式?jīng)Q定。雜交物之長(zhǎng)度小于18個(gè)堿基對(duì)時(shí)，Tm(℃)＝2(A+T堿基數(shù))+4(G+C堿基數(shù))。雜交物之長(zhǎng)度為18至49個(gè)堿基對(duì)時(shí)，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，此處N為該雜交中之堿基數(shù)，以及為[Na+]雜交作用緩沖液中之鈉離子濃度(1XSSC之[Na+]＝0.165M)。熟于此技藝者亦了解可于雜交作用及/或洗滌緩沖液中添加其它試劑以降低核酸分子對(duì)膜(例如，硝化纖維或尼龍膜)之非-專(zhuān)一性雜交作用，其包含但非限于阻斷劑(例如，BSA或鮭魚(yú)或鯡魚(yú)精子載體DNA)、界面活性劑(例如，SDS)、螯合劑(例如，EDTA)、聚蔗糖(Ficoll)、PVP等。尤其，使用尼龍膜時(shí)，該嚴(yán)格的雜交作用條件之另一較佳、非-限制實(shí)例為于0.25至0.5MNaH2PO4，7％SDS于約65℃下，接著于約65℃下以0.02MNaH2PO4，1％SDS洗滌一次或多次之雜交作用(參見(jiàn)，例如，Church及Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA811991-1995)，或可使用0.2XSSC，1％SDS。除了族群中可能存在之自然產(chǎn)生之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體序列組件之等位基因變異物外，熟于此技藝者更喜歡藉由將突變引入至SEQIDNO1、2、或3之核酸序列中之改變，而不會(huì)變更該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體序列之功能。一具體實(shí)施例中，該經(jīng)單離之核酸分子包括一核酸序列，其與SEQIDNO1、2、或3(例如，與完整長(zhǎng)度之SEQIDNO1、2、或3)具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或以上之相似性。II.重組表現(xiàn)載體及宿主細(xì)胞本發(fā)明之另一方面系關(guān)于，例如重組表現(xiàn)載體，其含有HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體核酸分子。如本文所使用，「載體」系指一種核酸分子其可運(yùn)送另一經(jīng)連接之核酸。其中一種載體為「質(zhì)體」，其為環(huán)狀雙股DNA環(huán)狀物其可與其它DNA片段接合。另一種載體為病毒載體，其中其它DNA片段可與病毒基因體接合。某些載體于其所引入之宿主細(xì)胞中可自行復(fù)制(例如，具有細(xì)菌之復(fù)制原點(diǎn)之細(xì)菌載體及游離型(episomal)哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如，非-游離型哺乳動(dòng)物載體)系經(jīng)由引入至宿主細(xì)胞而與宿主細(xì)胞之基因體整合，因而隨著宿主基因體復(fù)制。此外，某些載體可直接表現(xiàn)經(jīng)操作性連接之基因。此等載體系指本文中「表現(xiàn)載體」。通常，重組DNA技術(shù)中所利用之表現(xiàn)載體經(jīng)常為質(zhì)粒之形式。本說(shuō)明書(shū)中，「質(zhì)?！辜啊篙d體」可交互使用而質(zhì)粒為最常使用之載體形式。然而，本發(fā)明欲包含此等其它形式之表現(xiàn)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷之反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus)、及慢病毒)，其可提供同等之功能。較佳之具體實(shí)施例中，該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體系包含于反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，其可用于感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，人類(lèi)細(xì)胞)。更佳之具體實(shí)施例中，該反轉(zhuǎn)錄病毒載體無(wú)復(fù)制能力。此點(diǎn)尤其重要因?yàn)闃O不希望產(chǎn)生具有復(fù)制能力之含有HIV序列之反轉(zhuǎn)錄病毒，其可能會(huì)感染人類(lèi)而造成疾病。用于表現(xiàn)該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之特佳反轉(zhuǎn)錄病毒載體為Naldini，L等人之慢病毒載體((1996)Science272263-267，以參考資料合并于本文)。慢病毒載體特別適用于偵測(cè)未-分裂(以及分裂中)細(xì)胞。其它較佳之載體系詳述于美國(guó)專(zhuān)利第6,428,953、6,165,782、6,013,516、及5,994,136號(hào)中，皆以參考資料合并于本文。本發(fā)明之另一方面系關(guān)于宿主細(xì)胞，其系用于引入本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體核酸分子，例如，位于載體(例如，重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體)中之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體核酸分子或含有可因同源性而與宿主細(xì)胞之基因體中特定位置再結(jié)合之序列之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體核酸分子。本文中「宿主細(xì)胞」與「重組宿主細(xì)胞」可交互使用。應(yīng)了解此等名詞不僅系指特定對(duì)象之細(xì)胞亦指此等細(xì)胞之繼代或可能之繼代。由于突變或環(huán)境影響，后代中可能發(fā)生一些變化，故此繼代可能(事實(shí)上)與母細(xì)胞不完全相同，但仍包含于本文所使用之名詞之范圍中。宿主細(xì)胞可為任何原核或真核細(xì)胞。例如，含有HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之載體可于細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO)、COS細(xì)胞(例如COS7細(xì)胞)、C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞、或神經(jīng)元)中增殖及/或表現(xiàn)。其它適合之宿主細(xì)胞為熟于此技藝者所知悉。較佳之具體實(shí)施例中，宿主細(xì)胞為人類(lèi)T細(xì)胞(例如，CEMT細(xì)胞)。載體DNA可藉由習(xí)知之轉(zhuǎn)形或轉(zhuǎn)染技術(shù)引入至原核或真核細(xì)胞。如本文所使用，「轉(zhuǎn)形」及「轉(zhuǎn)染」系指各種用于將外來(lái)核酸(例如，DNA)引入至宿主細(xì)胞之經(jīng)此技藝認(rèn)可之技術(shù)，包含磷酸鈣或氯化鈣共-沉淀、DEAE-葡聚糖-中介之轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofection)、或電穿孔。將宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)形或轉(zhuǎn)染之適合的方法可見(jiàn)于Sambrook等人(MolecularCloningALaboratoryManual.