專(zhuān)利名稱(chēng)：：利用多瘤病毒和eb病毒序列的嚙齒動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，特別是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。具體地，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力增強(qiáng)的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系。本發(fā)明也涉及真核克隆和表達(dá)載體及相關(guān)方法，特別涉及能高水平表達(dá)目的蛋白質(zhì)的DNA載體。本發(fā)明允許表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中長(zhǎng)期保持游離型。
背景技術(shù)：
：整個(gè)說(shuō)明書(shū)中現(xiàn)有技術(shù)的任何討論決不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為承認(rèn)這種現(xiàn)有技術(shù)是本領(lǐng)域中廣泛已知的或是普通常規(guī)知識(shí)的一部分。在重組蛋白生產(chǎn)中，宿主細(xì)胞的選擇非常重要。可獲得許多重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。每種宿主細(xì)胞對(duì)重組蛋白表達(dá)的適宜性顯著不同，并且影響產(chǎn)物形成和所產(chǎn)生的最終蛋白質(zhì)隨后的分離/純化。表達(dá)系統(tǒng)(如細(xì)菌)不能產(chǎn)生特定種類(lèi)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)需要翻譯后修飾(如糖基化)才能具有生物活性。此外，為了具有生物活性，許多治療性蛋白質(zhì)需要復(fù)雜的翻譯后修飾如糖基化。文獻(xiàn)已經(jīng)很完備地記錄了使用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生治療性重組蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有進(jìn)行真正的蛋白質(zhì)折疊和復(fù)雜的翻譯后修飾的能力，這是許多蛋白質(zhì)的治療活性所必需的。同樣地，許多宿主細(xì)胞系已被管理部門(mén)批準(zhǔn)用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)。表達(dá)系統(tǒng)(如人細(xì)胞系293和PER.C6)已被建議作為生產(chǎn)重組治療性蛋白質(zhì)的宿主。這些細(xì)胞系是通過(guò)用5型腺病毒(ad5)的早期轉(zhuǎn)化區(qū)(E1)轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞(293)和人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞(PER.C6)產(chǎn)生的。由于細(xì)胞系(如293和PER.C6)表達(dá)Ad5E1區(qū)，因此它們能互補(bǔ)已通過(guò)缺失E1而被削弱的缺陷性Ad5載體的生長(zhǎng)。然而，與Ad5轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相關(guān)的調(diào)節(jié)的重要性是它們能在免疫缺陷的動(dòng)物(如裸鼠)中形成腫瘤。因此，使用Ad5轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，即將用于重組蛋白的細(xì)胞底物的致瘤成分傳遞到受治療的受試者中的風(fēng)險(xiǎn)。常規(guī)使用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系生產(chǎn)生物藥物蛋白質(zhì)。許多特性使得CHO細(xì)胞成為非常適合作為宿主細(xì)胞可在CHO細(xì)胞中達(dá)到高產(chǎn)物水平；它們提供無(wú)傳染性或病毒樣顆粒的安全的生產(chǎn)系統(tǒng)；它們已被廣泛表征；使用無(wú)血清培養(yǎng)基，它們能在生物反應(yīng)器中懸浮生長(zhǎng)到高細(xì)胞密度；已描述了用于在CHO細(xì)胞中擴(kuò)增基因的表達(dá)系統(tǒng)(DHFR、GS和金屬硫蛋白(MT)；Page和Sydenham，1991，Baker等，2001以及Bailey等2002)。細(xì)胞系CHO-K1已形成產(chǎn)生具有改良特性的多種CHO細(xì)胞系衍生物的基礎(chǔ)，改良的細(xì)胞系如超級(jí)CHO細(xì)胞系(Pak等1996)。超級(jí)CHO細(xì)胞來(lái)自通過(guò)基因工程改造來(lái)表達(dá)編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白和生長(zhǎng)因子(IGF-1)的基因的CHO-K1細(xì)胞。多瘤病毒多瘤病毒是包括猿猴病毒40(SV40)和小鼠多瘤病毒的小DNA腫瘤病毒家族。多瘤病毒已作為研究哺乳動(dòng)物基因表達(dá)、DNA復(fù)制和腫瘤發(fā)生的模型(Griffin，1982)。COS-1細(xì)胞系支持含有SV40復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的游離型復(fù)制(Gluzman，1981)并通過(guò)用編碼野生型T抗原的SV40病毒的復(fù)制起點(diǎn)缺陷型突變體轉(zhuǎn)化CV1細(xì)胞產(chǎn)生(Gluzman，1981)。病毒是宿主特異性的并且能在它們的允許宿主細(xì)胞中繁殖。SV40病毒可在猴細(xì)胞(CV1)中繁殖。Py是小鼠病毒并能在小鼠和一些嚙齒動(dòng)物中繁殖。多瘤的大T抗原是一種具有酶活性并能與細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用的多功能蛋白質(zhì)。它能結(jié)合DNA并且具有兩個(gè)核定位信號(hào)。它與病毒DNA復(fù)制起點(diǎn)上的幾個(gè)五聚體序列(GAGGC)特異性相互作用。大T抗原也具有DNA解旋酶活性。解旋酶活性對(duì)于病毒DNA復(fù)制至關(guān)重要并需要有功能的ATP酶活性以及結(jié)合多瘤病毒DNA的能力。多瘤病毒DNA在感染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制需要特異性功能病毒DNA復(fù)制起點(diǎn)、大T抗原和一組已知作為允許宿主因子的細(xì)胞蛋白質(zhì)，即DNA復(fù)制僅需要的病毒蛋白質(zhì)是大T抗原。病毒DNA復(fù)制不同于細(xì)胞DNA復(fù)制，因?yàn)樵赟期期間病毒起點(diǎn)可激發(fā)多次，而細(xì)胞DNA復(fù)制被嚴(yán)緊控制，以避免在一個(gè)細(xì)胞周期中基因組的任何區(qū)域被復(fù)制超過(guò)一次。Heffernan和Dennis在1991年的研究(Heffernan和Dennis，1991)成功地證明了表達(dá)病毒大T抗原的CHO細(xì)胞中真核表達(dá)載體的用途。然而，顯示目的蛋白質(zhì)的瞬時(shí)表達(dá)僅持續(xù)48-72小時(shí)。質(zhì)粒不能在細(xì)胞中穩(wěn)定地保持并且當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂時(shí)被迅速降解或者丟失。Gassmann等(Gassmann等1995地在小鼠胚胎干細(xì)胞中檢查了DNA的游離型復(fù)制和穩(wěn)定保持，以及在美國(guó)專(zhuān)利No.2002/0146689中描述了基于多瘤病毒的質(zhì)粒的用途和染色體外復(fù)制對(duì)大T抗原表達(dá)的依賴(lài)。我們已觀察到基于Py的表達(dá)載體(含有DNA復(fù)制的Py起點(diǎn)的質(zhì)粒)如基于SV40的載體能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制多次并且能獲得高拷貝數(shù)。與在轉(zhuǎn)染后的幾天內(nèi)質(zhì)粒復(fù)制壓倒并最終殺死宿主細(xì)胞的COS細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不同，用含有Py起點(diǎn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞不復(fù)制到這種程度。推測(cè)這是由于CHO細(xì)胞對(duì)PyDNA復(fù)制的半允許性質(zhì)所致。在該系統(tǒng)中，含有Pyori的質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)染的3天內(nèi)由于降解和/或細(xì)胞分裂而丟失并且喪失重組基因的表達(dá)。這將瞬時(shí)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的最大時(shí)間限制到最多3天。游離型載體理論上，基因治療是將矯正的遺傳材料遞送到細(xì)胞中以減輕疾病的癥狀或者糾正缺陷基因?；蛑委煹淖罴演d體需要1)高水平和穩(wěn)定表達(dá)目的基因，2)高轉(zhuǎn)染效率，3)不整合到染色體DNA中以避免影響細(xì)胞自身的DNA，以及4)沒(méi)有可能導(dǎo)致繼發(fā)癌的轉(zhuǎn)化特征。不能獲得滿(mǎn)足所有這些標(biāo)準(zhǔn)的載體。已證明通過(guò)非病毒載體介導(dǎo)的系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移是一種安全并簡(jiǎn)單的，但相對(duì)低效的基因遞送方法。當(dāng)前可獲得的許多系統(tǒng)都利用來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒的病毒載體。已大量研究了使用非整合病毒構(gòu)建有效的基因遞送載體的用途。特別是，已考慮了基于EBV的表達(dá)載體。EB病毒獲得不影響細(xì)胞基因組的高表達(dá)水平的一種方法是使用在染色體外復(fù)制的游離型質(zhì)粒載體。其在細(xì)胞中長(zhǎng)期在染色體外復(fù)制的游離型載體，是研究克隆基因的表達(dá)和基因治療的有用工具，例如，EB病毒(EBV)來(lái)源的質(zhì)粒。EB病毒(EBV)是人γ皰疹病毒。游離型復(fù)制和核停留都需要的病毒元件是EBV基因的順式作用復(fù)制起點(diǎn)(oriP)和與oriP區(qū)相互作用的EBV核抗原1(EBNA-1)。以細(xì)胞核中低拷貝數(shù)DNA附加體保持含有oriP和EBNA-1序列的質(zhì)粒并且在靈長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞周期復(fù)制一次。EBNA1的染色體結(jié)合活性保證在有絲分裂期間分離到子代細(xì)胞?；贓BV的載體主要在靈長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞中使用。由于以前認(rèn)為不可能在動(dòng)物(如小鼠)以及培養(yǎng)物(如CHO細(xì)胞)中測(cè)試EBV載體，因此EBV來(lái)源的載體不能在包括小鼠和倉(cāng)鼠的絕大多數(shù)嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制構(gòu)成了基因治療的嚴(yán)重缺陷。特別是，CHO細(xì)胞不支持EBV病毒DNA復(fù)制。以前在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中使用EBV來(lái)源的載體的研究已證明僅一些嚙齒動(dòng)物細(xì)胞(C6和L6)能復(fù)制含有EBVoriP并編碼EBNA-1的質(zhì)粒(Mizμguchi，H.Hosono，T.，Hayakawa.(2000))，并且僅持續(xù)有限的時(shí)間(即＜5天)。僅當(dāng)在表達(dá)載體中插入人DNA序列的不明確的大片段(21Kb)時(shí)，可能在CHO細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制(KrysanP.J.和MicheleCalos.(1993))。由于這種表達(dá)載體影響潛在的治療性產(chǎn)物產(chǎn)生的性質(zhì)不穩(wěn)定且不明確，因此這種大質(zhì)粒構(gòu)建體不易進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移研究。因此，需要能穩(wěn)定的游離型復(fù)制并保持而不含隨機(jī)的人DNA大片段的表達(dá)載體。