專利名稱：α－1－磷酸化2－脫氧－2－氟阿拉伯糖苷和2′－脫氧－2′－氟－β－D－阿糖核苷的制 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷和將其作為中間體的2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷的制造方法。
背景技術(shù)：
近年來，將2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷(2′F-ANA)作為構(gòu)成成分的反義寡核苷酸由于其生物活性而非常受到關(guān)注(專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)1、2)。
2′F-ANA是已知化合物，其化學(xué)合成法已經(jīng)有報道(專利文獻(xiàn)2，非專利文獻(xiàn)3、4)。具體來說，由于難以從天然的核苷衍生得到2′F-ANA，因此通過1-鹵代糖衍生物和核酸堿基的取代反應(yīng)(縮合反應(yīng))來合成。但是，反應(yīng)液中除了β體之外還混雜了α體，為了得到高純度的2′F-ANA需要繁復(fù)的柱層析法等純化處理。
其中，2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷可以比較容易地合成，但是對于2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷，由于反應(yīng)液中混雜了復(fù)雜的異構(gòu)體(α體、β體、7位體、9位體等)，因此目前還未建立高效的合成法。
作為克服上述化學(xué)合成法的缺點的方法之一，提出了酶合成法。例如，可以使2-脫氧核糖的1位磷酸化糖的異構(gòu)化反應(yīng)的平衡傾斜，合成α-1-磷酸化糖衍生物，接著使用核苷磷酸化酶，制造目標(biāo)核苷(專利文獻(xiàn)3)。
然而，根據(jù)本發(fā)明者所知，1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷相對穩(wěn)定，不易使α體和β體的平衡向一個方向傾斜，難以將上述酶法用于2′F-ANA的制造。
另一方面，還報道有使用核苷磷酸化酶由2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷和嘌呤堿合成2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷的酶合成方法(專利文獻(xiàn)4)。
專利文獻(xiàn)1國際公開第99/67378號小冊子專利文獻(xiàn)2日本專利特公平7-23395號公報專利文獻(xiàn)3日本專利特開2002-205996號公報專利文獻(xiàn)4日本專利特開昭63-258891號公報非專利文獻(xiàn)1Biochemistry，41，3457(2002).
非專利文獻(xiàn)2Bioorg.Med.Chem.Lett.，12，2651，(2002).
非專利文獻(xiàn)3J.Org.Chem.，50，3644(1985).
非專利文獻(xiàn)4J.Org.Chem.，53，85(1988).
發(fā)明的揭示發(fā)明要解決的課題然而，上述酶法中，(i)使用化學(xué)合成的昂貴的2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷作為原料，(ii)目標(biāo)產(chǎn)物2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷的合成效率極差(相對于堿基的收率不足15％)，(iii)必須使用兩種核苷磷酸化酶，所以未必是令人滿意的方法。作為上述方法的低收率的主要原因，可以認(rèn)為是使用核苷磷酸化酶的2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷的磷酸分解反應(yīng)效率低。
因此，本發(fā)明的目的在于提供簡便且高立體選擇性、高收率地制造難以高收率且立體選擇性合成的2′F-ANA、特別是2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷的方法。本發(fā)明的目的特別是在于提供能夠以工業(yè)規(guī)模、簡便且高純度地制造以往極難合成的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鳥嘌呤。
解決課題的方法本發(fā)明者鑒于所述情況反復(fù)認(rèn)真研究后，得到以下發(fā)現(xiàn)，從而完成了本發(fā)明(i)1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷意外地在水溶液中穩(wěn)定，其α體可以充分用作核苷磷酸化酶的底物；(ii)通過將式(III)所示的2-脫氧-2-氟阿拉伯糖衍生物水解、磷酸化，可以立體選擇性地得到α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷；(iii)通過在強堿的存在下將式(III)所示的化合物磷酸化，可以得到與不成為核苷磷酸化酶的底物的β-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷相比、成為底物的α體的生成比例更高的αβ體化合物；(iv)通過不使用2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷，而使用1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷(α體或αβ體化合物)作為原料，不用兩種核苷磷酸化酶，就可以高收率地得到2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷。
即，本發(fā)明提供式(I)
所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷或其鹽。
此外，本發(fā)明還提供式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的立體選擇性的制造方法，其特征在于，將式(III) (式中，R1表示羥基的保護(hù)基，X表示離去基團。)所示的2-脫氧-2-氟-阿拉伯糖衍生物水解，立體選擇性地得到式(IV) (式中，R1與前述定義相同。)所示的α-1-羥基體，將式(IV)的化合物磷酸化，制得式(V) (式中，R1與前述定義相同，R2表示氫原子或磷酸殘基的保護(hù)基。)所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷衍生物，接著將羥基和/或磷酸殘基的保護(hù)基脫保護(hù)。
此外，本發(fā)明還提供式(V′)
所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ體混合物的制造方法，其特征在于，在強酸鹽的存在下，將式(III) (式中，R1表示羥基的保護(hù)基，X表示離去基團。)所示的2-脫氧-2-氟-阿拉伯糖衍生物磷酸化，得到式(V) (式中，R1與前述定義相同，R2表示氫原子或磷酸殘基的保護(hù)基。)所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷衍生物的αβ體混合物，接著將羥基和/或磷酸殘基的保護(hù)基脫保護(hù)。