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratiryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989)，及其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。至于哺乳動(dòng)物細(xì)胞之穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知根據(jù)所使用之表現(xiàn)載體及轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅少部分之細(xì)胞可將外來(lái)DNA與其基因體整合。為了鑒別及挑選此整合物，通常會(huì)將編碼可選擇性標(biāo)志(例如，抗生素抗性)之基因隨著所欲之基因引入至宿主細(xì)胞中。較佳之可選擇性標(biāo)志包含對(duì)藥物，例如G418、潮霉素(hygromycin)及甲氨喋呤(methotrexate)，具有抗性者。將編碼可選擇性標(biāo)志之核酸引入至與編碼HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體相同之載體或者可引入至另一載體。藉由藥物選擇作用可鑒別該經(jīng)穩(wěn)定地以經(jīng)引入之核酸轉(zhuǎn)染之細(xì)胞(例如，已合并該可選擇性標(biāo)志基因之細(xì)胞可存活，而其它細(xì)胞則死亡)。最佳之具體實(shí)施例中，含有本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之宿主細(xì)胞系由將細(xì)胞以含有該構(gòu)筑體之重組反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生。產(chǎn)生宿主細(xì)胞之較佳方法可見(jiàn)于，例如，Naldini等人((1996)如前述)以及美國(guó)專(zhuān)利第6,428,953、6,165,782、6,013,516、及5,994,136號(hào)，皆以參考資料合并于本文。本發(fā)明之宿主細(xì)胞亦可用于產(chǎn)生非-人類(lèi)基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物。例如，于一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之宿主細(xì)胞為受精卵或胚胎干細(xì)胞其中已引入HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體序列。此等宿主細(xì)胞可用于創(chuàng)造非-人類(lèi)基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物，其中外來(lái)性HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體序列已引入其基因體。此等動(dòng)物可用于研究HIV感染及/或基因表現(xiàn)以及用于鑒別及/或評(píng)估HIV感染及/或基因表現(xiàn)之調(diào)控劑。如本文所使用，「基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物」為非-人類(lèi)動(dòng)物，較佳為哺乳動(dòng)物，更佳為嚙齒類(lèi)如大鼠或小鼠，其中該動(dòng)物之一種或多種細(xì)胞包含轉(zhuǎn)基因(trausgene)。基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物之其它實(shí)例包含非-人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)、綿羊、狗、牛、山羊、雞、兩棲類(lèi)等。轉(zhuǎn)基因?yàn)橥鈦?lái)性DNA其系與細(xì)胞之基因體整合而發(fā)展出基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物且該外來(lái)性DNA仍存留于成熟動(dòng)物之基因體中，因此可于該基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物之一種或多種細(xì)胞類(lèi)型或組織中直接表現(xiàn)出經(jīng)編碼之基因產(chǎn)物。本發(fā)明之基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物可藉由將HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體-編碼核酸引入至受精卵之雄性原核(malepronuclei)，例如，藉由微量注射或反轉(zhuǎn)錄病毒感染，以及使該卵于假孕之雌性養(yǎng)育動(dòng)物中成長(zhǎng)而創(chuàng)造出來(lái)。SEQIDNO1、2、或3之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體序列可作為轉(zhuǎn)基因而引入至非-人類(lèi)動(dòng)物之基因體中。藉由胚胎操作及微量注射以產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物之方法，尤其例如小鼠之動(dòng)物，已為此技藝所知悉，且詳述于，例如，Leder等人之美國(guó)專(zhuān)利第4,736,866及4,870,009號(hào)、Wagner等人之美國(guó)專(zhuān)利第4,873，191號(hào)以及Hogan，B.，ManipulatingtheMouseEmbryo(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。可使用類(lèi)似之方法以制造其它基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物?；蜣D(zhuǎn)殖創(chuàng)始動(dòng)物之鑒別可基于其基因體中HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體轉(zhuǎn)基因之存在及/或于該動(dòng)物之細(xì)胞或組織中表現(xiàn)該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體轉(zhuǎn)基因中之可表現(xiàn)序列?？蓪⒒蜣D(zhuǎn)殖創(chuàng)始動(dòng)物用于繁殖出其它帶有該轉(zhuǎn)基因之動(dòng)物。再者，帶有HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之轉(zhuǎn)基因之基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物可進(jìn)一步與帶有其它轉(zhuǎn)基因之基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物育種。本發(fā)明之基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物亦可用于產(chǎn)生含有HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之穩(wěn)定的細(xì)胞株。此細(xì)胞株系有用的因?yàn)槠淇山?jīng)制造而使其不會(huì)過(guò)度表現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因(于瞬間轉(zhuǎn)染時(shí)可能發(fā)生)，因此更確實(shí)地反應(yīng)出該轉(zhuǎn)基因之自然的細(xì)胞環(huán)境。