專利名稱：三肽基氨肽酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三肽基氨肽酶(TPAP)，一種編碼該TPAP的DNA結(jié)構(gòu)，一種生產(chǎn)TPAP的方法和在不需要TPAP活性的細(xì)胞中減少TPAP產(chǎn)量的方法。
三肽基氨肽酶是能夠裂解來自肽、寡肽或蛋白質(zhì)的未取代的N-末端的片段的酶。三肽基氨肽酶可以是非特異性的，即能夠裂解來自所述未取代的N-末端的任何三肽序列；或者是特異性的，即能夠裂解特殊類型的三肽序列。
此前已報(bào)導(dǎo)過來源于動(dòng)物的三肽基氨肽酶。例如，Doebber等(1978)披露了一種自牛腦垂體中提取的三肽基氨肽酶(Endocrinology1031794-1804)，已證實(shí)其能夠裂解來自牛生長(zhǎng)激素N-末端的三肽。在Mammalian Protease Vol.2，Exopeptidases(AP 1986，作者J.K.McDonald和A.J.Barrett)中，披露了分別自牛腦垂體、受孕的豬卵巢和豬脾中提取的三肽基氨肽酶。
Krieger等披露了一種自鉛色鏈霉菌(Streptomyces lividans)66中提取的一種細(xì)菌三肽基氨肽酶(Febs Letters Vol.352，No.3，pp385-388，1994)。Butler等披露了編碼所述氨肽酶的基因及其推定的氨基酸序列(Applied and Environmental Micrology，1995年8月，P.3145-3150)。這種肽酶被鑒定為絲氨酸蛋白酶，其最佳pH為7.5～8.5。
眾所周知，由微生物生產(chǎn)的制品如酶或其它蛋白的穩(wěn)定性會(huì)變化，特別是受生產(chǎn)所述制品的方法和/或所述制品的來源或微生物生產(chǎn)菌的影響。例如，由微生物生產(chǎn)的制品的穩(wěn)定性的降低，可能是由對(duì)熱、光或其它外界條件的抗性的降低所致，或是由所述制品本身的組成所致。就此而言，即使有微量的蛋白酶活性存在于蛋白質(zhì)制品中也會(huì)導(dǎo)致該蛋白制品的穩(wěn)定性明顯下降。不過，通常不能夠正確鑒定所述穩(wěn)定性變化的原因。
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，有多種真菌菌種能夠產(chǎn)生TPAP，而且，由這些微生物所產(chǎn)生的蛋白制品可能含有微量的TPAP，在某些情況下已發(fā)現(xiàn)TPAP能導(dǎo)致該蛋白制品穩(wěn)定性的降低。本發(fā)明人已成功地提取并鑒定了所述TPAP。已證實(shí)TPAP能夠非特異性地裂解來自蛋白制品的未取代的N-末端的三肽，這種裂解在某些情況下是需要的，但在另一些情況下卻很不需要(例如，當(dāng)導(dǎo)致含有TPAP的蛋白制品的穩(wěn)定性降低時(shí))。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可用于裂解肽或蛋白序列的基本純凈的三肽基肽酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)基本上不含TPAP的蛋白制品的方法，特別是生產(chǎn)那些為TPAP底物的蛋白制品，TPAP的存在會(huì)使這種制品的穩(wěn)定性下降。
在第一個(gè)大的方面，本發(fā)明涉及一種自真菌中提取的TPAP。具體地講，TPAP可得自真菌曲霉菌的菌株。另一方面，本發(fā)明涉及通過氨基酸和/或DNA序列資料和/或通過酶蛋白特征鑒定的TPAP，涉及編碼該TPAP的DNA結(jié)構(gòu)，還涉及這樣一種DNA結(jié)構(gòu)它包括一段與所述編碼TPAP的部分DNA序列互補(bǔ)到足于與該序列雜交的程度的核苷酸序列，從而破壞特定宿主細(xì)胞的TPAP生產(chǎn)能力。
在另一個(gè)重要方面，本發(fā)明涉及一種降低產(chǎn)TPAP細(xì)胞的TPAP產(chǎn)量的方法，在該方法中，對(duì)存在于所述細(xì)胞中的、為TPAP表達(dá)所必須的一段DNA序列進(jìn)行修飾或使其失活，以便降低該細(xì)胞的TPAP產(chǎn)量。
定義在本文中，“TPAP”用來表示一種氨肽酶，它能裂解來自肽或蛋白序列的N-末端三肽，例如，來自一種伸展蛋白序列，如激素原或酶原中的序列。一般而言，TPAP能夠裂解來自肽或蛋白的未取代的N-末端氨基的三肽XYZ，其中，X、Y、Z表示任何氨基酸殘基(即選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)。在TPAP底物中，所有的X、Y和Z可以不同或相同，或者X、Y和Z中有兩者相同。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的TPAP對(duì)于被裂解的三肽氨基酸序列來說是非特異性的。在例7中，列舉了通過裂解天然存在的肽和蛋白質(zhì)所獲得的三肽產(chǎn)物的具體例子。
在談及構(gòu)成本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)一部分的DNA序列的來源時(shí)所使用的“可獲自”一詞，是用于表示該DNA序列可以自相關(guān)生物的核酸(DNA或RNA)中提取，或以這些材料為基礎(chǔ)進(jìn)行制備。例如，所述DNA序列可以采用本領(lǐng)域已知的方法從由所述生物制備的基因組或cDNA文庫(kù)中提取，或以這些材料為基礎(chǔ)進(jìn)行制備。
類似地，當(dāng)“可獲自”一詞與本發(fā)明的TPAP一起使用時(shí)，是指該TPAP可以自所述生物中回收，或者可以由獲自所述生物的一段DNA序列編碼并從能表達(dá)該DNA序列的生物中回收。
本發(fā)明的TPAP在完成本發(fā)明的研究過程中，提取并鑒定了兩種不同的TPAPs-一種獲自黑曲霉(A.niger)菌株，另一種獲自米曲霉(A.oryzae)菌株。這兩種TPAPs可以作為一種大致為新的類型的三肽基氨肽酶的范例。
因此，一方面，本發(fā)明涉及一種TPAP，它由一種DNA結(jié)構(gòu)編碼，該DNA結(jié)構(gòu)包括i)由序列1、2和3中至少一個(gè)所示的部分DNA序列，最好是兩個(gè)或兩個(gè)以上的序列，或ii)編碼存在于DSM 9570中的成熟TPAP的N-末端部分的部分DNA序列，或iii)一個(gè)核苷酸序列，它能夠與以序列1、2或3中示出的DNA序列為基礎(chǔ)制備的寡核苷酸探針或以序列4-14中任一個(gè)示出的氨基酸序列為基礎(chǔ)制備的寡核苷酸探針雜交，而且，它編碼一種TPAP。
在下文中以“本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)和載體”為標(biāo)題的相應(yīng)部分中，將對(duì)iii)的核苷酸序列作更詳細(xì)的說明。
另一方面，本發(fā)明涉及一種基本純凈的TPAP，它具備以下特征中的一種或幾種-裂解底物Phe-Pro-Ala-pNA的能力，-分子量大約為65kDa(基本上按Laemmli所披露的方法測(cè)定，U.K.1970，“Cleavage of structural Proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4”，Nature，227，P.680-685)，
-pI范圍為4-6，-最佳pH值范圍約為5.0-7.5，-能與純化的黑曲霉TPAP或純化的米曲霉TPAP發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，-包括以下N-末端序列Ala-Xaa(1)-Asn-Xaa(2)-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Xaa(3)-Cys-Leu-Lys-Xaa(4)-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Xaa(5)-Xaa(6)(序列15)，其中Xaa(1)、Xaa(2)、Xaa(3)、Xaa(4)、Xaa(5)和Xaa(6)可以相同或是不同，并可以選自任一種天然氨基酸殘基。理想的是，Xaa(1)為L(zhǎng)ys或Gln、Xaa(2)為Ile或Thr，Xaa(3)為Pro或His，Xaa(4)為Glu或Gln，Xaa(5)為Pro或Ala和/或Xaa(6)為L(zhǎng)ys或Asn。
用于測(cè)定免疫交叉反應(yīng)性的抗體可以用純化的TPAP進(jìn)行制備。更具體地講，抗本發(fā)明的酶的抗血清可以按照N.Axelsen等所述的方法(見A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Blackwell ScientificPublications，1973，Chapter 23，或A.Johnstone和Thorpe所述方法(見Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications，1982，pp.27-31)通過對(duì)兔(或其它嚙齒動(dòng)物)進(jìn)行免疫制備。可以從抗血清中獲取純化的免疫球蛋白，例如，通過鹽沉淀[(NH4)2SO4]，接著再進(jìn)行透析和離子交換層析，例如在DEAE-SephadoxTM上進(jìn)行層析。蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)特征分析可以用Outcherlony雙擴(kuò)散分析法(O.Onchterlony，見Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir著)，BlackwellScientific Publications，1967，pp.655-706)，通過交叉免疫電泳(N.Axelsen等，Supra，Chapter3和4)進(jìn)行；或通過火箭免疫電泳(N.Axelsen等，Supra，Chaper2)。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的TPAP包括在序列4-9中所示出的氨基酸序列的至少一種的部分序列和/或其最佳pH值約為5.0～5.5和/或pI約為5.1或5.2。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的TPAP包括在序列10-14中示出的氨基酸序列的至少一種的部分序列和/或其最佳pH值范圍約為5.5～7.5和/或pI約為4.5。
從由一個(gè)黑曲霉菌株所產(chǎn)生的蛋白制品中提取TPAP，該TPAP是由包括序列1、2或3中至少一個(gè)所示出的序列的一段DNA序列編碼，或是獲自DSM 9570，或是包括在序列4-9中所示出的肽(參見下面的例1)。從一個(gè)米曲霉菌株中提取到含有序列10-14所示肽的TPA，參見下面的例2。
目前認(rèn)為，屬于本文所述的大致為新類型的三肽基氨肽酶的TPAP可以是任何來源的，包括動(dòng)物或植物，但最好來源于微生物，即細(xì)菌或真菌。就本發(fā)明人所知，本發(fā)明所披露的內(nèi)容是首次報(bào)導(dǎo)來源于真菌的TPAP。本發(fā)明的TPAP可以從天然的TPAP生產(chǎn)菌中提取，或者更常見的是，作為同源或異源基因產(chǎn)物通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，下文將對(duì)此作進(jìn)一步說明。