此外，本發(fā)明還提供式(II) (式中，B表示堿基。)所示的2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶與式(I)
所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′) 所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ體混合物及堿基作用。
此外，本發(fā)明還提供式(VII) 所示的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鳥嘌呤的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶與式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′)
所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ體混合物及2-氨基-6-取代嘌呤作用，得到式(VI) (式中，Y表示取代基。)所示的2-氨基-6-取代-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤，將其用水解酶處理。
另外，本發(fā)明還提供式(VII) 所示的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鳥嘌呤的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶及核苷酶與式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′)
所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ體混合物及鳥嘌呤核苷5′-單磷酸作用。
發(fā)明的效果若采用本發(fā)明，則可以簡便且高立體選擇性、高收率地制造難以高收率且立體選擇性合成的2′F-ANA、特別是2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷。特別是，若采用本發(fā)明，則能夠以工業(yè)規(guī)模、簡便且高立體選擇性、高收率地制造以往極難合成的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鳥嘌呤。
因此，本發(fā)明的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷或其鹽、以及將其作為關(guān)鍵中間體的本發(fā)明的制造方法在反義藥品的工業(yè)制造中是有用的。
實施發(fā)明的最佳方式作為式(I)所示的化合物、即化合物(I)的鹽，沒有特別限定，可以例舉例如堿金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽、鎂鹽等)、有機堿鹽(例如三甲胺鹽、三乙胺鹽、吡啶鹽、甲基吡啶鹽、二環(huán)己基胺鹽等)、銨鹽等，較好是鈉鹽。
以下，對化合物(I)的代表性的制造方法進(jìn)行說明。
合成法1(α體)將化合物(III)的1位水解，立體選擇性地得到化合物(IV)的α體，將化合物(IV)的1位羥基磷酸化制成化合物(V)，將化合物(V)的羥基和/或磷酸殘基的保護(hù)基脫保護(hù)。
(式中，R1表示羥基的保護(hù)基，X表示離去基團，R2表示氫原子或磷酸殘基的保護(hù)基。)式(III)～式(V)中，作為R1所表示的羥基的保護(hù)基，可以例舉甲?；⒁阴；?、特戊?；?、苯甲?；忍荚訑?shù)1～10的?；?，芐基、對甲氧基芐基等碳原子數(shù)7～20的芳烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基等碳原子數(shù)1～20的烷基甲硅烷基。其中，較好是碳原子數(shù)1～10的酰基，特別好是苯甲?；?br>
作為X所表示的離去基團，可以例舉氯原子、溴原子、碘原子等鹵素原子，甲磺?；?、甲苯磺?；?、三氟甲烷磺?；柞；?、乙?；⑻匚祯；⒈郊柞；忍荚訑?shù)1～10的?；?，較好是鹵素原子，特別好是溴原子。
作為R2所表示的磷酸殘基的保護(hù)基可以例舉烯丙基或可具有取代基的烷基。作為烷基，可以例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基等碳原子數(shù)1～10的烷基。作為烷基的取代基，可以例舉例如2-氰乙基、2-三甲基硅烷基乙基、芐基等。
化合物(III)可以按照公知的方法(J.Org.Chem.，50，3644(1985)、J.Org.Chem.，53，85(1988)、日本專利特公平7-23395號公報)進(jìn)行合成。
化合物(III)1位的水解反應(yīng)于乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、四氫呋喃(THF)等有機溶劑中，在三丁胺、三乙胺等堿的存在下，相對于1摩爾化合物(III)使用1摩爾以上的堿和水進(jìn)行即可。反應(yīng)溫度較好是0～100℃，反應(yīng)時間較好是1～24小時左右。根據(jù)需要，可以-邊攪拌-邊使反應(yīng)進(jìn)行。
這樣得到的化合物(IV)根據(jù)需要通過常規(guī)的糖的純化方法，例如使用有機溶劑的分配、各種層析法處理來進(jìn)行純化，再供于下面的磷酸化反應(yīng)即可。
化合物(IV)1位的磷酸化反應(yīng)按公知的方法進(jìn)行即可?？梢岳e例如使用五價磷酸化劑進(jìn)行磷酸化的方法、使用三價磷酸化劑進(jìn)行亞磷酸化后進(jìn)行氧化的方法。
作為使用五價磷酸化劑的方法，具體來說，于乙腈、THF、二氯甲烷等有機溶劑中，在三丁胺、三乙胺、吡啶等堿的存在下，相對于1摩爾化合物(IV)使用1～10摩爾磷酰氯、鹵化單烷基膦酰、鹵化二烷基膦酰等磷酸化劑即可。反應(yīng)溫度較好是-78～120℃，反應(yīng)時間較好是1～24小時左右。
作為使用三價磷酸化劑的方法，具體來說，于乙腈、THF、二氯甲烷、1，4-二烷等有機溶劑中，在三丁胺、三乙胺、吡啶等堿的存在下，與三氯化磷、氯磷酰肼(chlorophosphordiamidite)等亞磷酸化劑反應(yīng)，接著與氰乙醇、烯丙醇等醇類反應(yīng)形成亞磷酸鹽，將其使用間氯過苯甲酸、叔丁基過氧化物、過氧化氫等氧化劑進(jìn)行氧化即可。相對于1摩爾化合物(IV)使用1～10摩爾磷酸化劑、醇類和氧化劑即可。反應(yīng)溫度較好是-78～120℃，反應(yīng)時間較好是1～24小時左右。
這樣得到的化合物(V)根據(jù)需要通過常規(guī)的糖的純化方法，例如使用有機溶劑的分配、各種層析法處理來進(jìn)行純化，再供于下面的脫保護(hù)反應(yīng)即可。
化合物(V)的羥基和/或磷酸殘基的保護(hù)基的除去根據(jù)所使用的保護(hù)基適當(dāng)選擇酸處理、堿處理、催化還原、氟化銨處理等通常使用的方法來進(jìn)行即可。