此細(xì)胞株可自基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物(例如，小鼠)中單離出細(xì)胞且利用標(biāo)準(zhǔn)方法予以培養(yǎng)而產(chǎn)生。某些具體實(shí)施例中以初代(亦即，未-永生化)細(xì)胞較佳，或?yàn)榱擞谂囵B(yǎng)基中使其無(wú)限增殖該細(xì)胞可經(jīng)永生化(例如，經(jīng)由加入諸如SV40大T抗原之基因)。III.偵測(cè)HIV之方法又另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種測(cè)定樣本中是否存在HIV之方法，其包括將含有本發(fā)明之核酸分子之宿主細(xì)胞與樣本接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表樣本中存在HIV。較佳之具體實(shí)施例中，該生物樣本系單離自對(duì)象(例如，人類(lèi)對(duì)象)。又較佳之具體實(shí)施例中，該生物樣本系由生物液體樣本(例如，血液、血清、血漿、唾液、尿液、糞便、精液、陰道液、脊髓液、淋巴液、羊水、淚液、鼻腔分泌物、汗、乳汁、粘液、或組織液)、組織樣本(例如，淋巴結(jié)樣本、皮膚樣本、或絨毛膜樣本)、及細(xì)胞樣本(例如，血液細(xì)胞樣本如T細(xì)胞樣本)所組成之群組選出者。又一具體實(shí)施例中，該樣本可經(jīng)純化。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種測(cè)定細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)是否感染HIV之方法，其包括將該細(xì)胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉(zhuǎn)錄病毒接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表該細(xì)胞感染HIV。又另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種測(cè)定對(duì)象(例如，人類(lèi)對(duì)象)是否感染HIV之方法，其包括將該對(duì)象之細(xì)胞與含有本發(fā)明之核酸分子之反轉(zhuǎn)錄病毒接觸，以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)，其中該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)系代表感染HIV。IV.篩選試驗(yàn)本發(fā)明提供一種鑒別調(diào)控劑(亦即，可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之候選或測(cè)試化合物或試劑)之方法(本文中亦稱(chēng)為「篩選試驗(yàn)」)。本發(fā)明之篩選試驗(yàn)系依據(jù)本文所述之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體偵測(cè)HIV感染之能力。由于該可表現(xiàn)序列僅于Tat及Rev兩者皆存在時(shí)才表現(xiàn)，故可將含有本發(fā)明之表現(xiàn)構(gòu)筑體之宿主細(xì)胞以HIV感染且進(jìn)行測(cè)試以鑒別可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物。本發(fā)明之測(cè)試化合物可利用此技藝中已知之組合數(shù)據(jù)庫(kù)中多種方法之任一種而得，包含生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)；空間可定位平行固相或液相數(shù)據(jù)庫(kù)；需要反折積(deconvolution)之合成數(shù)據(jù)庫(kù)法；「一球珠-一化合物(one-beadone-compound)」數(shù)據(jù)庫(kù)法；及利用親合性層析選擇之合成數(shù)據(jù)庫(kù)法。該生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)法限于勝肽數(shù)據(jù)庫(kù)，而其它四種方法可應(yīng)用于勝肽、非-勝肽寡聚物或化合物之小分子數(shù)據(jù)庫(kù)(Lam，K.S.(1997)AnticancerDrugDes.1245)。用于合成分子數(shù)據(jù)庫(kù)之方法的實(shí)例可見(jiàn)于此技藝中，例如，DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.USA906909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111422；Zuckermann等人(1994)J.Med.Chem.372678；Cho等人(1993)Science2611303；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；以及Gallop等人(1994)J.Med.Chem.371233。化合物之?dāng)?shù)據(jù)庫(kù)可存在于溶液中(例如，Houghten(992)Biotechniques13412-421)、或存在于球珠(Lam(1991)Nature35482-84)、芯片(Fodor(1993)Nature364555-556)、細(xì)菌(Ladner美國(guó)專(zhuān)利第5,223,409號(hào))、孢子(Ladner美國(guó)專(zhuān)利第’409號(hào))、質(zhì)體(Cull等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA891865-1869)或噬菌體(Scott及Smith(1990)Science249386-390)；(Devlin(1990)Science249404-406)；(Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA876378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310)；(前述之Ladner)。一具體實(shí)施例中，該篩選試驗(yàn)系以細(xì)胞為主之試驗(yàn)，包括將含有本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；將細(xì)胞與HIV接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)。該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體較佳系穩(wěn)定地與該細(xì)胞之基因體整合。該測(cè)試化合物可于HIV感染該細(xì)胞之前，同時(shí)間，或之后添加。另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明之篩選試驗(yàn)為以細(xì)胞為主之試驗(yàn)，包括將細(xì)胞與HIV接觸；將該細(xì)胞與含有本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之反轉(zhuǎn)錄病毒接觸；將細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)。HIV感染、HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體(反轉(zhuǎn)錄病毒)感染、及測(cè)試化合物之添加可同時(shí)進(jìn)行或以任何順序進(jìn)行。