已使用游離型載體來(lái)增加穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的頻率并且在許多細(xì)胞類(lèi)型中獲得可靠的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。然而，已證明以前描述的游離型載體(例如基于EB病毒(EBV)或SV40大T抗原的游離型載體)在宿主細(xì)胞范圍和長(zhǎng)期培養(yǎng)的保持方面都有限制(Piechaczek等(1999)；以及Heffernan和Dennis(1991))。最近，已描述了用于快速生產(chǎn)產(chǎn)量多達(dá)20mg/L的大量重組蛋白的大規(guī)模瞬時(shí)蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法(Durocher等2002；Girard等2002；Meissner等2001；Jordan等1998)。這種大規(guī)模的瞬時(shí)表達(dá)使用轉(zhuǎn)化的人胚胎腎(HEK293)細(xì)胞和那些經(jīng)過(guò)改造表達(dá)EB病毒(EBV)核抗原1(EBNA-1)的細(xì)胞。同樣地，需要改進(jìn)的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其可用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，特別是重組的治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)并且也能用于人基因治療模型。由于常規(guī)使用嚙齒動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO、BHK、NS0)生產(chǎn)重組蛋白治療劑，因此具有能在這些細(xì)胞中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制并保持工作的表達(dá)系統(tǒng)是有利的。在可能用于最終生物加工的同一宿主細(xì)胞類(lèi)型中，在產(chǎn)物產(chǎn)生階段的早期迅速產(chǎn)生重組蛋白的能力顯然是有利的。也需要提高轉(zhuǎn)染效率的表達(dá)系統(tǒng)，其導(dǎo)致更高的重組蛋白表達(dá)。此外，也需要能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中游離型復(fù)制和保持長(zhǎng)期穩(wěn)定的游離型的克隆/表達(dá)載體。本發(fā)明的目的是克服或改進(jìn)至少一種現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，或者提供有用的備選方案。發(fā)明概述根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明提供包括嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包含編碼多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因。根據(jù)第二個(gè)方面，本發(fā)明提供包括嚙齒動(dòng)物細(xì)胞和載體的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，該載體包含多瘤病毒的DNA復(fù)制起點(diǎn)或者其功能等效物，其中所述細(xì)胞適于目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。根據(jù)第三個(gè)方面，本發(fā)明提供包括嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包含編碼多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因，和/或編碼EBV核抗原1(EBNA-1)或其功能等效物的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，當(dāng)提及細(xì)胞“包含”一種基因時(shí)，該基因可能在細(xì)胞的基因組內(nèi)或包含在載體內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，目的蛋白質(zhì)是治療性蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目的蛋白質(zhì)是單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目的蛋白質(zhì)適于用作疫苗。根據(jù)第四方面，本發(fā)明提供組成性表達(dá)大T抗原蛋白質(zhì)或其功能等效物的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞。因此，在第五方面，本發(fā)明提供包括嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，其中該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包含(a)含有編碼目的蛋白質(zhì)的基因的載體，(b)引起載體DNA復(fù)制的手段以及(c)EB病毒家族(EBV)的oriP和EBNA-1基因或其功能等效物。優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是穩(wěn)定的游離型復(fù)制系統(tǒng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，在本發(fā)明申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的”指目的蛋白質(zhì)的表達(dá)超過(guò)48小時(shí)。優(yōu)選地，表達(dá)目的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒的復(fù)制和保留持續(xù)3周以上。優(yōu)選通過(guò)大T抗原或其功能等效物與多瘤病毒的復(fù)制起點(diǎn)或其功能等效物的相互作用引起DNA復(fù)制。更優(yōu)選從整合到嚙齒動(dòng)物細(xì)胞基因組內(nèi)的基因表達(dá)大T抗原或其功能等效物。不受理論束縛，嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中大T抗原或其功能等效物的表達(dá)可能有助于將DNA轉(zhuǎn)移到嚙齒動(dòng)物的核內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中引起DNA復(fù)制的手段可能瞬時(shí)地或組成型地在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中呈現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚可以從整合到嚙齒動(dòng)物細(xì)胞染色體中的基因中表達(dá)EBNA-1基因或其功能等效物，或者其可在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)。優(yōu)選大T抗原或其功能等效物的表達(dá)為嚙齒動(dòng)物細(xì)胞提供功能益處。這種益處包括(但不限于)轉(zhuǎn)染率增加；編碼目的蛋白質(zhì)基因的表達(dá)增強(qiáng)；嚙齒動(dòng)物細(xì)胞作為單一細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物在無(wú)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力；以及細(xì)胞對(duì)凋亡發(fā)作的抗性。根據(jù)第六方面，本發(fā)明提供在嚙齒動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中使用的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)病毒元件并且包括至少一個(gè)病毒DNA復(fù)制起點(diǎn)，其中所述元件來(lái)自多瘤病毒和/或EB病毒(EBV)。優(yōu)選地，病毒元件包括多瘤病毒的復(fù)制起點(diǎn)(oriPV)和/或EBV的復(fù)制起點(diǎn)和/或EBV的核抗原(EBNA-1)。優(yōu)選地，載體能在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中游離型復(fù)制并且長(zhǎng)期穩(wěn)定地保持為游離型。根據(jù)第七方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的方法，包括在促進(jìn)所述蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包括(a)位于載體上的編碼目的蛋白質(zhì)的基因、其引起載體的DNA復(fù)制的手段，和(c)來(lái)自EB病毒家族(EBV)的一個(gè)或多個(gè)病毒元件，并回收所述蛋白質(zhì)。根據(jù)第八方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)重組蛋白的方法，包括在促進(jìn)所述蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞并任選地回收所述蛋白質(zhì)，其中CHO-K1細(xì)胞包含編碼多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因和根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體。根據(jù)第九方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明方法所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。根據(jù)第十方面，本發(fā)明提供藥物組合物，包括根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)以及可藥用載體。根據(jù)第十一方面，本發(fā)明提供用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選宿主細(xì)胞是嚙齒動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞，包括(但不限于)CHO細(xì)胞。根據(jù)第十二方面，本發(fā)明提供在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中提高凋亡抗性的方法，包括在細(xì)胞中表達(dá)多瘤大T抗原或其功能等效物。根據(jù)第十三方面，本發(fā)明提供在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中保持載體為游離型的方法，包括在所述載體上包含EBV的復(fù)制起點(diǎn)或其功能等效物和/或EBV的核抗原(EBNA-1)或其功能等效物。根據(jù)第十四方面，本發(fā)明提供包括嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包含編碼多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因，其中嚙齒動(dòng)物細(xì)胞不是CHO細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，本發(fā)明也可以包含通常在克隆和表達(dá)載體中具有的一個(gè)或多個(gè)特征。這些組件可包括(但不限于)可選擇的標(biāo)記(例如編碼抗生素抗性的基因)、允許很容易地將片段亞克隆到其它載體中的多克隆位點(diǎn)(多接頭區(qū))、允許產(chǎn)生所克隆產(chǎn)物的單鏈拷貝的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)，以及跨越克隆位點(diǎn)、產(chǎn)生用于鑒定宿主細(xì)胞的很容易檢測(cè)到的表型的基因，所述攜帶宿主細(xì)胞具有插入片段(例如LacZα片段或EGFP)的載體(Sambrook等2001)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“目的蛋白質(zhì)”包括任何肽或蛋白質(zhì)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括(但不限于)胰島素、α干擾素、乙型肝炎病毒表面抗原、GM-CSF、G-CSF、血液凝集因子VIII、紅細(xì)胞生成素、鏈激酶、人生長(zhǎng)激素、松弛素、凝乳酶、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子以及卵泡刺激因子。