具體地講，本發(fā)明的TPAP可獲自曲霉屬的一個(gè)菌株，如米曲霉、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)或臭曲霉(A.foetidus)的菌株，或木霉屬的菌株，如綠色木霉(T.viride)、T.reesei、T.longibrachiatum或T.harzianum的菌株，或鐮孢屬的一個(gè)種，如尖鐮孢(F.oxysporum)、禾本科鐮孢(F.graminearum)或腐皮鐮孢(F.solani)，或高溫霉屬(Thermomyces)的一個(gè)菌株，如疏綿狀高溫霉(T.lanuginosus)或T.insolens。
本發(fā)明的TPAP最好以提取的和基本純凈的形式提供，例如，純度至少為90％，如95％。
盡管蛋白制品中含有TPAP可能被視為是不理想的，因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致該制品的穩(wěn)定性降低，但是，把本發(fā)明的純化TPAP用于控制蛋白制品的去穩(wěn)定作用是有利的。例如，預(yù)計(jì)本發(fā)明的純化TPAP可用于在酶起到其應(yīng)有的作用后使其失活，因此，它起到“殺手酶”的作用。這種失活作用通常是通過熱失活實(shí)現(xiàn)的(或者通過純化除去不理想的酶活性)。將TPAP用于對(duì)耐熱酶進(jìn)行去穩(wěn)定作用特別有利。
作為上述用途的一個(gè)例子，下面將述用于淀粉液化的AMG的失活。目前，AMG的失活是通過將反應(yīng)混合物加熱至高溫(80-85℃)而實(shí)現(xiàn)的。加入TPAP也可實(shí)現(xiàn)這種失活目的，最好是在AMG已經(jīng)把糊精水解成葡萄糖后以分批方式進(jìn)行。然后，就可以通過僅把溫度提高到大約60℃的方法在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)AMG的失活。
另一個(gè)例子是用于啤酒如低熱量啤酒發(fā)酵的AMG的失活。在正常的啤酒發(fā)酵方法中，是通過巴氏消毒法使AMG失活的。加入TPAP可以降低所用AMG的熱穩(wěn)定性，因此，可降低巴氏消毒法的溫度。通過這種處理，可以改善其感觀特性。
另外，本發(fā)明的純化TPAP可用于一些需要特異性裂解三肽序列的目的247例如，某些肽或蛋白質(zhì)是以前體形式合成的，這種前體的N-末端氨基酸殘基中包括若干附加的氨基酸殘基，但這些附加氨基酸殘基的存在不利于該蛋白的使用。例如，在以諸如前體蛋白的保護(hù)形式合成蛋白或肽的過程中就會(huì)出現(xiàn)這種情況。
本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)和載體再一方面，本發(fā)明涉及一種編碼一個(gè)TPAP的DNA結(jié)構(gòu)，它包括i)序列1、2和3中所示部分DNA序列的至少一種，最好是兩種或全部，或ii)編碼TPAP的N-末端的部分DNA序列，它存在于DSM 9570中，或iii)一個(gè)核苷酸序列，它能與以序列1、2或3中任一個(gè)所示的DNA序列為基礎(chǔ)制備的寡核苷酸探針或以序列4-14中任一個(gè)所示的氨基酸序列為基礎(chǔ)制備的寡核苷酸探針雜交，而且，它編碼一種TPAP，或iv)一個(gè)互補(bǔ)于i)、ii)或iii)的DNA/核苷酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)既可用于TPAP(i)-iii)的DNA/核苷酸序列)的重組生產(chǎn)，又可用于在不需要產(chǎn)生TPAP(核苷酸序列iv))的細(xì)胞中降低其生產(chǎn)能力。
例如，可以從已知的其它生物或相關(guān)生物(如同一種生物)中提取核苷酸序列iii)，或是以序列1-14中任一個(gè)所示的部分DNA序列或氨基酸序列或DSM 9570的部分TPAP編碼DNA序列為基礎(chǔ)生產(chǎn)TPAP；例如，使用本文所披露的方法，或以所述DNA或氨基酸序列中任一個(gè)為基礎(chǔ)構(gòu)建，例如，通過引入核苷酸取代基，這種取代基不會(huì)使由該DNA序列編碼的TPAP出現(xiàn)另一種氨基酸序列，但會(huì)影響被用于生產(chǎn)這種TPAP的宿主生物的密碼子使用；或通過引入核苷酸取代基，這種取代基會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)另一種氨基酸序列，因此，會(huì)出現(xiàn)一種不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致一個(gè)TPAP突變型，該突變型具有不同于天然TPAP的特性，但其TPAP活性保持不變?？蛇M(jìn)行改變的其它例子有將一個(gè)或幾個(gè)核苷酸插入該序列；在該序列的任一端增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸；在該序列的任一端或在該序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸。
可以理解的是，序列1-3中所示的DNA序列和DSM 9570的DNA序列是部分序列，其可以包含于一個(gè)完整的TPAP編碼DNA序列中，或用于提取完整的TPAP編碼DNA序列。通過本領(lǐng)域的公知方法可以輕易地達(dá)到上述目的。根據(jù)本發(fā)明，核苷酸序列iii)欲包括所述完整的DNA序列。
上文提及的雜交是指在某種特定條件下核苷酸序列iii)與和編碼TPAP的DNA序列相同的探針雜交(或者與編碼TPAP的DNA序列雜交)，在下文的材料和方法一節(jié)將對(duì)此作詳細(xì)說明。通常，核苷酸序列iii)是與序列1、2或3中示出的DNA序列或DSM 9570的TPAP編碼DNA序列高度同源的(比較核苷酸序列iii)的部分序列，其與本文披露的部分DNA序列相應(yīng))，如同源性至少為65％，例如與所述DNA序列的同源性至少為70％，例如與所述序列的任一個(gè)或全部的同源性至少為75％、80％、85％、90％，或者甚至至少為95％。因此，預(yù)計(jì)本發(fā)明的TPAP與由所述DNA序列編碼的氨基酸序列的同源性至少為65％，例如，至少為70％(這一結(jié)果是基于對(duì)TPAP氨基酸序列部分與由所述DNA序列編碼部分的比較而得出的)，例如，同源性至少為75％、80％、85％、90％或者甚至至少為95％。
核苷酸序列iii)可以是DNA或RNA序列。
可以用眾所周知的方法制備本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的DNA序列i)-iii)。因此，可以通過建立cDNA或基因組文庫(kù)的方法，從預(yù)計(jì)獲得了相關(guān)DNA序列的生物，如上述細(xì)胞中提取DNA序列，并通過常規(guī)方法篩選陽(yáng)性克隆。這種方法的例子有按標(biāo)準(zhǔn)方法(見Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，Now York，1989)與合適的寡核苷酸探針雜交，和/或篩選表現(xiàn)相關(guān)活性的克隆，和/或篩選能產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)的克隆，該蛋白能與抗所述相關(guān)酶的抗體反應(yīng)。
從cDNA或基因組文庫(kù)中提取DNA的優(yōu)選方法為通過采用簡(jiǎn)并寡核苷酸探針的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。例如，可使用披露于PCR Protocols(1993，Bruce A.White著)和The Polymerase Chain Reaction (1994，KaryB.Mullis著)中的技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述PCR反應(yīng)。
或者僅僅從DSM 9570中提取DNA序列i)和ii)。
另外，本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的DNA序列，例如，互補(bǔ)于DNA/核苷酸序列i)、ii)或iii)的核苷酸序列iv)可以通過已建立的技術(shù)合成，例如，根據(jù)Narang，SA(1983，Tetrahedron 393)和Itakura等(1984，Annu.Rev.Biochem.53323)所披露的原理合成。
本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)可以是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接合成、基因組或cDNA起源的片段(視需要)而制備的基因組和合成片段的復(fù)合體、合成片段和cDNA的復(fù)合體或基因組和cDNA起源的復(fù)合體，所述合成片段相應(yīng)于完整的重組DNA分子的各個(gè)部分。
可以理解的是，DNA序列i)、ii)或iii)的優(yōu)選用途是用于制備重組TPAP，而DNA序列iv)的優(yōu)選用途是用于減少用來生產(chǎn)蛋白制品的細(xì)胞的TPAP生產(chǎn)能力，這種蛋白制品對(duì)TPAP敏感。
盡管DNA序列iv)可以互補(bǔ)于完整的TPAP編碼序列，但通常只要DNA序列iv)互補(bǔ)于該編碼序列的一部分就夠了。從功能角度考慮，DNA序列iv)與編碼TPAP的DNA序列必需有足夠長(zhǎng)的互補(bǔ)長(zhǎng)度，以便能與TPAP編碼DNA雜交，從而減少或抑制所述mRNA的轉(zhuǎn)錄。通常，DNA序列iv)包括一個(gè)至少有17個(gè)核苷酸，如至少有300個(gè)核苷酸的DNA序列就足夠了。
帶有本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)的載體，最好是重組表達(dá)載體，它可以是任何能方便地進(jìn)行重組DNA操作的載體，而表達(dá)載體的選擇通常取決于其中要導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞。因此，所述載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為一種染色體外實(shí)體存在的裁體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒或噬菌體?；蛘撸鲚d體也可以是在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后能整合到宿主細(xì)胞基因組中，并能與它所整合的染色體一起復(fù)制。