通過上述的方法得到的化合物(I)根據(jù)需要通過常規(guī)的糖的純化方法，例如使用有機溶劑的分配、各種層析法處理、結(jié)晶化等來進(jìn)行純化，再供于下面的酶反應(yīng)。
合成法2(αβ體混合物)在強酸鹽的存在下，將化合物(III)用磷酸化劑處理制成保護(hù)體αβ體混合物(V)即可。
磷酸化反應(yīng)于乙腈、二氯甲烷、DMF、甲基乙基酮等有機溶劑中，在三丁胺、三乙胺等堿的存在下，相對于1摩爾化合物(III)使其與1摩爾以上的正磷酸、磷酸單酯、磷酸二酯等磷酸衍生物反應(yīng)即可。反應(yīng)溫度較好是-78～120℃，反應(yīng)時間較好是1～24小時左右。
磷酸化時，強酸鹽特別好是相對于1摩爾化合物(III)添加0.1～20摩爾左右產(chǎn)生鹵素離子或硝酸根離子的強酸鹽。如表1所示，通過添加強酸鹽可以優(yōu)先于β體合成α體。
作為產(chǎn)生鹵素離子或硝酸根離子的強酸鹽，可以例舉碘化四正丁銨、碘化四乙銨、溴化四正丁銨、溴化四乙銨、氯化四正丁銨、氯化四乙銨等鹵素離子的銨鹽或金屬鹽，硝酸四正丁銨等硝酸根離子的銨鹽或金屬鹽。其中，較好是碘化四正丁銨、溴化四正丁銨、氯化四正丁銨、氯化四乙銨、硝酸四正丁銨。
得到的化合物(V)根據(jù)需要通過常規(guī)的糖的純化方法，例如使用有機溶劑的分配、各種層析法處理來進(jìn)行純化，再供于下面的脫保護(hù)反應(yīng)。
通過除去化合物(V)的羥基和/或磷酸殘基的保護(hù)基，可以得到化合物(I)中混雜其β體的αβ體混合物(V′)。
αβ體混合物(V′)的α/β比為1.9～2.6。保護(hù)基除去的條件根據(jù)所使用的保護(hù)基適當(dāng)選擇酸處理、堿處理、催化還原、氟化銨處理等通常使用的方法來進(jìn)行即可。
通過上述的方法得到的αβ體混合物根據(jù)需要通過常規(guī)的糖的純化方法，例如使用有機溶劑的分配、各種層析法處理、結(jié)晶化等來進(jìn)行純化，再供于下面的酶反應(yīng)。
接著，對于使核苷磷酸化酶同化合物(I)或αβ體混合物(V′)和堿基(B)作用、制造式(II)所表示的2′F-ANA的方法進(jìn)行說明。
作為反應(yīng)所使用的核苷磷酸化酶，只要是可以合成化合物(II)，沒有特別限定，特別好是嘌呤核苷磷酸化酶。這樣的核苷磷酸化酶、包括其制備方法是公知的，用該公知的方法可以容易地進(jìn)行制備。具體來說，核苷磷酸化酶不局限于特定的來源，動物來源、植物來源、微生物來源等所有來源的都可以使用。從制備的簡便性等角度來看，較好是微生物來源的核苷磷酸化酶。此外，所用的核苷磷酸化酶的基因被克隆了的情況下，也可以使用該克隆的核苷磷酸化酶基因，通過常規(guī)方法以大腸桿菌等作為宿主大量生產(chǎn)，通過該重組菌制備該酶。
這樣的核苷磷酸化酶只要具有該活性可以是任何形態(tài)。具體可以例舉微生物菌體、該菌體的處理物、由該處理物得到的酶制備產(chǎn)物等。
微生物菌體的制備可以通過使用該微生物可繁殖的培養(yǎng)基、以常規(guī)方法培養(yǎng)后用離心分離等收集菌體的方法來進(jìn)行。具體來說，如果以屬于芽孢桿菌屬或大腸桿菌類的細(xì)菌作為例子來說明，則可以使用肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％食鹽)、2xYT培養(yǎng)基(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％食鹽)等作為培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中接種種菌后，在約30～50℃下，根據(jù)需要一邊攪拌一邊培養(yǎng)約10～50小時左右，將得到的培養(yǎng)液離心分離收集微生物菌體，從而制備具有核苷磷酸化酶活性的微生物菌體。
作為微生物的菌體處理物，可以例舉將上述微生物菌體根據(jù)機械破壞(通過旋轉(zhuǎn)攪拌器(whirling blender)、細(xì)胞破碎儀(French press)、均化器、研缽等)、冷凍溶解、自體消化、干燥(通過冷凍干燥、風(fēng)干等)、酶處理(通過溶菌酶等)、超聲波處理、化學(xué)處理(通過酸、堿處理等)等一般的處理方法處理得到的菌體的破碎物或者菌體的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的變性物。
作為酶制備產(chǎn)物，可以使用由上述菌體處理物對具有核苷磷酸化酶活性的組分施以通常的酶純化方法，例如鹽析處理、等電點沉淀處理、有機溶劑沉淀處理、透析處理、各種層析法處理等，從而得到的粗酶或純化酶。
在反應(yīng)液中添加的堿基(B)根據(jù)合成的目標(biāo)使用市場上銷售的堿基、用公知的方法制備的堿基等即可。
作為堿基(B)，較好是嘌呤堿基或其衍生物。作為嘌呤堿基的衍生物，可以例舉具有選自鹵素原子、烷基、鹵代烷基、鏈烯基、鹵代鏈烯基、炔基、氨基、烷氨基、羥基、羥氨基、氨氧基、烷氧基、巰基、烷基巰基、芳基、芳氧基和氰基的取代基的化合物。取代基的數(shù)量和位置沒有特別限定。
作為鹵素原子，可以例舉氯原子、氟原子、碘原子、溴原子。
作為烷基，可以例舉甲基、乙基、正丙基等碳原子數(shù)1～6的烷基。
作為鹵代烷基，可以例舉氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、溴甲基、溴乙基等由上述鹵素原子取代的上述碳原子數(shù)1～6的烷基。
作為鏈烯基，可以例舉乙烯基、烯丙基等碳原子數(shù)2～7的鏈烯基。
作為鹵代鏈烯基，可以例舉溴乙烯基、氯乙烯基等由上述鹵素原子取代的碳原子數(shù)2～7的鏈烯基。
作為炔基，可以例舉乙炔基、丙炔基等碳原子數(shù)2～7的炔基。
作為烷氨基，可以例舉甲氨基、乙氨基、二乙氨基、二乙氨基等由上述碳原子數(shù)1～6的烷基取代的氨基。
作為烷氧基，可以例舉甲氧基、乙氧基、正丙氧基等碳原子數(shù)1～7的烷氧基。
作為烷基巰基，可以例舉甲基巰基、乙基巰基等具有上述碳原子數(shù)1～6的烷基的烷基巰基。
作為芳基，可以例舉苯基，甲苯基、乙苯基等由上述碳原子數(shù)1～6的烷基取代的烷基苯基，甲氧苯基、乙氧苯基等由上述碳原子數(shù)1～6的烷氧基取代的烷氧基苯基，二甲氨基苯基、二乙氨基苯基等由上述碳原子數(shù)1～6的烷氨基取代的烷氨基苯基，氯苯基、溴苯基等由鹵素原子取代的鹵代苯基等。
作為芳氧基，可以例舉具有上述芳基的基團。可以例舉例如苯氧基，甲苯氧基、乙苯氧基等由上述碳原子數(shù)1～6的烷基取代的烷基苯氧基，甲氧苯氧基、乙氧苯氧基等由上述碳原子數(shù)1～6的烷氧基取代的烷氧基苯氧基，二甲氨基苯氧基、二乙氨基苯氧基等由上述碳原子數(shù)1～6的烷氨基取代的烷氨基苯氧基，氯苯基、溴苯基等由鹵素原子取代的鹵代苯氧基等。