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“嚙齒動(dòng)物”包括(但不限于)小鼠、倉(cāng)鼠、海貍、荷蘭豬、大鼠、沙土鼠、水豚、豪豬、灰鼠、花栗鼠、旅鼠、土撥鼠、囊地鼠或松鼠。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“功能等效物”包括(但不限于)由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失、插入或突變而與野生型不同的元件，所述缺失、插入或突變不管是單獨(dú)還是組合，都不會(huì)使元件喪失對(duì)于本發(fā)明對(duì)本發(fā)明而言的功能。術(shù)語(yǔ)“功能等效物”也包括在種系發(fā)生上與在本說(shuō)明書(shū)中舉例說(shuō)明的病毒元件相關(guān)并因此具有相同功能性的元件，或者在種系發(fā)生在與本說(shuō)明書(shū)舉例說(shuō)明的病毒元件無(wú)關(guān)但與說(shuō)明書(shū)中舉例的那些元件執(zhí)行相同功能的元件。除非上下文明確要求，否則在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，“包括”等將被解釋為包含的意思，與除外或耗盡的意思相反；也就是說(shuō)，為“包括，但不限于”的意思。附圖簡(jiǎn)述圖1在本研究中使用的質(zhì)粒載體A.pBK-CMV-LT編碼Py大T抗原的表達(dá)質(zhì)粒。CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)PyLT的表達(dá)。Kan/Neo基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中賦予G418抗性，在細(xì)菌細(xì)胞中賦予卡那霉素抗性。B.pGEM-T-PyOri通過(guò)使用ClaI限制性末端的Pyori的PCR擴(kuò)增構(gòu)建。用TaqDNA聚合酶的末端A的PCR擴(kuò)增允許將PCR片段一步克隆到pGEM-T-Easy載體中。C.pEBV(A)和pEBYd2EGFP在本研究中將商品載體pCEP4重新命名為pEBV。其編碼基因EBNA-1和命名為OriP的EB病毒的DNA復(fù)制起點(diǎn)。D.pPyOri和pPyOri-d2EGFP通過(guò)將PyOri克隆到之前經(jīng)消化去除EBNA1和OriP的pEBV載體中而構(gòu)建。該載體代表CHO-T細(xì)胞中游離型復(fù)制的陽(yáng)性對(duì)照。E.pEBV-PyOri和pEBV-PyOri-d2EGFP通過(guò)將PyOri克隆到pEBV中構(gòu)建的表達(dá)載體。F.pBasic和pBasic-d2EGFP通過(guò)缺失EBNA1和OriP，從親本質(zhì)粒pEBV構(gòu)建pBasic。G.pPyOriLT分別從pPyLT-1(ATCC)和pPyA3-1(ATCC)中分離多瘤病毒大T抗原和Py起點(diǎn)并克隆到pNK中，一種編碼EGFP受體的專(zhuān)有載體(Bailey等1999)。圖2用pBK-CMV-LT轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中Py大T抗原的免疫熒光檢測(cè)未轉(zhuǎn)染的CHOK1(A)，用pBK-CMV-LT轉(zhuǎn)染的CHOK1細(xì)胞(B)。將細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡(上方)和在UV下(底部)觀察。圖3表達(dá)大T抗原的CHO-T克隆的頻率分布通過(guò)對(duì)Py大T抗原表達(dá)的免疫熒光染色，分析92個(gè)克隆。在指定的區(qū)域中(8×12平方厘米)記錄大T表達(dá)的熒光百分率。圖4質(zhì)粒復(fù)制的Southern印跡分析將報(bào)告質(zhì)粒(5μgpNK-Ori-EGFP)轉(zhuǎn)染到CHO-T克隆中，將2.5μgpNK-Ori-EGFP和2.5μgpCMV-大T抗原共轉(zhuǎn)染到CHOK1中(瞬時(shí)復(fù)制的+Ve對(duì)照)，將5μgpPoly-M2.6-EGFP轉(zhuǎn)染到CHOK1中(第二個(gè)+Ve對(duì)照)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過(guò)Hirt提取法提取低分子量DNA。通過(guò)用DpnI和Spel兩種酶消化，其后使用p32標(biāo)記的EGFP探針進(jìn)行Southern印跡雜交，來(lái)測(cè)量pNK-Ori-EGFP和pPoly-M2.6-EGFP的甲基化狀態(tài)作為復(fù)制的間接測(cè)定。由于質(zhì)粒含有一個(gè)Spel位點(diǎn)，哺乳動(dòng)物復(fù)制的DpnI抗性的pNK-Ori-EGFP和pPoly-M2.6-EGFP質(zhì)粒似乎是線性質(zhì)粒，由于質(zhì)粒含有不只一個(gè)DpnI位點(diǎn)，細(xì)菌復(fù)制的DpnI敏感的pNK-Ori-EGFP和pPoly-M2.6-EGFP質(zhì)粒似乎是小片段。在上面的Southern印跡中，泳道1為細(xì)菌復(fù)制的質(zhì)粒的對(duì)照(用DpnI和SpeI消化的pNK-Ori-EGFP質(zhì)粒)；泳道2-4為以不同濃度上樣的哺乳動(dòng)物復(fù)制的質(zhì)粒的對(duì)照(用SpeI消化的pNK-Ori-EGFP質(zhì)粒，泳道2為25ng，泳道3為50ng以及泳道4為75ng)泳道25為細(xì)菌的+Ve對(duì)照(用pNK-Ori-EGFP轉(zhuǎn)染的CHOK1)；泳道26為哺乳動(dòng)物的+Ve對(duì)照(用pNK-Ori-EGFP和pCMV大T抗原共轉(zhuǎn)染的CHOK1)；泳道27為哺乳動(dòng)物的+Ve對(duì)照(用pPoly-M2.6-EGFP轉(zhuǎn)染的CHOK1)；泳道28為-Ve對(duì)照(CHOK1)。使用光密度測(cè)定法、BABS、UNSW、定量復(fù)制的DNA帶。圖5(1)染色體外DNA的Southern印跡分析使用經(jīng)過(guò)改良的Hirt提取法(Hirt1967)分離染色體外的DNA。通過(guò)對(duì)僅在其識(shí)別位點(diǎn)被甲基化時(shí)才進(jìn)行切割的DpnI的抗性檢測(cè)質(zhì)粒復(fù)制。從大腸桿菌dam+株純化的DNA是DpnI的底物，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行一輪或多輪DNA復(fù)制的質(zhì)粒DNA則抗DpnI切割。(2)質(zhì)粒pPyOri-EGFP的復(fù)制。表達(dá)Py大T抗原的CHO細(xì)胞能支持pPyOri-EGFP的復(fù)制。如材料和方法中所述，使用甲基化特異性限制酶切消化通過(guò)Hirt法提取的DNA來(lái)區(qū)分未復(fù)制的DNA(A)和復(fù)制的DNA(B)。圖6在存在和缺乏Py大T抗原時(shí)EGFP在轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的表達(dá)。EGFP表達(dá)定義為熒光細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)乘以它們的平均相對(duì)熒光單位(RFU)。圖7生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)CHO-T(A)和CHOXL99(B)在Excell302培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。在具有50ml培養(yǎng)物的250ml旋轉(zhuǎn)器中進(jìn)行批培養(yǎng)。將細(xì)胞以3×105細(xì)胞/ml接種在Excell302培養(yǎng)基中并且每天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。在該研究中，CHO-T細(xì)胞的倍增時(shí)間是21.23小時(shí)，峰細(xì)胞密度是2.85×106細(xì)胞/ml。CHOXL99細(xì)胞的倍增時(shí)間是20.01小時(shí)，峰細(xì)胞密度是2.75×106細(xì)胞/ml。圖8構(gòu)建來(lái)用于比較CHO細(xì)胞中表達(dá)效率的載體。在圖1中顯示了詳細(xì)的質(zhì)粒圖。圖9A.GFP在CHO-T細(xì)胞中的表達(dá)。Facs分析顯示當(dāng)用雜合質(zhì)粒pEBVPyOri-d2EGFP轉(zhuǎn)染時(shí)，表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)量顯著高于用pPyOri-d2EGFP、pEBV-d2EGFP或pBasic-d2EGFP轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞。B.GFP表達(dá)隨時(shí)間的均值。在轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞(表達(dá)多瘤病毒大T抗原的CHO細(xì)胞)庫(kù)中，使用pEBVPyOri-d2EGFP表達(dá)GFP的細(xì)胞的數(shù)量增加，而其它庫(kù)顯示數(shù)量和表達(dá)都降低。圖10通過(guò)選擇研究長(zhǎng)期穩(wěn)定的游離型的保持(表達(dá)d2EGFP細(xì)胞的百分率)用5μgpEBV-d2EGFP、pPyOri-d2EGFP、pEBV-PyOri-D2EGFP和pBasic-d2EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-T(A)、CHOXL99(B)和HEK293(C)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)用潮霉素(400μg/ml)選擇細(xì)胞。進(jìn)行FACS分析以測(cè)量表達(dá)GFP細(xì)胞的百分率。圖11在用非復(fù)制的和復(fù)制的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞中重組蛋白的產(chǎn)量。在6孔板中，用所指的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-T細(xì)胞(A)和CHOXL99細(xì)胞(B)。轉(zhuǎn)染后，以總體積2ml，5×106細(xì)胞/ml的密度接種細(xì)胞。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)并且使用臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)定存活率。使用ELISA(Roche)測(cè)定HGH濃度。圖12在用編碼hGH的A)pBasic-和B)pPyEBV載體轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞的批研究或重組蛋白產(chǎn)量。轉(zhuǎn)染細(xì)胞并接種到100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)并使用臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)定存活率。使用hGHELISA試劑盒(Roche)測(cè)定產(chǎn)物濃度。正方形總的細(xì)胞數(shù)；三角形總的存活細(xì)胞數(shù)；圓形hGH產(chǎn)量。圖13在用pPyEBV/PyOri-HGH轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞中HGH的產(chǎn)率。A.轉(zhuǎn)染后，在100ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中接種總體積50ml、5×105細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)并使用ELISA(Roche)測(cè)定存活率。B.隨時(shí)間累積的蛋白質(zhì)濃度。C.通過(guò)計(jì)算累積的蛋白質(zhì)濃度的變化除以累積的細(xì)胞數(shù)量的變化，測(cè)定特異性產(chǎn)率。計(jì)算批運(yùn)行期間的特異性產(chǎn)率。測(cè)定最大特異性產(chǎn)率。圖14在CHO細(xì)胞中大T的表達(dá)模擬丁酸鈉的效應(yīng)。用載體pNK-d2EGFP轉(zhuǎn)化CHO和CHO-T細(xì)胞。PNK載體允許通過(guò)添加金屬選擇性激活由載體編碼的目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。CHO-T細(xì)胞模擬丁酸鈉效應(yīng)，通過(guò)激活EGFP基因表達(dá)來(lái)表達(dá)大T抗原。