在所述DNA結(jié)構(gòu)或載體中，所述DNA序列應(yīng)當(dāng)可操作地與一個(gè)合適的啟動(dòng)子序列連接。該啟動(dòng)子序列可以是任何DNA序列，其在所選擇的宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性，而且可來源于編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白的基因。該啟動(dòng)子可來源于編碼胞外和胞內(nèi)蛋白如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和糖酵解酶的基因。適于指導(dǎo)本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的例子包括來自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)性α-淀粉酶和Rhizomucor miehei脂肪酶的基因的啟動(dòng)子。來源于編碼糖酵解酶的基因的啟動(dòng)子的例子有TPI、ADH和PGK。該啟動(dòng)子也可以是同源啟動(dòng)子，即為被使用的宿主菌株所固有的基因。
所述啟動(dòng)子序列可以帶有接頭，以便引入特殊的限制位點(diǎn)，從而有利于該啟動(dòng)子序列與所選擇的基因或與選擇的信號(hào)肽或前導(dǎo)片段的連接。
本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)和/或表達(dá)載體還可以包括一個(gè)合適的終止子，它可操作地與編碼TPAP的DNA序列連接，和/或一個(gè)聚腺苷酸化序列。所述終止子和聚腺苷酸化序列可以和所述啟動(dòng)子為同一來源。還可將增強(qiáng)子序列插入該DNA結(jié)構(gòu)。
該DNA結(jié)構(gòu)和/或載體還可以包括一個(gè)使該載體能夠在相應(yīng)的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這種序列的例子包括質(zhì)粒pUC19、pACYC 177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
該DNA結(jié)構(gòu)和/或載體還可以包括一個(gè)選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記的例子包括amdS或argB，trpC或pyrG(后三種標(biāo)記可獲自構(gòu)巢曲霉或黑曲霉)。
用于構(gòu)建本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)的方法包括，分別連接上述DNA序列、啟動(dòng)子、終止子和其它因子，并將其插入帶有復(fù)制所必需的信息的合適載體上。該方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(例如，見所引用的Sambrook等的書)。
生產(chǎn)本發(fā)明TPAP的細(xì)胞和方法在一種實(shí)施方案中，將含有上述本發(fā)明DNA結(jié)構(gòu)或表達(dá)載體的本發(fā)明的細(xì)胞用作宿主細(xì)胞，用于本發(fā)明TPAP的重組生產(chǎn)。在這種情況下，所述DNA結(jié)構(gòu)或表達(dá)載體含有TPAP編碼DNA序列i)-iii)中的任一個(gè)或如上所述的DSM 9570插入片段?？捎迷揇NA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞，通常是將該DNA結(jié)構(gòu)整合到宿主染色體上，盡管該DNA結(jié)構(gòu)也可以作為染色體外實(shí)體存在。不過，一般認(rèn)為這種整合是有利的，因?yàn)檫@樣一來所述DNA序列似乎能更穩(wěn)定地保持在宿主細(xì)胞中。所述DNA結(jié)構(gòu)向所述宿主染色體上的整合作用可以按照常規(guī)方法進(jìn)行，例如，通過同源重組?；蛘?，根據(jù)不同類型的宿主細(xì)胞用下述一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物，如哺乳動(dòng)物或昆蟲的細(xì)胞，但最好是微生物細(xì)胞，例如，細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
合適的細(xì)菌的例子包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如枯草桿菌(Bacillussubtilis)、地衣型芽胞桿菌(B.licheniformis)、Bacillus lentus、短桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽胞桿菌(B.alkalophilus)、淀粉液化芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、凝固芽胞桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽胞桿菌(B.circulans)、Bacilluslautus、蘇云金桿菌(B.thuringiensis)或藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰色鏈霉菌(S.murinus)；或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌(E.coli)。舉例來說，所述細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)或以已知方式用感受態(tài)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。
理想的酵母生物可以選自酵母屬(Saccharomyces)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的一個(gè)種，如釀酒酵母。絲狀真菌最好是屬于曲霉屬的一個(gè)種，如米曲霉、構(gòu)巢曲霉、臭曲霉、棘孢曲霉、日本曲霉或黑曲霉，木霉屬(Trichoderma)的一個(gè)種，如T.reesei、T.longibrachiatum或T.harzianum，或鐮孢霉屬(Fusarium)的一個(gè)種，如尖鐮孢(F.oxysporum)、禾本科鐮孢或腐皮鐮孢。也可以用一種已知方法轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，該方法涉及原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，以及隨后的細(xì)胞壁再生。
另一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)TPAP的方法，該方法包括i)在能夠表達(dá)所述TPAP的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述本發(fā)明的細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中回收所述TPAP。
用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基，可以是任何適于相關(guān)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的常見培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從供貨商處購(gòu)買，也可以按照公開的配方制備(例如，可參閱Catalogues of the Americam Type Culture Collection)。據(jù)信，向培養(yǎng)基中添加蛋白后能使TPAP的產(chǎn)量增加。
可以用常見方法從培養(yǎng)基中回收TPAP，包括以下步驟通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞；如有必要，在細(xì)胞破裂后用鹽，如硫酸銨沉淀上清液或?yàn)V液中的蛋白類組分；接著通過各種層析方法進(jìn)行純化，如離子交換層析法或親和層析法等。
消除或降低TPAP活性TPAP作為由微生物生產(chǎn)的蛋白制品的去穩(wěn)定因子的確定，對(duì)于很多種不同蛋白制品的生產(chǎn)具有重要意義。因此，正如由本發(fā)明人所證實(shí)的，即使在蛋白制品中存在微量TPAP，也會(huì)導(dǎo)致該制品熱穩(wěn)定性的降低。因此，可以通過本發(fā)明構(gòu)建一種具有較低TPAP生產(chǎn)能力的生產(chǎn)菌株。
通常，可以通過如下方式降低TPAP生產(chǎn)細(xì)胞的TPAP產(chǎn)量修飾存在于所述細(xì)胞中的一段DNA序列或使其失活，該序列是TPAP表達(dá)所必須的，以便降低該細(xì)胞的TPAP產(chǎn)量。
舉例來說，被修飾的DNA序列可以是編碼TPAP的DNA序列或是表現(xiàn)TPAP活性所必需的該序列的一部分，也可以是由一個(gè)TPAP編碼DNA序列表達(dá)TPAP所需要的調(diào)節(jié)序列。
作為所述調(diào)節(jié)序列的一個(gè)例子，它可以是一個(gè)啟動(dòng)子序列或該序列的功能部分，即足于實(shí)現(xiàn)TPAP表達(dá)的一部分。
所述DNA序列的修飾或失活可以這樣實(shí)現(xiàn)對(duì)所述TPAP生產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，并選擇TPAP生產(chǎn)能力已被降低的細(xì)胞。誘變可以是特異性的或是隨機(jī)的，例如，可以用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行誘變，用合適的寡核苷酸進(jìn)行誘變，或?qū)υ揇NA序列進(jìn)行PCR誘變處理。另外，也可以用所述誘變劑的任意組合形式進(jìn)行誘變處理。
適用于本目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外線(UV)輻射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸、和核苷酸類似物。
當(dāng)采用以上誘變劑時(shí)，誘變通常是這樣進(jìn)行的在存在被選用的誘變劑的情況下培養(yǎng)待誘變的細(xì)胞，培養(yǎng)是在適于誘變發(fā)生的條件下進(jìn)行；選擇具有較低TPAP產(chǎn)量的突變細(xì)胞。
當(dāng)所述修飾或失活是通過TPAP編碼序列或該序列轉(zhuǎn)錄或翻譯所必須的調(diào)節(jié)因子上的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的插入、置換或去除而實(shí)現(xiàn)的時(shí)候，核苷酸的插入或去除可以導(dǎo)致這樣的結(jié)果例如，引入一個(gè)終止密碼子，去除起始密碼子或改變開放讀框。TPAP編碼序列或調(diào)節(jié)因子的修飾或失活可以按照本領(lǐng)域已知方法，通過定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生的誘變而實(shí)現(xiàn)。盡管原則上講可在體內(nèi)進(jìn)行修飾，即直接在帶有待修飾的TPAP基因的細(xì)胞上進(jìn)行，但目前看來，在體外進(jìn)行修飾比較理想，如下文所述。