作為嘌呤堿基及其衍生物，可以例舉例如嘌呤、6-氨基嘌呤(腺嘌呤)、6-羥基嘌呤(次黃嘌呤)、6-氟嘌呤、6-氯嘌呤、6-甲氨基嘌呤、6-二甲氨基嘌呤、6-三氟甲氨基嘌呤、6-苯甲酰氨基嘌呤、6-乙酰氨基嘌呤、6-羥氨基嘌呤、6-氨氧基嘌呤、6-甲氧基嘌呤、6-乙酰氧基嘌呤、6-苯甲酰氧基嘌呤、6-甲基嘌呤、6-乙基嘌呤、6-三氟甲基嘌呤、6-苯基嘌呤、6-巰基嘌呤、6-甲基巰基嘌呤、6-氨基嘌呤-1-氧化物、6-羥基嘌呤-1-氧化物、2-氨基-6-羥基嘌呤(鳥嘌呤)、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-碘嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-巰基嘌呤、2-氨基-6-甲基巰基嘌呤、2-氨基-6-羥氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氨基-6-苯甲酰氧基嘌呤、2-氨基-6-乙酰氧基嘌呤、2-氨基-6-甲基嘌呤、2-氨基-6-環(huán)丙基氨基甲基嘌呤、2-氨基-6-苯基嘌呤、2-氨基-8-溴嘌呤、6-氰基嘌呤、6-氨基-2-氯嘌呤(2-氯腺嘌呤)、6-氨基-2-氟嘌呤(2-氟腺嘌呤)、6-氨基-3-脫氮嘌呤、6-氨基-8-氮雜嘌呤、2-氨基-6-羥基-8-氮雜嘌呤、6-氨基-7-脫氮嘌呤、6-氨基-1-脫氮嘌呤、6-氨基-2-氮雜嘌呤等。
2′F-ANA可以如下進(jìn)行合成在Tris鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液等緩沖液中，向化合物(I)或其αβ體混合物(V′)和上述堿基(B)添加約5單位/mL以上、較好是約50單位/mL以上的核苷磷酸化酶?；衔?I)或其αβ體混合物(V′)的使用量較好是約1～200mM，特別好是10～100mM。相對于化合物(I)的堿基(B)的使用量較好是在1當(dāng)量以上，特別好是約2～5摩爾倍當(dāng)量左右。反應(yīng)時間較好是20～70℃，特別好是40～60℃。反應(yīng)時間較好是約1～100小時左右。根據(jù)需要，可以一邊攪拌一邊使反應(yīng)進(jìn)行。
接著，對使用上述制造方法的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鳥嘌呤、即混合物(VII)的制造進(jìn)行具體說明。
在化合物(I)或αβ體混合物(V′)和2-氨基-6-取代嘌呤中添加與上述同樣的核苷磷酸化酶，得到化合物(VI)，將其用水解酶處理即可。
作為反應(yīng)中所使用的2-氨基-6-取代嘌呤，只要是2-氨基-6-取代嘌呤的取代基Y為可水解的基團的嘌呤衍生物，沒有特別限定。作為取代基Y，可以例舉氯原子、溴原子、碘原子等鹵素原子，氨基，羥基，巰基，甲基巰基，羥氨基，甲氧基，苯甲酰氧基，乙酰氧基等。作為2-氨基-6-取代嘌呤的具體例子，可以例舉2-氨基-6-鹵代嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-羥基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-碘嘌呤、2-氨基-6-巰基嘌呤、2-氨基-6-甲基巰基嘌呤、2-氨基-6-羥氨基嘌呤、2-氨基-6-苯甲?；堰?、2-氨基-6-乙酰氧基嘌呤，特別好是2，6-二氨基嘌呤。
作為水解酶，只要具有可以通過水解2-氨基-6-取代嘌呤或具有它的核苷的6位的取代基、生成2-氨基-6-氧嘌呤(鳥嘌呤)或具有它核苷的活性，沒有特別限定。作為這樣的水解酶，可以例舉脫氨基酶，特別好是腺苷脫氨基酶。
使用水解酶的脫氨反應(yīng)，具體來說，在磷酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液等緩沖液中，添加約5單位/mL以上、較好是約30單位/mL以上的水解酶即可。反應(yīng)溫度較好是20～70℃，反應(yīng)時間較好是約1～100小時左右。根據(jù)需要，可以-邊攪拌-邊使反應(yīng)進(jìn)行。
使用水解酶的脫氨反應(yīng)可以在上述使用核苷磷酸化酶的反應(yīng)之后進(jìn)行，或者同時進(jìn)行。
此外，化合物(VII)也可以通過在化合物(I)或αβ體混合物(V′)和5′-單磷酸中添加核苷磷酸化酶及核苷酶來制造。反應(yīng)可以如下進(jìn)行實施在Tris鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液等緩沖液中，各添加約5單位/mL以上的核苷磷酸化酶及核苷酶，在20～70℃下，反應(yīng)約1～100小時左右，根據(jù)需要進(jìn)行攪拌。
作為反應(yīng)中所使用的核苷酶，只要具有可以將核苷酸水解成核酸堿基和糖磷酸的活性即可，具體可以例舉次黃嘌呤核苷酸核苷酶(Bull.Agric.Chem.Soc.Japan，23，281-288(1959))。可以使用與上述同樣的核苷磷酸化酶。
這樣得到的化合物(VII)可以通過通常的核苷分離純化方法，例如離子交換層析法、吸附層析法、結(jié)晶化等來進(jìn)行分離純化。
實施例以下，通過合成例對本發(fā)明更具體地進(jìn)行說明，但是本發(fā)明并不限定于以下的實施例的范圍內(nèi)。
合成例13，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H]將磷酸(5.0g，51mmol)、分子篩4A(3.6g)懸浮于乙腈(18mL)中，在0℃下加入三正丁基胺(24.3mL，102mmol)，于室溫下攪拌1小時。在室溫下加入碘化四正丁基銨(15.7g，42.5mmol)，10分鐘后，再滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](3.59g，8.5mmol)的乙腈溶液(36mL)。在室溫下攪拌2小時后，過濾除去不溶物。將濾液在減壓條件下濃縮，用乙酸乙酯(150mL)對殘渣進(jìn)行萃取。將有機層用0.1N鹽酸洗滌3次，用無水硫酸鈉干燥，將溶劑蒸發(fā)除去。
對標(biāo)題化合物用HPLC[UV230nm，分析柱SHISEIDO CAPCELL PAK NH2(4.6mmI.D.×250mm)，柱溫度30℃，移動相60mM KH2PO4(50％)-乙腈(50％)，pH4.0(H3PO4)，流速1.0mL/min]進(jìn)行分析，以面積％算出1-磷酸衍生物的生成率和α/β比。生成率為60.3％，α/β＝3.4。
將殘渣溶解于甲基乙基酮(90mL)，加入磷酸(13.3g)、分子篩4A(3.6g)，在80℃下攪拌2小時。過濾除去不溶物后，將溶劑蒸發(fā)除去。用乙酸乙酯(150mL)對殘渣進(jìn)行萃取。將有機層用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥后，將溶劑蒸發(fā)除去。HPLC分析生成率為60.5％，α/β＝4.9。
再將殘渣用反相ODS層析法(600mL，5～40％乙腈-水)純化，作為與β體的混合物得到2.91g(41％)標(biāo)題化合物(其中，相對于1摩爾標(biāo)題化合物含有0.6摩爾的三正丁銨和0.1摩爾的四正丁銨)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm8.07-8.02(4H，m)，7.51-7.36(6H，m)，5.99(1H，dd，J＝5.6，8.6Hz)，5.46(1H，dd，J＝4.3，22.9Hz)，5.30(1H，d，J＝49.1Hz)，4.74-4.57(3H，m).