發(fā)明描述現(xiàn)在將通過(guò)實(shí)施例并參考附圖的方式描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。下面的實(shí)施例描述了能在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中長(zhǎng)期瞬時(shí)生產(chǎn)重組蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的形成。該表達(dá)系統(tǒng)包括1)親本CHO-K1細(xì)胞系的具有Py的大T抗原基因(Py)的衍生物和2)由一個(gè)或多個(gè)用于游離型復(fù)制和/或保持質(zhì)粒穩(wěn)定的病毒元件構(gòu)成的DNA表達(dá)載體，細(xì)胞衍生物中轉(zhuǎn)染了上述表達(dá)載體。開(kāi)發(fā)稱(chēng)為CHO-T的表達(dá)Py大T抗原的CHO-K1細(xì)胞系，用于大規(guī)模瞬時(shí)生產(chǎn)重組的治療性蛋白質(zhì)。CHO-T細(xì)胞系的若干優(yōu)點(diǎn)使其特別適于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)。CHO-T是充分表征的CHO-K1的衍生物，其在無(wú)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中以單細(xì)胞懸液方式生長(zhǎng)。由于大T的組成型表達(dá)及其引發(fā)含有Pyori的質(zhì)粒DNA復(fù)制的能力，因此該細(xì)胞系顯示轉(zhuǎn)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)產(chǎn)量都提高。使用綠色熒光蛋白(GFP)和人生長(zhǎng)激素(hGH)作為報(bào)告基因以證明轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。用含有PyDNA復(fù)制起點(diǎn)的pPyOri表達(dá)載體或者含有EB病毒(EBV)的oriP和EBNA-1蛋白的pEBV表達(dá)載體，或者既含有Py起點(diǎn)也含有EBVoriP和EBNA-1的pEBV-PyOri表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。結(jié)果表明pPyOri和pEBV-PyOri載體都能夠在CHO-T細(xì)胞中游離型復(fù)制。在包含雜合載體pEBV/PyOriGFP或pEBV/PyOriHGH的細(xì)胞中，基因表達(dá)明顯比用pPyOriGFP或pPyOriHGH轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有所延長(zhǎng)。使用pEBV/PyOri的基因表達(dá)的延長(zhǎng)和提高是組合質(zhì)粒復(fù)制、游離型保持和在細(xì)胞分裂期間質(zhì)粒分離的結(jié)果?；赑y的表達(dá)載體和CHO-T細(xì)胞提供用于生產(chǎn)重組蛋白的有效的CHO表達(dá)系統(tǒng)。包括表達(dá)載體pEBV/PyOri和CHO-T細(xì)胞的雜合表達(dá)系統(tǒng)在工業(yè)應(yīng)用中對(duì)于重組蛋白的大規(guī)模瞬時(shí)生產(chǎn)特別有用。實(shí)施例1材料和方法細(xì)胞和培養(yǎng)基在含有10％FBS的DMEMCOONSF12中生長(zhǎng)CHO-K1(ATCCCCL61)。使CHO-T細(xì)胞適應(yīng)在無(wú)血清培養(yǎng)基(Excell302；JRHBiosciences，Kansas)和無(wú)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基(Excell325；JRHBiosciences，Kansas)中懸浮生長(zhǎng)。在Excell302中生長(zhǎng)XL99細(xì)胞(適于在無(wú)血清培養(yǎng)基(NeilKitchen1999)中懸浮生長(zhǎng)的懸浮CHO-K1細(xì)胞系)。NS0-T使用NS0細(xì)胞(非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞)(ECACC85110503)轉(zhuǎn)染編碼多瘤病毒大T抗原的質(zhì)粒。NS0的電穿孔使用ChuG等1987年描述的適當(dāng)?shù)姆桨高M(jìn)行NS0細(xì)胞的電穿孔。簡(jiǎn)言之，將1-1.5×107NS0細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期并使用10μgpBK-CMV-大T抗原質(zhì)粒在250V以15毫秒方形波脈沖進(jìn)行電穿孔。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后將細(xì)胞在G418(400μg/ml)中進(jìn)行選擇。NS0的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用lipofectamine2000試劑(Invitrogen)進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)言之，在室溫下在Optimem培養(yǎng)基中制備DNA和lipofectamine2000的濃度并孵育5分鐘。在添加到24孔板內(nèi)懸浮于500μl中的5×105個(gè)細(xì)胞前，將DNA和lipofectamine2000混合并一起再孵育20分鐘。然后在24或48小時(shí)后使用FACS(CytomationMoFlo細(xì)胞計(jì)數(shù)器)分析細(xì)胞。轉(zhuǎn)染使用NucleobondAX柱(Macherey-Nagel，Duren，德國(guó))制備轉(zhuǎn)染級(jí)的DNA。使用分析型凝膠電泳、限制性酶切消化和分光光度法獨(dú)立分析DNA的濃度和純度。如下轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞在6孔板(例如，Iwaki，東京，日本)中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞用1xPBS(磷酸緩沖鹽水137mMNaCl、2.7mMKCl、4.3mMNa2HPO4·7H2O、1.4mMKH2PO4)洗滌一次，然后以0.75×106細(xì)胞/ml在Opti-MEM培養(yǎng)基中重懸浮。用5μg質(zhì)粒和10-15μlLipofectamine2000(LifeTechnology)轉(zhuǎn)染1.5×106細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12小時(shí)將細(xì)胞在2mlExce11302培養(yǎng)基中重懸浮并用所需的選擇試劑進(jìn)行處理。染色體外DNA的分離和Southern印跡雜交將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞用1xPBS洗滌一次并以0.93×106細(xì)胞/ml在Opti-MEM培養(yǎng)基(LifeTechnologyInc)中重懸浮。然后在6孔板中用5μg(質(zhì)粒)和10μlLF20000轉(zhuǎn)染2ml重懸浮的培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，添加2mlExce11302培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)收獲細(xì)胞并根據(jù)Hirt提取技術(shù)(Hirt，1967)分離低分子量DNA。簡(jiǎn)言之，收獲細(xì)胞并用1xPBS洗滌，然后在1ml0.6％SDS/0.01MEDTA(pH7.5)中重懸浮。在室溫下將這種細(xì)胞懸液培養(yǎng)20分鐘后，向細(xì)胞中添加250μl5MNaCl并輕輕混合。然后將得到的混合物在4℃過(guò)夜培養(yǎng)。通過(guò)在15,000g離心30分鐘收集上清液。將上清液樣品首先用酚氯仿抽提兩次，然后用氯仿抽提。通過(guò)乙醇沉淀分離DNA并在20-30μl的TE緩沖液(pH8)中重懸浮。染色體外DNA的分離和復(fù)制分析在轉(zhuǎn)染24、48和72小時(shí)后使用改良的Hirt提取法(Hirt1967)分離染色體外的DNA。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞用PBS洗滌并與0.6％SDS(w/v)/10mMEDTA溶液孵育20分鐘。然后添加NaOH到終濃度為1M，使反應(yīng)在4℃過(guò)夜進(jìn)行。將樣品在Eppendorf離心機(jī)中離心20分鐘。隨后用酚∶氯仿∶異戊醇(兩次，SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)抽提和用氯仿(SigmaAldrich)抽提一次，DNA用純乙醇沉淀，然后在TE(10μl)中重懸浮。在37℃，將用Hirt法提取的DNA用溶于50mMNaCl、10mMTris-HCl和1mM二硫蘇蘚糖醇的SpeI和DpnI(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA，USA)消化2小時(shí)，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳1小時(shí)。根據(jù)Ausubel，1997的方法進(jìn)行Southern雜交。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞在脫嘌呤液(0.25MHCl)中浸泡30分鐘，在變性液(1.5MNaCl/0.5NNaOH)中浸泡20分鐘并中和(2MTris-HCL/2MNaCl)20分鐘。然后使用真空印跡裝置將DNA轉(zhuǎn)移到20XSSC中的硝酸纖維素膜上。在雜交烤箱中于80℃焙烤前，使膜在室溫下干燥30分鐘。在添加32P標(biāo)記的EGFP探針(Clonetech)前，將膜在(5XSSC/5XDenharts/0.5％SDS、100μg/ml鮭精DNA(Invitrogen))中于68℃預(yù)雜交6小時(shí)。在68℃孵育12小時(shí)后，在室溫下將膜在50ml2SSC/0.1％/SDS中洗滌一次，在室溫下用50ml1XSSC/0.1％SDS洗滌一次以及在68℃用0.1％XSSC/0.1％SDS(w/v)洗滌一次，共20分鐘，其后將膜與放射自顯影膠片曝光，使用Biorad-525光密度計(jì)對(duì)DNA定量。載體構(gòu)建pGEM-T-PyOri使用表1中所示的PyOri-ClaI-AS(反義)和PyOri-ClaI-S(正義)引物，從pPyA3-1(ATCC)中通過(guò)PCR擴(kuò)增548bp的PyDNA復(fù)制起點(diǎn)(PyOri)，構(gòu)建pGEM-T-PyOri。然后將擴(kuò)增的DNA克隆到線性化的pGEM-TEasy載體(Invitrogen)中。在圖1顯示pGEM-T-PyOri質(zhì)粒圖。表1用于擴(kuò)增pPyA3-1質(zhì)粒中PyOri的引物pBasic通過(guò)用ClaI消化pCEP-4(Invitrogen)并將缺乏EBNA-1和OriP的片段再連接，構(gòu)建pBasic。PpvOri通過(guò)分離pGEM-T-PyOri(在GM2163(dam-ve)細(xì)菌中生長(zhǎng))中的ClaI片段(第9到541位核苷酸)并將其與使用ClaI(第1位核苷酸)線性化并用小牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化的pBasic質(zhì)粒(在GM2163(dam-ve)細(xì)菌中生長(zhǎng))連接，構(gòu)建pPyOri。PpyOriLT分別從pPyLT-1(ATCC)和pPyA3-1(ATCC)中分離多瘤病毒大T抗原和Py起點(diǎn)并克隆到編碼EGFP報(bào)到分子的pNK載體中。pEBV-PvOri通過(guò)將pGEM-T-PyOri(在GM2163(dam-ve)細(xì)菌中培養(yǎng))中的ClaI(第9到541位核苷酸)片段與用ClaI(第5939位核苷酸)線性化并用CIAP去磷酸化的pCEP-4質(zhì)粒(Invitrogen)連接，構(gòu)建pEBV-PyOri。pEBV-d2EGFP、pPvOri-d2EGFP、pEBV-PvOri-d2EGFP和pBasic-d2EGFP通過(guò)從pCMV-d2EGFP(Clonetech，USA)中分離作為KpnI(889位核苷酸)到NotI(1806位核苷酸)片段的編碼不穩(wěn)定的EGFP蛋白d2EFGP的DNA并將其與KpnI(pEBV中第625位核苷酸、pPyOri中第4875位、pEBV-PyOri中第4875位以及在pBasic質(zhì)粒中第4875位核苷酸)和NotI(在pEBV中第648位核苷酸、在pPyOri中第4898位、在pEBV-PyOri中第4898位以及在pBasic質(zhì)粒中第4898位核苷酸)消化的pEBV、pPyOri、pEBV-PyOri和pBasic質(zhì)粒連接，構(gòu)建pEBV-d2EGFP、pPyOri-d2EGFP、pEBV-PyOri-d2EGFP和pBasic-d2EGFP。