使所選擇的宿主細(xì)胞的TPAP生產(chǎn)能力喪失或降低的一種常用方法的例子，是基于基因置換或基因間斷原理。例如，所述基因間斷法涉及使用與想要破壞的內(nèi)源基因或基因片段相關(guān)的DNA序列。該DNA序列在體外誘變成缺損基因，并將其轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。該缺損基因通過同源重組的方式取代所述內(nèi)源基因或基因片段。該缺損基因或基因片段最好編碼一種標(biāo)記，該標(biāo)記可用于選擇其TPAP基因已被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體。
另外，也可以通過已建立的反義技術(shù)，用互補(bǔ)于TPAP編碼序列的核苷酸序列，如上述核苷酸序列iv)實(shí)現(xiàn)所述DNA序列的修飾或失活。更具體地講，可通過以下方法使TPAP生產(chǎn)細(xì)胞的TPAP生產(chǎn)能力降低或喪失將一種互補(bǔ)于TPAP編碼序列、因而能夠與該細(xì)胞中所產(chǎn)生的TPAPmRNA雜交的核苷酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞中，以便在該核苷酸序列能與所述TPAP mRNA雜交的條件下在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄該核苷酸序列，從而降低由該mRNA翻譯成的TPAP量或失去這種翻譯能力。
由此產(chǎn)生的TPAT缺陷型突變體特別適用于異源蛋白的表達(dá)。在本文中，“異源蛋白”被用來表示一種并非宿主細(xì)胞所固有的蛋白，其天然序列已因修飾作用而改變的天然蛋白，或其表達(dá)量已因?qū)λ拗骷?xì)胞所做的重組DNA技術(shù)操作而改變的天然蛋白。
理想的是，待按照本發(fā)明方法進(jìn)行修飾的TPAP生產(chǎn)細(xì)胞為適于生產(chǎn)所需蛋白制品的菌株，該蛋白制品與所述細(xì)胞同源或異源。例如，曲霉屬、木霉屬和鐮孢菌屬的真菌細(xì)胞可以作為優(yōu)選生產(chǎn)細(xì)胞的例子。因此，本發(fā)明的待修飾細(xì)胞最好是一種曲霉菌細(xì)胞，特別是黑曲霉、米曲霉、日本曲霉、臭曲霉或構(gòu)巢曲霉的細(xì)胞；或是一種木霉菌細(xì)胞，如T.reesei、T.longibrachiatum或T.harzianum細(xì)胞；或是一種鐮孢菌細(xì)胞，如尖鐮孢、禾本科鐮孢或腐皮鐮孢細(xì)胞。
在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方案中，所述待修飾的細(xì)胞是被用于酶，如AMG生產(chǎn)的黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及一種制備一種基本上無TPAP活性的制品的方法，該方法包括用一個(gè)編碼所述制品的DNA序列轉(zhuǎn)化上述具有較低或無TPAP生產(chǎn)能力的宿主細(xì)胞，在適于所述制品表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中回收所述制品。
又一方面，本發(fā)明涉及一種制備一種基本上無TPAP活性的制品的方法，所述制品是由存在于一種TPAP表達(dá)細(xì)胞里的一種DNA序列編碼，該方法包括對(duì)一種DNA序列進(jìn)行修飾或使其失活，該DNA序列存在于所述細(xì)胞中，并為上述TPAP的表達(dá)所必需；隨后在適于所述制品表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中回收所述制品。
另一方面，本發(fā)明涉及一種通過TPAP生產(chǎn)細(xì)胞發(fā)酵的方式制備一種基本上無TPAP的制品的方法，所述細(xì)胞還能產(chǎn)生所述制品，該方法包括在發(fā)酵期間或發(fā)酵結(jié)束后將有效量的一種能抑制TPAP活性的抑制劑加入發(fā)酵液中，從該發(fā)酵液中回收所述想要的制品，并選擇性地對(duì)回收的制品作進(jìn)一步純化。在下面的實(shí)施例中對(duì)該方法做進(jìn)一步說明。
再一方面，本發(fā)明涉及一種制備一種基本上無TPAP活性的制品的方法，所述制品是由存在于一種TPAP表達(dá)細(xì)胞中的一段DNA序列編碼，該方法包括在允許所述制品表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述編碼該制品的TPAP表達(dá)細(xì)胞；用pH和溫度綜合處理所得到的培養(yǎng)液，以明顯降低TPAP活性；并從該培養(yǎng)液中回收所述制品。另外，還可以對(duì)從所述培養(yǎng)液中回收的一種酶制劑進(jìn)行上述綜合pH和溫度處理。所述綜合pH和溫度處理可以有選擇地與用TPAP抑制劑進(jìn)行的處理結(jié)合使用。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，可以消除至少60％的TPAP活性，如至少75％的活性，能消除至少85％的活性較好，能消除至少95％的活性更好，能大致消除至少99％的TPAP活性最好。預(yù)計(jì)，使用該方法可以徹底消除TPAP活性。
所述綜合pH和溫度處理最好是在pH為6.5-7的范圍內(nèi)，和25～40℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以取得想要的效果。通常，0.5～1小時(shí)就足于取得理想效果。
用于培養(yǎng)和純化感興趣的制品的方法可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如，按上文所述方法進(jìn)行。
本發(fā)明用于生產(chǎn)一種基本上無TPAP的制品的方法，特別適用于生產(chǎn)真核蛋白，尤其是真菌蛋白，如真菌酶。例如，所述酶制品可選自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白分解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶。上述酶的例子包括AMG、淀粉酶、脂肪酸、角質(zhì)酶、酯酶、纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、過氧化物酶、漆酶、酚氧化酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、裂合酶、果膠酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化酶、轉(zhuǎn)移酶、核糖核酸酶、半乳糖苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和殼多糖酶。這種TPAP-缺損細(xì)胞還可用于表達(dá)有藥用價(jià)值的異源蛋白，如激素、生長(zhǎng)因子、受體等。
應(yīng)當(dāng)理解，“真核蛋白”一詞不僅包括天然蛋白，而且包括通過氨基酸取代、缺失、增加而作過修飾或作過其它修飾的蛋白(如酶)，這種修飾是為了提高其活性、熱穩(wěn)定性和pH耐性等。
另一方面，本發(fā)明涉及一種基本上無TPAP活性的蛋白制品，該制品是由本發(fā)明的方法所生產(chǎn)。
例1黑曲霉TPAP的純化和鑒定材料和方法Phe-Pro-Ala-pNA底物(從Bachem公司購(gòu)得，瑞士)。
蛋白酶抑制劑Ala-Ala-Phe-氯甲基酮芐氧基羰基-Ala-Pro-Phe-氯甲基酮芐氧基羰基-Gly-Gly-Phe-氯甲基酮。
TPAP的純化從市售黑曲霉AMG制劑中提純TPAP(所述制劑購(gòu)自NovoNordiskA/S，丹麥)。對(duì)所配制的300ml AMG制品的樣品反復(fù)進(jìn)行稀釋，并在4℃下，在裝有3kDa截?cái)嗄さ腇iltron_濃縮器中濃縮，直到其導(dǎo)電性低于1.5mS/cm。其它純化步驟都是在環(huán)境溫度下進(jìn)行。
采用NaCl梯度的陽(yáng)離子交換層析將濃縮液(600ml)調(diào)至pH4.0并過濾，然后上一個(gè)用20mM乙酸鈉(pH4.0)平衡過的體積為200ml(2.6×37cm)的S-Sepharose柱。采用10ml/分鐘的流速。用0～0.2M線性梯度NaCl以10倍的柱體積洗脫TPAP。得到含有大部分肽酶活性的收集液。在一個(gè)裝有截?cái)嘀禐?0kDa的Diaflo膜的Amicon池中將緩沖液改為20mM乙酸鈉，pH5.5。
陰離子交換層析在一個(gè)用20mM乙酸鈉，pH5.5平衡的HiLoad Q-Sepharose HP柱(50ml，2.6×10cm)上對(duì)從上述S-Sepharose柱中得到的收集液進(jìn)行進(jìn)一步純化。用0-0.5M的線性梯度NaCl以15倍的柱體積洗脫TPAP。該蛋白以8.0ml/分鐘的流速加入，并以5.0ml/分鐘的速度洗脫。制成具有大部分TPAP活性的收集液。以上述方式在一個(gè)Amicon池中將緩沖液改為20mM乙酸鈉，pH4.0。
采用pH梯度的陽(yáng)離子交換層析在一個(gè)用20mM乙酸鈉，pH4.0平衡的Mono S柱(5/5)上對(duì)來自上述HiLoad Q-Sepharose HP柱的收集液作最后純化。用20mM乙酸鈉，pH4.0和20mM乙酸鈉，pH6.0以30倍柱體積形成pH4.0～pH6.0的梯度。流速為1.0ml/分鐘。TPAP的兩種同功酶分別在pH5.1和pH5.2時(shí)洗脫。
AMG的純化已通過陰離子交換層析法用Q-Sepharose柱從市售AMG制劑(Novo Nordisk A/S)中純化得到AMG G1。用20mM乙酸鈉，pH5.5平衡一個(gè)50ml柱，并用0～0.6M的線性NaCl梯度以8倍柱體積洗脫G1型。流速為8.0ml/分鐘。
在一個(gè)用20mM乙酸鈉，pH4.3平衡的Mono Q柱上用TPAP處理AMG G1后純化AMGtrunc。用30倍柱體積的0～1.0M線性NaCl梯度進(jìn)行洗脫，流速為1.0ml/分鐘。
去穩(wěn)定化分析將純化AMG G1的等分試樣與不同的TPAP在0.1M乙酸鈉，pH4.3中混合，并在37℃下培養(yǎng)幾周。終體積為1或2ml，AMG G1的濃度為10AGU/ml。取100μl培養(yǎng)混合物，并用0.1M乙酸鈉，pH4.3稀釋至濃度為2AGU/ml。在65℃溫度下對(duì)稀釋樣品作30分鐘的熱處理。待該樣品冷卻至環(huán)境溫度后，在微量滴定板上用對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(pNPG)(MercK，Art.6792)作顯色底物測(cè)未處理過的和熱處理過的樣品的活性。將50μl在0.1M乙酸鈉，pH4.3中配成的3mM pNPG與25μl樣品一起在環(huán)境溫度下培養(yǎng)30分鐘。通過加入75μl 0.1M的四硼酸鈉終止反應(yīng)。在一臺(tái)UV-max動(dòng)力微量板讀數(shù)器上測(cè)405nm波長(zhǎng)處的光吸收。計(jì)算T30，作為熱處理后保留活性的百分比。所有測(cè)試均重復(fù)2次。