合成例23，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H]在1.0M的磷酸/三正丁胺的乙腈溶液(0.75mL)中加入分子篩4A(50mg)以及以下的表1中所示的強酸鹽(各0.6mmol)，在室溫下攪拌40分鐘。向其中滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](50mg，0.12mmol)的乙腈溶液(0.5mL)。
HPLC分析保留時間，α體為3.8分，β體為4.4分。
其結(jié)果示于表1。由表1可知，通過添加強酸鹽，α體的生成比例提高。
合成例33，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿拉伯糖[式IVR1＝Bz]將3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](2.40g，5.7mmol)溶解于DMF(50mL)，加入三乙胺(4.8mL，34.2mmol)、水(3.1mL，171mmol)，在室溫下攪拌30分鐘。在減壓條件下蒸發(fā)除去溶劑，用乙酸乙酯對殘渣進(jìn)行萃取，將有機層用水、飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水進(jìn)行洗滌。再用無水硫酸鈉干燥后，將溶劑蒸發(fā)除去。將殘渣用硅膠柱層析法(150g，0～5％甲醇-三氯甲烷)純化，得到1.85g(90％)標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm8.08-8.01(4H，m)，7.63-7.41(6H，m)，5.70(1H，dd，J＝3.6，10.2Hz)，5.50(1H，dd，J＝4.3，22.0Hz)，5.18(1H，d，J＝49.1Hz)，4.77-4.60(3H，m)，2.89(1H，t，J＝3.4Hz).
合成例43，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-(二-2-氰乙基)磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝CH2CH2CN]將3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿拉伯糖[IVR1＝Bz](1.01g，2.8mmol)用乙腈共沸脫水2次，溶解于乙腈(20mL)，加入三乙胺(1.2mL，8.4mmol)和二(二異丙氨基)氯膦(1.69g，5.6mmol)，在室溫下攪拌1小時。向其中加入2-氰乙醇(1.9mL，28mmol)和1H-四唑(0.98g，14mmol)，在室溫下攪拌1.5小時。再加入70％叔丁基過氧化氫溶液(2.5mL)，在室溫下攪拌30分鐘。用乙酸乙酯(100mL)對殘渣進(jìn)行萃取，將有機層用水洗滌2次，用硫代硫酸鈉水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和食鹽水分別洗滌1次。用無水硫酸鈉干燥后，將溶劑在減壓條件下蒸發(fā)除去。將殘渣用硅膠柱層析法(70g，50～100％乙酸乙酯-正己烷)純化，得到0.78g(51％)標(biāo)題化合物。
1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm8.07-8.05(4H，m)，7.65-7.43(6H，m)，6.14(1H，dd，J＝4.2，8.3Hz)，5.56(1H，dd，J＝3.9，20.9Hz)，5.34(1H，d，J＝48.4Hz)，4.82(1H，q，J＝3.9Hz)，4.78(1H，dd，J＝3.5，12.2Hz)，4.68(1H，dd，J＝4.6，12.2Hz)，4.37-4.27(4H，m)，2.78-2.68(4H，m).
合成例53，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H]將3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-(二-2-氰乙基)磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝CH2CH2CN](85mg，0.16mmol)溶解于二氯甲烷(3mL)，加入DBU(0.25mL，1.6mmol)，在室溫下攪拌10分鐘。向其中加入氯三甲基硅烷(0.1mL，0.8mmol)，在室溫下攪拌1小時。用三氯甲烷對反應(yīng)液進(jìn)行萃取，將有機層用0.1N鹽酸洗滌后，用無水硫酸鈉干燥。將殘渣溶解于乙酸乙酯(0.5mL)，向其中滴加正己烷(5mL)。除去上清液，將殘渣進(jìn)行真空干燥，得到71mg(89％)標(biāo)題化合物(其中，相對于1摩爾標(biāo)題化合物，含有0.4摩爾的DBU)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm8.07-8.02(4H，m)，7.51-7.36(6H，m)，5.99(1H，dd，J＝5.6，8.6Hz)，5.46(1H，dd，J＝4.3，22.9Hz)，5.30(1H，d，J＝49.1Hz)，4.74-4.57(3H，m).
合成例62-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯二鈉鹽[式I]將合成例4中合成的3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-(二-2-氰乙基)磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝CH2CH2CN](590mg，1.08mmol)溶解于甲醇-THF(1∶1，6mL)，加入28％氨水(6mL)，在室溫下攪拌1小時。將溶劑蒸發(fā)除去后，加入28％氨水(10mL)，在室溫下攪拌-晚。將溶劑蒸發(fā)除去，向殘渣中加入水(20mL)，將其用乙酸乙酯(20mL)洗滌。回收水層，制成100mL水溶液。使其通過陽離子交換樹脂(三菱化學(xué)公司制，PK216，Na型，30mL)，將水蒸發(fā)除去，得到273mg(99％)標(biāo)題化合物。
1H-NMR(D2O，500MHz)δppm5.70(1H，dd，J＝6.9，9.8Hz)，5.02(1H，d，J＝50.5Hz)，4.26-4.17(2H，m)，3.87(1H，dd，J＝3.2，12.4Hz)，3.74(1H，dd，5.3，12.4Hz).