又本發(fā)明之另一篩選試驗(yàn)系以細(xì)胞為主之試驗(yàn)，包括將經(jīng)HIV感染之細(xì)胞與含有本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之反轉(zhuǎn)錄病毒接觸；將該細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；培養(yǎng)該細(xì)胞一段時(shí)間足以使HIV感染及基因表現(xiàn)；以及測(cè)定該可表現(xiàn)序列是否由該細(xì)胞表現(xiàn)。HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體(反轉(zhuǎn)錄病毒)感染以及測(cè)試化合物之添加可同時(shí)進(jìn)行或以任何順序進(jìn)行。應(yīng)注意若該篩選試驗(yàn)中所使用之宿主細(xì)胞已經(jīng)HIV感染時(shí)此具體實(shí)施例尤其適用。決定該測(cè)試化合物調(diào)控HIV感染及/或基因表現(xiàn)之能力可藉由，例如，監(jiān)測(cè)可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)作用(例如，報(bào)導(dǎo)子mRNA或多肽表現(xiàn)程度)或活性而達(dá)成。如本文中所述，缺乏HIVRev蛋白質(zhì)時(shí)，由可表現(xiàn)序列表現(xiàn)之任何mRNA系作為內(nèi)子之一部分而剪接掉，故無(wú)法偵測(cè)。該可表現(xiàn)序列可為核酸序列，其表現(xiàn)可藉由，例如，RNA雜交印跡法、RT-PCR、引物延伸、或核酸保護(hù)試驗(yàn)予以測(cè)量。該可表現(xiàn)序列亦可為編碼多肽之核酸序列，其表現(xiàn)可藉由，例如，蛋白印跡法、ELISA、或RIA試驗(yàn)予以測(cè)量?？杀憩F(xiàn)序列之表現(xiàn)亦可藉由使用，例如，螢光素試驗(yàn)、β-半乳糖試驗(yàn)、氯霉素乙醯轉(zhuǎn)移(CAT)試驗(yàn)、胸激(TK)試驗(yàn)、或螢光蛋白質(zhì)試驗(yàn)測(cè)量該可表現(xiàn)序列所編碼之蛋白質(zhì)之活性而予以監(jiān)測(cè)。實(shí)行此等試驗(yàn)之方法為此技藝中已知者。將受HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體控制且候選化合物存在時(shí)，該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)程度或活性與候選化合物不存在時(shí)該可表現(xiàn)序列之表現(xiàn)程度或活性進(jìn)行比較?；诖吮容^，則可鑒別該候選化合物是否為HIV感染及/或基因表現(xiàn)之調(diào)控劑。例如，當(dāng)該候選化合物存在時(shí)，可表現(xiàn)序列之mRNA或蛋白質(zhì)之表現(xiàn)，或者蛋白質(zhì)之活性大于(統(tǒng)計(jì)上顯著較大者)候選化合物不存在時(shí)，則該候選化合物系鑒別為HIV感染及/或基因表現(xiàn)之刺激物(非所欲者)。較佳地，當(dāng)候選化合物存在時(shí)，可表現(xiàn)序列之mRNA或蛋白質(zhì)之表現(xiàn)或活性小于(統(tǒng)計(jì)上顯著較小者)候選化合物不存在時(shí)，則該候選化合物系鑒別為HIV感染及/或基因表現(xiàn)之抑制劑。本發(fā)明進(jìn)一步系關(guān)于由上述篩選試驗(yàn)所鑒別之新穎藥劑。因此，于適當(dāng)之動(dòng)物模型(例如，感染HIV之動(dòng)物模型，如以HIV或SIV(猴免疫缺陷病毒)感染非-人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi))中進(jìn)一步使用如本文所述而鑒別之藥劑系落于本發(fā)明之范疇。例如，如本文所述而鑒別之藥劑可用于動(dòng)物模型中以決定此藥劑之功效、毒性、或治療之副作用?；蛘撸绫疚乃龆b別之藥劑可用于動(dòng)物模型中以決定此藥劑之作用機(jī)制。再者，本發(fā)明系關(guān)于由上述篩選試驗(yàn)所鑒別出之新穎藥劑之如本文所述之治療用途。V.治療方法該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體可藉由利用編碼治療性蛋白質(zhì)之可表現(xiàn)序列，用以治療經(jīng)HIV感染之對(duì)象(例如，人類(lèi)對(duì)象)。如本文所使用，「治療性蛋白質(zhì)」為任何蛋白質(zhì)(例如，勝肽或多肽)，當(dāng)其于細(xì)胞中表現(xiàn)時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞之功能產(chǎn)生作用。較佳之具體實(shí)施例中，治療性蛋白質(zhì)為對(duì)細(xì)胞有毒之蛋白質(zhì)(亦即，胞毒性)。較佳之胞毒性蛋白質(zhì)包含，但非限于，蓖麻毒素、商陸毒素、白喉毒素A、肥皂草毒素、白樹(shù)素、及假單胞菌外毒素A。由于本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體中之可表現(xiàn)序列僅于HIV蛋白質(zhì)存在時(shí)才表現(xiàn)，故胞毒性蛋白質(zhì)可用于選擇性地殺死遭HIV感染之細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供殺死遭HIV感染之細(xì)胞之方法，以及治療經(jīng)HIV感染之對(duì)象之方法。如本文所使用，「治療」對(duì)象包含向?qū)ο笫┯没蛲队柚委焺?例如，HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體)，向?qū)ο笾?xì)胞或組織施用或投予治療劑，而該對(duì)象患有疾病或病癥(例如，HIV感染或AIDS)，具有疾病或病癥之癥狀，或具有罹患疾病或病癥之風(fēng)險(xiǎn)(可能罹患疾病或病癥)，其目的為治愈、治療、減輕、緩和、改變、醫(yī)治、改善、改進(jìn)、或影響該疾病或病癥、該疾病或病癥之癥狀、或罹患該疾病或病癥之風(fēng)險(xiǎn)(罹患該疾病或病癥之可能性)。藉由以含有本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體(其中該可表現(xiàn)序列為胞毒性蛋白質(zhì))之反轉(zhuǎn)錄病毒感染遭HIV感染之細(xì)胞，該胞毒性蛋白質(zhì)可于該細(xì)胞中表現(xiàn)。該細(xì)胞可為任何遭HIV感染之細(xì)胞，例如T細(xì)胞。該細(xì)胞可為，例如，培養(yǎng)之細(xì)胞株，或藉由習(xí)知方法自對(duì)象(，例如，人類(lèi)對(duì)象)取得之細(xì)胞。具有胞毒性可表現(xiàn)序列之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體亦可用于治療遭HIV感染或具有感染HIV風(fēng)險(xiǎn)之對(duì)象(例如，人類(lèi)對(duì)象)。含有HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體之反轉(zhuǎn)錄病毒可直接投予至該對(duì)象俾使其感染該對(duì)象之細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)。當(dāng)藉由反轉(zhuǎn)錄病毒遞送至該細(xì)胞后，該HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)載體僅于該細(xì)胞經(jīng)HIV感染時(shí)才表現(xiàn)該胞毒性蛋白質(zhì)，因而殺死該細(xì)胞而防止病毒復(fù)制及散布。