TPAP分析該分析在微量滴定板讀數(shù)器上或在分光光度計(jì)上進(jìn)行，采用在0.1M乙酸鈉緩沖液，pH4.3中制成的濃度為0.2mM的底物Phe-Pro-Ala-pNA。在DMSO中配制濃度為5mM的Phe-Pro-Ala-pNA母液，并在使用前稀釋。隨后進(jìn)行反應(yīng)4分鐘，用一臺(tái)UV-max動(dòng)力微量板讀數(shù)器或一臺(tái)分光光度計(jì)在405nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)反應(yīng)，并計(jì)算起始裂解速度。
TPAP的抑制將含有4μgTPAP的等分試樣與若干種蛋白酶抑制劑一起培養(yǎng)，所述蛋白酶抑制劑為1mM Ala-Ala-Phe-氯甲基酮、1mM芐氧基羰基-Ala-Pro-Phe-氯甲基酮和1mM芐氧基羰基-Gly-Gly-Phe-氯甲基酮。培養(yǎng)30分鐘后測(cè)殘余活性。
過濾發(fā)酵液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心，并通過0.22μm的濾器滅菌過濾。將相應(yīng)的山梨酸鉀和苯甲酸鈉加入培養(yǎng)液中，使其濃度為0.1％，并將pH調(diào)節(jié)至4.3。分別向2ml的等分試樣中加200μl 10mM Ala-Ala-Phe-氯甲基酮或200μl0.1M乙酸鈉，pH4.3。取樣，并稀釋至2AGU/ml，然后按上述方法測(cè)T30。
AMG活性的測(cè)定(AGU)按照K.A.Holm所述方法(1980，Anal.Chem.Acta.，117，pp359-362)測(cè)AMG活性。簡(jiǎn)言之，該方法基于由AMG進(jìn)行的麥芽糖水解，水解產(chǎn)物為α-D-葡萄糖。經(jīng)過一個(gè)短暫、連續(xù)的透析處理之后，通過葡萄糖脫氫酶(GlucDH)反應(yīng)(在pH7.6下進(jìn)行)測(cè)葡萄糖濃度。自動(dòng)化Auto-Analyzer法的標(biāo)準(zhǔn)條件為底物28mM麥芽糖培養(yǎng)緩沖液乙酸鹽0.1M，pH4.3培養(yǎng)溫度37℃培養(yǎng)時(shí)間5分鐘該方法的酶工作面積為0.5～4AGU/ml。
結(jié)果按照表1所示的純化方案從市售AMG制劑(Novo Nordisk A/S)中提純TPAP，使其均勻。最終陽(yáng)離子交換柱的洗脫曲線顯示，存在兩種TPAP同功酶(TPAP-I和TPAP-II)，其pI值分別為5.1和5.2。通過SDS-PAGE和N-末端測(cè)序證實(shí)，兩種異構(gòu)型都是純凈的，但其比活性不同(見表1)。TPAP-II的比活性比TPAP-I的比活性高20％。
兩種TPAP異構(gòu)型之間pI值的小的差異，可以解釋為在發(fā)酵液中或在純化過程中發(fā)生了一個(gè)或幾個(gè)Asn-或Gln-殘基的脫酰氨基作用。
表1.從市售AMG制劑中純化TPAP
#基于這樣的假定1mg/ml能產(chǎn)生A280＝1#在TPAP分析中測(cè)pNA的釋放量
pH最佳值以與在TPAP分析中所述的相同方法測(cè)定TPAP的pH最佳值。用0.1M的乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH。所得到的pH最佳值曲線如

圖1所示?？梢钥闯觯?.0-5.5范圍內(nèi)的pH值下TPAP的作用較理想，當(dāng)pH值為5.25時(shí)特別理想。
測(cè)定TPAT的最佳溫度在0.1M乙酸鈉緩沖液pH5.5中，用上述TPAP分析法測(cè)定TPAP的溫度/活性關(guān)系。從下表中可以看出，在45-55℃的溫度范圍內(nèi)TPAP具有最大活性。
表2
質(zhì)譜分析對(duì)從黑曲霉中提取的TPAP進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析，得到一個(gè)寬的信號(hào)，表明TPAP被糖基化。證實(shí)其平均質(zhì)量為54.5kDa。
例2米曲霉TPAP的純化和鑒定材料和方法在含有大豆的培養(yǎng)基中在pH5的條件下發(fā)酵米曲霉IFO 4177，將發(fā)酵上清液作為原材料用于提純。發(fā)酵之后對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心，以除去大部分細(xì)胞。
純化將大約4L上清液在Seitz EKS板上除菌過濾。在一個(gè)3k截?cái)嗟腇iltron盒(Minisette)上對(duì)EKS-濾液進(jìn)行超濾，使其到最低體積，超濾液＝240ml。用固體硫酸胺(AMS)沉淀超濾液，使AMS的飽和度達(dá)到大約90％。攪拌至少30分鐘，然后通過在一臺(tái)Sorvall RC3B離心機(jī)中離心(4500rpm，15分鐘，室溫)回收AMS沉淀。將100ml去離子水加入AMS沉淀中，以溶解所述蛋白，并加入1％(w/v)FGV120活性炭進(jìn)行脫色。攪拌大約1小時(shí)后在一個(gè)Seitz EK1板上過濾懸浮液，以除去碳(和色素)。用1)100mM H3BO3、10mM二甲基戊二酸、2ml CaCl2，pH5和2)去離子水對(duì)EK1-濾液進(jìn)行透析。經(jīng)EK1-過濾之后以等分試樣形式冷凍透析液(260ml)。
將120ml透析液的等分試樣解凍，并將其加注到在20mM CH3COOH/NaOH，pH5.0中平衡的1.4L G25 Sephadex柱上。為了除去色素和酸性很強(qiáng)的蛋白，將G25-濾液加注到用同一種緩沖液(CH3COOH/NaOH，pH5.0)平衡的40ml Q-Sepharose FF柱上。洗滌該柱，然后用線性NaCl梯度(0-＞200mM)洗脫結(jié)合蛋白。分析來自該柱的級(jí)分的TPAP活性。大部分TPAP活性(70％)存在于流通液中，而大部分蛋白結(jié)合在柱上。
將來自Q-Sepharose柱的流通液加注到用20mM CH3COOH/NaOH，pH5.0平衡的50ml S-Sepharose HP柱上。洗滌該柱，然后用線性NaCl梯度(0-＞200mM)洗脫結(jié)合蛋白。分析來自該柱的級(jí)分的TPAP活性。大部分TPAP活性(75％)也存在于流通液中。其余TPAP活性存在于NaCl梯度的起始部分。收集流通液+級(jí)分1-11，并用50mM H3BO3、5mM二甲基戊二酸、1mMCaCl2，pH6.0進(jìn)行透析。
將透析過的收集液調(diào)節(jié)至pH7.0，然后將該酶加注到用50mMH3BO3、5mM二甲基戊二酸、1mM CaCl2，pH7.0平衡的23ml Source Q柱上。洗滌該柱，然后用線性NaCl梯度(0-＞500mM)洗脫結(jié)合蛋白。分析來自該柱的級(jí)分的TPAP活性。所有TPAP活性(95％)均存在于流通液中。其原因必然是該柱中載有過多的蛋白。用20mM CH3COOH/NaOH，pH4.0透析該流通液。
將以上透析過的酶加注到一個(gè)用20mM CH3COOH/NaOH，pH4.0平衡的50ml S-Sepharose HP柱上。洗滌該柱，然后用NaCl梯度(0-＞200mM)洗脫結(jié)合蛋白。分析來自該柱的TPAP活性。TPAP活性由100mM NaCl洗脫。收集TPAP活性，并用20mM CH3COOH/NaOH，pH4.0透析。為了取得比S-Sepharose柱好的分離度，將透析過的收集液加注到一個(gè)用相同的緩沖液(20mM CH3COOH/NaOH，pH4.0)平衡的8mlSOURCE S柱上。洗滌該柱，然后用NaCl梯度(0-＞200mM)洗脫結(jié)合蛋白。分析來自該柱的級(jí)分的TPAP活性。TPAP活性由60mM NaCl洗脫。收集TPAP活性并用20mM CH3COOH/NaOH，pH5.5透析。
將透析過的酶加注到一個(gè)用20mM CH3COOH/NaOH，pH5.5平衡的23ml SOURCE Q柱上。洗滌該柱，然后用NaCl梯度(0→200mM)洗脫結(jié)合蛋白。TPAP活性由30mM NaCl洗脫。通過SDS-PAGE分析來自該柱級(jí)分的TPAP活性。SDS-PAGE凝膠顯示，具有TPAP活性的級(jí)分中含有兩條帶一條65kDa帶(TPAP)和一條30kDa帶。TPAP帶是擴(kuò)散的，而30kDa帶尖銳，這表明TPAP被糖基化，而30kDa帶沒有。
通過超濾將含有TPAP的級(jí)分濃縮至1ml，并加注到一個(gè)用20mMTris-乙酸、100mM NaCl，pH5.5平衡的150ml Sephacryl S-100柱上。以1.0ml/分鐘的速度將上述兩條帶分開。收集具有TPAP活性的級(jí)分作為米曲霉TPAP。
質(zhì)譜分析對(duì)自米曲霉中提取的TPAP進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，得到一個(gè)寬的信號(hào)，表明TPAP被糖基化。測(cè)得的平均質(zhì)量為55.0kDa。
米曲霉TPAP的pH曲線以Phe-Pro-Ala-pNA為顯色底物研究了獲自米曲霉的TPAP的活性對(duì)pH的依賴性。將150μl標(biāo)定pH下的Britton-Robinson緩沖液加入50μl酶中，然后與50μl終濃度為0.2mM的底物Phe-Pro-Ala-pNA一起培養(yǎng)。在一臺(tái)UV-max動(dòng)力微量滴定板讀數(shù)器上進(jìn)行分析，并在405nm波長(zhǎng)下鑒測(cè)反應(yīng)3.5分鐘。其相對(duì)活性示于下表3中。
表3
例3黑曲霉TPAP的肽序列在一臺(tái)Applied Biosystems 473A測(cè)序儀上，按照生產(chǎn)商的說明書對(duì)完整的I型和II型黑由霉TPAP(例1)以及由I型TPAP衍生而來的肽的N-末端氨基酸進(jìn)行測(cè)序。
測(cè)完整的I型和II型TPAP的N末端的30個(gè)氨基酸的序列。兩個(gè)序列相同，其為Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-Leu-Lys-Gln-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys-(序列4)該序列與其它蛋白之間無任何同源性。
在變性、還原和S-羧甲基化之后，用獲自無色桿菌屬(Achromobacter)的賴氨酰特異性蛋白酶對(duì)I型TPAP進(jìn)行蛋白酶解，得到肽。分餾所得到的肽，并通過反相HPLC進(jìn)行再純化。通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析測(cè)定該肽的純度和質(zhì)量，采用的是一臺(tái)VG Analytical TofSpec，按生產(chǎn)商的推薦操作。對(duì)以下7種肽進(jìn)行測(cè)序。
肽1Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-Leu-Lys通過質(zhì)譜分析和氨基酸測(cè)序證實(shí)，Asn3是糖基化的。肽1與序列4中所示的序列和完整TPAP序列的氨基酸殘基1-17相同。
肽2Gln-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys肽2與完整TPAP序列(和序列4所示氨基酸序列)的氨基酸殘基18-30相同。質(zhì)譜分析和氨基酸序列分析證實(shí)回收的肽2有兩種型式。一種型式的N-末端有一個(gè)Gln殘基，而另一種形式中該Gln殘基被轉(zhuǎn)化成焦谷氨酸殘基。