合成例72-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I]將合成例1中合成的3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H](2.8g，作為α體3.38mmol)溶解于甲醇(70mL)，加入28％氨水(70mL)，在室溫下攪拌1.5小時。再加入28％氨水(70mL)，在室溫下攪拌一晚。在減壓條件下將溶劑蒸發(fā)除去，將殘渣溶解于水(50mL)中。將其用乙酸乙酯(100mL)洗滌2次，回收水層。在減壓條件下濃縮水，用膜濾器(PTFE，0.45μm)過濾后，將濾液濃縮。在殘渣中加入丙酮(10mL，2次)，除去上清液。將殘渣用乙醇共沸2次，在減壓條件下于50℃干燥2小時，得到1.36g粗制標(biāo)題化合物。
1H-NMR(D2O，500MHz)δppm5.71(1H，dd，J＝6.9，9.9Hz)，5.02(1H，d，J＝50.3Hz)，4.27-4.18(2H，m)，3.88-3.71(2H，m).
合成例89-(2-氟-β-D-阿糖基)腺嘌呤[式IIB＝腺嘌呤]在1.0M磷酸/三正丁胺的乙腈溶液(2.8mL，2.8mmol)中加入分子篩4A(126mg)和三正丁胺(0.67mL，2.8mmol)，在室溫下攪拌1小時。在室溫下加入碘化四正丁基銨(0.87g，2.4mmol)，再過10分鐘后，滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](0.2g，0.47mmol)的乙腈溶液(2mL)。在室溫下攪拌2小時后，過濾除去不溶物。在減壓條件下濃縮濾液，用乙酸乙酯(20mL)對殘渣進(jìn)行萃取。將有機層用0.1N鹽酸洗滌3次，用無水硫酸鈉干燥，將溶劑蒸發(fā)除去。將殘渣溶解于甲基乙基酮(5mL)中，加入磷酸(0.74g)、分子篩4A(0.2g)，在80℃下攪拌3小時。過濾除去不溶物后，將溶劑蒸發(fā)除去。用乙酸乙酯(20mL)對殘渣進(jìn)行萃取。將有機層用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥后，將溶劑蒸發(fā)除去，得到粗制標(biāo)題化合物(HPLC分析生成率為56.4％，α/β＝7.3)。
將其溶解于甲醇(4mL)，加入28％氨水(2mL)，在室溫下攪拌1小時。再加入28％氨水(2mL)，在室溫下攪拌一晚。在減壓條件下將溶劑蒸發(fā)除去，將殘渣溶解于水(20mL)。將其用乙酸乙酯(20mL)洗滌2次，回收水層。在減壓條件下將水濃縮，將殘渣溶解于20mM磷酸鉀緩沖液(20mL，pH7.6)，加入腺嘌呤(54mg，0.4mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，1750單位)，在50℃下靜置4天。將反應(yīng)液用膜濾器(PTFE，0.45μm)過濾，將濾液調(diào)整至40mL的水溶液后，用反相ODS層析法(40mL，0～5％乙腈-水)純化，以無色的結(jié)晶形式得到50mg標(biāo)題化合物(相對腺嘌呤收率46％)。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm8.26(1H，d，J＝1.7Hz)，8.17(1H，s)，7.36(2H，brs)，6.41(1H，dd，J＝4.6，14.1Hz)，6.15(1H，br)，5.25(1H，br)，5.22(1H，dt，J＝4.3，52.7Hz)，4.47(1H，dt，J＝4.5，19.4Hz)，3.86-3.84(1H，m)，3.68-3.63(2H，m).
合成例99-(2-氟-β-D-阿糖基)腺嘌呤[式IIB＝腺嘌呤]
將磷酸(2.8g，28.2mmol)、分子篩4A(2.0g)懸浮于乙腈(10mL)中，在0℃下加入三正丁胺(13.4mL，56.4mmol)，在室溫下攪拌1小時。在室溫下加入碘化四正丁基銨(8.7g，23.5mmol)，再過10分鐘后，滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](2.0g，4.7mmol)的乙腈溶液(20mL)。在室溫下攪拌2小時后，過濾除去不溶物。在減壓條件下濃縮濾液，用乙酸乙酯(150mL)對殘渣進(jìn)行萃取。將有機層用0.1N鹽酸洗滌3次，用無水硫酸鈉干燥，將溶劑蒸發(fā)除去。將殘渣溶解于甲基乙基酮(50mL)中，加入磷酸(7.4g)、分子篩4A(2.0g)，在80℃下攪拌2小時。過濾除去不溶物后，將溶劑蒸發(fā)除去。用乙酸乙酯(150mL)對殘渣進(jìn)行萃取。將有機層用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥后，將溶劑蒸發(fā)除去(HPLC分析生成率為67.4％，α/β＝3.1)。
將其溶解于甲醇(40mL)，加入28％氨水(20mL)，在室溫下攪拌1小時。再加入28％氨水(20mL)，在室溫下攪拌一晚。在減壓條件下將溶劑蒸發(fā)除去，將殘渣溶解于水(50mL)。將其用乙酸乙酯(200mL)洗滌2次，回收水層。在減壓條件下將水濃縮，得到粗制的標(biāo)題化合物。
將1/2量的該粗制的標(biāo)題化合物溶解于20mM磷酸鉀緩沖液(100mL，pH7.6)，加入腺嘌呤(270mg，2.0mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，2000單位)，在50℃下靜置6天。將反應(yīng)液用膜濾器(PTFE，0.45μm)過濾，將濾液調(diào)整至150mL的水溶液后，用反相ODS柱層析法(200mL，0～5％乙腈-水)純化，以無色的結(jié)晶形式得到181mg標(biāo)題化合物(相對腺嘌呤收率34％)。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm8.26(1H，d，J＝1.7Hz)，8.17(1H，s)，7.36(2H，brs)，6.41(1H，dd，J＝4.6，14.1Hz)，6.15(1H，br)，5.25(1H，br)，5.22(1H，dt，J＝4.3，52.7Hz)，4.47(1H，dt，J＝4.5，19.4Hz)，3.86-3.84(1H，m)，3.68-3.63(2H，m).