pEBV-hGH、pPvOri-hGH、pEBV-PvOri-hGH和pBasic-hGH從pCBhGH(Bailey等2002)中消化編碼人生長(zhǎng)激素(hGH)的DNA序列并連接到pBasic、pPyOri、pEBV-PyOri以及pEBV的KpnI位點(diǎn)中。流式細(xì)胞術(shù)分析在安裝了Summit3.0軟件和以200mW操作的氬離子激光并在光調(diào)整模式中調(diào)到488nm的CytomationMoFlo細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Cytomation，F(xiàn)ortCollins，CO)上采集所呈現(xiàn)的所有數(shù)據(jù)。使用前向角和側(cè)向散射光閘(gating)鑒定存活的總數(shù)，而使用前向角和脈沖寬度的散射閘排除雙聯(lián)體。使用525-nm短波通過(guò)二色鏡分離eGFP熒光。在使用510/23波段通過(guò)濾波器的FL4上檢測(cè)eGFP發(fā)射(其最大發(fā)射在508nm)。也使用555nm長(zhǎng)波通過(guò)二色鏡將eGFP發(fā)射反射到FL1進(jìn)行比較分析，但是無(wú)論使用525nm短波通過(guò)或者555nm長(zhǎng)波通過(guò)二色鏡，在平均熒光強(qiáng)度中都沒(méi)有記錄到有顯著有關(guān)的差異(數(shù)據(jù)未顯示)。有時(shí)使用1.3ND濾波器將eGFP熒光強(qiáng)度減少到第4個(gè)對(duì)數(shù)10以下。調(diào)整PMT電壓以確保與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照相關(guān)的自身熒光在第一個(gè)對(duì)數(shù)10內(nèi)被描述成高斯分布。將分析維持在不超過(guò)每秒600個(gè)細(xì)胞的事件率，每個(gè)樣品獲得總計(jì)20,000個(gè)事件。相對(duì)于對(duì)照比較性評(píng)估處理樣品的平均熒光數(shù)據(jù)。免疫熒光染色和大T抗原表達(dá)的檢測(cè)免疫熒光染色前一天，將CHO-T細(xì)胞用EDTA/PBS分開(kāi)，并以3×105細(xì)胞/孔接種在含有無(wú)菌1/1cm玻璃蓋片的經(jīng)過(guò)處理的6孔平板內(nèi)的組織培養(yǎng)物中。一旦細(xì)胞達(dá)到≥90％的匯合，將它們用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌一次，并在冰上用1ml2％甲醛/0.1％TritonX100固定30分鐘。然后將細(xì)胞用PBS沖洗三次并在每次洗滌之間在室溫下孵育5分鐘。細(xì)胞用2ml1xPBS/10％FBS封閉22分鐘，隨后添加25μlAb-1(Py大T抗原的單克隆抗體，1μg/mlOncogeneResearch產(chǎn)品，SantaCruz)在室溫下孵育1小時(shí)。如上所述將細(xì)胞用PBS洗滌3次。將細(xì)胞在室溫下與25μl偶聯(lián)FITC的ANTI-RATIgG(整個(gè)分子)(1∶32稀釋)(Sigma)在黑暗中孵育1小時(shí)。如上所述將細(xì)胞洗滌3次。然后將細(xì)胞于黑暗中在PBS中孵育，直到在熒光顯微鏡下觀察。HGH測(cè)定和蛋白質(zhì)定量使用ELISA試劑盒(Roche)從條件培養(yǎng)基中測(cè)量HGH。實(shí)施例2CHO細(xì)胞中的游離型復(fù)制將表達(dá)載體pPyOriLT(圖1G)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中以證明游離型復(fù)制。因此，pPyOriLT含有PyOri并編碼PyLT(兩種必需的病毒元件)并在許可性CHO細(xì)胞因子存在時(shí)足以引發(fā)質(zhì)粒DNA復(fù)制。監(jiān)測(cè)質(zhì)粒DNA復(fù)制3天。根據(jù)如上所述的Hirt提取技術(shù)從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中純化低分子量DNA(圖6(1))。通過(guò)對(duì)僅在其識(shí)別位點(diǎn)被甲基化時(shí)才進(jìn)行切割的DpnI的抗性檢測(cè)質(zhì)粒復(fù)制。從大腸桿菌dam+株純化的DNA(泳道1到4)是DpnI的底物(泳道5)，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行一輪或多輪DNA復(fù)制的質(zhì)粒DNA抗DpnI切割(泳道11-20)。如在圖6(2)中所示，在第三天，轉(zhuǎn)染后非復(fù)制的DNA(DpnI敏感的)的總量從每個(gè)細(xì)胞7000個(gè)拷貝迅速下降到每個(gè)細(xì)胞1000個(gè)拷貝以下。這些結(jié)果表明盡管CHO細(xì)胞支持PyOriLT的游離型復(fù)制，但是轉(zhuǎn)染后不久質(zhì)粒DNA的迅速下降將瞬時(shí)基因表達(dá)的時(shí)間限制到3到4天。實(shí)施例3(a)CHO-T細(xì)胞系的產(chǎn)生從ATCC中獲得Py大T抗原的cDNA并克隆到表達(dá)載體pBK-CMV(Clonetech)中。使用表達(dá)質(zhì)粒pBK-CMV-LT(圖1)轉(zhuǎn)染CHO-K1(ATCC，CCL61)。將細(xì)胞在G418(400μg/ml)中選擇兩周。通過(guò)如在圖2中所示的免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)Py大T抗原的表達(dá)。使用MoFlo細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Dako-Cytomation，F(xiàn)ortCollins，Colorado，USA)通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)分離單個(gè)細(xì)胞。分離如在圖3中所示的幾個(gè)大T抗原水平有變化的克隆。擴(kuò)增21個(gè)具有不同大T抗原表達(dá)水平的克隆并如在圖4的Southern印跡中所示測(cè)試它們支持含有Pyori的質(zhì)粒(pNK-Ori-EGFP)的DNA復(fù)制的能力。將pNK-Ori-EGFP轉(zhuǎn)染到CHO-T克隆中。通過(guò)上述Hirt抽提法提取低分子量DNA。測(cè)量pNK-Ori-EGFP的甲基化狀態(tài)作為復(fù)制的間接分析。純化通過(guò)Hirt法提取的DNA并用DpnI和SpeI消化，其后進(jìn)行Southern印跡雜交。使用含有32P標(biāo)記的EGFP構(gòu)成的探針檢測(cè)質(zhì)粒DNA。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的復(fù)制導(dǎo)致質(zhì)?？购怂醿?nèi)切酶DpnI的消化，而非復(fù)制的質(zhì)粒DNA對(duì)DpnI消化敏感并導(dǎo)致大量小片段，其取決于質(zhì)粒中i位點(diǎn)的數(shù)量。結(jié)果表明通過(guò)抗DpnI消化，證明許多CHO-T克隆(圖4；泳道5到24)能支持含有Pyori的DNA的復(fù)制。選擇克隆P1-C11(圖4，泳道11；CHO-T)用于以下部分描述的進(jìn)一步研究。(b)NS0-T細(xì)胞系的產(chǎn)生為了提供易于制備水平的大T抗原(LT)用于之后含有Py-ori質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，通過(guò)pCMV-LT的穩(wěn)定整合產(chǎn)生穩(wěn)定的NS0-T細(xì)胞系。在該方法中質(zhì)?？赡苎杆?gòu)?fù)制到高拷貝數(shù)而不浪費(fèi)時(shí)間等待LT表達(dá)。使用電穿孔獲得穩(wěn)定整合。簡(jiǎn)言之，電穿孔三種培養(yǎng)物，它們分別不含DNA(陰性對(duì)照)、含有pEGFP-C1質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照)或含有pCMV-LT質(zhì)粒(pLT)。然后將細(xì)胞進(jìn)行選擇(G418)培養(yǎng)以確定是否已穩(wěn)定整合pLT上攜帶的新霉素抗性基因。記錄三周期間培養(yǎng)物的存活率以確定這個(gè)事實(shí)。24小時(shí)后使用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)獲得陰性和陽(yáng)性對(duì)照樣本。這用于確定電穿孔步驟后是否任何質(zhì)粒DNA已成功地進(jìn)入細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照顯示EGFP熒光而陰性對(duì)照不顯示(數(shù)據(jù)未顯示)。轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和pLT培養(yǎng)物的存活率都立即下降，2天后恢復(fù)。4天后陽(yáng)性培養(yǎng)物的存活率達(dá)93％。含有陰性對(duì)照和pLT的培養(yǎng)物在前7天相互之間都有類(lèi)似的曲線。然而陰性對(duì)照在第一個(gè)兩天不象pLT培養(yǎng)物那樣降低那么多。第二天后每個(gè)培養(yǎng)物的存活率都迅速降低。15天后陰性對(duì)照的存活率達(dá)0％，而含有pLT的樣品在轉(zhuǎn)染后9天存活率下降到2％，轉(zhuǎn)染后21天恢復(fù)到88％(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例4CHO-T細(xì)胞的生長(zhǎng)特性懸浮生長(zhǎng)使CHO-T細(xì)胞系(克隆P1-C11)適于在無(wú)血清培養(yǎng)基(Exce11302)和無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基Exce11325中懸浮生長(zhǎng)。CHO-T細(xì)胞能以高度繁殖的方式懸浮生長(zhǎng)，這使得其非常適于大規(guī)模生產(chǎn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生物藥物的生產(chǎn)已從附著培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到懸浮培養(yǎng)物。懸浮培養(yǎng)物操作相對(duì)簡(jiǎn)單并且容易擴(kuò)大。懸浮細(xì)胞能達(dá)到每體積培養(yǎng)基中更高的生物量用以提高產(chǎn)率。此外，使用懸浮細(xì)胞，可在生物反應(yīng)器中提供均相條件，其將允許精確監(jiān)控和控制操作參數(shù)(如溫度、溶解的氧和pH)。因此這將允許以長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)方式輕而易舉地產(chǎn)生并收獲更多的產(chǎn)物。該特點(diǎn)優(yōu)于用附著細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)。不依賴(lài)血清CHO-T細(xì)胞可在無(wú)蛋白質(zhì)的合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)并生長(zhǎng)到高細(xì)胞密度。因此，由于在培養(yǎng)物中缺乏人或動(dòng)物蛋白質(zhì)，提高了安全性。通過(guò)將細(xì)胞在使用50ml培養(yǎng)基的250ml旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)，進(jìn)行生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究。將CHO-T細(xì)胞的生長(zhǎng)與CHOXL99(也適應(yīng)懸浮生長(zhǎng)的CHO-K1細(xì)胞系)進(jìn)行比較。將細(xì)胞以3×105細(xì)胞/ml接種到Exce11302培養(yǎng)基中，每天計(jì)數(shù)細(xì)胞共8天或者直到存活率降到50％以下。結(jié)果顯示于圖8中。與峰存活細(xì)胞密度為2.75×106細(xì)胞/ml、倍增時(shí)間為20.01小時(shí)的CHOXL99相比，CHO-T細(xì)胞的峰存活細(xì)胞密度為2.85×106細(xì)胞/ml，倍增時(shí)間為21.23小時(shí)。