肽3Thr-Ser-Pro-Glu-Gln-Ala-Val-Ser-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asp-Leu-Trp-Pro-Arg-Pro-Ser-Tyr-Gln-His-(序列5)肽4Phe-Ser-Gly-Leu-Phe-Asn-Ala-Ser-Gly-Arg-Ala-Phe-Pro-Asp-Val-Ser-Ala-Gln-Gly-Val-Asn-Tyr-Ala-Val-Tyr-Asp-Lys(序列6)通過質(zhì)譜分析和序列分析證實(shí)，Asn6是糖基化的。
肽5Ile-Gly-Phe-Ala-Ser-Tyr-Leu-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Tyr-Ala-Asx-Leu-Glu-Arg-Phe-Glu-Gln-His-Leu-(序列7)不可能辨別出Asx15是Asp還是Asn殘基。
肽6Xaa-Leu-Asx-Leu-Gln-Tyr-Ile-Leu-Gly-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Ile-Thr-Glu-Tyr-Ser-Thr-Gly-Gly-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Pro-(序列8)分辨不出Asx3究竟是Asp還是Asn殘基。Xaa1的身份未得到確認(rèn)。
肽7
Gly-Ala-Leu-Asx-Asp-Ile-Val-Asn-Gly-Thr-Ser-Val-Gly-Gln-Asp-Gly-Arg-Asn-Arg-Phe-Gly-Gly-Thr-Pro-Asn-Gly-Ser-(序列9)分辨不出Asx4究竟是Asp還是Asn殘基，注意，Asn25未被糖基化，盡管它存在于N-糖基化共有序列中。
米曲霉TPAP的肽序列在一臺(tái)Applied Biosystem 473A蛋白測(cè)序儀上，按生產(chǎn)商的說明書操作，測(cè)完整TPAP及采自TPAP的肽的N-末端氨基酸序列。
用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過SDS-PAGE和電吸印到PVDF-膜上測(cè)定完整TPAP的N-末端氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)23個(gè)殘基的氨基酸序列Ala-Lys-Xaa-Ile-Ser-His-Yaa-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Pro-Yaa-Leu-Lys-Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-(序列14)該序列明顯與黑曲霉TPAP的N-末端氨基酸序列同源?；谶@種同源性，Xaa極可能是糖基化Asn殘基，而Yaa可能是Cys-殘基。
在變性、還原和S-羧甲基化之后，用獲自無色桿菌屬的賴氨酰特異性蛋白酶對(duì)TPAP進(jìn)行蛋白酶解，得到肽。分餾所得到的肽，并通過反相HPLC進(jìn)行再純化。通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析測(cè)定該肽的純度和質(zhì)量，采用的是一臺(tái)VG Analytical TofSpec，按照生產(chǎn)商的推薦操作。對(duì)以下4種肽進(jìn)行測(cè)序。
肽8Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Ala-Asn-Ser-Gly-Ser-Lys(序列10)該肽與通過N-末端測(cè)序測(cè)定的完整TPAP的最后6個(gè)氨基酸殘基重疊，因此，將N-末端序列延長(zhǎng)至34個(gè)殘基。
肽9
Thr-Thr-Pro-Glu-Arg-Gly-Thr-Tyr-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asn-Tyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Trp-Gln-Asn-Gln-Ala-Val-Ala-Ser-Tyr-Leu-(序列11)該肽與獲自黑曲霉TPAP的肽3同源。
肽10Gly-Thr-Leu-Gly-Glu-Phe-Asp-Gly-Thr-Ser-Ala-Ser-Ala-Pro-Ala-Phe-Ser-Ala-Val-Ile-Ala-Leu-Leu-Asn-Asp-Ala-Arg-Leu-Arg-Ala-Gly-Lys-Pro-Thr-Leu-Gly-Phe-Leu-Asn-Pro-Trp-Leu-Tyr-Lys(序列12)肽11Thr-Gly-Arg-Gln-Gly-Leu-Gln-Asn-Ile-Thr-Leu-Gly-Ala-Ser-Ile-Gly-Xaa-Thr-Gly-Arg-Ala-Arg-Phe-Gly-Gly-Ala-Pro-Asn-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Pro-Tyr-Ala-Ser-(序列13)，Xaa表示未得到證實(shí)的殘基。
例4測(cè)定了I型和II型黑曲霉TPAP的氨基酸組成。在110℃溫度下，在含有0.1％苯酚的6N HCl中，在真空條件下對(duì)雙份的I型和II型TPAP凍干的等分試樣進(jìn)行水解，水解時(shí)間為16小時(shí)。水解以后，在3M甲磺酸中測(cè)色氨酸。水解之后，用一臺(tái)Applied Biosystems 420A氨基酸分析系統(tǒng)，按照生產(chǎn)商的說明書操作，測(cè)定氨基酸組成。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，I型和II型TPAP具有相同的氨基酸組成，如表4所示。
表4I型和II型黑曲霉TPAP的氨基酸組成
例5測(cè)定了I型和II型黑曲霉TPAP的單糖組成，在100℃的真空條件下在2M TFA中對(duì)雙份的I型和II型TPAP凍干的等分試樣進(jìn)行水解，水解時(shí)間分別為1小時(shí)、2小時(shí)和4小時(shí)。水解以后通過高效離子交換層析分析單糖的組成，采用一個(gè)CarboPacTMPA1柱，用16mM NaOH洗脫。通過脈沖安培計(jì)測(cè)定法測(cè)定單糖。由于不同的穩(wěn)定性及在2M TFA中釋出的單糖，水解1小時(shí)之后測(cè)半乳糖的量，水解2小時(shí)后測(cè)甘露糖的量，并在水解4小時(shí)后測(cè)葡糖胺的量。所得到的結(jié)果顯示，I型和II型TPAP在甘露糖含量方面的差異極小，如下面的表5所示。
表5I型和II型TPAP的單糖組成。結(jié)果以pmol單糖/pmol蛋白形式給出，有關(guān)數(shù)據(jù)是在氨基酸分析時(shí)獲得。
例6由黑曲霉TPAP進(jìn)行的裂解用純化的AMG和TPAP(用例1的材料和方法一節(jié)中所述方法獲得)研究黑曲霉TPAP對(duì)AMG G1型的去穩(wěn)定化能力，TPAP/AMG之比等于所配制的制品中二者的比例。對(duì)該去穩(wěn)定化制劑進(jìn)行的氨基酸測(cè)序顯示，在AMG催化域的N-末端有一個(gè)修飾。用肽酶對(duì)一種包括前3個(gè)氨基酸殘基(Ala-Thr-Leu)的三肽進(jìn)行裂解，結(jié)果表明，該酶是三肽基氨肽酶。是基于能裂解AMG和顯色底物Phe-Pro-Ala-pNA而將其歸類為三肽基氨肽酶的，這一結(jié)論還得到其缺乏裂解另一種顯色底物琥珀酰-Ala-Ala-Ala-pNA的能力的支持。在該底物中，N-末端的游離氨基被琥珀?；?，因而使得該底物不能夠由TPAP裂解。存放3周以后TPAP對(duì)AMG樣品的裂解仍不徹底，通過氨基酸測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其為完整AMG和截短AMG(AMGtrunc)的混合物。
在不同溫度下以各種劑量研究了TPAP對(duì)AMG G1的去穩(wěn)定化作用。TPAP在3-10μg/ml的劑量范圍內(nèi)能產(chǎn)生明顯的AMG去穩(wěn)定化作用，而且，TPAP/AMG之比類似于在幾種發(fā)酵液中測(cè)得的比例。在37℃溫度下去穩(wěn)定化作用最突出，但在25℃溫度下存放27天后對(duì)熱穩(wěn)定性也有明顯影響。在4℃下存放不影響AMG的熱穩(wěn)定性。
例7用各種天然蛋白和肽底物研究了黑曲霉TPAP的特異性。用這些底物發(fā)現(xiàn)，TPAP N-末端的氨基酸殘基的裂解位點(diǎn)極不專一。TPAP甚至能在Pro殘基和CM-Cys殘基之后進(jìn)行裂解。不過，在其裂解位點(diǎn)的ProC-末端可以完全抑制TPAP的裂解。用TPAP處理天然蛋白所得到的特異裂解產(chǎn)物包括以下三肽序列IPE、YVD、WRQ、KGA、LPS、ANL、NGT、LMQ、YFE、GPG、GGG、ADG、RST、SVE、KKP、EGV、NTG、AGD、RHN、LKT、VEK、KPE、GVN、TGA、GDR、HNL、HSQ、GTF、TSD、YSK、YLD、SRR、AQD、FVQ、WLM和ATL。
例8黑曲霉TPAP活性的抑制用蛋白酶抑制劑氯甲基酮Ala-Ala-Phe-CMK(AAF-CMK)抑制TPAP，在上述條件下進(jìn)行試驗(yàn)。證實(shí)AAF-CMK能完全抑制TPAP。
將AAF-CMK加入發(fā)酵液中可以完全抑制TPAP活性。在有或沒有TPAP活性的情況下，檢驗(yàn)了5批不同AMG的熱穩(wěn)定性。當(dāng)TPAP被抑制時(shí)，在37℃下存放2周后所有5批AMG的熱穩(wěn)定性未發(fā)生改變。沒有抑制劑的相應(yīng)樣品都明顯發(fā)生了去穩(wěn)定化作用。
例9通過培養(yǎng)一種黑曲霉的AMG生產(chǎn)菌株獲得10ml培養(yǎng)液，用NaOH將pH調(diào)至6.5或7.0。將各個(gè)樣品分別在25℃、40℃和50℃溫度下培養(yǎng)1小時(shí)，然后用乙酸將樣品的pH調(diào)至4.3。測(cè)定處理過的樣品的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種樣品回收方法(基于高溫下的pH處理)能夠有效消除TPAP活性(表6)。在pH6.5/40℃條件下處理所述培養(yǎng)液1小時(shí)，可將TPAP活性降低至5％，并得到一種很穩(wěn)定的產(chǎn)品，其熱穩(wěn)定性在40℃下放置2周后不會(huì)改變。
表6
該表中的所有數(shù)字均為％，分別用于表示TPAP和AMG的值是在所標(biāo)明時(shí)間的相對(duì)活性。
例10PCR克隆根據(jù)序列3所示的黑曲霉TPAP N-末端氨基酸序列，設(shè)計(jì)4種PCR引物(表7)。將獲自黑曲霉的一個(gè)菌株的基因組DNA用作4個(gè)PCR反應(yīng)的模板。提取預(yù)計(jì)為65bp的PCR片段，并克隆到質(zhì)粒pCRTMII(Invitrogen公司)上。對(duì)3個(gè)克隆的插入片段測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)在相當(dāng)于所述引物的位置具有簡(jiǎn)并序列，而在引物之間的序列相對(duì)N-末端氨基酸序列沒有發(fā)生改變。