應(yīng)了解，任何方法中涉及對(duì)人類(lèi)對(duì)象投予反轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)，尤其系含有HIV-衍生序列之反轉(zhuǎn)錄病毒，該反轉(zhuǎn)錄病毒應(yīng)無(wú)復(fù)制能力，因此于感染細(xì)胞后其無(wú)法復(fù)制。某些具體實(shí)施例中，以本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體治療對(duì)象時(shí)可結(jié)合其它治療HIV感染及/或AIDS之方法(例如，已認(rèn)可或?qū)嶒?yàn)性之療法)。例如，本發(fā)明之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)載體可與已知之AIDS藥物一起投予，該AIDS藥物包含，但非限于，蛋白抑制劑、反轉(zhuǎn)錄抑制劑、及核類(lèi)似物。此等藥物之實(shí)例包含，但非限于，安瑞那偉(agenerase)(安普那偉(amprenavir))、雙汰芝(Combivir)(結(jié)合瑞托偉(Retrovir)(300毫克)及依皮偉(Epivir)(150毫克)-于同一錠劑中)、佳息患(Crixivan)印地那偉(indinavir)、依皮偉(Epivir)(3tc/拉米夫定(lamivudine))、恩曲伐(Emtriva)(恩曲他濱(emtricitabine)(FTC))、服妥美(Fortovase)(沙奎那偉(saquinavir))、福澤昂(Fuzeon)(恩夫偉地(enfuvirtide))、西維得(Hivid)(ddc/扎西他濱(zalcitabine))、愛(ài)治(Hydrea)(羥基)、印維瑞(Invirase)(沙奎那偉)、卡雷翠(Kaletra)(洛皮那偉(lopinavir))、諾維(Norvir)(利托那偉(ritonavir))、蕊潰特(Rescfiptor)(地拉偉啶(delavirdine))、瑞托偉(Retrovir)、AZT(齊多夫啶(zidovudine))、瑞塔茲(Reyataz)(阿扎那偉(atazanavir)；BMS-232632)、蘇提發(fā)(Sustiva)(依發(fā)偉侖(efavirenz))、三思偉(Trizivir)(一錠劑中含有3種非核；阿巴卡偉(abacavir)+齊多夫啶+拉米夫定)、惠妥茲(Videx)(ddl/去羥肌(didanosine))、惠妥茲EC(VidexEC)(ddl/去羥肌)、維拉賽特錠(Viracept)(奈非那偉(nelfinavir))、維拉繆(Viramune)(奈偉拉平(nevirapine))、維瑞(Viread)(替諾福偉酯(tenofovirdisoproxilfumarate))、司瑞(Zerit)(d4t/斯塔夫啶(stavudine))、及司準(zhǔn)(Ziagen)(阿巴卡偉)。本發(fā)明將藉由下列實(shí)施例予以進(jìn)一步說(shuō)明，而不應(yīng)以該實(shí)施例限制本發(fā)明。此申請(qǐng)案中所注明之所有參考資料、專(zhuān)利案及公開(kāi)之專(zhuān)利申請(qǐng)案的內(nèi)容，以及序列表與圖標(biāo)系以參考資料合并于本文。實(shí)施例實(shí)施例1利用HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)載體偵測(cè)經(jīng)HIV感染之細(xì)胞利用Naldini等人((1996)Science272263-267，以參考資料合并于本文)所述之系統(tǒng)將人類(lèi)T細(xì)胞株CEM以SEQIDNO2之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體感染，其中該反轉(zhuǎn)錄病毒載體系以吾等之SEQIDNO2之雙-剪接載體置換。檢驗(yàn)經(jīng)選殖之細(xì)胞，其具有穩(wěn)定整合形式之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體。于Tat不存在時(shí)，該細(xì)胞自經(jīng)整合之構(gòu)筑體表現(xiàn)出RNA(參見(jiàn)第6圖；剪接之RNA；參見(jiàn)第2欄)但不表現(xiàn)編碼GFP之未剪接訊息。該CEM細(xì)胞(不含載體者)亦未表現(xiàn)RNA(第1欄)。于HIV感染后，該載體-陽(yáng)性株即表現(xiàn)高程度之GFP-編碼RNA(未剪接之RNA)，參見(jiàn)第4欄。經(jīng)HIV感染后，藉由螢光顯微術(shù)，HDEC-感染之細(xì)胞中顯示強(qiáng)GFP螢光(第7圖)。于未經(jīng)感染之細(xì)胞(無(wú)Tat蛋白質(zhì))中低表現(xiàn)程度之經(jīng)剪接之RNA證實(shí)缺乏Tat-依賴(lài)型報(bào)導(dǎo)子。于HIV不存在時(shí)(無(wú)Rev蛋白質(zhì))未經(jīng)剪接之RNA的缺乏證實(shí)此系統(tǒng)之選擇性。實(shí)施例2利用經(jīng)合并至慢病毒中之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)載體偵測(cè)經(jīng)活化感染之細(xì)胞將SEQIDNO2之HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體(本文中亦稱(chēng)為pNL-ORF-RRE-雙/剪接構(gòu)筑體)系包裝至VSV糖蛋白偽型之慢病毒中，且其中之可表現(xiàn)序列為綠色螢光蛋白質(zhì)(GFP)。將CEM細(xì)胞以報(bào)導(dǎo)子病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)但未受HIV感染故未產(chǎn)生報(bào)導(dǎo)子(第8圖，上圖，F(xiàn)L1-H)。將人類(lèi)CEMT細(xì)胞以HIV感染，此處Nef基因系以鼠CD24取代。將細(xì)胞染色以顯現(xiàn)鼠CD24(FL2-H)界定HIV感染之細(xì)胞(第8圖，中間)。經(jīng)HIV感染后，將細(xì)胞以報(bào)導(dǎo)子病毒感染，且藉由流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)。僅于經(jīng)HIV感染(FL2-H陽(yáng)性)之細(xì)胞中專(zhuān)一性地發(fā)現(xiàn)GFP-陽(yáng)性之細(xì)胞(由構(gòu)筑體而來(lái)之報(bào)導(dǎo)子；FL1-H)(第8圖，下圖)。本發(fā)明已參照其較佳之具體實(shí)施例予以詳細(xì)說(shuō)明。然而，應(yīng)了解熟于此技藝者可根據(jù)此揭示在下述申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所提出之本發(fā)明之精神與范疇下進(jìn)行修飾及改進(jìn)。