合成例102，6-二氨基-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤[式IIB＝2，6-二氨基嘌呤]將1/2量的合成例9中得到的粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I]溶解于20mM磷酸鉀緩沖液(100mL，pH7.6)，加入2，6-二氨基嘌呤(300mg，2.0mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，2000單位)，在50℃下靜置6天。將反應(yīng)液用膜濾器(PTFE，0.45μm)過濾，將濾液調(diào)整至150mL的水溶液后，用反相ODS柱層析法(200mL，0～3％乙腈-水)純化，以無色的結(jié)晶形式得到228mg標(biāo)題化合物(相對2，6-二氨基嘌呤收率40％)。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm7.81(1H，d，J＝2.4Hz)，6.79(2H，brs)，6.18(1H，dd，J＝4.2，16.5Hz)，5.89(3H，brs)，5.20(1H，br)，5.10(1H，dt，J＝3.7，52.6Hz)，4.39(1H，ddd，J＝3.7，4.5，18.2Hz)，3.82-3.80(1H，m)，3.79-3.60(2H，m).
合成例119-(2-氟-β-D-阿糖基)鳥嘌呤[式IIB＝鳥嘌呤]將2，6-二氨基-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤(61.2mg，0.21mmol)溶解于50mMTris鹽酸緩沖液(20mL，pH7.0)，加入腺嘌呤脫氨基酶(71單位)，在室溫下攪拌1.5小時。將反應(yīng)液用膜濾器(PTFE，0.5μm)過濾，調(diào)整至60mL的水溶液。將其用反相ODS柱層析法(80mL，0～2％乙腈-水)純化，以無色的結(jié)晶形式得到60.4mg標(biāo)題化合物(收率100％)。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm10.50(1H，brs)，7.80(1H，s)，6.54(2H，brs)，6.13(1H，dd，J＝4.2，16.0Hz)，5.94(1H，d，J＝4.5Hz)，5.11(1H，dt，J＝3.8，52.4Hz)，5.08(1H，t，J＝5.7Hz)，4.37(1H，dd，J＝3.9，17.8Hz)，3.82-3.79(1H，m)，3.66-3.57(2H，m).
合成例122-氨基-6-氯-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤[式IIB＝2-氨基-6-氯嘌呤]將實施例7中得到的粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I](200mg，0.5mmol)溶解于50mM磷酸鉀緩沖液(150mL，pH7.5)，加入2-氨基-6-氯嘌呤(170mg，1.0mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，3519單位)，在50℃下靜置14天。將反應(yīng)液用膜濾器(PTFE，0.45μm)過濾，將濾液調(diào)整至10mL的水溶液后，用反相ODS柱層析法(20mL，0～5％乙腈-水)純化，得到標(biāo)題化合物。
1H-NMR(D2O，500MHz)δppm8.20(1H，s)，6.31(1H，dd，J＝3.9，17.4Hz)，5.24(1H，dt，J＝3.1，51.2Hz)，4.56(1H，dt，J＝2.2，18.2Hz)，4.10-4.07(1H，m)，3.92-3.82(2H，m).
合成例132-氨基-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤[式IIB＝2-氨基嘌呤]將合成例7中得到的粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I](200mg，0.5mmol)溶解于50mM磷酸鉀緩沖液(150mL，pH7.5)，加入2-氨基嘌呤(135mg，1.0mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，1517單位)，在50℃下靜置9天。將反應(yīng)液用膜濾器(PTFE，0.45μm)過濾，將濾液調(diào)整至6mL的水溶液后，用反相ODS柱層析法(40mL，0～5％乙腈-水)純化，得到87.3mg(相對于2-氨基嘌呤收率32％)標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm8.63(1H，s)，8.18(1H，d，J＝2.2Hz)，6.64(2H，brs)，6.50(1H，br)，6.31(1H，dd，J＝4.4，15.2Hz)，5.19(1H，dt，J＝4.1，52.6Hz)，5.15(1H，br)，4.43(1H，ddd，J＝4.0，4.9，18.3Hz)，3.85(1H，q，J＝4.9Hz)，3.70-3.62(2H，m).
合成例142-氟-9-(2-氟-β-D-阿糖基)腺嘌呤[式IIB＝2-氟腺嘌呤]將合成例7中得到的粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I](76mg，0.2mmol)溶解于5mM Tris鹽酸緩沖液(60mL，pH7.5)，加入2-氟腺嘌呤(44mg，0.3mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，722單位)，在50℃下靜置5天。將反應(yīng)液用膜濾器(PTFE，0.45μm)過濾，將濾液調(diào)整至30mL的水溶液后，用反相ODS柱層析法(40mL，0～5％乙腈-水)純化，得到39.0mg(相對于2-氟腺嘌呤收率45％)標(biāo)題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm8.24(1H，d，J＝1.9Hz)，8.00-7.80(2H，m)，6.29(1H，dd，J＝4.6，13.8Hz)，5.98(1H，d，J＝5.1Hz)，5.22(1H，dt，J＝4.2，52.6Hz)，5.10(1H，t，J＝5.6Hz)，4.43(1H，ddd，J＝5.0，9.4，18.9Hz)，3.85(1H，dd，J＝4.9，9.6Hz)，3.71-3.61(2H，m).