實(shí)施例5含有Pyori的表達(dá)載體在CHO-T中的復(fù)制哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒復(fù)制需要下列三個(gè)元件1)DNA復(fù)制的病毒起點(diǎn)，2)相關(guān)的病毒反式作用蛋白質(zhì)以引發(fā)DNA復(fù)制，以及3)許可性宿主特異性蛋白質(zhì)。我們已在表達(dá)系統(tǒng)中組合了這些元件，其中該系統(tǒng)由含有Pyori的表達(dá)載體、反式作用的病毒蛋白質(zhì)和大T構(gòu)成，在允許Py復(fù)制的宿主細(xì)胞系CHO-K1中組成型表達(dá)。將質(zhì)粒pPyOri-EGFP轉(zhuǎn)染到CHO-T細(xì)胞中，通過(guò)使用上述甲基化特異性DpnI酶消化法測(cè)定經(jīng)歷一輪或多輪DNA復(fù)制的質(zhì)粒DNA的量，對(duì)質(zhì)粒DNA復(fù)制監(jiān)控3天。如在圖5中所示，轉(zhuǎn)染后非復(fù)制的DNA的總量一直下降，而復(fù)制的DNA的總量在第2天增加，但是以后下降(如在圖5B中所示)。這些研究表明pPyOri-EGFP在表達(dá)Py大T抗原的CHO細(xì)胞中復(fù)制幾次，結(jié)果每個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生高拷貝數(shù)，如所示從第1天的500個(gè)拷貝增加到第2天的3000個(gè)拷貝。圖6證明了質(zhì)?？截悢?shù)量增加后EGFP表達(dá)也增加。類(lèi)似地，第3天質(zhì)?？截悢?shù)量降低后基因表達(dá)也降低(圖5&6)。轉(zhuǎn)染后不久，質(zhì)粒DNA降低以及因而重組基因表達(dá)也降低將含有Pyori的載體在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中的使用限制到3-4天。因此，需要擴(kuò)大瞬時(shí)基因表達(dá)窗。為了這個(gè)目標(biāo)，我們研發(fā)了不僅能在CHO細(xì)胞中復(fù)制，而且也能以附加體穩(wěn)定保持質(zhì)粒的游離型載體，其極大地延長(zhǎng)了蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)時(shí)間。選擇EB病毒元件(EBNA-1和OriP)以補(bǔ)助基于Pyori的質(zhì)粒復(fù)制。EBV載體通過(guò)含有OriP序列的高親和力的基質(zhì)附著區(qū)錨定到核基質(zhì)中(Jankelevich等1992；Mattia等1999)。OriP與起點(diǎn)結(jié)合蛋白EBNA1的相互作用是EBV載體在靈長(zhǎng)動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制、保持和分離所必需的(Lupton和Levine1985；Polvino-Bodnar和Schaffer1992；Yates等1984)?；贓BV元件的游離型載體已廣泛用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Sclimenti，C.R.，1998)。EBVoriP和EBNA1共同使病毒DNA在細(xì)胞中保持穩(wěn)定的游離型。這兩個(gè)序列是必需的，并且足以使EBV載體在包括人、猴和狗的多種建立的細(xì)胞中保持和復(fù)制(SclimentiC.R.，1998)。然而，由于CHO細(xì)胞對(duì)EBV病毒繁殖的非許可性，因此不知道EBV載體是否能在CHO細(xì)胞中復(fù)制。設(shè)計(jì)并構(gòu)建如在圖8中描述的含有Pyori和/或EBV元件的四個(gè)質(zhì)粒。質(zhì)粒pEBV含有DNA復(fù)制的EBV起點(diǎn)(OriP)順式作用序列并編碼EB核抗原1(EBNA1)。質(zhì)粒pPyOri含有Pyori而無(wú)EBV序列。質(zhì)粒pEBV-PyOri含有OriP、EBV的EBNA1以及Py的ori。質(zhì)粒pBasic缺乏EBV和Py病毒元件。將報(bào)道基因d2EGFP或hGH克隆到在組成型CMV啟動(dòng)子的控制下的所有上述質(zhì)粒中。詳細(xì)的質(zhì)粒圖顯示于圖1中。pPvEBV載體的保留和分離將CHO-T、CHOXL99和人胚胎腎(HEK)293細(xì)胞的分別用編碼標(biāo)記蛋白EGFP的單一質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染并在含有濃度為400μg/ml的潮霉素的培養(yǎng)基中選擇。轉(zhuǎn)染后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)物以確定表達(dá)GFP的細(xì)胞的百分率(圖9A)和相對(duì)的平均熒光(RFU)(圖9B)。CHO-T細(xì)胞顯示當(dāng)用pEBV-PyOri-d2EGFP轉(zhuǎn)染時(shí)，表達(dá)GFP的細(xì)胞的百分率整體增加(圖10A)。圖10A顯示當(dāng)用pEBV-PyOri-d2EGFP轉(zhuǎn)染時(shí)，轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞庫(kù)經(jīng)歷表達(dá)EGFP細(xì)胞的百分率增加，在11到15天之間效果最顯著。然而，用pEBV-d2EGFP、pPyOri-d2EGFP或pBasic-d2EGFP轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞顯示表達(dá)GFP的細(xì)胞不隨著時(shí)間變化而增加(圖10A)。相反，轉(zhuǎn)染的CHOXL99(圖10B)和轉(zhuǎn)染的HEK(圖10C)不顯示表達(dá)GFP的細(xì)胞增加(除了最初pEBV-PyOri-d2EGFP在CHOXL99細(xì)胞中增加)。這些結(jié)果表明含有pEBV-PyOri-d2EGFP的CHO-T細(xì)胞的數(shù)量開(kāi)始增加，推測(cè)這是由于質(zhì)粒復(fù)制(大T抗原引發(fā)從Pyori的復(fù)制)和質(zhì)粒的保持及分離(EBNA-1和OriP的相互作用)(Lupton和Levine，1985)。其它質(zhì)粒構(gòu)建體中沒(méi)有觀察到這種情況。盡管pPyOri-d2EGFP能在CHO-T細(xì)胞中游離型復(fù)制，但是隨著時(shí)間的變化熒光細(xì)胞的數(shù)量降低，可能是由于通過(guò)降解和細(xì)胞分裂喪失了質(zhì)粒DNA(圖10C和10E)。不支持含有PyOri構(gòu)建體的CHOXL99細(xì)胞(由于缺乏大T抗原)展示當(dāng)用pEBV-PyOri-d2EGFP轉(zhuǎn)染并在潮霉素中選擇8天時(shí)熒光細(xì)胞增加，但是然后便降低(圖10B)。直到這時(shí)還明白這種觀測(cè)結(jié)果的原因。HEK293細(xì)胞展示高轉(zhuǎn)染率(圖10C)。然而，對(duì)于所有測(cè)試的構(gòu)建體來(lái)說(shuō)，熒光細(xì)胞的數(shù)量都迅速下降。該研究不能證實(shí)pEBV-d2EGFP和pEBV-PyOri-d2EGFP在HEK293細(xì)胞中復(fù)制，盡管由于EBNA-1和OriP的相互作用以及在許可性HEK細(xì)胞系中存在宿主特異性因子，而預(yù)計(jì)這些質(zhì)粒能在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行DNA復(fù)制。實(shí)施例6使用CHO-T細(xì)胞和CHOXL99細(xì)胞在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中產(chǎn)生hGH在用編碼人生長(zhǎng)激素基因(hGH)的四種表達(dá)載體中的每一種轉(zhuǎn)染的CHO-T和CHOXL99細(xì)胞中測(cè)定蛋白質(zhì)產(chǎn)生。如上所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并以3×105細(xì)胞/ml的密度接種到6孔微量滴定板中。將細(xì)胞培養(yǎng)多達(dá)8天而不添加新鮮培養(yǎng)基。每天記錄細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞存活率和HGH產(chǎn)率。如在圖11中所示，對(duì)于每組轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都達(dá)到大約3.5-4×106細(xì)胞/ml的峰細(xì)胞密度。用不能在CHO-T細(xì)胞中復(fù)制的載體(pBasic-hGH、pEBV-hGH和CHOXL99細(xì)胞中的所有載體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)量大約為1μg/mlhGH或更少，而在用pPyOri-hGH轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞中產(chǎn)量稍微高些。相反，含有表達(dá)載體pEBV-PyOri-hGH的CHO-T細(xì)胞其蛋白質(zhì)產(chǎn)量超過(guò)6μg/ml。這些結(jié)果表明高水平的瞬時(shí)蛋白質(zhì)產(chǎn)生可能是由于質(zhì)粒復(fù)制和分離導(dǎo)致拷貝數(shù)量增加所致。盡管質(zhì)粒pPyOri-hGH能在CHO-T細(xì)胞中復(fù)制，但是這些培養(yǎng)物導(dǎo)致終產(chǎn)物的產(chǎn)量?jī)H2mg/L。這些數(shù)據(jù)表明產(chǎn)物濃度的差異不是僅簡(jiǎn)單地由于質(zhì)粒復(fù)制所致。轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞和CHO細(xì)胞兩者的總的和存活的細(xì)胞密度相似，表明游離型復(fù)制對(duì)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有不利影響。hGH的規(guī)模化瞬時(shí)生產(chǎn)已出現(xiàn)用于快速生產(chǎn)毫克量重組蛋白的大規(guī)模轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Jordan等1998；Schlaegar等1999；Wurm和Bernard，1999；Durocher等2002)。測(cè)試本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)(CHO-T細(xì)胞系和DNA表達(dá)載體pEBV-PyOri)用于hGH的大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)。用能復(fù)制的表達(dá)載體pPyEBV-hGH或不能復(fù)制的載體pBasic-hGH轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以5×105細(xì)胞/ml的濃度接種細(xì)胞并以100ml的總體積在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)。如在圖12中所示，兩種培養(yǎng)物都達(dá)到相似的最大存活細(xì)胞數(shù)，存活率一直保持在總細(xì)胞數(shù)量的90％以上直到接種4天后，隨后存活率迅速下降，推測(cè)是由于營(yíng)養(yǎng)耗盡。在Basic-hGH(A)和pPyEBV-hGH(B)的轉(zhuǎn)染子中產(chǎn)物產(chǎn)量分別是10mg/L和30mg/L。在用pEBV-OriPy-hGH轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞中產(chǎn)率增加是由于質(zhì)粒復(fù)制和分離。在隨后的半連續(xù)批試培養(yǎng)中，使用培養(yǎng)基更換策略(每48小時(shí)更換50％)以擴(kuò)大培養(yǎng)物的存活率。圖13顯示從在用pEBV-OriPy-hGH瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO-T細(xì)胞獲得的生長(zhǎng)譜和產(chǎn)率，作為接種后培養(yǎng)基置換飼養(yǎng)策略的結(jié)果。盡管所達(dá)到的最大存活細(xì)胞密度類(lèi)似于在以前的批研究中所獲得的那些最大存活細(xì)胞密度，但是飼養(yǎng)策略允許長(zhǎng)期提高細(xì)胞存活率而不經(jīng)歷急劇下降。使用這種策略，維持了細(xì)胞存活率并使累積的蛋白質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到75mg/L的濃度，計(jì)算的最大的特異性產(chǎn)率為7.8pg/細(xì)胞/天。這種飼養(yǎng)策略推定允許連續(xù)的細(xì)胞分裂和因此的質(zhì)粒復(fù)制。