為了克隆編碼三肽基氨肽酶的較大DNA片段，制備相當(dāng)于所述不變序列的引物#6010(GCACTGTC TGAAGCAGCTGTACAACATCGGTG)。再根據(jù)另外兩種肽序列設(shè)計(jì)3個(gè)PCR引物(表7)。以黑曲霉基因組DNA為模板進(jìn)行了3個(gè)PCR反應(yīng)(#6010/#5 988，#6010/#5989和#6010/#5990)。該反應(yīng)是在42℃和45℃兩種退火溫度下進(jìn)行的。反應(yīng)#6010/#5989(一個(gè)約80bp的片段)和#6010/#5990(3個(gè)片段，大約分別為120bp、500bp和950bp)證實(shí)，在兩種不同的溫度下進(jìn)行的退火，在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)相同的帶型。在反應(yīng)#6010/#5988中，在42℃下見到一個(gè)大約120bp的片段，而在45℃下見到一個(gè)大約950bp的片段。950bp的片段正是所需要的，并將其插入PCR II AT載體。按照布達(dá)佩斯條約規(guī)定，已將獲得了950kp片段的大腸桿菌交由Deutsche Sammlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH保藏，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德國(guó)，保存日期為1994年12月5日，保藏號(hào)DSM9570。
表7寡核苷酸引物#57655′-G A C T C C A T C A T C A C C C CT T T T TA A A AG G#57665′-G A C A G C A T C A T C A C C C CT T T T TAG#5767C T G A T G G T T C G G C T G G G-5′A A C A A
#5768C T G A T G G T T C G C C T G G G-5′A A C T A#5988A T A C G A C A A A T A C T A T T-5′G C C G GG GT T#5989A T A A A A C T C C T C A T A C G-5′G G C T T GG#5990C T T C T A A A A C T T G T T G T-5′C G G C C從兩端測(cè)950bp片段的序列。發(fā)現(xiàn)該片段編碼TPAP的N-末端部分。該N-末端部分的部分序列如序列2所示，從另一端測(cè)序所得到的部分序列示于序列3中。發(fā)現(xiàn)完整的“950個(gè)堿基的片段”的序列由908bp組成，其序列示于序列1中。
Southern分析按上述方法從黑曲霉菌株和米曲霉菌株IFO 4177中提取基因組DNA(Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.811470-1474)。用合適的限制酶消化基因組DNA，在0.7％的瓊脂糖凝膠上分級(jí)，并按照生產(chǎn)商的說法吸印到ImmobilonTM-N上。檢測(cè)該膜上950bp TPAP基因片段的存在，按照Feinberg等所述的方法(1983，Anal.Biochem.1326)通過隨機(jī)引導(dǎo)的方式用α-32P dATP(NewEngland)進(jìn)行標(biāo)記。然后將該膜放在雜交溶液(5×SSC(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)，10×Denhardt(0.2％Ficoll，0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％牛血清白蛋白)，10mM EDTA，1％SDS，150μg/ml PolyA，50μg/ml酵母RNA)中，在65℃溫度下溫育2小時(shí)。隨后加入放射性標(biāo)記的探針，并在65℃溫度下溫育過夜，伴以輕微振蕩。在30℃下，在2×SSC，1％SDS中將膜洗兩遍，每次15分鐘。最后將該膜干燥，用塑料膜封裝，并在-70℃下使X光片(Fuli-RX)曝光。結(jié)果表明，兩個(gè)菌株都只含有一個(gè)編碼TPAP的基因。
序列表序列1908個(gè)堿基CACTGTCTGAAGCAGCTGTACAACATCGGTGACTACCAGGCCGATCCCAAGTCCGGCAG-CAAGATCGGCTTTGCCAGCTACCTTGAGGAATACGCCCGGTATGCCGATCTCGAGAGG-TTCGAGCAGCACCTGGC TCCCAATGCCATCGGCCAGAACTTCAGCGTCGTCCAATTCAACG-GCGGCCTCAACGATCAGCTTTCA TCGAGTGACAGCGGCGAAGCCAACCTCGACCTGCAGTA-CATCCTGGGCGTCAGCGCTCCCGTCCCCA TCACCGAGTACAGCACCGGCGGACGCGGCGAA-CTAGTCCCCGACCTGAGCTCCCCCGACCCCAACGA CAACAGCAACGAGCCCTACCTTGACT-TCCTTCAGGGAATCCTCAAGCTTAACAACTCCGACCTCCCA CAAGTCATCTCTACCTCCTA-CGGTGAAGACGAACAGGTATGCACCTCACCTGACCCATTCCATTTTA CATCCCTCACCTCT-CTCAACCAAACTAACAACACCAACAGACTATCCCCGTCCCCTACGCCCGCACC GTCTGCAA-CCTCTACGCCCAACTCGGCAGCCGCGGCGTCTCTGTAATCTTCTCCAGCGGCGACTCCGGCGTCGGCGCCGCCTGCCTCACCAACGACGGCACCAACCGCACGCACTTCCCTCCTCAATTCCCCGC CTCCTGCCCCTGGGTAACCTCCGTCGGCGCAACCTCCAAGACCTCCCCCGAGCAA-GCCGTCTCCTTC TCCTCCGGCGGCTTCTCCGACCTCTGGCCCCGCCCCTCCTACCAACACG-CCGCCGTGCAAACCTACC TCACCAAGCACCTGGGCAACAAGTTCTCGGGGCTTTTCAACGC-CTCCGGCCGCGCCTTCCCCGACGT CTCCGCGCAGGGCGTCAACTACGCTGTTTACGACAAA序列2CACTGTCTGAAGCAGCTGTACAACATCGGTGACTACCAGGCCGATCCCAAGTCCGGCAGCAAGATCGGCTTGGGCAGCTACCTTGAGGAATACGCCCGGTATGCCGATCTCGAGAGGTTCGAGCAGCACCTGGCTCCAATGCATCGGCAGAACTCAGCGTCGTCCAATTCACGGCGGCT-CACGATCAGCTTCATCGAGTGACAGCGGCGAGCAACTCGACTGCAGTAC序列3CCTCCTACCAACACGCCGCCGTGCAACCTACCTGACCAAGCACCTGGCAACAAGTTCTCGG-GGCTTTTCAACGCCTCCGGCCGCGCCTTCCCCGACGTCTCCGCGCAGGGCGTCAACTACGCT-GTTTACGACAA序列4Ala-Gln-Asn-Thr-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-His-Cys-Leu-Lys-Gln-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Pro-Lys
序列5Thr-Ser-Pro-Glu-Gln-Ala-Val-Ser-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asp-Leu-Trp-Pro-Arg-Pro-Ser-Tyr-Gln-His-序列6Phe-Ser-Gly-Leu-Phe-Asn-Ala-Ser-Gly-Arg-Ala-Phe-Pro-Asp-Val-Ser-Ala-Gln-Gly-Val-Asn-Tyr-Ala-Val-Tyr-Asp-Lys序列7Ile-Gly-Phe-Ala-Ser-Tyr-Leu-Gln-Glu-Tyr-Ala-Arg-Tyr-Ala-Asx-Leu-Glu-Arg-Phe-Glu-Gln-His-Leu-序列8Xaa-Leu-Asx-Leu-Gln-Tyr-Ile-Leu-Gly-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Ile-Thr-Glu-Tyr-Ser-Thr-Gly-Gly-Arg-Gly-Glu-Leu-Val-Pro-序列9Gly-Ala-Leu-Asx-Asp-Ile-Val-Asn-Gly-Thr-Ser-Val-Gly-Gln-Asp-Gly-Arg-Asn-Arg-Phe-Gly-Gly-Thr-Pro-Asn-Gly-Ser-序列10Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Ala-Asn-Ser-Gly-Ser-Lys序列11Thr-Thr-Pro-Glu-Arg-Gly-Thr-Tyr-Phe-Ser-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Asn-Tyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Trp-Gln-Asn-Gln-Ala-Val-Ala-Ser-Tyr-Leu-序列12Gly-Thr-Leu-Gly-Glu-Phe-Asp-Gly-Thr-Ser-Ala-Ser-Ala-Pro-Ala-Phe-Ser-Ala-Val-Ile-Ala-Leu-Leu-Asn-Asp-Ala-Arg-Leu-Arg-Ala-Gly-Lys-Pro-Thr-Leu-Gly-Phe-Leu-Asn-Pro-Trp-Leu-Tyr-Lys
序列13Thr-Gly-Arg-Gln-Gly-Leu-Gln-Asn-Ile-Thr-Leu-Gly-Ala-Ser-Ile-Gly-Xaa-Thr-Gly-Arg-Ala-Arg-Phe-Gly-Gly-Ala-Pro-Asn-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Pro-Tyr-Ala-Ser-序列14Ala-Lys-Xaa-Ile-Ser-His-Yaa-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Pro-Yaa-Leu-Lys-Glu-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-序列15Ala-Xaa(1)-Asn-Xaa(2)-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Xaa(3)-Cys-Leu-Lys-Xaa(4)-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Xaa(5)-Xaa(6)
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCT Rule 13bis)
權(quán)利要求