序列表<110>美國(guó)衛(wèi)生與公共服務(wù)部<120>HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體及其用途<130>59582-PCT<150>60/507,034<151>2003-09-28<160>3<170>PatentIn3.3版<210>1<211>4418<212>DNA<213>人工合成<220><223>HIV-依賴(lài)型表現(xiàn)構(gòu)筑體<400>1tggaagggctaatttggtcccaaaaaagacaagagatccttgatctgtggatctaccaca60cacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccagggatcagatatccac120tgacctttggatggtgcttcaagttagtaccagttgaaccagagcaagtagaagaggcca180aataaggagagaagaacagcttgttacaccctatgagccagcatgggatggaggacccgg240agggagaagtattagtgtggaagtttgacagcctcctagcatttcgtcacatggcccgag300agctgcatccggagtactacaaagactgctgacatcgagctttctacaagggactttccg360ctggggactttccagggaggtgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagat420gctacatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctga480gcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgcct540tgagtgctcaaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctc600agacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaag660cgaaagtaaagccagaggagatctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacgg720caagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctaga780aggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatggg840aaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatggg900caagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggct960gtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagat1020cattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagaca1080ccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagc1140aagcggccgctctagcccgggcggatccgaattcgcatgcgtcgactcgaggactacaag1200gatgacgatgacaaggattacaaagacgacgatgataaggactataaggatgatgacgac1260aaataatagcaattcctcgacgactgcatagggttacccccctctccctcccccccccct1320aacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattt1380tccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttg1440acgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtc1500gtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctt1560tgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgta1620taagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtg1680gaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaag1740gtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttag1800tcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaa1860cacgatgataatggccacaaccatggtgagcaagcagatcctgaagaacaccggcctgca1920ggagatcatgagcttcaaggtgaacctggagggcgtggtgaacaaccacgtgttcaccat1980ggagggctgcggcaagggcaacatcctgttcggcaaccagctggtgcagatccgcgtgac2040caagggcgcccccctgcccttcgccttcgacatcctgagccccgccttccagtacggcaa2100ccgcaccttcaccaagtaccccgaggacatcagcgacttcttcatccagagcttccccgc2160cggcttcgtgtacgagcgcaccctgcgctacgaggacggcggcctggtggagatccgcag2220cgacatcaacctgatcgaggagatgttcgtgtaccgcgtggagtacaagggccgcaactt2280ccccaacgacggccccgtgatgaagaagaccatcaccggcctgcagcccagcttcgaggt2340ggtgtacatgaacgacggcgtgctggtgggccaggtgatcctggtgtaccgcctgaacag2400cggcaagttctacagctgccacatgcgcaccctgatgaagagcaagggcgtggtgaagga2460cttccccgagtaccacttcatccagcaccgcctggagaagacctacgtggaggacggcgg2520cttcgtggagcagcacgagaccgccatcgcccagctgaccagcctgggcaagcccctggg2580cagcctgcacgagtgggtgtaatagggtaccaggtaagtgtacccaattcggccgctgat2640cttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataa2700agtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgca2760gagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcagg2820aagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctgg2880tatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgca2940actcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacct3000aaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgc3060tgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgac3120ctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattga3180agaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggc3240aagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataat3300gatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatag3360agttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacc3420cgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcg3480attagtgaacggatctcgacggtatcgtatggggattggtggcgacgactcctggagccc3540gtcagtatcggcggaattccagctgagccagcagcagatggggtgggagcagtatctcga3600gacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaacaatgctgcttgt3660gcctggctagaagcacaagaggaggaagaggtgggttttccagtcacacctcaggtacct3720ttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggg3780ggactggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctac3840cacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatat3900ccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagag3960gccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgac4020cctgagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcc4080cgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgacatcgagcttgctacaagggactt4140tccgctggg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所述的核酸分子或其互補(bǔ)，其中該可表達(dá)序列包括治療基因。18.如權(quán)利要求17所述的核酸分子或其互補(bǔ)，其中該治療基因編碼胞毒性蛋白質(zhì)。19.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的核酸分子或其互補(bǔ)，還包括核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。20.一種核酸分子，其包括插入物，該插入物包含于以編號(hào)＿＿保藏于NIAID研究和參考試劑計(jì)劃(NIAIDResearchandReferenceReagentProgram)的質(zhì)粒中。21.一種核酸分子，其包括插入物，該插入物包含于以編號(hào)＿＿保藏于美國(guó)典型菌種保藏中心的質(zhì)粒中。22.一種分離的核酸分子或其互補(bǔ)，其包括選自SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3的核酸序列。23.一種分離的核酸分子或其互補(bǔ)，其包括與選自下列群組的核酸序列具有至少約60％的同一性的核酸序列SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3。24.如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其包含在載體中。25.如權(quán)利要求24所述的核酸分子，其中該載體為質(zhì)粒。26.如權(quán)利要求24所述的核酸分子，其中該載體為重組病毒。27.如權(quán)利要求26所述的核酸分子，其中該載體為重組反轉(zhuǎn)錄病毒。28.如權(quán)利要求27所述的核酸分子，其中該載體為重組慢病毒。29.如權(quán)利要求27至28中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中該反轉(zhuǎn)錄病毒是衍生自HIV。30.如權(quán)利要求26至29中任一項(xiàng)所述的核酸分子，其中該病毒不具有復(fù)制能力。31.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的核酸分子。32.如權(quán)利要求31所述的宿主細(xì)胞，其中該核酸分子穩(wěn)定地整合到該細(xì)胞的基因組中。33.如權(quán)利要求31或32中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其為人類(lèi)T細(xì)胞。34.如權(quán)利要求33所述的宿主細(xì)胞，其為CEMT細(xì)胞。35.一種宿主細(xì)胞是以編號(hào)＿＿保藏于NIAID研究和參考試劑計(jì)劃。36.一種宿主細(xì)胞是以編號(hào)＿＿保藏于美國(guó)典型菌種保藏中心。37.一種測(cè)定樣本中是否存在HIV的方法，其包括a)將權(quán)利要求31至36中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞與該樣本接觸；b)培養(yǎng)該細(xì)胞足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使HIV感染及基因表達(dá)；c)測(cè)定該報(bào)告基因是否由該細(xì)胞表達(dá)；其中該可表達(dá)序列的表達(dá)代表樣本中存在HIV。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中該樣本為分離自受試者的生物樣本。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該受試者為人類(lèi)。40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該樣本選自生物液體樣本、組織樣本、或細(xì)胞樣本。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該生物液體樣本選自血液、血清、血漿、唾液、尿液、糞便、精液、陰道液、脊髓液、淋巴液、羊水、淚液、鼻腔分泌物、汗液、乳汁、粘液或組織間液。42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該組織樣本選自淋巴結(jié)樣本、皮膚樣本或絨毛膜樣本。43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該細(xì)胞樣本為血液細(xì)胞樣本。44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中細(xì)胞樣本為T(mén)細(xì)胞樣本。45.如權(quán)利要求37至44的任一項(xiàng)所述的方法，其中該樣本是被純化的。46.一種測(cè)定細(xì)胞是否感染HIV的方法，其包括a)將細(xì)胞與權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)的病毒相接觸；b)培養(yǎng)該細(xì)胞足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使HIV基因表達(dá)；c)測(cè)定該可表達(dá)序列是否由該細(xì)胞表達(dá)；其中該可表達(dá)序列的表達(dá)代表該細(xì)胞感染HIV。47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中該細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞。48.一種測(cè)定受試者是否感染HIV的方法，其包括a)將該受試者的細(xì)胞與權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)的病毒接觸；b)測(cè)定該可表達(dá)序列是否由該細(xì)胞表達(dá)；其中該可表達(dá)序列的表達(dá)代表感染HIV。