因此，質(zhì)粒復(fù)制、保持和分離共同導(dǎo)致重組基因表達(dá)能力增加以及產(chǎn)物產(chǎn)量提高。實(shí)施例7大T抗原可抑制凋亡的開(kāi)始如在圖7中所示，CHO-T和CHOXL99細(xì)胞存活率的比較顯示CHO-T細(xì)胞的細(xì)胞存活率超過(guò)親本細(xì)胞系XL99的存活率。表達(dá)大T抗原的CHO細(xì)胞也可能顯示抗凋亡的有益效果。真核細(xì)胞培養(yǎng)已變成十億美元的工業(yè)，在幾十年的時(shí)間生產(chǎn)了有重要商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)品。然而，真核細(xì)胞比細(xì)菌更脆弱，并且由于程序化細(xì)胞死亡或凋亡，與環(huán)境顯著相關(guān)的大規(guī)模培養(yǎng)常常導(dǎo)致顯著水平的細(xì)胞死亡。在典型的生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)中，凋亡最常見(jiàn)的原因之一是細(xì)胞培養(yǎng)基中缺乏營(yíng)養(yǎng)物或特異性存活因子。已進(jìn)行了許多研究以確定可提高在商業(yè)相關(guān)的生物技術(shù)方法中使用的細(xì)胞系的存活率和產(chǎn)率的營(yíng)養(yǎng)策略。通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞的存活，可提高有價(jià)值的蛋白質(zhì)(如單克隆抗體)的產(chǎn)量，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)生產(chǎn)主要是存活細(xì)胞群的功能。凋亡干預(yù)的機(jī)理類(lèi)似所描述的E1B19kDa蛋白的機(jī)理。已證實(shí)多瘤病毒LT可克服p53誘導(dǎo)的導(dǎo)致程序化細(xì)胞死亡或凋亡的生長(zhǎng)停滯(Rodier等，(2000))。其通過(guò)結(jié)合并使Rb蛋白失活來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例8丁酸鈉比較表達(dá)大T抗原的CHO細(xì)胞提高了基因表達(dá)。不受理論的束縛，認(rèn)為由于表達(dá)大T的CHO細(xì)胞模擬丁酸鈉的基因活化效應(yīng)，因此類(lèi)似的機(jī)理可能是原因。丁酸鈉是組蛋白脫酰酶(HDAC)抑制劑，推定其通過(guò)滅活細(xì)胞成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白R(shí)b而增加基因表達(dá)(Buquet-Fagot等(1996)，Luo等，(1998)，以及Struhl(1998))。常常在生產(chǎn)過(guò)程中使用丁酸鈉以增加重組基因表達(dá)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)率。然而，添加丁酸鈉也導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯以及凋亡的開(kāi)始；因此，僅在生產(chǎn)過(guò)程的最后階段添加。CHO-T細(xì)胞中大T抗原的組成型表達(dá)模擬丁酸鈉的效應(yīng)以增加基因表達(dá)而不導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯；因而可在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中使用以始終如一地產(chǎn)生高特異性的生產(chǎn)率(圖14)。在CHO-T細(xì)胞中提高轉(zhuǎn)染率當(dāng)用攜帶多瘤病毒ori序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)，CHO-T細(xì)胞(穩(wěn)定表達(dá)多瘤病毒大T抗原PyLT的CHO-K1細(xì)胞)提供增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的機(jī)制。不希望受理論束縛，認(rèn)為由于在PyLT上存在核定位信號(hào)(NLSs)，與CHO相比提高了CHO-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。已知NLS通過(guò)它們與核輸入機(jī)構(gòu)的相互作用，參與外源蛋白質(zhì)有效轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)(Nagasaki等(2003)，Dean.(1997))。已證明質(zhì)粒DNA-NLS肽綴合物可增加質(zhì)粒DNA的表達(dá)效率。含有多瘤ori序列的質(zhì)粒DNA含有PyLT結(jié)合的許多PyLT結(jié)合位點(diǎn)。討論本工作描述了在CHO細(xì)胞中不僅能進(jìn)行游離型復(fù)制而且能保留附加體的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)由載體pEBV-OriPy和CHO-T細(xì)胞構(gòu)成，并被設(shè)計(jì)成用于重組蛋白的大規(guī)模瞬時(shí)生產(chǎn)，所述重組蛋白用于早期產(chǎn)物產(chǎn)生目的。目前，使用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的最成功的實(shí)例已使用適應(yīng)懸浮的轉(zhuǎn)化的人胚胎腎HEK293(EBNA)宿主細(xì)胞，其經(jīng)過(guò)改造來(lái)表達(dá)EBNA-1。與含有OriP復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體組合，本系統(tǒng)能夠使游離的質(zhì)粒DNA保持在核內(nèi)并進(jìn)行自主復(fù)制(Langle-Rouault等1998；Sclimenti和Calos1998；VanCraenenbroeck等2000)。已在批式生產(chǎn)方法中使用HEK293(EBNA)細(xì)胞用于從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染庫(kù)中獲得各種重組蛋白，產(chǎn)量達(dá)20mgL-1(Durocher等2002；Girard等2002；Meissner等2001)。一直沒(méi)有利用至少與HEK293(EBNA)系統(tǒng)同樣有效的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在CHO細(xì)胞中大規(guī)模瞬時(shí)生產(chǎn)。眾所周知不同的宿主細(xì)胞類(lèi)型賦予不同的翻譯后修飾，其可能顯著影響治療性重組蛋白的性質(zhì)。由HEK293和CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的相同的重組蛋白可能在體外具有不同的生物學(xué)活性(Haack等1999)。例如，已知HEK293細(xì)胞在N-聚糖加工方面與CHO細(xì)胞不同(VanCraenenbroeck等2000；Yates等1984)。在將可能用于最終生物加工的同一宿主細(xì)胞類(lèi)型中，在產(chǎn)物篩選/產(chǎn)生的早期階段瞬時(shí)產(chǎn)生重組蛋白的能力顯然是有利的。基于EB的載體不能在CHO細(xì)胞自主復(fù)制。在本研究中，我們已經(jīng)證明如果通過(guò)PyOri和PyLT的相互作用進(jìn)行復(fù)制，那么可極大地提高瞬時(shí)基因表達(dá)。與PyLT相互作用的嚙齒動(dòng)物多瘤病毒DNA復(fù)制起點(diǎn)導(dǎo)致在CHO細(xì)胞中染色體外的質(zhì)粒復(fù)制。通過(guò)EBNA-1和OriP的相互作用確保轉(zhuǎn)染的DNA保持在核中并分離到子代細(xì)胞中。多瘤病毒和EBV序列兩者的組合導(dǎo)致在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)基因拷貝數(shù)量增加并維持CHO細(xì)胞中的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。我們已經(jīng)展示這里所描述的表達(dá)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染10天內(nèi)可產(chǎn)生多達(dá)75g/L的重組蛋白。結(jié)論穩(wěn)定復(fù)制并長(zhǎng)期在細(xì)胞內(nèi)保留的染色體外的載體是研究基因表達(dá)、DNA復(fù)制、修復(fù)、重組以及其它細(xì)胞加工的有用工具，對(duì)于基因治療具有潛在的重要性。以前一直不能將這種載體用于嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，即使這些細(xì)胞是在理解哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的生物學(xué)中常用的細(xì)胞。游離載體有若干優(yōu)點(diǎn)首先，插入的目的基因不被干擾或者受調(diào)節(jié)限制，而這常常在整合到細(xì)胞DNA的過(guò)程中發(fā)生；其次，插入的異源基因的存在不導(dǎo)致細(xì)胞自身重要區(qū)域的重排或中斷；第三，游離載體在細(xì)胞核中以多個(gè)拷貝持續(xù)存在，無(wú)論何時(shí)提供必需的病毒反式作用因子都導(dǎo)致目的基因的擴(kuò)增；最后，使用游離載體常常導(dǎo)致比使用染色體整合的質(zhì)粒有更高的轉(zhuǎn)染效率。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基于pEBVPyOri載體誘導(dǎo)的長(zhǎng)期復(fù)制和增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是快速生產(chǎn)足夠用于結(jié)構(gòu)和功能分析以及高通量篩選的重組蛋白的有用工具。結(jié)合基因轉(zhuǎn)移機(jī)制(如陽(yáng)離子脂質(zhì))，本表達(dá)系統(tǒng)提供用于基因治療和用于基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。盡管參考具體的實(shí)施例已描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到本發(fā)明可包括許多與這里所描述的本發(fā)明的一般原則和精神一致的其它形式。參考文獻(xiàn)Bailey，C.G.，Baig，M.，Gray，P.P.和Sunstrom，N.A.(1999)Arapidselection/amplificationprocedureforhigh-levelexpressionofrecombinantproteininametal-amplifiablemammalianexpressionsystem.SO-BiotechnologyTechniques.13(9).615-619.Bailey，C.G.，Tait，A.S.和Sunstrom，N.A.(2002)High-throμghputclonalselectionofrecombinantCHOcellsusingadominantselectableandamplifiablemetallothionein-GFPfusionprotein.Biotechnology&Bioengineering80，670-6.Baker，K.N.，Rendall，M.H.，Hills，A.E.，Hoare，M.，F(xiàn)reedman，R.B.和James，D.C.(2001)MetaboliccontrolofrecombinantproteinN-glycanprocessinginNS0andCHOcells.Biotechnology&Bioengineering.73，188-202.Buquet-Fagot，C.，Lallemand，F(xiàn).，Charollais，R.H.和Mester，J.(1996)Sodiumbutyrateinhibitsthephosphorylationoftheretinoblastomageneprodnctinmousefibroblastsbyatranscription-dependentmechanism.JournalofCellularPhysiology.166，631-6.Chu，GHayakawa，H和Berg，P1987.ElectroporationfortheefficienttransfectionofmammaliancellswithDNA.Nucl.AcidsTes151311-1326.Cole，C.N.(1996)PolyomavirinaeThevirusesandtheirreplication.Lippincott-RavenPhiladelphia.Dean，D.A.