1.一種降低或消除真菌TPAP生產(chǎn)細(xì)胞的TPAP生產(chǎn)能力的方法，在該方法中，對(duì)存在于該細(xì)胞中并為TPAP表達(dá)所必須的DNA序列進(jìn)行修飾或使其失活，以便降低該細(xì)胞的TPAP產(chǎn)量，或不產(chǎn)生TPAP。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述DNA序列編碼TPAP或其表達(dá)TPAP活性所必須的部分。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述DNA序列是從TPAP編碼DNA序列表達(dá)TPAP所需的調(diào)節(jié)序列。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述DNA序列是啟動(dòng)子序列或其功能片段。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中，所述DNA序列的修飾或失活是這樣實(shí)現(xiàn)的對(duì)TPAP生產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，和篩選TPAP生產(chǎn)能力已降低或喪失的細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中，所述誘變是通過隨機(jī)或定點(diǎn)誘變實(shí)現(xiàn)的。
7.一種降低或消除真菌TPAP生產(chǎn)細(xì)胞的TPAP生產(chǎn)能力的方法，在該方法中，將充分互補(bǔ)于TPAP編碼序列并因此能夠與該細(xì)胞中所產(chǎn)生的TPAP mRNA雜交的核苷酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞中，使該核苷酸序列可以在一定條件下在該細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，所述條件使該核苷酸序列與所述TPAP mRNA雜交并因此降低由所述mRNA翻譯成的TPAP的量或消除所有此類翻譯。
8.一種按照權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法制備的宿主細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，它是微生物細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，它是真菌細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，它是選自曲霉菌(Aspergillus sp.)、木霉菌(Trichoderma sp.)或鐮孢菌(Fusarium sp.)的細(xì)胞。
12.一種制備基本上無TPAP活性的產(chǎn)物的方法，該方法包括用編碼該產(chǎn)物的DNA序列轉(zhuǎn)化權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，在適于所述產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中回收所述產(chǎn)物。
13.一種制備基本上無TPAP活性的產(chǎn)物的方法，所述產(chǎn)物是由存在于TPAP表達(dá)細(xì)胞中的DNA序列編碼，該方法包括按權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法修飾存在于所述細(xì)胞內(nèi)并為表達(dá)TPAP所必需的DNA序列或使其失活，接著在適于該產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所述產(chǎn)物。
14.一種通過發(fā)酵TPAP生產(chǎn)細(xì)胞制備基本上無TPAP的產(chǎn)物的方法，所述細(xì)胞也能產(chǎn)生所述產(chǎn)物，該方法包括在發(fā)酵期間或在發(fā)酵完成之后將有效量的、能抑制TPAP活性的抑制劑加入發(fā)酵液中，從發(fā)酵液中回收目的產(chǎn)物，并任選地對(duì)所回收的產(chǎn)物作進(jìn)一步純化。
15.一種通過發(fā)酵TPAP生產(chǎn)細(xì)胞制備基本上無TPAP的產(chǎn)物的方法，所述細(xì)胞也能產(chǎn)生所述產(chǎn)物，該方法包括對(duì)發(fā)酵液或從該發(fā)酵液中提取的含有TPAP和目的產(chǎn)物的酶制劑進(jìn)行綜合pH和溫度處理，處理的時(shí)間足夠長(zhǎng)以便降低TPAP活性，并任選地從處理過的發(fā)酵液中回收所述產(chǎn)物。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中所述降低TPAP活性的處理是在6.5～7的pH范圍和25～40℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
17.如權(quán)利要求12-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述產(chǎn)物是酶。
18.如權(quán)利要求17的方法，其中所述產(chǎn)物選自淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶和植物細(xì)胞壁降解酶。
19.如權(quán)利要求18的方法，其中所述產(chǎn)物是AMG、脂肪酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、過氧化物酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、漆酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶或植酸酶。
20.一種基本上無TPAP活性的蛋白產(chǎn)物，它是通過權(quán)利要求12-19中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的。
21.如權(quán)利要求20的產(chǎn)物，它是AMG。
22.一種提取的真菌三肽基氨肽酶。
23一種三肽基氨肽酶(TPAP)，它由一種DNA結(jié)構(gòu)編碼，該結(jié)構(gòu)包括i)序列1、2或3中示出的DNA序列，或ii)DSM 9570的部分TPAP編碼DNA序列，或iii)一個(gè)核苷酸序列，它能夠與以序列1、2或3中示出的DNA序列為基礎(chǔ)制備的探針或以序列4-14中任一個(gè)所示出的氨基酸序列為基礎(chǔ)制備的探針雜交，而且它編碼一種TPAP。
24.一種提取的TPAP，它能夠裂解底物Phe-Pro-Ala-pNA，并且能與純化的黑曲霉(A.niger)TPAP或純化的米曲霉(A.oryzae)TPAP發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，和/或包括以下N-末端序列Ala-Xaa(1)-Asn-Xaa(2)-Ser-His-Cys-Asp-Ser-Ile-Ile-Thr-Pro-Xaa(3)-Cys-Leu-Lys-Xaa(4)-Leu-Tyr-Asn-Ile-Gly-Asp-Tyr-Gln-Ala-Asp-Xaa(5)-Xaa(6)(序列15)，其中，Xaa(1)、Xaa(2)、Xaa(3)、Xaa(4)、Xaa(5)和Xaa(6)中的任一個(gè)可以相同或不同，而且可以選自任何天然氨基酸殘基。
25.如權(quán)利要求24的TPAP，其中Xaa(1)為L(zhǎng)ys或Gln，Xaa(2)為Ile或Thr，Xaa(3)為Pro或His，Xaa(4)為Glu或Gln，Xaa(5)為Pro或Ala和/或Xaa(6)為L(zhǎng)ys或Asn。
26.如權(quán)利要求22-25中任一項(xiàng)的TPAP，其最佳pH范圍為5.0-7.5。
27.如權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)的TPAP，它包括序列4-9中示出的部分氨基酸序列中的至少一種，和/或最佳pH范圍大約為5.0～5.5。
28.如權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)的TPAP，它包括序列10-14中示出的部分氨基酸序列中的至少一種，和/或最佳pH范圍大約為5.5～7.5。
29.如權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)的三肽基氨肽酶，它來源于微生物。
30.如權(quán)利要求29的三肽基氨肽酶，它來源于真菌。
31.如權(quán)利要求30的三肽基氨肽酶，它可以獲自曲霉屬(Aspergillus)的一個(gè)菌株，特別是獲自米曲霉、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)或臭曲霉(A.foetidus)。
32.一種DNA結(jié)構(gòu)，包括一個(gè)編碼一種來源于真菌的TPAP的DNA序列。
33.一種編碼一種TPAP的DNA結(jié)構(gòu)，它包括i)序列1、2和3中示出的DNA序列中的至少一個(gè)，或ii)DSM 9570的與TPAP相關(guān)的DNA序列，或iii)一個(gè)核甘酸序列，它能夠與以序列1、2或3中示出的DNA序列為基礎(chǔ)制備的寡核苷酸探針或以序列4-14中任一個(gè)所示出的氨基酸序列為基礎(chǔ)制備的寡核苷酸探針雜交，而且它能編碼一種TPAP，或iv)一個(gè)互補(bǔ)于i)、ii)或iii)的DNA序列的DNA序列。
34.一種表達(dá)載體，它包括權(quán)利要求32或33所述的DNA結(jié)構(gòu)。
35.一種宿主細(xì)胞，它包括權(quán)利要求32或33所述的DNA結(jié)構(gòu)，或包括權(quán)利要求34的表達(dá)載體。
36.一種生產(chǎn)TPAP的方法，包括在適于TPAP表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求35的宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中回收TPAP。
37.DSM 9570或其突變體，它包括一種序列1所示DNA序列的類似物。
全文摘要
一種三肽基氨肽酶(TPAT)，它由一種DNA結(jié)構(gòu)編碼，該DNA結(jié)構(gòu)包括i)序列1、2或3中示出的DNA序列，或ii)DSM 9570的部分TPAP編碼DNA序列，或iii)一個(gè)核苷酸序列，它能夠與以序列1、2或3中示出的DNA序列為基礎(chǔ)制備的寡核苷酸探針或以序列4－14中任一個(gè)示出的氨基酸序列為基礎(chǔ)制備的寡核苷酸探針雜交，而且它編碼一種TPAP。該TPAP可通過重組DNA技術(shù)獲得。通過對(duì)TPAP編碼DNA序列進(jìn)行滅活或修飾可以生產(chǎn)出TPAP缺陷型生產(chǎn)菌株。
文檔編號(hào)C12R1/77GK1611601SQ20041009550
公開日2005年5月4日 申請(qǐng)日期1995年11月8日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月8日
發(fā)明者K·A·霍爾姆, G·拉斯默森, T·哈凱爾, J·萊姆貝克 申請(qǐng)人:諾沃奇梅茲有限公司