49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中該受試者為人類(lèi)。50.如權(quán)利要求37至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)定該可表達(dá)序列是否由該細(xì)胞表達(dá)的步驟包括檢測(cè)該可表達(dá)序列所編碼的RNA。51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中檢測(cè)該RNA的方法選自RNA雜交印跡法、引物延伸、RT-PCR或核酸酶保護(hù)法。52.如權(quán)利要求37至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)定該可表達(dá)序列是否由該細(xì)胞表達(dá)的步驟包括檢測(cè)該可表達(dá)序列所編碼的多肽。53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中對(duì)該多肽的檢測(cè)方法選自蛋白印跡法、ELISA或RIA。54.如權(quán)利要求52所述的方法，其中該多肽采用檢測(cè)該多肽的活性的方法進(jìn)行檢測(cè)。55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中檢測(cè)該多肽的活性的方法選自螢光試驗(yàn)、β-半乳糖苷酶試驗(yàn)、CAT試驗(yàn)、螢光素酶試驗(yàn)、及胸腺嘧啶脫氧核苷激酶試驗(yàn)。56.一種殺死被HIV感染的細(xì)胞的方法，其包括將該細(xì)胞與權(quán)利要求29至30中任一項(xiàng)所述的病毒接觸，其中該可表達(dá)序列編碼胞毒性蛋白質(zhì)。57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中該細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞。58.如權(quán)利要求56至57中任一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞包含于人類(lèi)受試者。59.一種治療被HIV感染的受試者的方法，其包括對(duì)該受試者給藥權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)所述的病毒，其中該可表達(dá)序列編碼胞毒性蛋白質(zhì)。60.一種鑒別可抑制HIV感染或基因表達(dá)的化合物的方法，其包括a)將權(quán)利要求31至36中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；b)將該細(xì)胞與HIV接觸；c)培養(yǎng)該細(xì)胞足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使HIV感染及基因表達(dá)；d)測(cè)定該可表達(dá)序列是否由該細(xì)胞表達(dá)，其中抑制該可表達(dá)序列表達(dá)的化合物被鑒定為能夠抑制HIV感染或基因表達(dá)的化合物。61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中步驟(a)及(b)可以任何順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。62.一種鑒別可抑制HIV感染或基因表達(dá)的化合物的方法，其包括a)將細(xì)胞與HIV接觸；b)將該細(xì)胞與權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)所述的病毒接觸；c)將該細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；d)培養(yǎng)該細(xì)胞足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使HIV感染及基因表達(dá)；e)測(cè)定該可表達(dá)序列是否由該細(xì)胞表達(dá)，其中抑制該可表達(dá)序列表達(dá)的化合物被鑒定為能夠抑制HIV感染或基因表達(dá)的化合物。63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中步驟(a)、(b)、及(c)可以任何順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。64.一種鑒別可抑制HIV感染或基因表達(dá)的化合物的方法，其包括a)將經(jīng)HIV感染的細(xì)胞與權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)所述的反轉(zhuǎn)錄病毒接觸；b)將該細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸；c)培養(yǎng)該細(xì)胞足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使HIV感染及基因表達(dá)；d)測(cè)定該可表達(dá)序列是否由該細(xì)胞表達(dá)，其中抑制該可表達(dá)序列表達(dá)的化合物被鑒定為能夠抑制HIV感染或基因表達(dá)的化合物。65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中步驟(a)及(b)可以任何順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。66.如權(quán)利要求60至65中任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)定該可表達(dá)序列是否由該細(xì)胞表達(dá)的步驟包括檢測(cè)該報(bào)告基因所編碼的RNA。67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中檢測(cè)該mRNA的方法選自RNA雜交印跡法、引物延伸、RT-PCR、及核酸酶保護(hù)法。68.如權(quán)利要求60至65中任一項(xiàng)所述的方法，其中測(cè)定該可表達(dá)序列是否由該細(xì)胞表達(dá)的步驟包括檢測(cè)該報(bào)告基因所編碼的多肽。69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中檢測(cè)該多肽的方法選自蛋白印跡法、ELISA、或RIA。70.如權(quán)利要求68所述的方法，其中該多肽采用檢測(cè)該多肽活性的方法進(jìn)行檢測(cè)。71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中檢測(cè)該多肽活性的方法選自螢光試驗(yàn)、β-半乳糖苷酶試驗(yàn)、CAT試驗(yàn)、螢光素酶試驗(yàn)、及胸腺嘧啶脫氧核苷激酶試驗(yàn)。全文摘要本發(fā)明提供具有可表現(xiàn)序列之核酸分子，該可表現(xiàn)序列包含報(bào)導(dǎo)基因及治療基因，其表現(xiàn)系依賴(lài)HIVTat及Rev兩種蛋白質(zhì)之存在。本發(fā)明進(jìn)一步提供偵測(cè)HIV之方法、鑒別該可抑制HIV感染及/或基因表現(xiàn)之化合物之方法、殺死經(jīng)HIV感染之細(xì)胞之方法、以及治療經(jīng)HIV感染之對(duì)象之方法。文檔編號(hào)C12NGK1886417SQ200480035300公開(kāi)日2006年12月27日申請(qǐng)日期2004年9月28日優(yōu)先權(quán)日2003年9月28日發(fā)明者Y·吳,J·W·馬什申請(qǐng)人:美國(guó)衛(wèi)生與公共服務(wù)部