(1997)ImportofplasmidDNAintothenucleusissequencespecific.ExperimentalCellResearch.230，293-302.Durocher，Y.，Perret，S.，Kamen，A.(2002).High-levelandhigh-throμghputrecombinantproteinproductionbytransienttransfectionofsuspension-growinghuman293-EBNA-1cells.NucleicAidsResearch.30(2)E9.；1Gahn，T.A.和Schildkraut，C.L.(1989)TheEpstein-Barrvirusoriginofplasmidreplication，oriP，containsboththeinitiationandterminationsitesofDNAreplication.Cell58，527-35.Gassmann，M.，Dohoho，G.hBerg，P.(1995)Maintenanceofanextrachromosomalplasmidvectorinmouseembryonicstemcells.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica92，1292-6.Girard，P.M.D.，Baumgartner，G.，Bourgeois，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胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包含編碼多瘤大T抗原或其功能等效物的基因和/或編碼EB病毒核抗原1(EBNA-1)或其功能等效物的基因。7.根據(jù)權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其中編碼多瘤大T抗原或其功能等效物的基因由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞組成性表達(dá)。8.根據(jù)權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其中編碼EBNA-1或其功能等效物的基因由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞組成性表達(dá)。9.根據(jù)權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其中編碼EBNA-1的基因由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)。10.根據(jù)權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其中編碼多瘤大T抗原的基因由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)地表達(dá)。11.組成性表達(dá)大T抗原蛋白或其功能等效物的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞。12.包含嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，其中該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包含(a)含有編碼目的蛋白質(zhì)基因的載體，(b)引發(fā)載體的DNA復(fù)制的手段和(c)EB病毒(EBV)的oriP或其功能等效物以及EBV的EBNA-1基因或其功能等效物。13.權(quán)利要求12的表達(dá)系統(tǒng)，其中提供具有選自下述一種或多種功能益處的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞(i)轉(zhuǎn)染效率提高，(ii)基因表達(dá)增強(qiáng)，(iii)嚙齒動(dòng)物細(xì)胞能在無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中長(zhǎng)成單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，和(iv)細(xì)胞抗凋亡發(fā)生。14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的表達(dá)系統(tǒng)，其中引發(fā)載體復(fù)制的手段由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞組成性表達(dá)。15.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的表達(dá)系統(tǒng)，其中引發(fā)載體復(fù)制的手段由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)。16.權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)的表達(dá)系統(tǒng)，其中引發(fā)載體DNA復(fù)制的手段是表達(dá)具有多瘤病毒的復(fù)制起點(diǎn)或其功能等效物的大T抗原或其功能等效物。17.根據(jù)權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的表達(dá)系統(tǒng)，其中該表達(dá)系統(tǒng)是穩(wěn)定的游離型復(fù)制系統(tǒng)。18.根據(jù)權(quán)利要求17的表達(dá)系統(tǒng)，其中表達(dá)目的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒的復(fù)制和保留持續(xù)超過(guò)3周。19.一種用于嚙齒動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含一個(gè)或多個(gè)病毒元件，其中所述元件來(lái)自多瘤病毒和/或EB病毒(EBV)并包含至少一種病毒的DNA復(fù)制起點(diǎn)。20.根據(jù)權(quán)利要求19的表達(dá)載體，其中該載體能在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中游離型復(fù)制并且長(zhǎng)期保持為穩(wěn)定的游離型。21.根據(jù)權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其中病毒元件包括多瘤病毒的復(fù)制起點(diǎn)(oriPV)和/或EBV復(fù)制起點(diǎn)和/或EBV的核抗原EBNA-1。22.生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的方法，其包括培養(yǎng)嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、在促進(jìn)表達(dá)的條件下促進(jìn)所述蛋白質(zhì)的表達(dá)并回收所述蛋白質(zhì)，該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包含(a)位于載體上的編碼目的蛋白質(zhì)的基因，(b)引發(fā)載體DNA復(fù)制的手段，和(c)來(lái)自EB病毒家族(EBV)的一種或多種病毒元件。23.權(quán)利要求22的方法，其中引發(fā)載體DNA復(fù)制的手段由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞組成性表達(dá)。24.權(quán)利要求22的方法，其中引發(fā)載體DNA復(fù)制的手段由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)。25.權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)的方法，其中引發(fā)載體DNA復(fù)制的手段是具有多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)或其功能等效物的多瘤病毒的大T抗原或其功能等效物。26.權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)的方法，其中來(lái)自EB病毒家族的一種或多種病毒元件中的至少一種由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞組成性表達(dá)。27.權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)的方法，其中來(lái)自EB病毒家族的一種或多種病毒元件中的至少一種由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)。28.權(quán)利要求22至27中任一項(xiàng)的方法，其中病毒元件包括EB病毒核抗原1——EBNA-1。29.生產(chǎn)重組蛋白的方法，其包括培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞、在促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下促進(jìn)所述蛋白質(zhì)的表達(dá)并回收所述蛋白質(zhì)，該CHO-K1細(xì)胞由根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，包含編碼多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因。30.蛋白質(zhì)，其根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求29的方法所產(chǎn)生。31.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求29的方法所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和可藥用載體。32.宿主細(xì)胞，其由根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項(xiàng)的載體所轉(zhuǎn)化。33.根據(jù)權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。34.一種提高嚙齒動(dòng)物細(xì)胞凋亡抗性的方法，包括在細(xì)胞中表達(dá)多瘤大T抗原或其功能等效物。35.權(quán)利要求34的方法，其中多瘤大T抗原由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞組成性表達(dá)。36.權(quán)利要求34的方法，其中多瘤大T抗原由嚙齒動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)。37.保持載體在嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中為游離型形似的方法，其包括在所述載體中含有EBV的復(fù)制起點(diǎn)和/或EBV的核抗原1——EBNA-1或其功能等效物。38.包含嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包含編碼多瘤大T抗原(PyLT)或其功能等效物的基因，其中該嚙齒動(dòng)物細(xì)胞不是CHO細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，特別是涉及利用多瘤病毒和EB病毒元件的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明利用多瘤病毒的大T抗原和復(fù)制起點(diǎn)以及EBV的EBV核抗原1(EBNA－1)和EBV復(fù)制起點(diǎn)。本發(fā)明提供蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力提高的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系。本發(fā)明也涉及真核細(xì)胞克隆和表達(dá)載體以及相關(guān)的方法，特別是涉及能高水平表達(dá)目的蛋白質(zhì)的DNA載體。本發(fā)明允許表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中長(zhǎng)期保持為游離型。本發(fā)明也涉及提高嚙齒動(dòng)物細(xì)胞凋亡抗性的方法，其包括表達(dá)多瘤大T抗原。文檔編號(hào)C12N15/85GK1910287SQ200480032915公開(kāi)日2007年2月7日申請(qǐng)日期2004年9月9日優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日發(fā)明者N-A·松斯特倫,R·庫(kù)納普拉朱申請(qǐng)人:艾塞特生物技術(shù)有限公司