合成例159-(2-氟-β-D-阿糖基)鳥嘌呤[式IIB＝鳥嘌呤]將磷酸(48.1g，0.49mol)、分子篩4A(38g)懸浮于乙腈(160mL)中，在0℃下加入三正丁胺(233.9mL，0.98mol)，在室溫下攪拌1小時。在室溫下加入碘化四正丁基銨(151.0g，0.41mol)，再10分鐘后，滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](34.62g，0.82mol)的乙腈溶液(240mL)。在室溫下攪拌2小時后，過濾除去不溶物。在減壓條件下濃縮濾液，在殘渣中加水(200mL)，用乙酸乙酯(600mL)對殘渣萃取2次。將有機層用無水硫酸鈉干燥，將溶劑蒸發(fā)除去。將殘渣溶解于甲基乙基酮(830mL)中，加入磷酸(110.6g)，在80℃下攪拌2小時。將溶劑蒸發(fā)除去，向殘渣中加水(1L)，用乙酸乙酯(1L)對殘渣萃取2次。將有機層用無水硫酸鈉干燥后，將溶劑蒸發(fā)除去，得到粗制3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H]。
將其溶解于甲醇(600mL)，加入28％氨水(300mL)，在室溫下攪拌1.5小時。再加入28％氨水(300mL)，在室溫下攪拌一晚。在減壓條件下將溶劑蒸發(fā)除去，將殘渣溶解于水(500mL)。將其用乙酸乙酯(800mL)洗滌2次，回收水層。在減壓條件下將水濃縮，用膜濾器(PTFE，0.45μm)過濾后，加水得到粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I]的水溶液(2.5L，pH7.5)。
向其中加入2，6-二氨基嘌呤(15.4g，0.1mol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，108300單位)，在50℃下靜置10天。將反應(yīng)液用稀鹽酸調(diào)整至pH4，用硅藻土過濾除去沉淀物。將濾液用吸附樹脂柱(三菱化學(xué)公司制，SP206，1.4L，0～20％乙醇-水)純化，濃縮得到2，6-二氨基-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤[式IIB＝2，6-二氨基嘌呤]的水溶液(3.1L)。
向其中加入磷酸二氫鉀(8.4g)，用1N氫氧化鉀調(diào)整至pH7.3后，加入腺嘌呤脫氨基酶(2000單位)，在40℃下靜置3小時。將反應(yīng)液用稀鹽酸調(diào)整至pH4，用吸附樹脂柱(三菱化學(xué)公司制，SP206，1.9L，0～15％乙醇-水)純化，以無色結(jié)晶形式得到7.8g標(biāo)題化合物(HPLC純度99％，相對于2，6-二氨基嘌呤收率27％)。
參考例1(1)嘌呤核苷磷酸化酶的制備在含有20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L氯化鈉、1g/L葡萄糖、100μg/mL氨芐青霉素的100mL營養(yǎng)培養(yǎng)基中，接種帶有按照日本專利特開平9-117298號公報所記載的方法制備的重組載體pTrc-B56的大腸桿菌JM109“pTrc-B56”，在37℃下振蕩培養(yǎng)。
在達(dá)到4×108個/mL時，在培養(yǎng)液中添加IPTG，使最終濃度為1mmol/L，再于37℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離(9000×g，10分鐘)回收培養(yǎng)菌體，懸浮于20mL的緩沖液(含有50mmol/L Tris鹽酸緩沖液(pH7.8)、5mmol/L EDTA、0.1％Triton X100)。通過在菌體懸浮液中加入溶菌酶，使最終濃度達(dá)到1mg/mL，在37℃下保溫1小時，將性狀轉(zhuǎn)化體溶菌，再通過離心分離(12000×g，10分鐘)除去菌體殘渣。將這樣得到的上清部分作為酶液。
(2)腺苷脫氨基酶的制備在含有20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L氯化鈉、1g/L葡萄糖、100μg/mL氨芐青霉素的100mL營養(yǎng)培養(yǎng)基中，接種帶有按照日本專利特開平5-219978號公報所記載的方法制備的重組載體pDR-add的大腸桿菌性狀轉(zhuǎn)化體JM105“pDR-add”，在37℃下振蕩培養(yǎng)。
在達(dá)到4×108個/mL時，在培養(yǎng)液中添加IPTG，使最終濃度為0.1mmol/L，再于37℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離(9000×g，10分鐘)回收培養(yǎng)菌體，懸浮于10mL的緩沖液(20mmol/L Tris鹽酸緩沖液(pH8.2)、10％乙二醇)。將菌體懸浮液用超聲波破碎機進(jìn)行處理，再通過離心分離(2000×g，10分鐘)除去菌體殘渣。將這樣得到的上清部分作為酶液。
權(quán)利要求
1.式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷或其鹽。
2.式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的立體選擇性的制造方法，其特征在于，將式(III) 所示的2-脫氧-2-氟-阿拉伯糖衍生物水解，立體選擇性地得到式(IV) 所示的α-1-羥基體，將式(IV)的化合物磷酸化，制得式(V) 所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷衍生物，接著將羥基和/或磷酸殘基的保護(hù)基脫保護(hù)；式中，R1表示羥基的保護(hù)基，X表示離去基團，R2表示氫原子或磷酸殘基的保護(hù)基。
3.式(V′) 所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ體混合物的制造方法，其特征在于，在強酸鹽的存在下，將式(III) 所示的2-脫氧-2-氟-阿拉伯糖衍生物磷酸化，得到式(V) 所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷衍生物的αβ體混合物，接著將羥基和/或磷酸殘基的保護(hù)基脫保護(hù)；式中，R1表示羥基的保護(hù)基，X表示離去基團，R2表示氫原子或磷酸殘基的保護(hù)基。
4.如權(quán)利要求3所述的制造方法，其特征還在于，使用產(chǎn)生鹵素離子或硝酸根離子的強酸鹽。
5.式(II) 所示的2′-脫氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶與式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′) 所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ體混合物及堿基作用；式中，B表示堿基。
6.如權(quán)利要求5所述的制造方法，其特征還在于，堿基是嘌呤堿基，或者具有選自鹵素原子、烷基、鹵代烷基、鏈烯基、鹵代鏈烯基、炔基、氨基、烷氨基、羥基、羥氨基、氨氧基、烷氧基、巰基、烷基巰基、芳基、芳氧基和氰基的取代基的嘌呤堿基。
7.如權(quán)利要求5或6所述的制造方法，其特征還在于，核苷磷酸化酶是嘌呤核苷磷酸化酶。
8.式(VII) 所示的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鳥嘌呤的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶與式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′) 所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ體混合物及2-氨基-6-取代嘌呤作用，得到式(VI) 所示的2-氨基-6-取代-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤，將其用水解酶處理；式中，Y表示取代基。
9.如權(quán)利要求8所述的制造方法，其特征還在于，2-氨基-6-取代嘌呤為2，6-二氨基嘌呤。
10.如權(quán)利要求8或9所述的制造方法，其特征還在于，水解酶為脫氨基酶。
11.式(VII) 所示的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鳥嘌呤的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶及核苷酶與式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′) 所示的1-磷酸化2-脫氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ體混合物及鳥嘌呤核苷5′-單磷酸作用。
12.如權(quán)利要求11所述的制造方法，其特征還在于，核苷磷酸化酶為嘌呤核苷磷酸化酶。
13.如權(quán)利要求11或12所述的制造方法，其特征還在于，核苷酶為次黃嘌呤核苷酸核苷酶。
全文摘要
可以簡便且高立體選擇性、高收率地制造式(II)所示的2′－脫氧－2′－氟－β－D－阿糖核苷、特別是2′－脫氧－2′－氟－β－D－阿糖嘌呤核苷，其特征在于，使核苷磷酸化酶與式(I)所示的α－1－磷酸化2－脫氧－2－氟阿拉伯糖苷或式(V′)所示的1－磷酸化2－脫氧－2－氟阿拉伯糖苷的αβ體混合物及堿基作用；式中，B表示堿基。
文檔編號C12P19/40GK1867576SQ200480030618
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者山田浩平, 松本倫毅, 早川弘之 申請人:雅瑪山醬油株式會社